KR100316068B1 - 델타6-불포화효소에 의한 감마리놀레산의 제조 - Google Patents
델타6-불포화효소에 의한 감마리놀레산의 제조 Download PDFInfo
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Abstract
리놀레산을 효소6-불포화효소에 의해 γ-리놀레산으로 전환된다. 본 발명은6-불포화효소 유전자로된분리된 핵산에 관한다. 더욱 구체적으로는, 분리된 핵산은6-불포화효소 유전자의 프로모터, 암호화대역, 및 종결 대역으로 이루어 진다. 본 발명은 기능적 조합에서 이질적인 조절적 서열과
Description
제 1도는씨네코씨스티스(Synechocystis)6-불포하효소(패널 A)와12-불포화효소 (패널 B)의 연역된 아미노산 서열의 수치법(hydropathy) 프로필 도시한 것이다. 추정적인 막 확산 영역을 실선으로 나타내었다. 소수성 지수는 19개 아미노산 잔기의 윈도우 크기에 대해 산출하였다 (Kyte 외, (1982) J. Molec. Biol.157).
제 2도는 야생형 (패널 A)와 트랜스제닉형(transgenic) (패널 B) 아나바에나 (Anabaena)의 기체 액체 크로마토그래피 프로필을 제공 한다.
제 3도는 중복 대역과 서브클론을 갖는 코스미드 cSy75, cSy13 및 cSy7 맵의 다이아그램이다. cSy75, cSy75-3.5 및 cSy7의 서브클론 기원을 사선을 그어 대각선으로 나타내었다. 불활성화된 제한효소 부위는 괄호안에 있다.
제 4도는 야생형 (패너 A) 및 트랜스제닉형 (패널 B) 담배의 기체 액체 크로마토그래피 프로필을 나타낸다.
리놀레산(18:2) (LA)은 효소6-불포화효소(6-desaturase)에 의해 감마 리놀레산(18:3) (GLA)로 전환된다. 이 효소, 또는 이것을 암호화하는 핵산이 LA-생산 세포내로 전달되면, GLA가 생산된다. 본 발명은6-불포화효소 유전자로 된 핵산을제공한다. 더욱 구체적으로는, 이 핵산은-불포화효소 유전자의 프로모터, 암호화 대역 및 종결 대역으로 이루어진다. 본 발명은 또한, 기능적 조합에 있어서6-불포화효소 암호화 대역 및 이질적인 조절 서열로 된 재조합 구축물에 대한 것이다. 본 발명의 핵산과 재조합 구축물은 트랜스제닉 생물에 있어서 GLA를 생산하는데 유용하다.
리놀레산(C18 9.12) 및 α-리놀레산(C18 9,12,15)은 척추동물이 합성할 수 없는 필수적인 섭취성분들이다. 척추동물이 이들을 합성하지 못하는 이유는 척추동물의 세포는 지방산의 9위치에 이중결합을 도입할 수는 있으나 지방산 사슬의 메틸-말단과 9이중결합 사이에 부가적인 이중결합을 도입할 수는 없기 때문이다. 이들은 다른 생성물의 전구체들이기 때문에 리놀레산과 α-리놀레산은 필수 지방산이며, 주로 식물원으로부터 수득된다. 리놀레산은 포유동물에 의해 γ-리놀레산(GLA,(C18 6,9,12)로 전환되며 이는 다시 대부분의 프로스타글란딘의 필수적인 전구체임으로 해서 매우 중요한 지방산인 아라키돈산(20:4)으로 전환될 수 있다.
리놀레산의 식이적 공급은 GLA 및 아라키돈산으로의 그의 결과적인 전환으로 인해, GLA 및 아라키돈산의 식이적 필요량을 충족한다. 그러나, 포화지방의 소비는 과콜레스테롤혈증, 아테롬성 동맥경화증 및 기타 화학적인 관상동맥 질환과 같은 위험한 상태와 어떤 관계가 있는 것으로 입증된 반면, 불포화지방의 소비는 혈중콜레스테롤 농도의 감소 및 아테롬성 동맥경화증 발병 위험 감소와 연관되어 왔다. GLA 섭취의 의료적인 잇점은 GLA가 아라키돈산의 전구체이고 따라서 프로스타글란딘 합성에도 기여한다는 것에 기인할 것이다. 따라서, 리놀레산보다 더욱 불포화된 GLA의 소비는 건강상 잠재적인 혜택 가능성을 갖는다. 그러나, GLA는 실제로 상업적으로 재배된 작물에는 존재하지 않는다.
리놀레산은 효소인6-불포화효소에 의해 GLA로 전환된다. 약 359개의 아미노산으로 된 효소인6-불포화효소는 막-결합 대역과 지방산의 불포화를 위한 활성 부위를 갖는다. 이 효소가 GLA가 아닌 리놀레산을 고유하게 생산하는 세포내로 전달되면, GLA가 생산된다. 본 발명은,6-불포화효소를 암호화하는 유전자를 제공함으로써, 기능적인6-불포화효소를 함유하고 GLA를 생산하는 트랜스제닉 생물을 생산하는 것을 가능케 한다. 대량의 GLA를 생산가능케 하는 것에 더하여, 본 발명은 GLA의 새로운 섭취 공급원을 제공한다.
본 발명은 분리된6-불포화효소 유전자에 관한다. 특히, 이 분리된 유전자는6-불포화효소 프로모터, 암호화 대역, 및 종결 대역으로 이루어진다.
본 발명은 또한6-불포화효소 프로모터, 암호화 대역 및 종결대역으로 이루어진 발현 벡터에도 관한 것이다.
본 발명은 또한6-불포화효소 암호화 대역과 이질적인 조절대역, 즉,6-불포화효소 유전자로부터 유도되지 않는 요소들과의 기능적인 조합으로 이루어진 발현 벡터에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 벡터를 함유하는 세포 및 생물, 그리고 이들 생물의 자손들 역시본 발명에 의해 제공된다.
본 발명은 또한 분리된 박테리아의6-불포화효소를 제공하며 또한 박테리아의6-불포화효소를 암호화하는 분리된 핵산에도 관한다.
본 발명은 또한 어떤 식물세포를 본 발명의 분리된 핵산으로 형질전환시켜 상기 식물세포로부터 GLA 함량이 증가된 식물을 재생산 하는 것으로 이루어지는 감마 리놀레산(GLA) 함량이 증가된 식물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따라 내한성(耐寒性) 식물의 제조방법도 제공된다.
본 발명은6-불포화효소를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다.6-불포화효소를 암호화하는 핵산을 동정하기 위해, GLA를 생산하는 생물로부터 DNA를 분리한다. 상기 생물은, 예컨대, 동물세포, 특정의 곰팡이(예컨대모르티에렐라 (Mortierella)), 특정의 박테리아 (예컨대,씨네코씨스티스 (Synechocystis)) 또는 특정의 식물 (예컨대, 유리지치, 달맞이꽃, 까치밥나무)일 수 있다. 게놈 DNA의 분리는 Sambrook 등 (1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cond Spring Harbor, NY)에 의해 예시되는 바와 같이 당업자에게 잘 알려진 여러가지 방법에 의해 달성될 수 있다. 분리된 DNA는 Sambrook 등의 방법(1989)에서 발견될 수 있는 공지의 물리적 방법이나 효소적 절단에 의해 단편화시켜 예컨대 박테리오파지 또는 코스미드 벡터와 같은 적절한 벡터내로 클로닝시킨다. 본 발명의 DNA를 함유하는 발현 벡터를 특별히 고찰한다.6-불포화효소를 암호화하는 DNA는 기능적 분석에 의해 동정할 수 있다. 분획화된 DNA를 함유하는 벡터는 예컨대, 감염, 트랜스콘쥬게이션, 트랜스펙션등의 수단에 의해, GLA가 아닌 리놀레산을 생산하는 숙주 생물에로 전달될 수 있다. 본문에서 "형질전환"이라 함은 일반적으로 숙주 세포내로 외래 DNA를 혼입시키는 것을 가리키는 것으로 한다. 제조합 DNA를 숙주 생물내로 도입하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있으며 예컨대 Sambrook등 (1989)의 문헌에서 찾아볼 수 있다. 이들 생물에 의한 GLA의 생산(즉, 기능획득)을 예컨대 가스 크로마토그래피나 기타 다른 공지 방법에 의해 분석한다. GLA를 생산하도록 유도되는, 즉 상기 벡터 도입에 의해 획득된 기능을 갖는 생물들은6-불포화효소를 암호화하는 DNA를 발현하는 것으로서 동정되며, 상기 DNA는 생물로부터 회수된다. 회수된 DNA는 다시 단편화되어, 발현 벡터로 클론될 수 있으며, 상기 방법에 의해 기능적으로 평가되어 한단계 높은 특정성으로6-불포화효소를 암호화하는 DNA를 정의할 수 있다.
본 발명의 일례로서, 시아노박테리아인씨네코씨스티스(Synechocystis)(Pasteur Culture Collection (PCC) 6803, American Type Culture Collection (ATCC) 27184)로부터 무작위적으로 DNA를 분리하여, 코스미드 벡터로 클론시킨 다음, 트랜스콘쥬게이션에 의해 GLA-결핍 시아노박테리아인아나바에나 (Anabaena)스트레인 PCC 7120(ATCC 27893) 내로 도입한다.아나바에나 (Anabaena)리놀레산으로부터의 GLA 생산을 가스 크로마토그래피에 의해 모니터하여 상응하는 DNA 분획을 분리한다.
분리된 DNA를 예컨대, Sambrook 등 (1989)와 같이 기술분야에 잘 알려진 방법으로 서열 분석한다.
본 발명에 따라,6-불포화효소 유전자로 된 DNA가 분리되었다. 더욱 구체적으로는, 시아노박테리아인씨네코씨스티스(Synechocystis)로부터6-불포화효소 유전자로 이루어진 3.588 킬로베이스 (kb) DNA가 분리되었다. 3.588kb DNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 SEQ ID NO; 1에 나타내었다. 잠재적인 암호화 대역을 정의하는 오픈 리딩 프레임은 뉴클레오타이드 317 내지 1507 및 뉴클레오타이드 2002 내지 3081에 존재한다.6-불포화효소를 암호화하는 역할을 하는 뉴클레오타이드를 정희하기 위해,6-불포화효소 활성을 부여하는 3,588kb 분획을 각각 단 한 개의 오픈 리딩 프레임을 함휴하는 두개의 서브 분획으로 절단하였다. ORF1 분획은 뉴클레오타이드 1 내지 1704를 함유하는 반면, ORF2 분획은 뉴클레오타이드 1705 내지 3588을 함유한다. 각 분획은 전방(F) 및 역방(R)의 두가지 방향에서 시아노박테리아의 카르복실라제 프로모터를 함유하는 짝 발현 벡터내로 서브클론된다 (AM542, Wolk 외, (1984)Proc, Natl, Acad, Sci, USA 81, 1561). 결과 적인 구축물(즉, ORF1 (F), OFR1(R), ORF2 (F) 및 ORF2(R))을 야생형아나바에나 (Anabaena)PCC 7129에 표준법 (예컨대, Wolk외, (1984)Proc, Natl, Acad, Sci, USA 81, 1561)에 의해 콘쥬게이션시킨다.아나바에나 (Anabaena)의 콘쥬게이션된 세포들은 녹색 콜로니로서 선별되며 선택적인 액체 배지(BG11N + with 15㎍/ml 네오마이신)에서 배양된다. 전방 및 역방 ORF1 및 ORF2 구조물을 함유하는 결과적인 트랜스콘 쥬게이트로부터 표준법 (예컨대, Dahmer외, (1989)Journal of American Oil Chemical Society 66, 543)에 의해 지질을 추출한다. 비교를 위해,아나바에나 (Anabaena)및씨테코씨스티스(Synechocystis)의 야생형 배양체로부터도 지질을 추출한다. 이 지방산 메틸 에스테르를 에컨대 수소 불꽃 이온화 검색기 및 모세관 컬럼이 구비된Tracor-560 기체 액체 크로마토그래피와 같은 기체 액체 크로마토그래피(GLCC)에 의해 분석한다. 이 GLC 결과를 다음 표 1에 나타내었다.
GLC 분석에 의해 평가되는 바와 같이, GLA 결핍아나바에나 (Anabaena)는 전방에서 ORF2를 함유하는 구축물이 트랜스콘쥬게이션에 의해 도입될 때 GLA 생산 기능을 획득한다. 카르복실라제 프로모터에 대해 역방으로 ORF2를 갖거나, 또는 어느 방향에서건 ORF1을 갖는 구조물은 GLA 생산을 나타내지 않았다. 이 분석은 1884 bp 단편중의 단일 오픈 리딩 프레임(ORF2)이6-불포화효소를 암호화함을 입증한다. 이 1884bp 단편을 SEQ ID NO:3으로서 나타낸다. 이것은 제 1 (A)도 및 (B)도에 각각 나타난 바와 같이6-불포화효소와12-불포화효소 사이의 수치법 프로필의 전체적인 유사성에 의해 구체화된다[Wada 외, (1990)Nature347].
6-불포화효소를 암호화하는 분리된 핵산은 상술한 기능 분석 또는 하이브리다이제이션 프로브로서Anabaena 6-불포화효소를 암호화 하는 분리된 핵산을 이용하는 핵산 하이브리다이제이션 기술에 의해 다른 GLA-생산 생물로부터 분리될 수 있다. 게놈법과 cDNA 클론법 두가지 모두 당업자에게 잘 알려져 있으며 본 발명에서 고려된다. 하이브리다이제이션 프로브는 전체 SEQ, ID NO:1로서 개시된 전체 DNA 서열, 또는 제한 분획이나 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 그의 다른 DNA 분획으로 이루어질 수 있다. 교차-하이브리다이제이션에 의한 동종 유전자의 클로닝 방법은 예컨대, Sambrook(1989) 및 Beltz등(1983)Methods in Enzymology 100, 266에서 찾아볼 수 있다.
6-불포화효소를 암호화하는 DNA의 도입에 의해 GLA 생산 기능을 획득한 트랜스제닉 생물은 또한 옥타데카테트라엔산(18:4 6,9,12,15) 생산 기능도 획득한다. 옥타데카테트라엔산은 보통 어류의 오일과Boraginaceae과에 속하는 몇몇 식물 종에 존재한다(Craig외, [1964]J. Amer. Oil Chem. Soc. 41,209-211; Gross 외 [1976]Can. J. Plant Sci. 56. 659-664). 본 발명의 트랜스제닉 생물에 있어서, 옥타데카테트라엔산은 부가적인15-불포화효소의 불포화나6-불포화효소에 의한 α-리놀레산의 불포화로부터 야기된다.
ORF2 즉,6-불포화효소를 암호화하는 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 359개의 아미노산을 SEQ, ID NO:2에 나타내었다. 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산을 암호화하는 다른 뉴클레오타이드 서열도 고려한다. 예컨대, 유전 암호의 축중으로부터 야기되는 이러한 서열을 동정하는 것은 당업자의 일반 지식에 속한다. 또한, 당업자라면 상기 기능 분석의 획득에 의해,6-불포화효소를 암호화하는 ORF2를 함유하는 1884 bp 단편의 더 작은 서브 단편을 결정할 수 있다.
본 발명은6-불포화효소의 이러한 모든 폴리펩티드 단편 및 LA를 GLA로 전환시키는 활성을 보유하는 핵산에도 관한다.
본 발명의 또 다른 측면에서는, 1884 bp 단편, 또는6-불포화효소 유전자의 프로모터, 암호화 서열 및 종결 대역을 함유하는 더 작은 단편을 함유하는 벡터를6-불포화효소 프로모터와 종결 대역이 기능적인, 예컨대, 시아노박테리아와 같은 생물내로 전달한다. 따라서 재조합6-불포화효소를 생산하는 생물들이 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면은 표준 단백질 정제법에 의해 재조합 생물로부터 정제될 수 있는, 분리된6-불포화효소를 제공한다 (예컨대, Ausubel 외, [1987]Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates, New York).
6-불포화효소를 암호화하는 DNA를 함유하는 벡터들 역시 본 발명에 의해 제공된다. 당업자들은 여러가지 생물에서6-불포화효소 암호화 서열을 발현시키기 위해 적절한 벡터를 구축할 수 있음을 익히 알 것이다. 복제가능한 발현 벡터들이 특히 바람직하다. 본문에 설명된 바와 같은 복제가능한 발현 벡터들은 소망되는 유전자, 즉,6-불포화효소 유전자의 조절적인 발현을 위해 조작된 DNA 또는 RNA 분자들이다. 바람직하게는, 벡터들이 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드 또는 바이러스인 것이 좋다. 예컨대, Wolk등 (1984,Proc. Natl, Acad, Sci, USA,1561-1565) 및 Bustos 등 (1991J. Bacteriol. 174,7525-7533)에 의해 설명된 셔틀 벡터들도 본 발명에서 고려된다. Sambrook 외, (1989), Geoddel, 편. (1990)Methods in Enzymology 185Academic Press, 및 Perbal (1988)A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons, Inc. 은 본 발명의6-불포화효소가 삽입되어 발현될 수 있는 벡터들에 관한 상세한 고찰을 제시한다. 이러한 벡터들은 또한6-불포화효소를 암호화하는 핵산을 발현시킬 수 있는 핵산 서열도 함유한다. 어떤 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 서열 요소에는 프로모터, 인핸서 요소, 상류(upstream) 활성화 서열, 전사 종결 시그날 및 폴리아데닐화 부위가 포함된다. 구성 프로모터 및 조적 특이적 프로모터 두가지 모두 고려된다. 식물 세포의 형질전환을 위해서는, 꽃양배추의 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로보터와 식물 종자가 성숙되는 동안 조절되는 프로모터가 특히 흥미롭다. 이러한 모든 프로모터 및 전사 조절 요소들은 단독으로 또는 조합하여, 본 발명의 복제가능한 발현 벡터에서 이용될 수 있으며 기술분야에 잘 알려진 것이다. CaMV 35S 프로모터는 예컨대, Restrepo등에 의해 설명되어 있다 (1990,Plant Cell 2, 987). 유전적으로 조작 및 변이처리된 조절 서열도 고려된다.
본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들은 특정 숙주 세포에서의 발현에 적합한 벡터 및 조절적 요소들을 결정할 수 있을 것이다. 예컨대,씨네코씨스티스 (Synechocystis)로부터의 종결대역과6-불포화효소의 암호화 대역에 작동적으로 결합된아나바에나 (Anabaena)의 카르복실라제를 암호화하는 유전로부터의 프로모터를 함유하는 벡터가 시아노박테리아에서의6-불포화효소의 발현에 적합하다. 본문에서 "작동적으로 결합된(operably linked)"란 용어는 프로모터와 터미네이터 서열이 효과적으로 기능하여 전사를 조절함을 의미한다. 또 다른 예로서, 트랜스제닉 식물에서6-불포화효소의 발현에 적합한 벡터는6-불포화효소암호화 대역에 작동적으로 결합되고 또한 종자 종결신호 또는 노팔린 합성 종결 신호에 추가적으로 결합된 헬리안티닌, 나핀, 또는 글리신으로부터 유도된 종자-특이적 프로모터를 함유할 수 있다.
특히, 계류 중인 본 발명자들의 다른 미국 특허출원 제 682,354호 (1991. 4.8.출원)에 개시되고 본 발명에 참고 삽입된 헬리안티닌 조절 요소들은 본 발명의6-불포화효소 발현을 위한 프로모터 요소들로서 고려된다.
본문에서 고려된 기능들을 보유하는 본문에 개시된 뉴클레오타이드 서열 또는 조절 요소들의 변형 역시 본 발명의 범위에 속한다. 이러한 변형에는, 삽입, 치환 및 결실, 그리고 유전 암호의 축중을 반영하는 특이적인 치환이 포함된다.
이러한 하이브리드 벡터들의 구축을 위한 표준 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 Sambrook등 (1989), 또는 널리 이용가능한 재조합 DNA 기술 상의 수많은 실험적 매뉴얼에서 찾아 볼 수 있다. 다양한 전략들이 DNA의 단편을 접합시키는데 이용될 수 있으며, 이들의 선택은 DNA 단편의 말단 특성에 좌우된다. 본 발명에 따라, 하이브리드 벡터에 예컨대, 시그날 펩티드를 암호화하는 서열, 소포체에서 단백질을 체류시키는데 요구되는, KDEL을 암호화하는 서열 또는 엽록체에6-불포화효소를 지향시키는 변이 펩티드를 암호화하는 서열과 같이, 클로닝, 발현 또는 가공을 용이하게 하는 다른 뉴클레오티드 서열 요소들을 포함시키는 것도 고려된다. 이러한 서열들은 당업자에게 공지이다. 예컨대, Van den Broeck 외, (1985)Nature 313, 358에 최적화된 변이 펩티드가 설명되어 있다. 원핵 및 진핵 시그날 서열이 예컨대, Michaelis 외, (1982)Ann,Rev,Microbiol. 36, 425에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의6-불포화효소를 암호화 하는 DNA를 함유하는 시아노박테리아 외의 생물을 제공한다. 본 발명에 따라 고려되는 트랜스제닉 생물에는 박테리아, 시아노박테리아, 곰팡이 및 식물 그리고 동물이 포함된다. 본 발명의 분리된 DNA는 예컨대, 감염, 트랜스펙션, 형질전환 또는 트랜스콘쥬게이션과 같은 공지 기술에 의해 숙주 내로 도입될 수 있다. 이러한 생물들에 본 발명의 DNA를 전달하는 기술은 널리 알려져 있으며 Sambrook등 (1989)과 같은 문헌에서 찾아볼 수 있다.
다양한 식물 형질전환법이 알려져 있다.6-불포화효소 유전자는 Horsch 외, (1985)Science 227, 1229에 설명된 바와 같은 리프 디스크(leaf disk) 형질전환-재생법에 의해 식물 내로 도입될 수 있다. 원형질 배양(Horsch 외, (1984)Science 223, 496; DeBlock 외 (1984)EMBO J. 2, 2143; Bardon 외, (1983)Cell 32, 1033)과 같은 다른 형질전환 방법들 역시 사용될 수 있으며 본 발명의 범위에 든다. 바람직한 구체 식물은아그로박테리움 (Agrobacterium)-유래 벡터로 형질전환된다. 그러나, 본 발명의6-불포화효소 유전자를 식물 세포 내에 삽입하기 위해 다른 방법들도 이용할 수 있다. 이러한 대안책에는 바이오리스틱적인 접근(Klein 외, (1987)Nature 327, 70), 전기영동, 화학적으로-유도된 DNA 업테이크, 및 벡터로서 폴렌 또는 바이러스를 사용하는 것 들을 들 수 있다.
형질전환법에 필요한 경우, 본 발명의6-불포화효소 유전자를 예컨대,Bevan (1984)Nucleic Acide Res. 12,811에 설명된 이중 벡터와 같은 식물 형질전환 벡터에 삽입할 수 있다. 식물 형질전환 벡터는아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 천연적인 유전자 전달시스템을 변형시킴으로써 유도될 수 있다. 이 천연 시스템은 형질전환된 식물로 전달되는, T-DAN라 알려진, 하나의 커다란 분절을 함유하는 큰 Ti (종양-유도성)-플라스미드로 이루어진다. Ti 플라스미드의 또 다른 분절인vir대역은 T-DNA 전달에 책임이 있다. T-DNA 대역은 말단 반복에 의해 경계가 그어진다. 변형된 이원(binary) 벡터에서 종양-유도 유전자는 결실되고,vir대역의 기능은 T-DNA 경계 서열에 의해 경계된 외래 DNA를 옮기는데 이용된다. T-대역은 또한 항생제 저항에 대한 선별적인 마커 및 전달을 위한 서열을 삽입하기 위해 복수개의 클로닝 부위도 함유한다. 이러한 조작된 스트레인들은 "무장해제된 (disarmed)"A.tumefaciens스트레인들로 알려져있으며, 식물들의 핵 게놈에 T-대역에 의해 경계가 그러진 서열의 효과적인 형질전환을 가능케 한다.
표면-멸균된 리프 디스크들을 2일간 배양된A.tumefaciens를 함유하는 "무장해제된" 외래 DNA와 함께 접종시킨 다음, 항생제-함유 배지로 옮긴다. 적절한 항생제를 함유하는 배지에서 뿌리내린 후 형질 전환된 슛들을 선별하여, 토양으로 옮긴다음 재생산한다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 분리된 DNA를 함유하는 트랜스제닉 식물 또는 이들 식물의 자손을 제공한다. 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물의 두가지 모두 고려될 수 있다. 상술한 식물 형질 전환법에 의해 식물세포들을6-불포화효소를 암호화하는 분리된 DNA로 형질전환시킨다. 형질전환된 식물세포들은 보통 유합 조직 (callus) 배양체 또는 리프 디스크에서 공지방법 (예컨대 Horsch외, (1985)Science 227, 1129)에 의해 완전한 트랜스제닉 식물 내로 재생된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 식물은 해바라기, 유지종자 평지, 옥수수, 담배, 땅콩 또는 대두이다. 형질전환된 식물의 자손들은6-불포화효소를 암호화하는 DNA를 계승하므로, 형질전환된 실물로부터의 종자나 접지들을 이용하여 트랜스제닉 식물 계보를 유지할 수 있다.
본 발명은 또한 GLA 함량이 증가된 트랜스제닉 식물의 제조방법을 제공한다. 이 방법은 LA는 함유하나 GLA는 결여되거나 낮은 농도로 GLA를 함유하는 식물 세포에6-불포화효소를 암호화하는 DNA를 도입시킨 다음, 트랜스제닉 세포로부터 GLS 함량이 증가된 식물을 재생산하는 것으로 이루어진다. 특히, 해바라기, 대두, 유지종자 평지, 옥수수, 땅콩 및 담배와 같이 상업적으로 재배되는 식물들이 트랜스제닉 생물로서 고려된다.
본 발명은 또한 GLA를 함유하는 트랜스제닉 생물의 제공방법을 제공한다. 이 방법은 LA는 함유하나 GLA는 결여하거나, 함유한다 해도 낮은 농도로 함유하는 생물에게6-불포화효소를 암호화하는 DNA를 도입시키는 것으로 된다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 GLA와 LA가 모두 결여된 생물에12-불포화효소 및6-불포화효소를 암호화하는 DNA로 된 하나 이상의 발현 벡터를 도입하는 것으로 된다. 따라서, LA와 GLA 모두가 결여된 생물체를12-불포화효소를 발현시킴으로써 LA를 생산하도록 유도한 다음6-불포화효소를 발현시킴으로써 GLA를 생산한다.12-불포화효소, 또는12-불포화효소 및6-불포화효소를 암호화하는 DNA로 발현 벡터들은 당업자에게 잘 알려진 재조합 기술 방법 (Sambrook외, 1989) 및12-불포화효소의 공개된 배열(Wadad 외, [1990]Nature (London) 347, 299-203)에 의해 구축할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라, SEQ. ID NO:1의 뉴클레오타이드 2002-3081이 시아노박테리아의12-불포화효소를 암호화함이 발견되었다. 따라서, 이 서열은 주제의 발현 벡터를 구축하는데 이용될 수 있다. 특히, 해바라기, 대두, 유지종자 평지, 옥수수, 땅콩 및 담배와 같은(그러나 이에 한정되지 않음) 상업적으로 재배되는 작물을 고려할 수 있다.
본 발명은 또한 식물에 있어서 내한성(耐寒性)을 유도하는 방법에 관한 것이기도 하다. 냉해 민감성은 세포막에 있어서 지질의 막전이에 기인하는 것일 것이다. 막 전이 온도는 막 지질 중의 지방산의 불포화도에 좌우되므로, 예컨대,6-불포화효소를 도입하여 LA를 GLA로 전환시킴으로써, 불포화도를 증가시키면 내한성을 향상 또는 유도할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 어떤 식물세포에6-불포화효소를 암호화하는 DNA를 도입하여, 상기 형질전환된 식물세포로부터 내한성이 향상된 식물을 재생산하는 것으로 된다. 바람직한 구체예에서, 이런 식물은 해바라기, 대두, 종자유, 평지, 옥수수, 땅콩 또는 담배 식물인 것이 좋다.
다음 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위한 것이다.
실시예 1
스트레인 및 배양 조건
씨네코씨스티스 (Synechocystis)(PCC 6803, ATCC 27184),아나바에나(Anabaena)(PCC 7120, ATCC 27893) 및씨네코코커스 (Synechococcus)(PCC 7942, ATCC 33912)를 백열전구 조명하에서 BG11B+ 배지 (Rippka외, (1979)J. Gen. Microbiol. 111, 1-61)에서 30℃에서, 광독립영양적으로 배양시켰다. 코스미드와 플라스미드를 선정하여 Maniatis 외 (1982)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York에 설명된 대로 표준 농도의 항생제가 보강된 LB 배지 상에서 대장균 스트레인 DH5α에서 증식시켰다.
실시예 2
씨네코씨스티스 (Synechocystis)코스미드 게놈 라이브러리의 구축
씨네코씨스티스 (Synechocystis)(PCC 6803)으로부터의 총 게놈 DNA를Sau3A로 부분 절단하고 수크로스 구배상에서 분획화하였다 (Ausubel 외, [1987]Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). 30 내지 40kb DNA 단편들을 함유하는 분획들을 선별하여 코스미드 벡터인 pDUCA7의 탈포스포릴화된BamHI 부위에 접합시켰다 (Buikema외, [1991]J. Bacteriaol, 173, 1879-1885). Ausubel등 (1987)에 따라, 접합된 DNA를 생체외 패키지시키고, Buikema 등(1991)이 설명한 바에 따라,AvaI 및Eco4711 메틸레이즈 헬퍼 플라스미드, pRL528을 함유하는 대장균 DH5α에서 상기 패키지된 상을 증식시켰다. 총 1152 콜로니들을 무작위적으로 분리하여 개별적으로 12개의 96 웰-마이크로타이터 판에서 유지시켰다.
실시예 3
아나바에나 (Anabaena)에서의 GLA의 획득-기능 발현
아나바에나(Anabaena)는 GLA는 함유하지 않으나, GLA의 전구체인 리놀레산은 상당히 많은 양으로 함유하는 사상(絲狀) 시아노박테리아이다 (제2도;표2). 실시예 2에 설명된씨네코씨스티스 (Synechocystis)코스미드 라이브러리를아나바에나 (Anabaena)에 콘쥬게이션시켜 GLA를 생산하는 트랜스콘쥬건트(transconjugants)를 동정하였다.아나바에나 (Anabaena)세포들을 BG11N+ 액상 배지에서 대수기 중간까지 생육시킨 다음 동 배지에서 최종 농도 약 2 X 108세포/ml가 되도록 재현탁시켰다. 암피실린을 함유하는 LB에서 생육된 대장균 RP4의 대수기 중간까지의 배양체(Burkzrdt외, [1979]J. Gen. Microbiol. 114,341-348)를 세정하여 신선한 LB 배지에 재현탁시켰다. 다음,아나바에나 (Anabaena)와 RP4를 혼합하여 56% LB를 함유하는 BG11B+ 플레이트위에 골고루 산포하였다. 이 코스미드 게놈 라이브러리를 50㎍/ml의 카나마이신과 17.5 ㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 LB 플레이트위에 레플리카 플레이팅시킨 다음아나바에나 (Anabaena)와 RP4를 함유하는 BG11N+ 플레이트위에 팻취시켰다. 30℃에서 24시간 인큐베이션시킨 후, 30 ㎍/ml의 네오마이신을 언더레이시키고; 트랜스콘쥬건트가 나타날때까지 30℃에서 계속 인큐베이션시켰다.
각각의 트랜스콘쥬건트들을 콘쥬게이션 후 분리하고 15 ㎍/ml 네오마이신을 함유한 BG11N+ 액상 배지 2ml 중에서 배양시켰다. 다음과 같이 10개의 트랜스콘쥬건트의 풀(pool)을 함유하는 배양체와 양생형 배양체로부터 지방산 메틸 에스테르를 제조하였다. 야생형 배양체 및 트랜스제닉 시아노박테이라 배양체는 원심분리및 증류수로 2회 세척함으로써 수확하였다. Dahmer외 (1989)J. Amer. Oil, Soc. 66, 543-548에 설명된 바와 같이 이들 배양체로부터 지방산 메틸 에스테르를 추출하고 모세관 컬럼(30m x 0.25mm 결합된 FSOT Superox II, Alltech Associates Inc., IL)과 수소 불꽃 이온화 검색기가 구비된 Tracor-560을 이용하여 기체 액체 크로마토그래피 (GLC)에 의해 분석하였다. 표준물질 (Sigma Chemical Co.로부터 구입)의 체류시간 및 크로마토그래피를 이용하여 지방산을 동정하였다. 정상화된 C18 지방산 각각의 피크면적 대 내부 표준치의 비율로서 평균 지방산 조성을 측정하였따.
제 2도에 대표적인 GLC 프로필을 나타내었다. C18 지방산 메틸 에스테르를 나타내었다. 지방산 메틸 에스테르의 공지 표준치와 체류시간을 비교함으로써 피크들을 동정하고 기체 크로마토그래피-질량 분광계로 확인하였다. 패널 A는 야생형아나바에나 (Anabaena)의 지방산의 GLC 분석결과를 도시한 것이다. 화살표는 GLA의 전달시간을 가리킨다. 패널 B는 pAM542+1.8F를 함유하는아나바에나 (Anabaena)의 트랜스콘쥬건트의 지방산의 GLC 프로필이다. 2가지 GLA 생산 풀(250 트랜스콘쥬컨트를 대표하는 25 풀)은 GLA를 생산하는 것으로 동정되었다. 각 GLA 양성 풀의 개별적인 트랜스콘쥬건트를 GLA 생산에 대해 분석하였다; GLA를 상당한 농도로 발현하고 코스미드 cSy13 및 cSy75를 각각 함유하는 트랜스콘쥬건트들인, AS13 및 AS75가, 각 풀로부터 하나씩 동정되었다(제3도). 이 코스미드들은 길이 약 7.5kb 대역에서 중복된다. cSy75의 3.5kbNheI 단편을 벡터 pDUCA7에 재 클론시켜아나바에나 (Anabaena)로 도입시켜 GLA 발현 기능을 획득하게 하였다 (표 2).
서열 분석을 위해 cSy75-3.5의 3.5kb Nhe I 단편의 두가지NheI/HindIII 서브단편 (1.8 및 1.7kb)을 "pBLUESCRIPT" (Stratagene) (제 3 도)에 서브클론시켰다. 표준 분자 생물학기술을 Maniatis외 (1982) 및 Ausubel등(1987)이 설명한 바에 따라 수행하였다.
Advanced DNA Technologies Laboratory (Bioloby Department, Texas A & M University)가 합성한 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용함으로써 양쪽 스트랜드 모두에서 "SEQUENASE"(United States Biochemical)를 이용하여 pBS1.8의 디데옥시 서열분석을 행하였다(Sanger외 [1977]Proc, Nat1, Acad, Sci, USA 74, 5463-5467). DNA 서열분석은 Devereux 외 (1984)Nucleic Acids Res. 12, 387-395에 설명된 바와 같이 GCC (Madison, WI) 소프트웨어를 이용하여 행하였다.
NheI/HindIII 서브단편들을 시아노박테리아의 카르복실라제 프로모터에 대해 전방 및 역방 모두에서 콘쥬걸 발현 벡터인 AM542 내로 옮겨 콘쥬게이션에 의해아나바에나 (Anabaena)에 도입시켰다. 전방에서 1.8kb 단편을 함유하는 트랜스콘쥬게이트 (AM542-1.8F)는 상당히 많은 양의 GLA와 옥타에카테트라엔산을 생산하였다 (제 2도; 표 2). 역방 1.8kb 단편이나 전방 및 역방 1.7kb 단편등 다른 구축물을 함유하는 트랜스콘쥬건트들은 GLA를 검색가능한 양으로 생산하지 않았다(표 2).
제 2도는 야생형아나바에나 (Anabaena)로부터의 추출물의 C18 지방산 프로필과 (제 2A도)전방에서 cSy75-3.5 1.8kb 단편을 함유하는 트랜스제닉아나바에나 (Anabaena)로부터의 추출물의 C18 지방산 프로필 (제 2B도)를 비교하는 것이다. AM542-1.8F 로부터의 지방산 메틸에스테르의 GLX 분석 결과 믿을만한 GLA 스탠다드의 그것과 동일한 체류시간 피크를 나타내었다. 가스 크로마토그래피-질량 분광계(GC-MS)에 의한 이 피크 분석은 이것이 GLA 레퍼런스 샘플의 것과 동일한 질량 프래그멘테이션을 갖는다는 것을 확인해 주었다. 다포화된 지방산을 변경된 농도로 갖는 트랜스제닉아나바에나 (Anabaena)는 생장률 및 형태학이 야생형의 그것들과 유사하였다.
실시예 4
6& 12불포화효소 유전자를 함유하는 씨네코코커스(Synechococcus) 의 형질전환
12-불포화효소 유전자를 함유하는 세 번째 코스미드, cSy7는 공지재된씨네코씨스티스 (Synechocystis) 12-불포화효소 유전자 서열로부터 합성된 올리고뉴클레오타이드씨네코씨스티스 (Synechocystis)게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리하였다 (Wada외, [1990]Nature (London) 347, 200-203).12-불포화효소 유전자를 함유하는 이 코스미드로부터의 1.7kbAvaI 단편이 동정되었으며 이를 프로브로 사용하여 cSy13이6-불포화효소 유전자뿐만 아니라12-불포화효소 유전자도 함유함을 입증하였다(제 3도). 게놈의 Southern 블롯 분석 결과6 및12-불포화효소 유전자 모두가씨네코씨스티스 (Synechocystis)게놈에 특이적인 것이므로 C18 지방산 불포화에 관련된 두가지 기능의 유전자 모두가씨네코씨스티스 (Synechocystis)게놈과 밀접한 관련이 있음을 보여주었다.
단세포 시아노박테리아인씨네코씨스티스(SYnechocystis)(PCC7942)는 리놀레산도, GLA (3)도 함유하지 않는다.6- 및12-불포화효소 유전자들을 개별적으로, 그리고 외래 DNA를씨네코씨스티스 (SYnechocystis)(Golden 외 [1987]Methods in Enzymol, 153, 215-231)의 게놈 내로 삽입시키는데 필요한 서열들을 함유하는 셔틀 벡터인 pAM854 (Bustos외 [1991]J.Bacteriol. 174, 7525-7533)와 함께 클로닝시켰다.씨네코씨스티스 (Synechocystis)를 이들 유전자 구축물을 이용하여 형질전환시키고 콜로니들을 선별하였다. 트랜스제닉씨네코씨스티스 (SYnechocystis)로부터 지방산 메틸 에스테르를 추출하고 GLC에 의해 분석하였다.
표2는 야생형씨네코씨스티스(SYnechocystis)의 주요 지방산이 스테아르산 (18:0)과 올레산 (18:1)임을 보여준다.씨네코씨스티스(Synechocystis)를 이들 주요 지방산에 더해 리놀레산(18:2)를 발현하는 pAM854-12로 형질전환시켰다. pAM854-6 및12로 형질전환된 트랜스포먼트들은 리놀리에이트와 GLA를 모두 생산하였다(표1). 이 결과들은12-와6-불포화효소 유전자를 모두 함유하는씨네코씨스티스 (Synechocystis)가 C18 지방산의12-위치에 제2의 이중결합을,6-위치에 제 3의 이중결합을 도입할 수 있는 능력을 획득하였음을 가리키는 것이다. 그러나, pAM854-6을 함유하는 트랜스포먼트에서는 지방산 조성물중 어떠한 변화도 관찰되지 않았는데, 이는12-불포화효소에 의해 합성된 기질이 존재하지 않으면,6-불포화효소가 불활성적임을 가리키는 것이다. 이 실험은 나아가, 1.8 kbNheI/HindIII 단편 (제3도)이씨네코씨스티스 (Synechocystis) 6-불포화효소의 암호화 대역과 프로모터 대역을 모두 함유함을 확인해준다. 다포화된 지방산을 변경된 농도로 함유하는 트랜스제닉씨네코씨스티스 (Synechocystis)는 생육 속도와 형태학이 야생형의 경우와 유사하였다.
실시예 5
6-불포화효소의 뉴클레오타이드 서열
기능적인6-불포화효소 유전자를 포함하는 cSy75-3.5의 1.8kb 단편의 뉴클레오타이드 서열을 측정하였다. 359개 아미노산의 폴리펩티드를 암호화하는 오픈리딩 프레임이 동정되었다(SEQ ID NO: 3).Kyte-Doolittle 수치법 분석(Kyte 외, [1982]J. Mo1. Biol. 157, 105-132)에 의해 막투과대역(제 1A도)를 나타낼 수 있는 소수성 아미노산의 두가지 대역이 동정되었다; 또한6-불포화효소의 수치법적 프로필은12-불포화효소 유전자와 유사하고 (제1B도; Wada 외)9-불포화효소와도 유사하다 (Thiede 외. [1986]J. Biol. Chem. 261, 13230-13235). 그러나,씨네코씨스티스 (Synechocystis)의6- 및12-불포화효소 간의 서열 유사성은 뉴클레오타이드 수준에서 40% 미만이며 아미노산 수준에서 약 18%이다.
실시예 6
시아노박테리아의6-불포화효소의 담배로의 전달
시아노박테리아의6-불포화효소 유전자를 식물 발현 벡터내로 이동시키고아그로벡테리움 (Agrobacterium)매개된 유전자 전달 기술을 이용하여 담배로 전달하였다. 전달된 불포화효소가 잎사귀 및 발아중인 종자에서 적절히 발현되도록 하고 불포화효소 유전자 산물이 소포체나 엽록소로 표적화되도록 하기 위해,씨네코씨스티스 (Synechocystis)의-불포화효소 오픈 리딩 프레임(ORF)를 함유하는 여러 가지 발현 카세트들을 구축하였다. 이들 카세트의 성분에는: (i) 각각 모든 식물조직 또는 발아중인 종자에서 6-불포화효소 유전자 발현을 유도하기 위한 해바라기 헬리안티닌 유전자 유래의 35S 프로모터 또는 종자 특이적인 프로모터, (ii) 새로이 합성된 6-불포화효소를 ER에 표적화하기 위한 홍당무 익스텐젼 유전자 또는 해바라기 헬리안티닌 유전자로부터의 추정적인 시그날 펩티드, (iii) 6-불포화효소OFR의 COOH-말단에서의 ER 내강 체류 시그날 서열 (KDEL) 및 (iv) 6-불포화효소를 엽록체 내로 표적화시키기 위한 최적 변이 펩티드가 포함된다. 35S 프로모터는 Restrepo등에 의해 설명된 pRTL2의 유도체이다. 최적 변이 펩티드 서열은 Van de Broeck 등 (1985)에 의해 설명된다. 홍당무 익스텐젼 시그날 펩티드는 Chen 등 (1985)EMBO J. 9, 2145에 설명되어 있다.
CaMV 35S 프로모터에 의해 구동된 익스텐젼 시그날 펩티드와 소포체 체류 서열 (KDEL)에 융합된씨네코씨스티스 (Synechocystis) 6-불포화효소로 유전자로 이루어진, 키메릭 시아노박테리아 불포화효소 유전자를 함유하는 트랜스제닉 담배 식물이 생산되었다. 트랜스제닉 담배 게놈 DNA의 PCR 증폭 결과 6-불포화효소 유전자가 담배 게놈에 혼입된 것으로 나타났다. 이들 트랜스제닉 담배 식물들의 잎사귀의 지방산 메틸 에스테르를 추출하여 기체 액체 크로마토그래피 (GLC)에 의해 분석하였다. 이들 트랜스제닉 담배는 상당히 많은 양의 GLA를 축적하였다 (제4도). 제 4도는 GLC에 의해 측정된 지방산 메틸 에스테르를 보여준다. 지방산 메틸 에스테르의 공지 표준치와 추출시간을 비교함으로써 피크를 동정하였다. 따라서, 지방산 대사에 관련된 시아노박테리아의 유전자들을 이용함으로써 변형된 지방산 조성을 갖는 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있다.
Claims (21)
- 시아노박테리아의6-불포화효소를 암호화하는 분리된 핵산.
- 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:3의 뉴클레오타이드로 된 핵산.
- 제 1항의 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열을 암호화는 분리된 핵산.
- 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 벡터에 함유되어 있는 분리된 핵산.
- 제 4 항에 있어서, 상기 핵산의 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 프로모터 및/또는 종결 시그날에 작동적으로 결합된 분리된 핵산.
- 제 5 항에 있어서, 상기 프로모터가6-불포화효소 프로모터, 아나바에나(Anabaena) 카르복실라제 프로모터, 헬리안티닌 프로모터, 글리신 프로모터, 나핀프로모터, 또는 헬리안티닌 조직-특이적 프로모터인 분리된 핵산.
- 제 5 항에 있어서, 상기 종결 시그날이 씨네코씨스티스 (Synechocystis) 종결 시그날, 노팔린 합성 종결 시그날, 또는 종자 종결 시그날인 분리된 핵산.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 핵산이 트랜스제닉식물세포또는 박테리아에 함유된 분리된 핵산.
- 제 8항의트랜스제닉 식물세포로부터 재생된 식물 또는 상기 식물의 자손.
- 제 9항에 있어서, 상기 식물이 해바라기, 대두, 옥수수, 담배, 땅콩 또는 유지종자 평지 식물인 식물.
- (a) 제 1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따른 분리된 핵산으로 식물세포를 형질전환시키고;(b) 상기 식물세포로부터 감마 리놀fp산 (GLA) 함량이 증가된 식물을 재생산시키는 단계로 이루어지는, 감마 리놀레산 (GLA) 함량이 증가된 식물의 제조방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 식물이 해바라기, 대두, 옥수수, 담배, 땅콩 또는 유지종자 평지식물인 제조방법.
- 감마 리놀레산 (GLA)결핍되어 있거나 이를 결여한 식물 또는 박테리아를 제 1항 내지 7항중 어느 한항에 따른 분리된 핵산으로 형질전환시키는 것으로 이루어지는, GLA가 결핍되어 있거나 이를 결여한 식물 또는 박테리아에 있어서 감마 리놀레산 (GLA) 생산을 유도하는 방법.
- 감마 리놀레산 (GLA) 및 리놀레산 (LA)이 결핍되어 있거나 이들이 결여된 식물 또는 박테리아를 박테리아의 △6-불포화효소를 암호화하는 분리된 핵산 및 △12-불포화효소를 암호화하는 분리된 핵산으로 형질전환시키는 것으로 이루어지는, 감마 리놀레산 (GLA) 및 리놀레산 (LA)이 결핍되어 있거나 이들이 결여된 식물 또는 박테리아에 있어서 감마 리놀레산 (GLA) 생산을 유도하는 방법.
- 감마 리놀레산 (GLA) 및 리놀레산 (LA)이 결핍되어 있거나 이들이 결여된 식물 또는 박테리아를 박테리아의 △6-불포화효소를 암호화하는 분리된 핵산 및 △12-불포화효소를 암호화하는 분리된 핵산을 함유하는 1가지 이상의 발현백터로 형질전환시키는 것으로 이루어지는, 감마 리놀레산 (GLA) 및 리놀레산 (GA)이 결핍되어 있거나 이들이 결여된 식물 또는 박테리아에 있어서 감마 리놀레산 (GLA) 생산을 유도하는 방법.
- 제 14항 또는 15항에 있어서, △6-불포화효소를 암호화하는 상기 분리된 핵산이 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 317 내지 1507로 이루어진 방법.
- 감마 리놀레산이 결핍되어 있거나 이를 결여한 식물 또는 박테리아를 제 1 항 내지 7항중 어느 한항에 따른 분리된 핵산으로 형질전환시키는 것으로 이루어지는, 감마 리놀레산이 결핍되어 있거나 이를 결여한 식물 또는 박테리아에 었어서 옥타데카테트라엔산의 생산을 유도하는 방법.
- (a) 제 1항 내지 7항중 어느 한항에 따른 분리된 핵산으로식물세포를 형질전환시킨 다음;(b) 상기 형질전환된 식물세포로부터 내한성(耐寒性)이 향상된 식물을 재생산하는 것으로 이루어지는, 내한성이 향상된 식물을 생산하기 위해 제 1항 내지 7항중 어느 한항에 따른 분리된 핵산을 이용하는 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 식물이 해바라기, 대두, 옥수수, 담배, 땅콩 또는 유지종자 평지 식물인 방법.
- 분리된 시아노박테리아의 △6-불포화효소.
- 제 20항에 있어서, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 시아노박테리아의 △6-불포화효소.
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