JP3537434B2 - Δ６−デサチュラーゼによるガンマリノレン酸の製造 - Google Patents

Δ６−デサチュラーゼによるガンマリノレン酸の製造

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Description

【発明の詳細な説明】
リノール酸（18:2）（LA）は、酵素Δ６−デサチュラ
ーゼによってガンマリノレン酸（18:3）（GLA）に変換
される。この酵素、またはこれをエンコード（encode）
する核酸が、LA−生成細胞中に移入されると、GLAが生
成される。本発明は、そのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子
からなる核酸を提供する。より詳しくは、Δ６−デサチ
ュラーゼ遺伝子のプロモータ、コーディング領域、及び
停止領域からなる核酸である。さらに本発明は、異型の
調節配列との機能的複合（functional combination）に
おけるΔ６−デサチュラーゼのコーディング領域からな
る再配列構造を指向する。本発明の核酸と再配列構造
は、トランスジェニック（transgenic）生体において有
用である。 リノール酸（C18Δ９、12）及びα−リノレン酸（C18
Δ12、15）のような不飽和脂肪酸は、脊椎動物によって
合成されない必須食物的要素である。なぜならば、脊椎
動物細胞は脂肪酸のΔ９位に二重結合を導入することは
できるが、Δ９位の二重結合と脂肪酸鎖のメチル末端と
の間に付加的二重結合を導入することはできないからで
ある。それらは他の生成物の前駆体であるから、リノー
ル酸及びα−リノレン酸は必須脂肪酸であり、通常は植
物源から得られる。リノール酸は、ほ乳類によってγ−
リノレン酸（GLA、C18Δ６、９、17）に変換され、それ
は今度はアラキドン酸（20:4）に変換される。そのアラ
キドン酸は、ほとんどのプロスタグランジンの必須前駆
体であるので非常に重要である。 リノール酸の食物的供給品は、それが結果的にGLA及
びアラキドン酸に変換されることによって、GLAとアラ
キドン酸に対する食物的要求を満足する。しかし、飽和
脂肪の消費と、過コレステロール血症、アテローム性動
脈硬化症、及び冠状疾患に対する感受性に関連した他の
化学的疾病のような健康上の危険との関係が実証されて
いる。一方、不飽和脂肪酸の消費は、血液コレステロー
ル濃度の減少及びアテローム性動脈硬化症の危険性の低
下に連関している。食物的GLAの治療上の利点は、GLAが
アラキドン酸の前駆体となり、引き続きプロスタグラン
ジン合成に貢献することによると考えられる。従って、
リノール酸よりも不飽和性の高いGLAを消費すること
は、潜在的な健康上の利点を有している。しかしなが
ら、GLAは、商業的に生育した収穫植物には実際上存在
しない。 リノール酸は、酵素Δ６−デサチュラーゼによりGLA
に変換される。Δ６−デサチュラーゼは、約359のアミ
ノ酸からなり、膜に結合したドメイン（domain）と、脂
肪酸の脱飽和の活性サイトを有している。この酵素が、
GLAではなくリノール酸を固有に生成する細胞中に移入
されると、GLAが生成される。本発明は、Δ６−デサチ
ュラーゼをエンコードする遺伝子を供給することによっ
て、機能的なΔ６−デサチュラーゼを含み、GLAを生成
することのできるトランスジェニック生体を生み出すこ
とを可能にする。多量のGLAの生成を可能にしすること
に加えて、本発明は、GLAの新しい食物源を提供する。 本発明は、単離されたΔ６−デサチュラーゼ遺伝子を
指向する。特に、Δ６−デサチュラーゼプロモータ、コ
ーディング領域、及び末端領域からなる単離された遺伝
子である。 さらに本発明は、Δ６−デサチュラーゼプロモータ、
コーディング領域、及び末端領域からなる発現ベクター
を指向する。 また本発明は、異型調節領域、すなわちΔ６−デサチ
ュラーゼ遺伝子から導かれない因子との機能的複合にお
けるΔ６−デサチュラーゼコーディング領域からなる発
現ベクターを指向する。 本発明のベクターからなる細胞及び生体、及びそのよ
うな生体の子孫もまた、本発明で提供される。 本発明は、さらに単離された細菌のΔ６−デサチュラ
ーゼを提供し、さらに細菌のΔ６−デサチュラーゼをエ
ンコードする単離された核酸を指向する。さらに本発明
は、ガンマリノレン酸（GLA）含有量の増加した植物の
製法を提供し、それは、本発明の単離された核酸での植
物細胞の形質転換と、その植物細胞からのGLA含有量の
増加した植物の再生からなる。 耐寒性（chilling torerant）植物の製法もまた、本
発明によって提供される。 図１は、シネコシスチス（Synechocystis）Δ６−デ
サチュラーゼ（パネルＡ）及びΔ12−デサチュラーゼ
（パネルＢ）の演繹されたアミノ酸配列のヒドロパシー
・プロファイル（hydropathy profile）を示す。推定の
膜スパンニング（spannimg）領域は実線で示した。疎水
性インデックス（index）は、19アミノ酸残基のウィン
ドサイズ（window size）で計算した（キテ（kyte）
他）、（1982）、J.Molec.Biol.、157）。 図２は、野生型（パネルＡ）及びトランスジェニック
（パネルＢ）のアナバエナ（Anabaena）のガス液体クロ
マトグラフィープロファイルを与える。 図３は、コスミド（cosmid）cSy75、cSy13及びcSy7の
地図を、重なり合い及びサブクローンとともに示した図
である。cSy75、cSy75−3.5及びcSy7の起源は、斜めの
点線で示した。不活性化された制限サイトは括弧で示し
た。 図４は、野生型（パネルＡ）及びトランスジェニック
（パネルＢ）のタバコのガス液体クロマトグラフィープ
ロファイルを与える。 本発明は、Δ６−デサチュラーゼをエンコードする単
離された核酸を提供する。Δ６−デサチュラーゼをエン
コードする核酸を同定するために、GLAを生成する生体
からDNAを単離した。その生体は、例えば、動物細胞、
ある種の真菌（例えばモルチエレラ（Mortierell
a））、ある種の細菌（例えばシネコシスチス）あるい
はある種の植物（ボラージ（borage）、オエノセラ（Oe
nothera）、クランツ（currants））であってよい。ゲ
ノム遺伝子の単離は、サムブルーク（Sambrook）他、
（1989）、分子クローニング：研究室マニュアル、コー
ルド・スプリング・ハーバー（cold Spring Harbor）、
ニューヨーク、に例示されているような、当業者によく
知られた方法を変形して行なった。単離されたDNAは、
物理的方法または酵素的分解によって断片に（fragmen
t）され、例えばバクテリオファージやコスミドベクタ
ーといった適宜のベクターに、サムブルーク他（1989）
の文献に見られるような公知の方法の変形によってクロ
ーンされる。本発明のDNAを含んでいる発現ベクター
を、特にここで考慮する。Δ６−デサチュラーゼをエン
コードするDNAは、機能獲得分析（gain of function an
alysis）で同定することができる。断片にされたDNAを
含むベクターが、例えば感染、トランスコンジュゲーシ
ョン（transconjugation）、移入によって、GLAではな
くリノール酸を生成する生体に転移される。ここで使用
する”形質転換（transformation）”は、一般に外来の
DNAを宿主細胞に取り入れることを意味する。再配列DNA
を宿主生体に導入する方法は、当業者にはよく知られて
おり、例えば、サムブルーク他（1989）に見いだされ
る。これらの生体によるGLAの生成（例えば機能の獲
得）は、例えばガスクロマトグラフィーまたは他の当業
者に知られた方法によって検定される。GLAを生成させ
られる、例えば、ベクターの導入によって獲得された機
能を有する生体は、Δ６−デサチュラーゼをエンコード
する発現DNAによって同定され、そのDNAは、その生体か
ら再生される。再生されたDNAは、再び断片にされ、発
現ベクターでクローンされ、Δ６−デサチュラーゼをエ
ンコードするDNAがより特異的に定義されるように、上
記の方法によってさらに検定される。 本発明の例として、シアノバクテリアのシネコシスチ
ス パステウア・カルチャー・コレクション（Pasteur
Culture Collection）（PCC）6803、アメリカンタイプ
・カルチャー・コレクション（American type Culture
Collection）（ATCC）27184から、ランダム（random）D
NAを単離し、コスミドベクターにクローンし、GLA欠損
シアノバクテリアのアナバエナ菌株PCC7120、ATCC27893
へのトランスコンジュゲーションによって導入した。ア
ナバエナリノール酸からのGLAの生成は、ガスクロマト
グラフィーによって監視し、対応するDNAフラグメント
を単離した。 単離されたDNAは、例えばサムブルーク他（1989）に
見られるような、当業者によく知られた方法により配列
した。 本発明によれば、Δ６−デサチュラーゼ遺伝子からな
るDNAが単離された。特に、Δ６−デサチュラーゼ遺伝
子からなる3.588キロベース（kb）DNAが、シアノバクテ
リアのシネコシスチスから単離された。その3.588kbDNA
のヌクレオチド配列が同定され、配列番号:1に示した。
潜在的コーディング領域を決定するオープンリーディン
グフレーム（open reading frame）は、ヌクレオチド31
7から1507及び2002から3081に存在する。Δ６−デサチ
ュラーゼのエンコードに役割をはたしうるヌクレオチド
を決定するために、Δ６−デサチュラーゼ活性を与える
3.588kbフラグメントを、それぞれが１つのオープンリ
ーディングフレームを持つ２つのサブフラグメントに開
裂させた。フラグメントORF1は、１から1704のヌクレオ
チドを含み、一方フラグメントORF2は、1705から3588の
ヌクレオチドを含む。それぞれのフラグメントは、前方
向及び後方向で、シアノバクテリア・カルボキシラーゼ
・プロモータを含んでいる相方の発現ベクター（AM54
2、ウォーク（wolk）他、（1984）、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA81、1561）にサブクローンされる。結果的な構造
（例えば、ORF1（Ｆ）、ORF1（Ｒ）、ORF2（Ｆ）、及び
ORF1（Ｒ））は、通常の方法により、野生型のアナバエ
ナPCC7120に複合される（例えば、ウォーク他、（198
4）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81、1561参照）。アナバ
エナの複合細胞は、選択媒体（リップカ（Rippka）他、
（1979）J.Gen Microbiol.111、１に従うBG11N＋30μg/
mlのネオマイシン（neomycin）を含む標準鉱物媒体）で
の２週間の成長の後の、死んだ非複合細胞の茶色のバッ
クグラウンド上のネオＲグリーンコロニー（NeoR green
colonies）と同定された。そのグリーンコロニーは選
択され、選択液体媒体（BG11N＋15μg/mlネオマイシ
ン）中で成長される。脂質を、前及び後方向に配向した
ORF1及びORF2構造を含むトランスコンジュガント（Tran
sconjugant）から、標準的な方法（例えば、ダーマー
（Dahmer）他、（1989）Journal of American Oil Chem
ical Society 66、543）で抽出する。比較のために、ア
ナバエナ及びシネコシスチスの野生型の培地からも脂質
を抽出した。脂肪酸メチルエステルがガス液体クロマト
グラフィー（GLC）、例えば、水素火炎イオン化検出機
とキャピラリーカラムを備えたトレイカー（Tractor）
−560ガス液体クロマトグラフにより分析された。GLC分
析の結果を表１に示す。 GLC分析による検定では、GLA欠損アナバエナは、前方
向のORF2を含む構造がトランスコンジュゲーションによ
って導入されたときに、GLA生成の機能を獲得する。カ
ルボキシラーゼプロモーターに対して後方向のORF2、あ
るいは両方向のORF1の構造を含むトランスコンジュゲー
ションは、GLA生成を示さなかった。この分析は、1884b
pフラグメントを持った単一のオープンリーディングフ
レーム（ORF2）が、Δ６−デサチュラーゼをエンコード
することを示している。1884bpフラグメントは、配列番
号:3に示した。これは、図１（Ａ）及び（Ｂ）に各々示
したように、Δ６−デサチュラーゼとΔ12−デサチュラ
ーゼ（ワダ（Wada）他、（1990）、ネーチャー（Natur
e）、347）との間のヒドロパシープロファイルの全体的
な類似性によって実証される。 Δ６−デサチュラーゼをエンコードする単離された核
酸は、上述の機能獲得分析または交雑プローブとしてア
ナバエナΔ６−デサチュラーゼをエンコードする単離さ
れた核酸を使用した核酸交雑技術により、他のGLA生成
生体から同定される。ゲノム及びcDNAクローニング法が
当業者に知られており、本発明によって熟慮される。交
雑プローブは、オリゴヌクレオチド・プローブを含む、
配列番号:1に示した全DNA配列、あるいはそれらの制限
フラグメントまたは他のフラグメントからなることがで
きる。交差交雑による相同遺伝子のクローニングの方法
は、当業者にはよく知られており、例えば、サムブルー
ク（1989）やベルツ（Beltz）他（1983）エンザイモロ
ジー（Enzymology）における方法、100、266に見いだせ
る。 Δ６−デサチュラーゼをエンコードするDNAの導入に
より、GLA生成の機能を獲得するトランスジェニック生
体は、オクタデカテトラエン酸（18:4
Δ６、９、12、15）生成の機能もまた獲得する。オクタ
デカテトラエン酸は、通常、魚油及びボラギナセアエ
（Boraginaceae）族（クレイグ（Craig）他、（1964）
J.Amer.Oil Chem.Soc.41、209−211;グロス（Gross）
他、（1976）Can.J.Plant Sci.56、659−664）に属する
いくつかの植物種に存在する。本発明のトランスジェニ
ック生体においては、オクタデカテトラエン酸は、Δ６
−デサチュラーゼによるα−リノレン酸のさらなる脱飽
和、もしくはΔ15−デサチュラーゼによるGLAの脱飽和
の結果得られる。 ORF2、例えばΔ６−デサチュラーゼをエンコードする
オープンリーディングフレームによってエンコードされ
た359アミノ酸を、配列番号:2に示した。さらに本発明
は、配列番号:2のアミノ酸をエンコードする他のヌクレ
オチド配列を熟慮する。例えば遺伝コードの同義性から
得られるそのような配列の同定は、当業者の知識の範囲
内である。さらに、当業者は、上述した機能獲得分析に
より、Δ６−デサチュラーゼをエンコードするORF2を含
む1884bpフラグメントのより小さなサブフラグメントを
同定することができる。 本発明は、そのようなΔ６−デサチュラーゼのポリペ
プチドフラグメント及びLAをGLAに変換する活性を有し
ているその核酸を考慮する。 本発明の他の態様では、1884bpフラグメント、または
Δ６−デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、コーディ
ング配列及び停止領域を含むより小さなフラグメント
は、例えば、Δ６−デサチュラーゼプロモーター及び停
止領域が機能的であるようなシアノバクテリアに転移さ
れる。従って、本発明では、再配列Δ６−デサチュラー
ゼを生成する生体が提供される。本発明のさらなる態様
では、再配列生体から、タンパク質精製の標準的な方
法、例えば、アウスベル（Ausubel）他、（1987）、分
子生物学での最近の議定書（Cullent Protocols in Mol
ecular Biology）、グリーン出版社（Green Publishing
Associates）、ニューヨーク、で精製された、単離さ
れたΔ６−デサチュラーゼを提供する。 Δ６−デサチュラーゼをエンコードするDNAを含むベ
クターもまた、本発明によって提供される。適当なベク
ターが、多くの生体におけるΔ６−コーディング配列の
発現を指向するように構成されることができることは、
当業者には明かである。レプリカ可能な（repricable）
発現ベクターが特に好ましい。ここに説明するレプリカ
可能な発現ベクターは、例えばΔ６−デサチュラーゼの
ような設計された（desired）遺伝子の制御された発現
のために設計された（engineered）DNAまたはRNA分子で
ある。好ましくは、ベクターは、プラスミド、バクテリ
オファージ、コスミド、またはウイルスである。例え
ば、ウォーク他、（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、15
61−1565及びブストス（Bustos）他、（1991）J.Bacter
iol.174、7525−7533、のような、シャトルベクターも
また本発明に従って考慮される。サムブルーク（198
9）、ゴエデル（Goeddel）編、（1990）、エンザイモロ
ジーの方法（Methods in Enzymology）、アカデミック
・プレス（Acadimic Press）、及びパーバル（Parbal）
（1988）、分子クローニングの実用ガイド（Practical
Guide to Molecular Cloning）、ジョン・ウィリー・ア
ンド・サン（John Wiley and Sons,Inc.,）は、Δ６−
デサチュラーゼをエンコードする核酸中に挿入され発現
されることのできるベクターの詳細な総説を提供する。
そのようなベクターは、Δ６−デサチュラーゼをエンコ
ードする核酸の発現に影響を与えることのできる核酸配
列をも含んでいる。遺伝子生成の発現に影響を与えるこ
とのできる配列因子は、プロモーター、促進因子、上流
側活性化配列、転写停止信号及びポリアデニレーション
（polyadenylation）サイトを含む。構成及び組織特異
的プロモーターを考える。植物細胞の転換のために、カ
ウリフラワー（cauliflower）モザイクウイルス（CaM
V）35Sプロモーター、及び植物種子成熟の間に調節され
るプロモーターは特に興味深い。すべてのそのようプロ
モーター及び転写調節因子は、単一または組み合わされ
て、このレプリカ可能な発現ベクターにおける使用が考
慮され、それは当業者に知られている。CaMV355プロモ
ーターは、例えばレストレポ（Restrepo）他、（1990）
PlantCell、2987、に説明されている。遺伝的に設計さ
れ、突然変異した調節配列もまた考慮される。 当業者は、特別な宿主細胞における発現に好適なベク
ターまたは調節因子を同定することができる。例えば、
アナバエナのカルボキシラーゼをエンコードする遺伝子
からのプロモーターからなるベクターで、Δ６−デサチ
ュラーゼのコーディング領域に操作可能に（operable）
結合され、さらにシネコシスチスからの停止信号に操作
可能に結合しているものは、シアノバクテリアでのΔ６
−デサチュラーゼの発現に適している。本明細書におけ
る「操作可能に結合した」とは、プロモーター及び停止
配列が、転写の調節に効果的に機能することを意味す
る。さらなる例として、トランスジェニック植物でのΔ
６−デサチュラーゼの発現に適したベクターは、Δ６−
デサチュラーゼコーディング領域に実施可能に結合し、
さらに種子（seed）停止信号またはノパリン（nopalin
e）シンターゼ停止信号に実施可能に結合したヘリアン
チニン（helianthinin）、ナピン（napin）、またはグ
リシンから導かれた種子特異的プロモーター配列からな
ることができる。 特に、本出願人が1991年４月８日に出願し、審査中の
米国出願番号682,354及びそれに記載した参考文献に開
示されているヘリアンチニン調節因子は、本発明のΔ６
−デサチュラーゼの発現を指向するプロモーター因子と
考えられる。 ここで考慮した機能を維持した、ここで説明した核酸
配列または調節因子の修飾は、本発明の範囲内である。
そのような修飾は、挿入、置換、及び欠失、特に遺伝コ
ードの同義性を反映する置換を含んでいる。 そのようなハイブリッドベクターを構成する標準的技
法は、当業者にはよく知られており、サムブルーク他
（1989）や、広まっている再配列DNA技術の無数の研究
室マニュアルに見いだせる。DNAのフラグメントをリゲ
ート（ligate）するために、多くの方法が広まってお
り、その選択は、DNAフラグメントの末端の性質によ
る。本発明によって、ハイブリッドベクターに、クロー
ニング、発現またはプロセッシングを促進する他の配列
因子、例えば信号ペプチドをエンコードする配列、小胞
体でのタンパク質の保持に必要なKDELをエンコードする
配列、または葉緑体へのΔ６−デサチュラーゼを指向す
るトランジット（transit）ペプチドをエンコードする
配列が含まれることが考慮される。そのような配列は、
当業者には知られている。最適なトランジットペプチド
は、例えばファン・デン・ブロイク（Van den Broeck）
他、（1985）、ネイチャー、313、358に記述されてい
る。前核及び真核信号配列は、ミハエリス（Michaeli
s）他、（1982）、Ann.Rev.Microbiol.36、425に記述さ
れている。 本発明のさらなる態様は、本発明のΔ６−デサチュラ
ーゼをエンコードするDNAを含む、シアノバクテリア以
外の生体を提供する。本発明で考慮されるトランスジェ
ニック生体は、バクテリア、シアノバクテリア、細菌、
及び植物と動物を含む。本発明の単離されたDNAは、感
染、トランスフェクション、形質転換またはトランスコ
ンジュゲーションのような当業者に知られた方法で宿主
に導入される。そのような生体に本発明のDNAを移転す
る方法は、広く知られており、サムブルーク他（1989）
などの文献に与えられている。 植物の形質転換方法の変法は知られている。そのΔ６
−デサチュラーゼ遺伝子はホルシュ（Horsch）ら（198
5）Science 227,1229によって開示されたような葉片の
形質転換−組換え手法により植物の内部に導入すること
ができる。プロトプラスト培養（ホルシュ（Horch）ら
（1984）Science 223,496;デブロック（DeBlock）ら（1
984）EMBO J.2,2143;バートン（Barton）ら（1993）Cel
l 32,1033）のような、形質転換の別な方法もまた使用
でき、さらにそれらは本発明の範囲内である。好適な実
施態様において植物はアグリバクテリウム誘導ベクター
で形質転換される。しかしながら、別な方法は植物細胞
内に本発明のΔ６−デサチュラーゼ遺伝子を挿入するこ
とにより利用し得る。同様に近縁の方法は、バイオリス
チックアプローチ（クレイン（Klein）ら（1987）Natur
e 327,70）、電気泳動、化学的に誘導されたDNAの取入
れ、さらにウイルス又はベクターとしての花粉の使用を
含む。 形質転換方法が必要な時、本発明のΔ６−デサチュラ
ーゼ遺伝子は植物の形質転換ベクター、例えばビバン
（Bevan）（1984）Nucleic Acids Res.12,8111によって
開示されたバイナリーベクターを挿入することができ
る。植物の形質転換ベクターはアグロバクテリウム チ
ューメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の
自然遺伝子転移システムの変型によって誘導することが
できる。その自然システムは形質転換された植物に転移
されるＴ−DNAとして知られる、ラージセグメントを含
んだラージTi（腫瘍−誘導性）−プラスミドを備える。
そのTiプラスミドの別のセグメント、その対向する領域
はＴ−DNA転移の原因となる。そのＴ−DNA領域は末端反
復によって境される。バイナリーベクターの変更におい
て腫瘍−誘発遺伝子は削除されており、そしてその対向
する領域の機能は、Ｔ−DNA境界配列により境された転
移外来DNAに利用される。そのＴ−領域は又、抗生物質
抵抗性のための選択可能なマーカーと、転移のための挿
入配列のための多岐クローニングサイトとを含む。その
ような工学的な株は”解除した（disarmed）"A.tumefac
iens株として知られており、そして植物の核のゲノム内
のＴ−領域によって境される配列の転移の能力を与え
る。 表面滅菌した葉片は、”解除した（disarmed）”外来
DNA含有A.tumefaciensを接種し、２日間培養し、そして
抗生物質含有培地に転換する。形質転換された芽（shoo
ts）は適当な抗生物質を含む培地中で出根させた後に選
択され、土壌に移して再生する。 本発明の別な態様は、本発明の分離されたDNAを包含
した遺伝子導入植物又はこれら植物の子孫を提供する。
単子葉植物と双子葉植物との両方の植物が企図される。
植物細胞は上述された植物形質転換方法のいずれかによ
ってΔ６−デサチュラーゼをエンコードする分離された
DNAで形質転換される。カルス培養又は葉片で通例であ
るが、形質転換された植物細胞は、当業者の１つの周知
方法により完全な遺伝子導入植物内で再生される（例え
ばホルシュ（Horsch）ら（1985）Science 227,1129）。
好ましい実施態様において、遺伝子導入植物はヒマワ
リ、ナタネ、トウモロコシ、タバコ、落花生及び大豆で
ある。Δ６−デサチュラーゼをエンコードするDNAを遺
伝する形質転換植物の子孫に由来し、形質転換植物から
の種子又は切断片が遺伝子導入植物系列を維持するのに
使用される。 本発明は更に、GLAの含量を増加した遺伝子導入植物
を提供するための方法を提供する。この方法は、GLAを
欠損又は欠乏しているが、LAを含んだ植物細胞内へΔ６
−デサチュラーゼをエンコードする導入性DNAと、遺伝
子導入細胞からのGLA含量が増加された再生植物とを包
含する。殊に、商業的栽培作物植物は、ヒマワリ、大
豆、ナタネ、トウモロコシ、落花生及びタバコを非限定
的に含む、遺伝子導入生体として企図される。 本発明は更に、GLAを含む遺伝子導入生体を提供する
ための方法を提供する。この方法はGLAを欠損或いは欠
乏しているがLAを含む生体の中にΔ６−デサチュラーゼ
をエンコードするDNAを導入することを備える。別な実
施態様において、GLAとLAの両方が欠乏する生体の中に
Δ12−デサチュラーゼとΔ６−デサチュラーゼをエンコ
ードしたDNAを備える１つ又はそれ以上の発現ベクター
を導入ことを備える。従って、LAとGLAの両方が欠乏し
た生体は、Δ12−デサチュラーゼの発現によって生産が
誘発され、かつGLAがΔ６−デサチュラーゼの発現のた
めに生成される。Δ12−デサチュラーゼ又はΔ12−デサ
チュラーゼとΔ６−デサチュラーゼをエンコードしたDN
Aを備える発現ベクターは、当業者における周知の組換
え技術の方法（サムブルーク（Sambrook）ら,1989）及
びΔ12−デサチュラーゼの公表された配列（ワダ（Wad
a）ら［1990］Nature（London）347,200−203）によっ
て構成することができる。加えて、シアノバクテリア由
来のΔ12−デサチュラーゼの配列番号:1（SEQ.ID NO:
1）でエンコードした2002−3081核酸が本発明によって
発見されている。従って、この配列は主体発現ベクター
を構成するのに使用することができる。殊に、商業的栽
培作物植物が遺伝子導入植物として企図され、非限定的
に、ヒマワリ、大豆、ナタネ、トウモロコシ、落花生及
びタバコを含む。 本発明は更に、植物における寒冷寛容性を誘発するこ
との方法を示す。寒冷感受性は細胞膜中の脂質の相転移
によるものであろう。相転移温度は膜脂質中の脂肪酸の
不飽和度に依存し、それ故、例えばLAからGLAに転換す
るΔ６−デサチュラーゼを導入することによって不飽和
の度合を増加させれば耐寒性を誘引又は改善できる。従
って、本発明方法は植物細胞内にΔ６−デサチュラーゼ
をエンコードしたDNAを導入することと、その遺伝子導
入植物細胞から耐寒性を改善した植物を再生することを
備える。好適な実施態様において、その植物はヒマワ
リ、大豆、ナタネ、トウモロコシ、落花生及びタバコの
植物である。 以下の実施例により本発明をさらに説明する。 実施例１ 株と培養条件 シネコシスチス（Synechosystis）（PCC 6803,ATCC 2
7184）、アナバエナ（Anabaena）（PCC 7120,ATCC 2789
3）、シネココカス（Synechococcus）（PCC 7942,ATCC
33912）は、白熱ランプの照射（60μE.m−2.S−１）の
もとでBG11N＋培地（リプカ（Rippka）ら［1979］J.Ge
n.Microbiol.111,1−61）中、30℃で光独立栄養的に培
養した。コスミドとプラスミドが選択され、かつマニア
チス（Maniatis）ら（1982）Molecular Cloning:A Labo
ratry Manual,コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー，コールドスプリング，ニューヨークによって開示さ
れた標準濃度での抗生物質を補足したLB培地上で大腸菌
（Escherichia coli）DH5α株中で増殖した。 実施例２ シネコシスチス（Synechocystis）コスミドゲノミック
ライブラリーの構成 シネコシスチス（Synechocystis）（PCC 6803）から
の総ゲノミックDNA（Total genomic DNA）はSau3Aで消
化し、かつショ糖密度勾配法（アウスベルら［1987］Cu
rrent Protocols in Molecular Biology,Green Publish
ing Associates and Wiley Interscience,ニューヨー
ク）によって分別した。30から40kbのDNA断片を含んだ
フラクションを選択し、さらにコスミドベクター、pDUC
A7（ブイケマ（Buikema）ら［1991］J.Bacteriol.173,1
879−1885）のBamH Iサイトを脱リン酸化して連結し
た。その連結されたDNAはオースベル（Ausubel）ら（19
87）によって開示されたようにインビトロでパッケージ
し、さらにパッケージされたファージは、Ava IとEco47
11メチラーゼヘルパープラスミド、ブイケマ（Buikem
a）ら（1991）により開示されたようなpRL528を含んだ
大腸菌（E.coli）DH5α株中で増殖した。総数1152個の
コロニーを任意に分離し、12個の96穴のミクロタイター
プレート（Microtiter plates）に個々に保持した。 実施例３ アナバエナ中のGLAの機能獲得発現 繊維状シアノバクテリアであるアナバエナ（PCC 712
0）はGLAが欠乏しているが、GLAの前駆体であるリノー
ル酸を著しい量含有している（図2;表２）。実施例２に
示されたシネコシスチス コスミド ライブラリーは、
GLAを生産するトランスコンジュガント（transconjugan
ts）を同定するためにアナバエナ（PCC 7120）に接合さ
れた。アナバエナ細胞をBG11N＋液体媒体中のミッド−
ログ（mid−log）相まで生育し、ml当たり約２×108細
胞の最終濃度まで同じ媒体中で再度懸濁した。アンピシ
リンを含有するLB中に生育された大腸菌（E.coli）RP4
（バーカート（Burkardt）他［1979］J.Gen.Microbiol.
114、341−348）のミッド−ログ相培養物を洗浄し、新
鮮なLB媒体中で再度懸濁した。次に、アナバエナとRP4
とを混合し、５％のLBを含有するBG11N＋平板上に均一
に広げた。50μg/mlのカナマイシンと17.5μg/mlのクロ
ラムフェニコールとを含有するLB平板上にコスミド ゲ
ノム ライブラリーをレプリカ培養し、続いてアナバエ
ナとRP4とを含有するBG11N＋平板上にパッチした。30℃
で24時間インキュベーションを行った後、30μg/mlのネ
オマイシンを下に置いた；そしてトランスコンジュガン
トが発現するまで30℃でインキュベーションを続けた。 個々のトランスコンジュガントを接合の後に隔離し、
15μg/mlのネオマイシンを有する2mlのBG11N＋液体媒体
中で生育した。脂肪酸メチルエステルを以下の様に10個
のトランスコンジュガントのプールを含有する培養物と
野性型培養物とから調整した。野性型及び遺伝子導入の
シアノバクテリア培養物を遠心分離によって収集し、蒸
留水を用いて二度洗浄した。脂肪酸メチルエステルをダ
ーマー（Dahmer）他（1989）J.Amer.Oil.Chem.Soc.66、
543−548に記載されているこれらの培養物から抽出し、
キャピラリーカラムと水素炎イオン化検出器とを備えた
トラコー（Tracor）−560（30m×0.25mm、FSOTスペロッ
クス（Superox）IIに接続、オールテック アソシエー
ツ インコーポレーテッド（Alltech Associates In
c.）、イリノイ州）を用いてガス液体クロマトグラフィ
ー（GLC）によって分析した。脂肪酸の同定のために、
標準（シグマ ケミカル カンパニー（Sigma Chamical
Co.）より取得）の保持時間およびコクロマトグラフィ
ー（cochromatography）を用いた。平均の脂肪酸組成
を、内部の標準に標準化されたそれぞれのC18脂肪酸の
ピーク領域の割合として決定した。 図２に代表的なGLCプロファイルを示す。C18脂肪酸メ
チルエステルを示す。ピークは脂肪酸メチルエステルの
既知の標準を用いて溶離時間を比較することによって同
定し、ガスクロマトグラフィー−質量分析法によって確
定した。パネルＡは野性型アナバエナの脂肪酸のGLC分
析を描いている。矢印はGLAの移動時間を指している。
パネルＢはpAM542＋1.8Fをもつアナバエナのトランスコ
ンジュガントの脂肪酸のGLCプロファイルである。GLAを
生産した２つのGLA生産プール（250トランスコンジュガ
ントを表わす25プールのもの）が同定された。それぞれ
のGLA陽性プールの個々のトランスコンジュガントを分
析してGLA生産を求めた；著しい水準のGLAを発現しかつ
それぞれcSy13及びcSy75のコスミドを含有する（図
３）、別々のプールから得られた２つの個々のトランス
コンジュガントAS13及びAS75を同定した。これらのコス
ミドは長さ約7.5kbの領域で重複する。cSy75の3.5kb Nh
e IフラグメントをベクターpDUCA7中でリクローンし（r
ecloned）、GLAの機能獲得発現を生じるアナバエナに転
移した（表２）。 塩基配列決定のために、cSy75−3.5の3.5kb Nhe Iフ
ラグメントの２つのNhe I/Hind IIIサブフラグメント
（subfragments）（1.8及び1.7kb）を"pブルースクリプ
ト（pBLUESCRIPT）”（ストラタジーン（Stratagene）
（図３）にサブクローンした（subcloned）。マニアチ
ス（Maniatis）他（1982）及びアウスベル（Ausubel）
他（1987）に記載されているような標準分子生物学法を
行った。pBS1.8のジデオキシ（dideoxy）塩基配列決定
（サンガー（Sanger）他［1977］Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 74、5463−5467）をアドバンストDNAテクノロジーズ
ラボラトリー（Advanced DNA Technologies Laborato
ry）（テキサスＡ＆Ｍ大学、生物学部）によって合成さ
れた特定のオリゴヌクレオチド プライマーを用いるこ
とによって両標準に関して”シークエナーゼ（SEQUENAS
E）”（ユナイテッド ステーツ バイオケミカル（Uni
ted States Biochemical））を用いて行った。DNA塩基
配列決定分析はデベロウ（Devereux）他（1984）Nuclei
c Acid Res.12、387−395、によって記載されているよ
うなGCG（ウイスコンシン州、マジソン（Madison））ソ
フトウエアを用いて行った。 シアノバクテリアのカルボキシラーゼに関して前進及
び後進の両方向で、Nhe I/Hind IIIの両サブフラグメン
トを接合発現ベクターAM542に転移し、接合によってア
ナバエナに導入した。前進方向（AM542−1.8F）中の1.8
kbフラグメントを含有するトランスコンジュガントは著
しい量のGLAとオクタデカテトラエン酸を生産した（図
2;表２）。他の構成物、すなわち後進方向の1.8kbフラ
グメントか前進及び後進方向の1.7kbフラグメントかの
いずれか、を含有するトランスコンジュガントは検知可
能な水準のGLAを生産しなかった（表２）。 図２は、野性型アナバエナからの抽出物のC18脂肪酸
プロファイル（図2A）を前進方向にあるcSy75−3.5の1.
8kbフラグメントを含有する遺伝子導入のアナバエナの
もの（図2B）と比較している。AM542−1.8Fからの脂肪
酸メチルエステルのGLC分析は、真正のGLA標準と同様の
保持時間をもつピークを示した。ガスクロマトグラフィ
ー−質量分析法（GC−MS）によるこのピークの分析によ
って、このピークがGLA対照試料と同じ質量フラグメン
ト化パターンを有することが確定した。ポリ不飽和脂肪
酸の変化した水準を有する遺伝子導入のアナバエナは、
成長速度及び形態において野性型と同様であった。 実施例４ Δ６とΔ12デサチュラーゼ遺伝子でのシネココカス（Sy
nechococcus）の転換 Δ12−デサチュラーゼ遺伝子を含有する第３コスミド
であるcSy7が、刊行されたシネコシスチスΔ12−デサチ
ュラーゼ遺伝子配列（ワダ他［1990］、ネイチャー（ロ
ンドン）347、200−203）から合成されたオリゴヌクレ
オチドでシネコシスチス遺伝子ライブラリを選抜するこ
とにより単離された。Δ12−デサチュラーゼ遺伝子を含
有するこのコスミドからの1.7kbAva I断片は、同定さ
れ、cSy13がΔ６−デサチュラーゼ遺伝子だけでなくΔ1
2−デサチュラーゼ遺伝子も含有することを証明するプ
ローブとして使用された（図３）。ゲノミック サザン
ブロット（genomic southern blot）分析はさらに、両
Δ６−とΔ12−デサチュラーゼ遺伝子がシネコシスチス
ゲノムに独特であるので、C18脂肪酸脱飽和中に含まれ
た両機能遺伝子はシネコシスチスゲノム中に密接に架橋
していることを示した。 単細胞シアノバクテリウムシネココカス（PCC7942）
は、リノール酸とGLA（３）を共に欠いている。Δ12と
Δ６−デサチュラーゼ遺伝子は個々にコローニングさ
れ、外来DNAのシネココカスゲノム中への組み込みに必
要な配列を含んだシャトルベクターであるpAM854（ブス
トス（Bustos）他［1991］、J.Bacteriol.174,7525−75
33）中にともにクローニングされる（Golden他、［198
7］酵素の方法.153,215−231）。シネココカスは、これ
らの遺伝子構造で形質転換され、コロニーが選ばれた。
脂肪酸メチルエステルがトランスジェニックシネココカ
スから抽出され、GLCにより分析された。 野性型のシネココカスの主要な脂肪酸がステアリン酸
（18:0）とオレイン酸（18:1）であることを表２は示し
ている。pAM854−Δ12で形質転換されたシネココカス
は、主要な脂肪酸に加えてリノール酸（18:2）を発現し
た。pAM854−Δ６とΔ12によるトランスフォーマント
（transformant）は、リノール酸塩とGLA（表１）を共
に製造した。これらの結果は、両Δ12−とΔ６−デサチ
ュラーゼ遺伝子を含有しているシネココカスが、C18脂
肪酸のΔ12位置に第２二重結合を、Δ６位置に第３二重
結合を導く能力を得たことを示している。しかしなが
ら、pAM854−Δ６を有するトラスフォーマント中で脂肪
酸組成の変化が観察されず、このことは、Δ12デサチュ
ラーゼにより合成された基質の不在中で、Δ６−デサチ
ュラーゼが不活性であることを示している。この実験は
さらに、1.8kbNhe I/Hind III断片（図３）が、シネコ
シスチスΔ６−デサチュラーゼ遺伝子のコーディング及
びプロモータ領域を共に含有することを確信させる。多
不飽和脂肪酸の改められたレベルを持つトランスジェニ
ックシネココカスは、成長速度と形態が野性型と類似し
ていた。 実施例５ Δ６−デサチュラーゼのヌクレオチド配列 機能性Δ６−デサチュラーゼ遺伝子を含有するcSy75
−3.5の1.8kb断片のヌクレオチド配列が同定された。35
9アミノ酸のポリペプチドをエンコードするオープンリ
ーディングフレームが明らかにされた（図４）。カイト
−ドゥリトル水治療分析（カイト他［1982］J.Mol.Bio
l.157,105−132）は、トランスメンブランドメインを再
現し得る疎水性アミノ酸の２つの領域を明らかにした
（図1A）。さらには、Δ６−デサチュラーゼの水治療の
プロファイルは、Δ12−デサチュラーゼ遺伝子（図1B;
ワダ他）とΔ９−デサチュラーゼ（Thiede他［1986］j.
Biol.Chem.261,13230−13235）のそれに類似している。
しかしながら、シネコシスチスΔ６−とΔ６−デサチュ
ラーゼの間の配列類似性は、ヌクレオチドレベルで40％
より少なく、アミノ酸レベルで約18％である。 実施例６ シアノバクテリアルΔ６−デサチュラーゼのタバコへの
転移 シアノバクテリアルΔ６−デサチュラーゼ遺伝子は植
物発現ベクターに移動させられ、遺伝子転移技術に媒介
されたアグロバクテリウムを使用してタバコに転移され
た。転移されたデサチュラーゼが葉で好適に発現され、
種子を育成すること、及びデサチュラーゼ遺伝子生成物
が細胞質膜状構造もしくは葉緑体を標的としていること
を確信するために、シネコシスチスΔ−デサチュラーゼ
オープンリーディングフレーム（ORF）で各種発現カセ
ットが構成された。これらのカセットの構成は次記を含
む。（ｉ）全ての植物組織もしくは各単に成育する種中
のΔ６−デサチュラーゼ遺伝子発現をさせるための、ヒ
マワリヘリアンチニン遺伝子から誘導された35sプロモ
ータもしくは種子特異的プロモータ。（ii）新合成され
たΔ６−デサチュラーゼをERに標的するために、ニンジ
ン伸張遺伝子もしくはヒマワリヘリアンチニン遺伝子の
いずれかからの推定される信号ペプチド。（iii）Δ６
−デサチュラーゼORFのCOOH−端末でのERルーメン保留
信号配列（KDEL）。そして、（iv）Δ６デサチュラーゼ
を葉緑体に標的とするための最適化されたトランジット
ペプチド。35sプロモータは、レストレポ（Restrepo）
他（1990）により記載されたpRTL2の誘導体である。最
適化されたトランジットペプチド配列は、ファンデブロ
ック（Van de Broeck）他（1985）によって記載されて
いる。ニンジン伸張信号ペプチドはチェン（Chen）他
（1985）EMBO J.9,2145により記載されている。 トランスジェニックタバコ植物は、細胞質膜状構造保
留配列（KDEL）に融合されたシネコシスチスΔ６デサチ
ュラーゼ遺伝子とCaMV35Sプロモータによりドライブさ
れた伸張信号ペプチドとからなるキメラシアノバクテリ
アルデサチュラーゼ遺伝子を含有するように生成され
た。トランスジェニックタバコゲノミックDNAのPCR増大
は、Δ６デサチュラーゼ遺伝子がタバコゲノムに導入さ
れたことを示す。これらのトランスジェニックタバコ植
物の葉の脂肪酸メチルエステルが抽出され、ガス液体ク
ロマトグラフィ（GLC）により分析された。これらのト
ランスジェニックタバコは、GLAをかなりの量蓄積した
（図４）。図４は、GLCにより定量された脂肪酸メチル
エステルを示す。脂肪酸メチルエステルの既知の標準と
溶離時間を比較することによりピークは同定された。従
って、脂肪酸代謝中に含まれるシアノバクテリアル遺伝
子は、変化した脂肪酸組成を有するトランスジェニック
植物を生成するのに使用され得る。 配列リスト （１）一般情報 （ｉ）出願人：トーマス、テリー L.レディー、アブ
ツ（Avutu）S.ヌッチオ、マイケルフレイシエント（Fre
yssinet）、ジョージス L. （ii）発明の名称：デルタ６−デサチュラーゼによる
ガンマリノレン酸の製造 （iii）配列の数:3 （iv）通信アドレス： （Ａ）名宛人：スカリー、スコット、マーフィ＆プ
レッサー （Ｂ）通り:400ガーデンシティプラザ （Ｃ）市：ガーデンシティ （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号:11530 （ｖ）コンピュータ読取りフォーム： （Ａ）媒体種：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ:IBM PC コンパーティブル （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウエア：パテントイン リリース＃1.
0,バージョン＃1.25 （vi）現出願データ （Ａ）出願番号：指定 （Ｂ）出願日:1992年１月08日 （Ｃ）分類： （viii）代理人／代理情報 （Ａ）氏名：マックナルティ、ウイリアム Ｅ （Ｂ）登録番号:22606 （Ｃ）引例／名簿番号:8383Z （ix）電信情報： （Ａ）電話：（516）742−4343 （Ｂ）ファックス：（516）742−4366 （Ｃ）テレックス:230 901 SANS UR （２）配列番号:1の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:3588塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA（ゲノミック） （ix）特徴： （Ａ）名称／鍵:CDS （Ｂ）存在位置:2002..3081 （xi）配列の記載：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:359アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：タンパク質 （xi）配列の記載：配列番号:2: （２）配列番号:3の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:1884塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNA（ゲノミック） （xi）配列の記載：配列番号:3:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ナッシオ，マイケル アメリカ合衆国 テキサス 77841 カ レッジ ステーション （番地なし） ピーオーボックス 553 (72)発明者 フレッシネ，ジョルジュ フランス国 サン シュール オー モ ン ドール リュ ドゥ ネルヴリュウ 21 (56)参考文献 ＪＡＯＣＳ，Ｖｏｌ．67，Ｎｏ．４ （1990）ｐ．217−225 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏ ｌ．，Ｖｏｌ．30，Ｎｏ．７（1989) ｐ．971−978 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号:3のヌクレオチド配列、または配
    列番号:3のヌクレオチド配列の１若しくは数個の核酸が
    欠失、置換若しくは付加された配列を含む、シアノバク
    テリアのΔ６−デサチュラーゼをコードする単離された
    核酸。
  2. 【請求項２】配列番号:3のヌクレオチド配列を含む単離
    された核酸。
  3. 【請求項３】請求項１記載の核酸にコードされるアミノ
    酸配列をコードする単離された核酸。
  4. 【請求項４】前記核酸がベクターに含まれている、請求
    項１ないし３のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  5. 【請求項５】前記単離された核酸の遺伝子産物の発現に
    作用することができるプロモーターおよび／または終結
    シグナルに操作可能に結合されている請求項４記載の単
    離された核酸。
  6. 【請求項６】前記プロモーターが、Δ６−デサチュラー
    ゼプロモーター、アナバエナ・カルボキシラーゼプロモ
    ーター、ヘリアンチニンプロモーター、グリシンプロモ
    ーター、ナピンプロモーター、またはヘリアンチニン組
    織特異的プロモーターである、請求項５記載の単離され
    た核酸。
  7. 【請求項７】前記終結シグナルが、シネコシスチス終結
    シグナル、ノパリンシンターゼ終結シグナル、または種
    子終結シグナルである、請求項５記載の単離された核
    酸。
  8. 【請求項８】前記単離された核酸が、トランスジェニッ
    ク生物内に含まれている、請求項１ないし７のいずれか
    一項に記載の単離された核酸。
  9. 【請求項９】前記トランスジェニック生物が、細菌、真
    菌、植物細胞または動物である、請求項８記載の単離さ
    れた核酸。
  10. 【請求項１０】請求項１ないし６のいずれか一項に記載
    の単離された核酸を用いて形質転換された植物細胞から
    再生された、双子葉または単子葉植物もしくは当該双子
    葉または単子葉植物の子孫であって、ここで前記単子葉
    植物がイネ、オーチャードグラス、またはトウモロコシ
    である、双子葉または単子葉植物もしくは当該双子葉ま
    たは単子葉植物の子孫。
  11. 【請求項１１】前記植物が、ヒマワリ、ダイズ、イネ、
    オーチャードグラス、トウモロコシ、タバコ、落花生、
    またはナタネである、請求項10記載の植物。
  12. 【請求項１２】増加したガンマリノレン酸（GLA）を有
    する双子葉または単子葉植物を産生する方法（ここで前
    記単子葉植物はイネ、オーチャードグラスおよびトウモ
    ロコシからなる群から選択される）であって、以下の工
    程： （ａ）請求項１ないし７のいずれか一項に記載の単離さ
    れた核酸を用いて植物細胞を形質転換すること、および （ｂ）前記植物細胞から増加したGLA含量を有する植物
    を再生すること を含む方法。
  13. 【請求項１３】前記植物が、ヒマワリ、ダイズ、イネ、
    オーチャードグラス、トウモロコシ、タバコ、落花生、
    またはナタネである、請求項12記載の方法。
  14. 【請求項１４】ガンマリノレン酸（GLA）に不足がある
    またはGLAを欠如するヒト以外の細菌、真菌、双子葉植
    物、単子葉植物、または動物においてGLAの産生を誘導
    する方法（ここで前記単子葉植物はイネ、オーチャード
    グラス、またはトウモロコシである）であって、請求項
    １ないし６のいずれか一項に記載の単離された核酸を用
    いて前記ヒト以外の細菌、真菌、双子葉植物、単子葉植
    物、または動物を形質転換することを含む方法。
  15. 【請求項１５】ガンマリノレン酸（GLA）およびリノー
    ル酸（LA）に不足があるまたはこれらを欠如するヒト以
    外の細菌、真菌、双子葉植物、単子葉植物、または動物
    においてGLAの産生を誘導する方法（ここで前記単子葉
    植物はイネ、オーチャードグラス、またはトウモロコシ
    である）であって、配列番号:3のヌクレオチド配列、ま
    たは配列番号:3のヌクレオチド配列の１若しくは数個の
    核酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含むシアノ
    バクテリアのΔ６−デサチュラーゼをコードする単離さ
    れた核酸、およびΔ12−デサチュラーゼをコードする単
    離された核酸を用いて前記ヒト以外の細菌、真菌、双子
    葉植物、単子葉植物、または動物を形質転換することを
    含む方法。
  16. 【請求項１６】ガンマリノレン酸（GLA）およびリノー
    ル酸（LA）に不足があるまたはこれらを欠如するヒト以
    外の細菌、真菌、双子葉植物、単子葉植物、または動物
    においてGLAの産生を誘導する方法（ここで前記単子葉
    植物はイネ、オーチャードグラス、またはトウモロコシ
    である）であって、配列番号:3のヌクレオチド配列、ま
    たは配列番号:3のヌクレオチド配列の１若しくは数個の
    核酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含むシアノ
    バクテリアのΔ６−デサチュラーゼをコードする単離さ
    れた核酸、およびΔ12−デサチュラーゼをコードする単
    離された核酸を含む少なくとも一つの発現ベクターを用
    いて前記ヒト以外の細菌、真菌、双子葉植物、単子葉植
    物、または動物を形質転換することを含む方法。
  17. 【請求項１７】前記シアノバクテリアのΔ６−デサチュ
    ラーゼをコードする単離された核酸が、配列番号:1のヌ
    クレオチド2002−3081、または配列番号:1のヌクレオチ
    ド2002−3081の１若しくは数個の核酸が欠失、置換若し
    くは付加された配列を含む、請求項15または16記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】ガンマリノレン酸に不足があるまたはこ
    れを欠如するヒト以外の細菌、真菌、双子葉植物、単子
    葉植物、または動物においてオクタデカテトラエン酸の
    産生を誘導する方法（ここで前記単子葉植物はイネ、オ
    ーチャードグラス、またはトウモロコシである）であっ
    て、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の単離され
    た核酸を用いて前記ヒト以外の細菌、真菌、双子葉植
    物、単子葉植物、または動物を形質転換することを含む
    方法。
  19. 【請求項１９】改善された耐寒性を有する双子葉または
    単子葉植物を産生するための請求項１ないし６のいずれ
    か一項に記載の単離された核酸の使用方法（ここで前記
    単子葉植物はイネ、オーチャードグラス、またはトウモ
    ロコシである）であって、 （ａ）請求項１ないし６のいずれか一項に記載の単離さ
    れた核酸を用いて植物細胞を形質転換すること、および （ｂ）前記形質転換された植物細胞から改善された耐寒
    性を有する植物を再生すること を含む方法。
  20. 【請求項２０】前記植物がヒマワリ、ダイズ、イネ、オ
    ーチャードグラス、トウモロコシ、タバコ、落花生、ま
    たはナタネである、請求項19記載の方法。
  21. 【請求項２１】配列番号:2のアミノ酸配列、または配列
    番号:2のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠
    失、置換若しくは付加された配列を含む、単離されたシ
    アノバクテリアのΔ６−デサチュラーゼ。
  22. 【請求項２２】配列番号:2のアミノ酸配列を含む単離さ
    れたシアノバクテリアのΔ６−デサチュラーゼ。
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