RU2248397C2 - Гены десатураз и их применение - Google Patents
Гены десатураз и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2248397C2 RU2248397C2 RU2000113073/13A RU2000113073A RU2248397C2 RU 2248397 C2 RU2248397 C2 RU 2248397C2 RU 2000113073/13 A RU2000113073/13 A RU 2000113073/13A RU 2000113073 A RU2000113073 A RU 2000113073A RU 2248397 C2 RU2248397 C2 RU 2248397C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- polypeptide according
- desaturase
- nucleic acid
- gla
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 52
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 38
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 102
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 100
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 97
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 102100025287 Cytochrome b Human genes 0.000 claims description 20
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 claims description 20
- 240000004355 Borago officinalis Species 0.000 claims description 18
- 235000007689 Borago officinalis Nutrition 0.000 claims description 17
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 12
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 12
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 12
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 12
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 claims description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 8
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims description 7
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 claims description 6
- LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N (2E,4E,6E,8E)-octadeca-2,4,6,8-tetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O LGHXTTIAZFVCCU-SSVNFBSYSA-N 0.000 claims description 5
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000219925 Oenothera Species 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 5
- 235000004496 Oenothera biennis Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000002066 eicosanoids Chemical class 0.000 claims description 4
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 claims description 3
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 3
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 claims description 3
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 3
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 claims description 3
- 206010006298 Breast pain Diseases 0.000 claims description 3
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 claims description 3
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 claims description 3
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 3
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 claims description 3
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000127993 Elaeis melanococca Species 0.000 claims description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 claims description 3
- 208000006662 Mastodynia Diseases 0.000 claims description 3
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 claims description 3
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 claims description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 3
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 3
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 claims description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 206010000496 acne Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 2
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 claims 2
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 claims 2
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 claims 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 claims 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 21
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 6
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 5
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 description 5
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229940049918 linoleate Drugs 0.000 description 4
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- -1 respectively) Proteins 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 101150085703 vir gene Proteins 0.000 description 3
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 2
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 2
- 101150113476 OLE1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 2
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 101100188627 Zea mays OLE16 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000722877 Borago Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101000824316 Caenorhabditis elegans Omega-3 fatty acid desaturase fat-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091027551 Cointegrate Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101150115493 FAD3 gene Proteins 0.000 description 1
- OPGOLNDOMSBSCW-CLNHMMGSSA-N Fursultiamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CCOC1CSSC(\CCO)=C(/C)N(C=O)CC1=CN=C(C)N=C1N OPGOLNDOMSBSCW-CLNHMMGSSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 244000028344 Primula vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000016311 Primula vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 235000011483 Ribes Nutrition 0.000 description 1
- 241000220483 Ribes Species 0.000 description 1
- 235000016911 Ribes sativum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002355 Ribes spicatum Nutrition 0.000 description 1
- 244000281209 Ribes triste Species 0.000 description 1
- 235000016897 Ribes triste Nutrition 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 1
- 241000192581 Synechocystis sp. Species 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003721 gunpowder Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002351 pectolytic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000000614 rib Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- JIWBIWFOSCKQMA-UHFFFAOYSA-N stearidonic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O JIWBIWFOSCKQMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/10—Anti-acne agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и медицине. Трансформация растения нуклеиновой кислотой, кодирующей Δ6 десатуразу С.elegans, приводит к получению растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты и устойчивостью к холоду. Извлекаемая из растения десатураза может также быть использована для приготовления лекарства для лечения расстройства организма, связанного с дефицитом в нем гамма-линоленовой кислоты. 10 н. и 26 з.п. ф-лы, 9 ил.
Description
Настоящее изобретение относится, среди прочего, к новым десатуразам и к их применению.
За последние несколько лет из высших растений, наиболее значительно из Arabidopsis thaliana, был выделен ряд микросомальных и растворимых десатураз жирных кислот. Это явилось результатом комбинированного генетического и биохимического подхода к получению и комплементации мутантных линий Arabidopsis, дефектных по десатурации или элонгации жирных кислот (Somerville С., Browse J. (1996) Trends Cell. Biol., 6, 148-1153). Важность этого подхода подтверждена выделением и характеристикой генов, кодирующих микросомальные десатуразы, такие как десатуразы Δ12 (Okuley J., et al., (1994), Plant Cell 6, 147-158) и Δ15 (Arondel V., et al., (1992), Sciеnсе 258, 1353-1355) (кодируемые генами FAD2 и FAD3, соответственно), ферменты, которые прежде оказывались труднообрабатываемыми с помощью классических методик очистки вследствие их гидрофобности. Выделение этих и родственных ферментов, таких как Δ12 гидроксилаза из Ricinus communis (van de Loo F N et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6743-6747), дало возможность идентификации ряда консервативных мотивов в растительных микросомальных десатуразах, наиболее значительно так называемых “гистидиновых боксов” (Shanklin, J et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6743-6747). Белки, содержащие эти мотивы, можно классифицировать как ферменты, содержащие ди-железо центр (Shanklin, J. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2981-2986).
В WO 93/11245 (Du Pont) описываются различные фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие десатуразы, в частности Δ12 и Δ15 десатуразы, которые были выделены из различных растений. Недавно из растения бурачника (Borago officinalis), которое аккумулирует γ-линоленавую кислоту (ГЛК), выделили кДНК клон, используя высоковырожденную ПЦР против этих гистидиновых мотивов. В US 5614393 (Rhone-Poulenc Agrochimie) описывается и заявляется нуклеотидная последовательность Δ6 десатуразы бурачника. Хотя в описании изобретения предполагается, что нуклеиновые кислоты, кодирующие Δ6 десатуразу, могут быть выделены специалистом из животных клеток без труда, подходящих животных клеток не предлагается (в противоположность грибным и бактериальным клеткам), а также отсутствует описание выделения таких нуклеиновых кислот из животных клеток. С помощью гетерологичной экспрессии в трансгенном табаке было показано, что выделенный кДНК клон кодирует микросомальную Δ6 десатуразу (Sayanova О. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4211-4216). Десатурация в Δ6 положении представляет собой необычную модификацию у высших растений, встречающуюся только у небольшого числа видов, таких как бурачник, энотера (Oenothera spp.) и красная смородина (Ribes spp.), которые аккумулируют Δ6-ненасыщенные жирные кислоты ГЛК и октадекатетраеноевую кислоту (OTK:18:4Δ6,9,12,15, также известную как стеаридоновая кислота) в семенах и/или листьях.
ГЛК является растительной жирной кислотой большой значимости и широко применяется при лечении ряда медицинских состояний, включая экзему и масталгию. Утверждают, что применение ГЛК восстанавливает потерю Δ6-ненасыщенных жирных кислот или удовлетворяет повышенную потребность в них (Horrobin, D.F. (1990) Rev. Contemp. Pharmakother. 1: 1-45).
В целях ссылки предлагается фиг.5, чтобы показать в упрощенной форме путь метаболизма, который, как считают, встречается у некоторых организмов (включая людей), и в который вовлечены Δ6 десатуразы. Можно видеть, что ГЛК может синтезироваться in vivo из линолевой кислоты под действием Δ6 десатуразы, и что ГЛК может использоваться для синтеза дигомо-ГЛК, которая может превращаться в арахидоновую кислоту под влиянием Δ5 десатуразы. Арахидоновая кислота является предшественником различных важных эйкозаноидов (включая простагландины и лейкотриены). Δ6 десатураза также превращает α-линолевую кислоту в ОТК. Таким образом, ясно, что Δ6 десатураза является первой обязательной стадией на пути биосинтеза этих биологически активных молекул (см. фиг.5).
Последовательность ранее выделенной микросомальной Δ6 десатуразы бурачника отличается от ранее охарактеризованных растительных микросомальных десатураз/гидроксилаз тем, что она содержит N-терминальную протяженность, которая проявляет гомологию с цитохромом b5, a также тем, что третий (ближайший к С-концу) гистидиновый бокс отличается от консенсуса (Shanklin J et al, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2981-2986) H-X-Х-Н-Н глутамином, заменяющим первый гистидин. Это наблюдалось также в случае Δ6 десатуразы цианобактерии Synechocystis (GenBank ID; L11421). В WO 93/06712 (Rhone Poulenc Agrochimie) описывается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая Δ6 десатуразу, выделенную из Synechocystis, и заявляются бактериальные Δ6 десатуразы и их применение.
Хотя Δ6 десатурация жирной кислоты является необычной модификацией у высших растений, считают, что у животных она является обычной. Незаменимая жирная кислота линолевая кислота (18:2Δ9,12) десатурируется до ГЛК с помощью Δ6-десатуразы, что является первой стадией на пути биосинтеза эйкозаноидов (которые включают в себя простагландины и лейкотриены). Это приводит к быстрому метаболизму ГЛК (до ди-гомо-ГЛК и арахидоновой кислоты; то есть 20:3 Δ8,11,14 и 20:4 Δ5,8,11,14, соответственно). Следовательно, аккумуляция ГЛК обычно не наблюдается.
Червь нематода Caenorhabitis elegans является крайне полезным в связи с тем, что его генетика хорошо изучена, и он имеет много сходств с высшими животными, как, например, с людьми, и, следовательно, является крайне полезным в разработке десатураз для применения у таких животных.
Согласно настоящему изобретению предлагается полипептид, обладающий десатуразной активностью, который содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг.1.
Аминокислотная последовательность, показанная на фиг.1, представляет собой последовательность Δ6 десатуразы, имеющейся у червя нематоды Caenorhabitis elegans. Это является весьма значимым, поскольку до настоящего изобретения не сообщалось об успешном секвенировании или очистке животной Δ6 десатуразы. Так как C.elegans не аккумулирует ГЛК, выделение из него Δ6 десатуразы было неожиданной целью для выделения гена десатураз.
Десатураза по изобретению значительно отличается от известных десатураз. Гомология между Δ6 десатуразой по изобретению и микросомальными Δ12 и Δ15 десатуразами из Arabidopsis, описанными в WO 93/11245, составляет 24% и 16%, соответственно, как определили, используя программу BESTFIT. Ген Δ6 десатуразы по настоящему изобретению показывает 21%-ную идентичность с десатуразой FAT-1 C.elegans, описанной в статье Spychalla, J.P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1142-1147. Гомология последовательности между Δ6 десатуразой по настоящему изобретению и Δ6 Synechochocystis, описанной в WO 93/06712, составляет только 23%.
Согласно другому аспекту изобретения, таким образом, предлагается выделенная животная Δ6 десатураза.
Аминокислотная последовательность, показанная на фиг.1, является значимой также в связи с тем, что она имеет очень низкий уровень идентичности последовательности с Δ6 десатуразой бурачника (единственной иной эукариотической Δ6 десатуразой, секвенированной до настоящего изобретения). Действительно, этот уровень идентичности последовательности ниже 32%. При таком низком уровне идентичности можно ожидать, что эти два полипептида будут иметь полностью различные функции. Неожиданно, что оба они обладают активностью Д6 десатуразы.
Настоящее изобретение, однако, не ограничивается Δ6 десатуразой, имеющей последовательность, показанную на фиг.1. Оно также включает в себя другие десатуразы, имеющие по меньшей мере 32%-ную идентичность последовательности с этой последовательностью. Предпочтительные полипептиды по настоящему изобретению имеют по меньшей мере 40%-ную или, более предпочтительно, по меньшей мере 50%-ную идентичность аминокислотной последовательности с этой последовательностью. Более предпочтительно степень идентичности последовательности составляет по меньшей мере 75%. Идентичности последовательности по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% являются наиболее предпочтительными.
Для целей настоящего изобретения идентичность последовательности (либо аминокислотной, либо нуклеотидной) можно определить с помощью использования программы “BESTFIT” Wisconsin Sequence Analysis Package GCG 8.0.
Там, где имеются высокие степени идентичности последовательности, могут быть относительно небольшие различия в аминокислотной последовательности. Так, например, может быть менее чем 20, менее чем 10 или даже менее чем 5 различий.
Фрагменты полипептидов, описанных выше, также находятся в объеме настоящего изобретения при условии, что они обладают десатуразной активностью, то есть они обладают способностью вводить двойную связь в субстрат в конкретном положении, как определено с помощью ГХ-МС (газовой хроматографии - масс-спектрометрии). Что является низшим пределом активности? Эти фрагменты предпочтительно имеют длину по меньшей мере 100 аминокислот. Более предпочтительно эти фрагменты имеют длину по меньшей мере 150 аминокислот.
В кратком изложении, полипептид по настоящему изобретению обладает десатуразной активностью и:
а) содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг.1;
б) имеет одну или более чем одну аминокислотную делецию, инсерцию или замену относительно полипептида как определено в (а) выше, но вместе с этим имеет по меньшей мере 32%-ную идентичность аминокислотной последовательности; или
в) представляет собой фрагмент полипептида как определено в (а) или (б) выше, который имеет длину по меньшей мере 100 аминокислот.
Термин “полипептид” используется здесь в общем смысле, чтобы указать на то, что конкретная молекула содержит множество аминокислот, соединенных вместе пептидными связями. Следовательно, в объем этого термина включены вещества, на которые в литературе иногда ссылаются как на пептиды, полипептиды или белки.
Желательно полипептид по настоящему изобретению должен иметь домен цитохрома. Домен цитохрома можно определить как переносящий электроны домен, который содержит простетическую группу гем. Предпочтительно присутствует домен цитохрома b. Более предпочтительно присутствует домен цитохрома b5 (желательно он включает в себя мотив Н-Р-G-G-Х15-Р-Х3-6-Н, где Х представляет собой любую аминокислоту). Домен цитохрома b5 присутствует в аминокислотной последовательности как Δ6 десатуразы бурачника, так и Δ6 десатуразы C.elegans, показанных на фиг.2Б. Домен цитохрома b5 предпочтительно является N-терминальным доменом - то есть он находится ближе к N-терминальной области десатуразы, чем к С-терминальной области. Это составляет противоположность с другими десатуразами. Например, с дрожжевой Δ9 десатуразой, имеющей С-терминальный домен цитохрома b5, и с растительными Δ12 и Δ15 десатуразами, которые не имеют никакого домена цитохрома b5.
Полипептид по настоящему изобретению предпочтительно имеет один или более чем один гистидиновый бокс (наиболее предпочтительно три). Один из них может иметь замену H→Q. (Она дает вариант гистидинового бокса, который считается консервативным у ряда видов животных/растений).
Полипептиды по настоящему изобретению могут иметь любую пространственную специфичность, включая цис/транс активность, хотя предпочтительно, чтобы они представляли собой десатуразы переднего конца, которые вводят двойную связь между С3 и С7 положениями, отмеренными от СООН (Δ конец) этой группы. Специалист способен легко отличать различные десатуразы с помощью определения различных положений двойных связей, вводимых этими десатуразами. Это можно сделать с помощью известных аналитических методик, например с помощью использования газовой хроматографии и масс-спектрометрии.
Особенно предпочтительными десатуразами по изобретению являются Δ6 десатуразы.
Желательно, эти десатуразы встречаются в природе у одного или более чем одного организма, который не аккумулирует ГЛК (то есть, где ГЛК может продуцироваться, но обычно не обнаруживается в связи с тем, что она очень быстро претерпевает метаболизм). Такие десатуразы могут встречаться в природе у одного или более чем одного животного. Эти десатуразы встречаются в природе у одной или более чем одной нематоды, например у C.elegans.
Чтобы более полно представить объем настоящего изобретения, теперь более детально будут обсуждаться полипептиды в объеме каждого из вышеуказанных (а), (б) и (в).
Полипептиды в объеме (а)
Полипептид в объеме (а) может состоять из аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1, либо может иметь дополнительную N-терминальную и/или дополнительную С-терминальную аминокислотную последовательность.
Дополнительные N-терминальные или С-терминальные последовательности можно включать по разным причинам, и методики для включения таких дополнительных последовательностей хорошо известны в данной области техники. Такие методики включают в себя использование методик клонирования генов, в соответствии с которыми молекулы нуклеиновых кислот лигируют вместе, а затем используют для экспрессии полипептида в подходящем хозяине.
Дополнительные последовательности можно включать, чтобы изменить характеристики конкретного полипептида. Это может быть полезным для улучшения экспрессии или регуляции экспрессии в отдельных системах экспрессии. Например, дополнительная последовательность может обеспечить некоторую защиту от протеолитического расщепления.
Дополнительные последовательности также могут быть полезными при изменении свойств полипептида, чтобы способствовать его идентификации или очистке. Например, может присутствовать сигнальная последовательность, чтобы направлять транспорт полипептида к конкретному месту внутри клетки или экспортировать полипептид из клетки. Для различных систем экспрессии можно использовать различные сигнальные последовательности.
В другом примере включения дополнительной последовательности полипептид сшивают с группировкой, которую можно выделить с помощью аффинной хроматографии. Эта группировка может представлять собой эпитоп, и аффинная колонка может содержать иммобилизованные антитела или иммобилизованные фрагменты антител, которые связываются с указанным эпитопом (желательно с высокой степенью специфичности). Полученный в результате слитой белок обычно можно элюировать с колонки добавлением подходящего буфера.
Дополнительные N-терминальные или С-терминальные последовательности могут, однако, присутствовать просто как результат конкретной методики, используемой для получения полипептида по настоящему изобретению, и не должны обеспечивать какую-либо конкретную преимущественную характеристику.
Полипептиды в объеме (б)
Теперь, переходя к полипептидам, определенным в (б) выше, следует понимать, что они являются вариантами полипептидов, данных в (а) выше.
В аминокислотной последовательности полипептида, который обладает желаемым свойством, часто можно сделать различные изменения, чтобы получить варианты, которые тем не менее обладают этим свойством. Такие варианты полипептидов, описанных в (а) выше, находятся в объеме настоящего изобретения и более детально обсуждаются в разделах (i)-(iii) ниже. Они включают в себя аллельные и неаллельные варианты.
(i) Замены
Примером варианта настоящего изобретения является полипептид как определено в (а) выше, отличающийся заменой одной или более чем одной аминокислоты одной или более чем одной другой аминокислотой.
Специалист знает, что различные аминокислоты имеют сходные характеристики. Одну или более чем одну такую аминокислоту полипептида часто можно заменить одной или более чем одной другой такой аминокислотой, не устраняя желаемое свойство этого полипептида (как, например, десатуразная активность).
Например, аминокислоты глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин часто можно заменять друг на друга (аминокислоты, имеющие алифатические боковые цепи). Из этих возможных замен предпочтительно, чтобы глицин и аланин использовались для замены друг на друга (поскольку они имеют относительно короткие боковые цепи), а валин, лейцин и изолейцин использовались для замены друг на друга (поскольку они имеют более крупные алифатические боковые цепи, которые являются гидрофобными). Другие аминокислоты, которые часто можно заменять друг на друга, включают в себя фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи); лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, имеющие основные боковые цепи); аспартат и глутамат (аминокислоты, имеющие кислые боковые цепи); аспарагин и глутамин (аминокислоты, имеющие амидные боковые цепи); а также цистеин и метионин (аминокислоты, имеющие серосодержащие боковые цепи).
На замены этой природы часто ссылаются как на “консервативные” или “полуконсервативные” аминокислотные замены.
(ii) Делеции
Делеции аминокислот могут являться предпочтительными, поскольку можно уменьшить общую длину и молекулярную массу полипептида, сохраняя при этом желаемую активность. Это может дать возможность уменьшить количество полипептида, требующееся для конкретной цели.
(iii) Инсерции
Можно также получить инсерции аминокислот в отношении полипептида, как определено в (а) выше. Это можно сделать, чтобы изменить природу полипептида (например, чтобы способствовать идентификации, очистке или экспрессии).
Полипептиды, включающие изменения аминокислот (замены, делеции или инсерции) относительно последовательности полипептида как определено в а) выше можно получить, используя любые подходящие методики. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, включающую в себя желаемое изменение последовательности, можно получить с помощью сайт-направленного мутагенеза. Затем эту последовательность можно использовать, чтобы дать возможность экспрессии полипептида, имеющего соответствующее изменение в своей аминокислотной последовательности.
Полипептиды в объеме (в)
Как обсуждалось выше, часто является предпочтительным уменьшение длины полипептида. Следовательно, признак (в) настоящего изобретения охватывает фрагменты полипептидов (а) или (б) выше, которые имеют длину по меньшей мере 100 аминокислот, но которые могут не быть такими же длинными, как полноразмерный полипептид, показанный на фиг.1. Желательно эти фрагменты имеют длину по меньшей мере 200, по меньшей мере 300 или по меньшей мере 400 аминокислот.
Теперь различные применения полипептидов по настоящему изобретению будут описаны только с помощью примера.
Полипептиды по настоящему изобретению можно использовать, среди прочего, при получении полезных молекул. Например, Δ6 десатуразы можно использовать при получении γ-линоленовой кислоты (ГЛК) или при получении метаболитов, в отношении которых ГЛК является предшественником. Например, октадекатетраеноевую кислоту (ОТК; 18:4 Δ6,9,12,15), член n-3 (или ω-3) жирных кислот, можно производить путем Δ6-десатурации α-линоленовой кислоты.
ГЛК, ОТК и их метаболиты являются полезными в медицине. Они могут использоваться при изготовлении лекарства для лечения расстройства, в которое вовлечен дефицит ГЛК или метаболита, образующегося из ГЛК in vivo (например, эйкозаноида). Расстройства, которые можно лечить, включают в себя экзему, масталгию, гиперхолестеринемию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, диабетическую невропатию, вирусные инфекции, угри, гипертензию, цирроз и рак.
Эти метаболиты можно производить in vivo в подходящих хозяевах или in vitro.
Когда метаболит нужно производить in vitro, десатуразу по настоящему изобретению и ее субстрат обычно получают отдельно, а затем объединяют, когда требуется произвести этот метаболит. Таким образом, в объем настоящего изобретения включен способ получения ГЛК или ОТК, при котором Δ6 десатуразу по настоящему изобретению используют для превращения субстрата линолевой кислоты или субстрата α-линоленовой кислоты в ГЛК или ОТК, соответственно.
Когда метаболит нужно производить in vivo в организме, таком как растение или животное, субстрат для десатуразы по настоящему изобретению обычно будет обеспечиваться самим соответствующим нечеловеческим организмом. Следовательно, производство метаболита in vivo можно осуществлять с помощью встраивания гена, кодирующего десатуразу по настоящему изобретению, в организм и предоставления возможности для экспрессии десатуразы этим организмом. Эта десатураза затем может действовать на свой субстрат. Таким образом, следует понимать, что полипептиды по настоящему изобретению можно использовать для обеспечения активности десатуразы в организмах, которые в норме не обладали бы такой активностью, или для повышения уровня десатуразной активности в организмах, уже обладающих некоторой десатуразной активностью. Если требуется, полезный метаболит можно очистить из такого организма. Альтернативно сам этот организм можно использовать непосредственно в качестве источника метаболита. Конкретные методики клонирования, которые можно использовать для получения трансгенных организмов с десатуразной активностью, обсуждаются далее.
Полипептиды по настоящему изобретению можно также использовать в качестве индикаторов трансформации организма. Например, если организм, предназначенный для трансформации, не имеет определенной десатуразы, а нуклеиновая кислота, предназначенная для использования при трансформации, кодирует эту десатуразу, после пробной трансформации можно провести анализ, чтобы определить, присутствует ли эта десатураза или нет. Так, в случае Δ6 десатуразы можно провести анализ на наличие ГЛК, и ГЛК может служить в качестве простого маркера на присутствие функциональной трансгенной кассеты, содержащей последовательность, кодирующую Δ6 десатуразу.
Следующее применение настоящего изобретения состоит в получении антител. В объем настоящего изобретения включены антитела, которые связываются с полипептидами по настоящему изобретению.
Предпочтительные антитела специфически связываются с полипептидами по настоящему изобретению и, следовательно, их можно использовать для очистки таких полипептидов. (Например, их можно иммобилизовать и использовать для связывания с полипептидами по настоящему изобретению. Эти полипептиды затем можно элюировать с помощью промывки подходящим элюентом в соответствующих условиях).
Антитело или его производное в объеме настоящего изобретения можно использовать в диагностике. Например, анализы связывания с использованием такого антитела или производного, можно применять, чтобы определить, присутствует ли определенная десатураза или нет. Это полезно при диагностике расстройств, которые возникают вследствие отсутствия функциональной десатуразы.
Антитела в объеме настоящего изобретения могут являться моноклональными или поликлональными.
Поликлональные антитела можно получить путем стимуляции их продуцирования у подходящего животного-хозяина (например, мыши, крысы, морской свинки, кролика, овцы, козы или обезьяны), когда этому животному инъецируют полипептид по настоящему изобретению. При необходимости вместе с полипептидом по настоящему изобретению можно ввести адьювант. Затем эти антитела можно очистить вследствие их связывания с полипептидом по настоящему изобретению.
Моноклональные антитела можно получать из гибридом. Их можно создавать с помощью слияния миеломных клеток и клеток селезенки, которые продуцируют желаемое антитело, с целью создания бессмертной клеточной линии. Так, можно использовать хорошо известную методику Kohler & Milstein (Nature 256, 52-55 (1975)) или вариации этой методики.
Методики получения моноклональных и поликлональных антител, которые связываются с определенным полипептидом, хорошо разработаны сейчас в данной области техники. Они обсуждаются в стандартных учебниках по иммунологии, например в Roitt et al., Immunology second edition (1989), Churchill Livingstone, London.
Кроме полных антител, настоящее изобретение включает в себя их производные, которые способны связываться с полипептидами по настоящему изобретению. Так, настоящее изобретение включает в себя фрагменты антител и синтетические конструкции. Примеры фрагментов антител и синтетических конструкций даны Dougall et al., в Tibtech 12 372-379 (September, 1994).
Фрагменты антител включают в себя, например, Fab, F(ab’)2, и Fv фрагменты. (Они обсуждаются, например, в Roitt et al. (см. выше)). Fv фрагменты можно модифицировать с образованием синтетической конструкции, известной как одноцепочечная Fv (scFv) молекула. Она включает в себя пептидный линкер, ковалентно присоединяющий Vh и Vl районы, которые способствуют стабильности молекулы. Другие синтетические конструкции, которые можно использовать, включают в себя CDR пептиды. Они представляют собой синтетические пептиды, содержащие антиген-связывающие детерминанты. Можно также использовать пептидные миметики. Эти молекулы обычно представляют собой органические кольца ограниченной конформации, которые напоминают структуру CDR петли и которые включают в себя взаимодействующие с антигеном боковые цепи.
Синтетические конструкции включают в себя химерные молекулы. Так, например, гуманизированные (или приматизированные) антитела или их производные находятся в объеме настоящего изобретения. Примером гуманизированного антитела является антитело, имеющее каркасные районы человека, но гипервариабельные районы грызунов.
Синтетические конструкции также включают в себя молекулы, содержащие дополнительную группировку, которая обеспечивает эту молекулу каким-нибудь желаемым свойством дополнительно к связыванию антигена. Например, эта группировка может представлять собой метку (например флуоресцентную или радиоактивную метку). Альтернативно она может представлять собой фармацевтически активный агент.
В объем настоящего изобретения также включены молекулы нуклеиновой кислоты.
Такие молекулы нуклеиновой кислоты:
а) кодируют полипептид по настоящему изобретению; или
б) комплементарны молекулам как определено в (а) выше; или
в) гибридизуются с молекулами как определено в (а) или (б) выше.
Эти молекулы нуклеиновой кислоты и их применение более детально обсуждаются ниже.
Полипептиды по настоящему изобретению могут кодироваться большим разнообразием молекул нуклеиновых кислот, принимая во внимание хорошо известную вырожденность генетического кода. Все эти кодирующие молекулы нуклеиновых кислот входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительные кодирующие молекулы нуклеиновых кислот кодируют полипептид, показанный на фиг.1. Они включают в себя молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующую последовательность, показанную на фиг.1, и ее вырожденные варианты.
Молекулы нуклеиновых кислот можно использовать непосредственно. Альтернативно их можно встраивать в векторы.
Нуклеиновые кислоты или векторы, содержащие их, можно использовать при клонировании. Их можно вводить в нечеловеческих хозяев, чтобы обеспечить экспрессию полипептидов по настоящему изобретению, используя методики, известные специалистам в данной области техники. Альтернативно можно использовать бесклеточные системы экспрессии.
Методики клонирования, экспрессии и очистки полипептидов хорошо известны специалисту. Различные подобные методики описываются в стандартных учебниках, таких как Sambrook et al. (Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)); в Old & Primrose (Principles of Gene Manipulation, 5th Edition, Blackwell Scientific Publications (1994)); и в Stryer (Biochemistry, 4th Edition, W H Freeman and Company (1995)).
С помощью использования подходящей системы экспрессии можно производить полипептиды в желаемой форме. Например, полипептиды могут продуцироваться микроорганизмами, такими как бактерии или дрожжи, у культивируемыми клетками насекомых (которые можно инфицировать бакуловирусом) или клетками млекопитающих (как, например, клетками яичника китайского хомячка (СНО)).
Однако предпочтительными хозяевами являются растения или материал размножения растений, например масличная культура рапс, подсолнечник, злаки, включая кукурузу, табак, бобы, включая арахис и сою, сафлор, масличная пальма, кокосовая пальма и другие пальмы, хлопок, кунжут, горчица, лен, клещевина, бурачник и энотера, либо материал их размножения.
Технология получения растений или материала размножения растений в настоящее время хорошо разработана. Она кратко обсуждается, например, в WO 96/21022. Десатуразы, выделенные из животных, успешно экспрессированы в растениях. Например, Spychalla, J.P. et al. (см. выше) описывает экспрессию десатуразы C.elegans в трансгенном Arabidopsis. Кроме того, в ЕР 0550162 (Pioneer Hi-Bred International, Inc.) описывается химерная генная конструкция, кодирующая Δ9 десатуразу, выделенную из крысы, а также растения, трансформированные этой конструкцией для получения жирных кислот. Десатураза, описанная в этой публикации, имеет только 22%-ную идентичность с Δ6 десатуразой по настоящему изобретению.
Конкретные методики, которые можно использовать, обсуждаются ниже. Конечно, следует понимать, что такие методики не являются ограничивающими.
(i) Векторные системы, основанные на Agrobacterium tumefaciens
Эти векторные системы включают в себя системы, основанные на Ti, такие как pGV3850, в которых Т-ДНК обезврежено. Желательно присутствует селективный маркер (например маркер, который обеспечивает устойчивость к антибиотикам).
Можно также использовать промежуточные векторы (ПВ). Они имеют свойство быть маленького размера и, следовательно, ими обычно легче манипулировать, чем с большими векторами на основе Ti. ПВ в целом представляют собой векторы, полученные из Т-ДНК, клонированной в плазмидные векторы, выделенные из E.coli, такие как pBR322. ПВ часто являются дефектными по конъюгации, и поэтому для придания подвижности ПВ можно использовать способную к конъюгации плазмиду (такую как pRK2013) таким образом, чтобы ПВ можно было трансформировать в реципиент Agrobacterium. Затем в Agrobacterium может происходить гомологичная рекомбинация in vivo, чтобы дать возможность встраивания ПВ в резидентную обезвреженную Ti-плазмиду с целью получения коинтеграта, который способен автономно реплицироваться в Agrobacterium.
Другой альтернативой является использование бинарных Ti векторов. В этом случае модифицированный район Т-ДНК, несущий чужеродную ДНК, может обеспечиваться малой плазмидой, которая реплицируется в E.coli (например pRK252). Затем эту плазмиду (иногда называемая мини-Ti или микро-Ti) можно конъюгативно переносить посредством трехродительского спаривания в A.tumefaciens, которая содержит совместимый vir ген (при условии транс-функции vir).
Бинарные векторы можно использовать даже без Ti последовательностей. В этом случае, чтобы способствовать переносу плазмиды, можно использовать бактериальные функции mob и oriT. Кроме того, может обеспечиваться транс-функция vir.
Векторные системы, обсуждаемые выше, можно применять для переноса генов в растения с использованием протокола Horsch et al. (Science 227, 1229-31 (1985)) или его вариантов. В этом случае из листьев двудольного растения компостером можно вырезать небольшие диски, стерилизовать их поверхность, а затем поместить их в среду, имеющую в своем составе A.tumefaciens, которая содержит рекомбинантную Т-ДНК, в которой чужеродный ген, предназначенный для переноса, сопровождается селективным маркером (например nео геном). Затем эти диски можно культивировать в течение 2 суток, а затем переносить в среду для отбора селективного маркера (Для селективного маркера nео это можно сделать с помощью культивирования, используя среду, содержащую канамицин). A.tumefaciens можно убить с помощью использования среды, содержащей карбенициллин. Побеги будут развиваться из каллуса в норме через 2-4 недели. Затем их можно отрезать и пересадить в среду, индуцирующую корни, и когда они станут достаточно большими, пересадить их в почву.
(ii) Векторные системы, основанные на Agrobacterium rhizogenes
Эти системы включают в себя Ri производные плазмиды. Ri Т-ДНК, как правило, считают безвредной, и, следовательно, такие плазмиды можно считать эквивалентными обезвреженным Ti плазмидам. Разработана коинтегративная система ПВ, основанная на Ri плазмидах.
(iii) Системы трансформации, основанные на протопластах растений
Подходящие методики описаны в “Plant Gene Transfer and Expression Protocols” ed. H.Jones, Human Press Methods in Molecular biology, 49, 1995.
Трансформации растений можно способствовать с помощью удаления растительных клеточных стенок с образованием протопластов. Эти клеточные стенки можно удалить любыми подходящими способами, включая механическое разрушение или обработку целлюлолитическими и пектинолитическими ферментами. Затем протопласты можно отделить от остальных компонентов с помощью центрифугирования, а затем для трансформации протопластов гетерологичной ДНК можно использовать методики, такие как электропорация. В подходящих условиях культивирования эти трансформированные протопласты будут наращивать новые клеточные стенки, а также делиться. Затем можно индуцировать побеги и корни, и могут образоваться ростки.
(iv) Трансфекция с помощью биолистиков
Для доставки ДНК или РНК в растительные клетки можно использовать высокоскоростные микроснаряды, несущие эти ДНК или РНК. Это позволило получить широкое разнообразие трансгенных растений и подходит как для однодольных, так и для двудольных растений. Например, можно использовать золотые или вольфрамовые частицы, покрытые ДНК или РНК. Подходящие аппараты для метания этих микроснарядов включают в себя аппараты на основе пороха, аппараты на основе электрического разряда и пневматические аппараты.
(v) Системы на основе вирусов
Векторы растительных ДНК-вирусов включают в себя вирусы мозаики цветной капусты (которые инфицируют ряд двудольных) и геминивирусы (которые инфицируют широкий круг двудольных и однодольных). Растительные РНК-вирусы составляют большинство и включают в себя вирус мозаики костера (который инфицирует ряд Graminae, включая ячмень) и вирус табачной мозаики (который инфицирует растения табака).
Из предшествующего описания следует понимать, что молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, могут быть клонированы и экспрессированы в широком разнообразии организмов.
Кроме молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды по настоящему изобретению (на которые здесь ссылаются как на “кодирующие” молекулы нуклеиновых кислот), настоящее изобретение также включает в себя молекулы нуклеиновых кислот, им комплементарные. Так, например, обе нити двунитевой молекулы нуклеиновой кислоты включены в объем настоящего изобретения (связаны они друг с другом или нет). Включены также молекулы мРНК и комплементарные молекулы ДНК (например молекулы кДНК).
Молекулы нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с одной или более чем одной молекулой нуклеиновой кислоты из обсуждаемых выше, также охвачены настоящим изобретением. На такие молекулы нуклеиновой кислоты здесь ссылаются как на “гибридизующиеся” молекулы нуклеиновой кислоты.
Гибризидующаяся молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может иметь высокую степень идентичности последовательности по всей длине с молекулой нуклеиновой кислоты в объеме (а) или (б), приведенных выше (например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности).
Как следует понимать специалистам в данной области техники, чем выше степень идентичности последовательности, которую имеет данная однонитевая молекула нуклеиновой кислоты с другой однонитевой молекулой нуклеиновой кислоты, тем выше вероятность того, что в подходящих условиях она будет гибридизоваться с однонитевой молекулой нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной этой другой однонитевой молекуле нуклеиновой кислоты.
Желательно, чтобы гибридизующиеся молекулы по настоящему изобретению имели длину по меньшей мере 10 нуклеотидов и предпочтительно имели длину по меньшей мере 25, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 нуклеотидов.
Предпочтительные гибридизующиеся молекулы гибридизуются в строгих условиях гибридизации. Одним из примеров строгих условий гибридизации является тот, когда попытку гибридизации осуществляют при температуре от примерно 35°С до примерно 65°С, используя солевой раствор, который является примерно 0,9-молярным. Однако специалисту следует уметь варьировать такие параметры соответствующим образом, чтобы принимать в расчет переменные, такие как длина зонда, состав оснований, тип присутствующих ионов и т.д.
Наиболее предпочтительно гибридизующиеся молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению гибридизуются с молекулой ДНК, имеющей кодирующую последовательность, показанную на фиг.1, с эквивалентной ей РНК или с последовательностью, комплементарной любой из вышеуказанных молекул.
Гибридизующиеся молекулы нуклеиновых кислот могут быть полезны, например, в качестве зондов или праймеров.
Зонды можно использовать, чтобы очищать и/или идентифицировать нуклеиновые кислоты. Например, их можно использовать для идентификации присутствия всего гена десатуразы или его участка, и, следовательно, они являются полезными в диагностике.
Праймеры являются полезными для амплификации нуклеиновых кислот или их участков, например с помощью методик ПЦР.
Кроме использования в качестве зондов или праймеров, гибридизующиеся молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению можно использовать в качестве антисмысловых молекул, чтобы изменить экспрессию полипептидов по настоящему изобретению посредством связывания с комплементарными молекулами нуклеиновых кислот. (Как правило, этого можно достичь с помощью предоставления молекул нуклеиновой кислоты, которые связываются с молекулами РНК, которые в норме должны транслироваться, предотвращая таким образом трансляцию за счет образования дуплексов).
Гибридизующиеся молекулы нуклеиновой кислоты можно также получать в виде рибозимов. Рибозимы также можно использовать, чтобы регулировать экспрессию посредством связывания их с молекулами РНК и расщепления этих молекул, которые включают в себя определенные последовательности-мишени, распознаваемые этими рибозимами.
Из предшествующего обсуждения следует понимать, что большое число нуклеиновых кислот входят в объем настоящего изобретения. Если в контексте не указано иначе, молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут, таким образом, обладать одной или более чем одной из следующих характеристик:
1. Они могут представлять собой ДНК или РНК (включая варианты встречающихся в природе ДНК или РНК структур, которые имеют не встречающиеся в природе основания и/или не встречающиеся в природе остовы).
2. Они могут быть однонитевыми или двунитевыми.
3. Они могут быть представлены в рекомбинантной форме, то есть ковалентно сшитыми с гетерологичной 5’ и/или 3’ фланкирующей последовательностью с образованием химерной молекулы (например вектора), которая не встречается в природе.
4. Они могут быть представлены без 5’ и/или 3’ фланкирующих последовательностей, которые обычно встречаются в природе.
5. Они могут быть представлены в чистой по существу форме, например с помощью использования зондов для выделения клонированных молекул, имеющих желаемую целевую последовательность, или с помощью использования методик химического синтеза. Таким образом, они могут быть представлены в форме, которая является по существу свободной от примесей белков и/или от других нуклеиновых кислот.
6. Они могут быть снабжены интронами (например в виде полноразмерного гена) или не содержать интронов (например в виде кДНК).
Теперь настоящее изобретение будет описано только с помощью примера со ссылкой на сопровождающие графические материалы, фиг.1-6.
На фиг.1 показана последовательность ДНК и установленная по ней аминокислотная последовательность полноразмерной кДНК pCeD6.1 C.elegans. Положения N-терминального домена цитохрома b5 и варианта третьего гистидинового бокса подчеркнуты. Выведенная аминокислотная последовательность этой кДНК является идентичной последовательности, спрогнозированной для остатков 1-38 и 68-473 W08D2.4.
На фиг.2А показано сравнение установленных аминокислотных последовательностей кДНК CeD6.1 C.elegans и спрогнозированного белка W08D2.4 C.elegans (MywormD6=CeD6.1; cew08d2=OPC (открытая рамка считывания) W08D2.4).
На фиг.2В показано сравнение установленных аминокислотных последовательностей Δ6 десатуразы бурачника (Sayanova et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4211-4216) и кДНК CeD6.1 C.elegans (Boofd6=Δ6 десатураза Borago officinatis; ceeld6=CeD6.1).
На фиг.3А и 3В показаны метиловые эфиры суммарных липидов S.cerevisiae, выращенных в индуцирующих условиях (линолеат и галактоза).
На фиг.4 показан ГХ-МС анализ нового пика, идентифицированного у дрожжей, несущих pYCeD6.1.
На фиг.5 показан упрощенный вариант метаболизма n-6 незаменимых жирных кислот у млекопитающих.
На фиг.6А и 6В показаны эфиры жирной кислоты и метила материала листьев, как из контрольного трансформированного растения Arabidopsis (А), так и из трансформированного растения Arabidopsis, экспрессирующего Δ6 десатуразу C.elegans (Б).
Пример 1 - Выделение гена Δ6 десатуразы и экспрессия в дрожжах
В базе данных последовательностей NCBI EST проводили поиск аминокислотных последовательностей, используя известную Δ6 десатуразу жирных кислот бурачника (Sayanova et al. (1997), см. выше) и ограничивая поиск последовательностями, содержащими вариантный гистидиновый бокс Q-X-X-H-Н.
Были идентифицированы EST C.elegans. Они были далее охарактеризованы с помощью поиска в базе данных планов EST C.elegans (лаборатория проф. И.Кохара (Y.Kohara) (National Institute of Genetics, Mishima, Japan); База данных ДНК Японии), чтобы идентифицировать соответствующие космидные клоны.
Из плана EST C.elegans частичный кДНК клон 448 п.о., обозначенный как yk436b12, был идентифицирован с помощью этих поисков, и этот клон использовали для скрининга кДНК библиотеки C.elegans (смешанная стадия; также снабжалась проф. Кохара). Это показало, что клон yk436b12 был гомологичен участку гена, присутствующего на космиде W08D2 (Z70271 номер по каталогу Genbank), который образует участок хромосомы IV. С помощью программы прогнозирования белков Genefinder (Wilson R et al. (1994) Nature 368, 32-38) было спрогнозировано, что основания 21-2957 космиды W08D2 кодируют ОРС из 473 остатков, которая прерывается 5 интронами. Wilson R et al. описывают участок последовательности хромосомы III C.elegans. Был идентифицирован и далее очищен ряд положительных клонов, и с помощью секвенирования подтвердили, что полноразмерные клоны кодируют транскрипт, вероятно, транскрибированный с гена, обозначенного W08D2.4, на космиде W08D2, как определено с помощью поиска в базе данных генов, секвенированных с помощью плана генома C.elegans.
Исследование этого спрогнозированного полипептида (обозначенного W08D2.4 в Sanger Centre Nematode Sequencing Project, Hinxton, UK) выявило, что он имел ряд характеристик, напоминающих микросомальную десатуразу жирных кислот, включая три гистидиновых бокса. Однако эта спрогнозированная белковая последовательность указывала на наличие N-терминального домена, подобного цитохрому b5, содержащего диагностический мотив H-P-G-G, обнаруженный в белках цитохромах b5 (Lederer F. (1994) Biochimie 76, 674-692). Поскольку Δ6 десатураза, выделенная авторами изобретения из бурачника, также содержала N-терминальный домен b5, это указывало на то, что W08D2.4 может кодировать Δ6 десатуразу.
Более тщательное исследование этой последовательности выявило наличие третьего вариантного гистидинового бокса с заменой H→Q (опять же, как наблюдалось у Δ6 десатуразы бурачника). Степень подобия между W08D2.4 и Δ6 десатуразой бурачника составляет менее 52% и, следовательно, является низкой. Цифра менее 31%, полученная для идентичности, также является низкой.
Поскольку W08D2.4 кодируется геном, содержащим много (6) интронов, было необходимо выделить полноразмерную кДНК, чтобы проверить последовательность, спрогнозированную программой Genefinder, а также дать возможность экспрессии ОРС, чтобы определить кодируемую функцию.
Скрининг кДНК библиотеки осуществляли EST вставкой yk436b12 (любезно предоставленной проф. И. Кохара) и идентифицировали ряд положительных бляшек. Далее их очистили до гомогенности, вырезали и секвенировали самые большие вставки (~1450 п.о.) из полученных спасенных фагмид. Таким образом подтвердили, что кДНК, выделенные авторами изобретения, действительно гомологичны W08D2.4, причем 5’ и 3’ концы кДНК эквивалентны основаниям 9 и 3079 последовательности космиды W08D2.
Поскольку инициирующий кодом ATG, который, как спрогнозировано программой Genefinder, является стартом генного продукта W08D2.4, действительно представляет собой первый метионин в кДНК клоне, то авторы изобретения убедились, что они выделили действительно полноразмерную кДНК. Последовательность ДНК и установленная по ней аминокислотная последовательность одного репрезентативного кДНК клона (названного pCeD6.1; длиной 1463 п.о.) показана на фиг.1; эта установленная аминокислотная последовательность идентична спрогнозированной для W08D2.4 в большей части белка. Положения N-терминального домена цитохрома b5 и варианта третьего гистидинового бокса подчеркнуты. Установленная аминокислотная последовательность этой кДНК идентична последовательности, спрогнозированной для остатков 1-38 и 68-473 W08D2.4.
Однако последовательности ДНК, кодирующие остатки 38-67 (Y-S-I......L-Y-F), спрогнозированные для W08D2.4, в этом кДНК клоне не присутствуют. Это означает, что установленная аминокислотная последовательность CeD6.1 в действительности имеет длину 443 аминокислоты в противоположность последовательности, спрогнозированной для W08D2.4, которая имеет длину 473 остатка. Единственным другим различием между двумя этими аминокислотными последовательностями является замена M→V в остатке 401, являющаяся результатом замены основания A→G (основание 1211). Эти две последовательности сравниваются на фиг.2А, так же как сравниваются установленная аминокислотная последовательность Δ6 десатуразы бурачника и установленная аминокислотная последовательность CeD6.1 (фиг.2Б). Вероятно, что дополнительная последовательность, спрогнозированная для W08D2.4, является следствием неправильного прогноза интронэкзонных границ.
Обратите внимание на наличие мотива H-P-G-G цитохрома b5 на N-конце (кодируемого основаниями 96-108) и замены Н→Q в третьем гистидиновом боксе (кодируемом основаниями 1157-1172).
Кодирующую последовательность W08D2.4 встраивали в дрожжевой вектор экспрессии pYES2 с помощью ПЦР. Для введения сайтов Крnl и Sacl на 5’ и 3’ концах соответственно использовали нуклеотиды с выступающими 5’ концами. Правильность конструкции проверяли с помощью транскрипции и трансляции in vitro, используя систему TnT (Promega).
Конкретно, затем в качестве матрицы для ПЦР амплификации полной спрогнозированной кодирующей последовательности (длина 443 аминокислотных остатка) использовали клон pCeD6.1 и клонировали в дрожжевой вектор экспрессии pYES2 (Invitrogen) с получением pYCeD6. Правильность этой ПЦР-генерированной последовательности проверяли транскрипцией/трансляцией этой плазмиды in vitro, используя промотор РНК полимеразы Т7, присутствующий в pYES2.
Используя объединенную систему транскрипции/трансляции Promega TnT, генерировали продукты трансляции и анализировали их с помощью электрофореза в ПААГ (полиакриламидный гель) с ДСН (додецилсульфат натрия) и авторадиографии согласно инструкции производителя. Таким образом выявили (данные не представлены), что плазмида pYCeD6 генерирует продукт ~55 кДа, тогда как в контроле (pYES2) не удалось получить каких-либо белковых продуктов, что указывает на то, что конструкция была правильной.
Полученную плазмиду вводили в дрожжи (S.cerevisiae) с помощью литий-ацетатного способа (Guthrie С., Fink G.R. (1991) Meths Enz. 194) и индуцировали экспрессию трансгена добавлением галактозы. К дрожжам добавляли 0,2 М линолеат (натриевую соль) в присутствии 1% тергитола NP-40.
Трансформация и отбор дрожжей, способных расти на урацилдефицитной среде, выявили дрожжевые колонии, несущие рекомбинантную плазмиду pYCeD6 посредством селективного маркера URA3, которого несет pYES2. Экспрессии pYCeD6 добивались с помощью индукции GAL промотора, который присутствует в pYES2. Это осуществляли после того, как клетки вырастали в течение ночи с раффинозой в качестве источника углерода, и среду дополняли добавлением линолеата (18:2) в присутствии низких уровней детергента. Это последнее добавление требовалось, поскольку нормальным субстратом для Δ6 десатурации являются жирные кислоты 18:2, которые обычно не встречаются у S.cerevisiae.
Суммарные жирные кислоты дрожжей анализировали с помощью ГХ метиловых эфиров. Подтверждение присутствия ГЛК осуществляли с помощью ГХ-МС (Sayanova et al. (1997) см. выше).
Более детально, культурам затем давали продолжать расти после индукции, при этом отбирали аликвоты для анализа с помощью ГХ. Когда метиловые эфиры суммарных жирных кислот выделяли из дрожжей, несущих плазмиду pYCeD6 и выращенных в присутствии галактозы, и анализировали линолеат с помощью ГХ, наблюдали дополнительный пик (фиг.3). На фиг.3 на панели А представлены дрожжи, трансформированные контрольным (пустым) вектором pYES2, на панели Б представлены дрожжи, трансформированные pYCeD6.1. Общие метиловые эфиры жирных кислот идентифицировали как 16:0 (пик 1), 16:1 (пик 2), 18:0 (пик 3), 18:1 (пик 4), 18:2 (пик 5; добавлен экзогенно). Дополнительный пик (6) на панели Б соответствует 18:3 ГЛК указан стрелкой. Он имел такое же время удерживания, как и стандарт подлинной ГЛК, что указывает на то, что трасгенные дрожжи способны к Δ6-десатурации линолевой кислоты. Ни в одном из контрольных образцов (трансформация pYES2) таких пиков не наблюдалось. Идентичность этого дополнительного пика подтверждали с помощью ГХ-МС, что положительно идентифицировало это соединение как ГЛК (фиг.4). В эксперименте фиг.4 образец анализировали с помощью масс-спектров, как ранее (Sayanova О. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4211-4216), и эти данные использовали для поиска в библиотеке профилей. Этот образец был идентифицирован как ГЛК. Показано сравнение масс-спектров нового пика (А) и подлинной ГЛК (Б); визуальное и компьютерное исследование выявило, что они являются идентичными. Это подтверждает, что CeD6.1 кодирует Δ6 десатуразу C.elegans, и что эта кДНК, вероятно, должна транскрибироваться с гена, который, как спрогнозировано, кодирует ОРС W08D2.4, хотя установленная аминокислотная последовательность CeD6.1 на 30 остатков меньше, чем последовательность W08D2.4.
Пример 2 - Экспрессия Δ6 десатуразы C.elegans в растениях
Кодирующую последовательность Δ6 десатураз C.elegans субклонировали в растительный вектор экспрессии pJD330, который содержит вирусный промотор 35S и терминатор Nos. Затем полученную кассету, или промотор/кодирующая последовательность/терминатор, субклонировали в растительный бинарный вектор трансформации pBin19, и полученную плазмиду вводили в Agrobacterium tumefaciens. Затем этот штамм Agrobacterium использовали для трансформации Arabidopsis с помощью вакуум-инфильтрации соцветий. Семена собирали и помещали на чашки с селективной средой, содержащей канамицин. Поскольку pBin19 придает устойчивость к этому антибиотику, будет расти только трансформированный растительный материал. Устойчивые линии идентифицировали и подвергали самооплодотворению для получения гомозиготного материала. Материал листьев анализировали на профили жирных кислот, используя такой же способ, как тот, что использовался для экспрессии десатуразы нематод в дрожжах. Метиловые эфиры жирных кислот разделяли с помощью ГХ, и новые пики, показанные на фиг.6, идентифицировали путем сравнения с известными стандартами и ГХ-МС. В (Б) видны два новых пика, которые были идентифицированы как γ-линоленовая кислота (пик 1) и октадекатетраеноевая кислота (пик 2). Они представляют собой продукты Δ6-десатурации жирных кислот-предшественников линолевой кислоты и α-линоленовой кислоты, соответственно.
Авторы изобретения показали, что кДНК C.elegans (CeD6.1) кодирует Δ6 десатуразу, и что эта последовательность является идентичной с спрогнозированной OPC W08D2.4 за исключением вставки 30 остатков, присутствующей в N-терминальном районе последнего белка. Неясно, представляет ли собой установленная аминокислотная последовательность, спрогнозированная для CeD6.1, вариант сплайсинга W08D2.4, или она является результатом ошибочного прогноза интрон/экзонных соединений программой Genefinder. Однако, ясно, что CeD6.1 кодирует Δ6 десатуразу.
Представляется, что OPC, кодируемая этой последовательностью C.elegans, родственна Δ6 десатуразе жирных кислот высших растений, ранее выделенной авторами изобретения (Sayanova et al. (1997), см. выше), в том, что обе они содержат N-терминальные домены, которые проявляют гомологию с цитохромом b5. Продемонстрировано, что микросомальные десатуразы жирных кислот используют свободный микросомальный цитохром b5 в качестве своего донора электронов (Smith М. А. et al. (1990) Biochem. J. 272, 23-29, Smith M.A. et al. (1992) Biochem. J. 287, 141-144), и похоже, что подавляющее большинство идентифицированных последовательностей для этих ферментов, не содержат этот дополнительный домен цитохрома b5 (Okuley J. et al. (1994) Plant Cell. 6, 147-158, Aronel V. et al. (1992) Science 258, 1353-1355 и Napier, J.A. et. al. (1997) Biochemical J., 328: 717-8).
До настоящего изобретения было известно только два примера десатураз, содержащих домен цитохрома b5, причем одна представляет собой Δ6 десатуразу бурачника, а другая представляет собой дрожжевую микросомальную Δ9 (OLE1) десатуразу (Napier, J.A. et al. (1997) Biochemical J., см. выше, и Mitchell AG, Martin CE (1995) J. Biol. Chem. 270, 29766-29772). OLE1, однако, содержит С-терминальный домен цитохрома b5 (Napier J.A. et al, (1997) Biochemical J, в печати, и Mitchell AG, Martin CE (1995) J. Biol. Chem. 270, 29766-29772). Причина цитохрома b5, возможно, в том, что Δ6 десатураза представляет собой десатуразу “переднего конца”. (Десатурацию “переднего конца” можно определить как конечную реакцию десатурации на цепи жирной кислоты, обычно вводящую двойные связи между существующей ранее связью и Δ-концом карбокси группы (Mitchell AG, Martin CE (1995) J. Biol. Chem. 270, 29766-29772 и Aitzetmuller К., Tseegsuren, N (1994) J. Plant Physiol. 143, 538-543).
В любом случае, теперь считается фактом, что как вариантный гистидиновый бокс, так и N-терминальный домен цитохрома b5 являются консервативными как у растений, так и у животных, о чем свидетельствует их наличие в обеих Δ6 десатуразах, бурачника и нематоды.
Таким образом, изобретение может давать возможность идентификации других Δ6 десатураз, а также других десатураз “переднего конца”, которые нужно идентифицировать по наличию этих мотивов.
Claims (36)
1. Выделенный полипептид, обладающий десатуразной активностью, который:
а) имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг.1;
б) имеет одну или более чем одну аминокислотную делецию, вставку или замену относительно полипептида как определено в (а) выше, но вместе с тем имеет с ним по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности; или
в) представляет собой фрагмент полипептида как определено в (а) или (б) выше, который имеет длину по меньшей мере 100 аминокислот.
2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что он имеет домен цитохрома.
3. Полипептид по п.2, отличающийся тем, что он имеет домен цитохрома b5.
4. Полипептид по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что он имеет по меньшей мере один гистидиновый бокс.
5. Полипептид по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что он имеет три гистидиновых бокса.
6. Полипептид по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что он представляет собой десатуразу, которая вводит двойную связь между уже существующей двойной связью и карбоксигруппой жирной кислоты.
7. Полипептид по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что он представляет собой Δ6-десатуразу.
8. Полипептид по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что он встречается в природе в организме, который не аккумулирует γ-линоленовую кислоту (ГЛК).
9. Полипептид по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что он встречается в природе в эукариоте.
10. Полипептид по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что он встречается в природе в животном.
11. Полипептид по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что он встречается в природе в нематоде.
12. Полипептид по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что он встречается в природе Caenorhabitis elegans.
13. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что он состоит из аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1, или из ее участка.
14. Полипептид по любому из пп.1-13 для получения или отбора антител.
15. Полипептид по любому из пп.1-13 для применения в медицине.
16. Полипептид по любому из пп.1-13 для приготовления лекарства для лечения расстройства, в которое вовлечен дефицит γ-линоленовой кислоты или метаболита, образующегося in vivo из γ-линоленовой кислоты (ГЛК).
17. Полипептид по п.16, отличающийся тем, что метаболит представляет собой эйкозаноид.
18. Полипептид по любому из пп.15-17, для лечения расстройства, представляющего собой экзему, масталгию, гиперхолестеринемию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, диабетическую невропатию, вирусные инфекции, угри, цирроз, гипертензию и рак.
19. Маркер трансформации организма, содержащий полипептид по любому из пп.1-13.
20. Маркер по п.19, отличающийся тем, что организмом является растение.
21. Антитело или его производное, которое специфически связывается с полипептидом по любому из пп.1-13 и получено с использованием этого полипептида.
22. Антитело или его производное по п.21 для диагностики расстройств, которые возникают вследствие отсутствия функциональной десатуразы.
23. Способ оценки того, имеет ли организм полипептид по любому из пп.1-13 или нет, при котором определяют, имеет ли этот организм полипептид, который связывается с антителом или его производным по п.21 или нет.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что организм представляет собой человека.
25. Способ по п.23 или 24, отличающийся тем, что его осуществляют предпочтительно in vitro.
26. Способ получения ГЛК, при котором для превращения линолевой кислоты в ГЛК используют полипептид по любому из пп.1-13.
27. Способ получения октадекатетраеновой кислоты (ОТК), при котором для превращения α-линоленовой кислоты в ОТК используют полипептид по любому из пп.1-13.
28. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая:
а) кодирует полипептид по любому из пп.1-13, или
б) представляет собой комплемент молекулы нуклеиновой кислоты как определено в (а) выше.
29. Молекула нуклеиновой кислоты по п.28 для применения в качестве зонда или в качестве праймера.
30. Молекула нуклеиновой кислоты по п.28 для получения организма, который аккумулирует ГЛК или метаболит, образующийся из ГЛК в этом организме.
31. Молекула нуклеиновой кислоты по п.28 для получения организма, который является хладостойким.
32. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.28.
33. Вектор по п.32 для получения организма, который аккумулирует ГЛК или метаболит, образующийся из ГЛК в этом организме.
34. Вектор по п.32 для получения организма, который является хладостойким.
35. Способ получения полипептида по любому из пп.1-13, при котором хозяина, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по п.28 или вектор по п.32, причем хозяин предпочтительно представляет собой растение, такое как масличную культуру рапс, подсолнечник, злаки, включая кукурузу, табак, бобы, включая арахис и сою, сафлор, масличную пальму, кокосовую пальму и другие пальмы, хлопок, кунжут, горчицу, лен, клещевину, бурачник и энотеру, или материал для размножения растений, инкубируют в условиях, вызывающих экспрессию указанного полипептида, а затем очищают указанный полипептид.
36. Способ создания хозяина, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по п.28 или вектор по п.32, причем хозяин предпочтительно представляет собой растение, такое, как масличную культуру рапс, подсолнечник, злаки, включая кукурузу, табак, бобы, включая арахис и сою, сафлор, масличную пальму, кокосовую пальму и другие пальмы, хлопок, кунжут, горчицу, лен, клещевину, бурачник и энотеру, или материал для размножения растений, при котором нуклеиновую кислоту по п.28 или вектор по п.32 вводят в организм с обеспечением его трансформации.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9724783.7 | 1997-11-24 | ||
GBGB9724783.7A GB9724783D0 (en) | 1997-11-24 | 1997-11-24 | Novel polypeptides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2000113073A RU2000113073A (ru) | 2002-10-20 |
RU2248397C2 true RU2248397C2 (ru) | 2005-03-20 |
Family
ID=10822539
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000113073/13A RU2248397C2 (ru) | 1997-11-24 | 1998-11-24 | Гены десатураз и их применение |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6897050B1 (ru) |
EP (1) | EP1032682A1 (ru) |
JP (1) | JP2002505848A (ru) |
KR (1) | KR20010032433A (ru) |
CN (1) | CN1285874A (ru) |
AU (1) | AU762750B2 (ru) |
BR (1) | BR9815419A (ru) |
CA (1) | CA2311472A1 (ru) |
EE (1) | EE200000304A (ru) |
GB (1) | GB9724783D0 (ru) |
HU (1) | HUP0004484A3 (ru) |
IN (1) | IN1998KO02070A (ru) |
MX (1) | MXPA00005109A (ru) |
PL (1) | PL340760A1 (ru) |
RU (1) | RU2248397C2 (ru) |
WO (1) | WO1999027111A1 (ru) |
ZA (1) | ZA9810716B (ru) |
Families Citing this family (46)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6355861B1 (en) * | 1991-10-10 | 2002-03-12 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase |
US6683232B1 (en) | 1991-10-10 | 2004-01-27 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of γ linolenic acid by a Δ6-desaturase |
US7183458B1 (en) | 1999-06-07 | 2007-02-27 | Basf Plant Science Gmbh | Δ6 acetylenase and Δ6-desaturase from ceratodon purpureus |
DE10030976A1 (de) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Basf Ag | DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren |
EP1190080A1 (de) * | 1999-07-06 | 2002-03-27 | BASF Plant Science GmbH | $g(D)6-DESATURASEGENE EXPRIMIERENDE PFLANZEN UND PUFAS ENTHALTENDE ÖLE AUS DIESEN PFLANZEN UND EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG UNGESÄTTIGTER FETTSÄUREN |
ATE510908T1 (de) | 2000-09-28 | 2011-06-15 | Bioriginal Food & Science Corp | Fad5-2, mitglied der desaturase-familie und verwendungen davon |
DE10102337A1 (de) | 2001-01-19 | 2002-07-25 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte |
US7179647B2 (en) | 2002-01-30 | 2007-02-20 | Basf Plant Science Gmbh | Elongase gene and method for producing polyunsaturated fatty acids |
GB2385852A (en) | 2002-02-27 | 2003-09-03 | Rothamsted Ex Station | Delta 6-desaturases from Primulaceae |
DE10219203A1 (de) | 2002-04-29 | 2003-11-13 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen |
ES2525212T3 (es) | 2002-12-19 | 2014-12-19 | University Of Bristol | Procedimiento novedoso de producción de ácidos grasos poliinsaturados |
CA2517253C (en) | 2003-02-27 | 2018-07-03 | Basf Plant Science Gmbh | Method for the production of polyunsaturated fatty acids |
EP2365063B1 (de) | 2003-03-31 | 2015-10-14 | University Of Bristol | Neue pflanzliche Acyltransferase spezifisch für langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren |
MXPA05010571A (es) | 2003-04-08 | 2005-11-23 | Basf Plant Science Gmbh | Delta-4-desaturasas a partir de euglena gracilis, que expresan plantas y aceites que comprenden pufa |
CA3037924A1 (en) | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Basf Plant Science Gmbh | Method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
US11952581B2 (en) | 2003-08-01 | 2024-04-09 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
ES2375363T3 (es) | 2004-02-27 | 2012-02-29 | Basf Plant Science Gmbh | Método para la preparación de ácidos grasos omega-3 insaturados en organismos transgénicos. |
JP4567047B2 (ja) | 2004-02-27 | 2010-10-20 | ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー | トランスジェニック植物における多価不飽和脂肪酸の製造方法 |
CN103451246B (zh) | 2004-04-22 | 2018-02-16 | 联邦科学技术研究组织 | 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸 |
CA3056110C (en) | 2004-04-22 | 2020-07-14 | Surinder Pal Singh | Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells |
DE602005023308D1 (de) | 2004-06-04 | 2010-10-14 | Fluxome Sciences As | Stoffwechseltechnisch hergestellte zellen zur produktion mehrfach ungesättigter fettsäuren |
DE102005013779A1 (de) | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen |
DE102005038036A1 (de) | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen |
GB2431158A (en) | 2005-10-13 | 2007-04-18 | Rothamsted Res Ltd | Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid |
DE102005052551A1 (de) | 2005-11-02 | 2007-05-16 | Rothamsted Res Harpenden | Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae |
GB0603160D0 (en) | 2006-02-16 | 2006-03-29 | Rothamsted Res Ltd | Nucleic acid |
AR059376A1 (es) | 2006-02-21 | 2008-03-26 | Basf Plant Science Gmbh | Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados |
US8629195B2 (en) | 2006-04-08 | 2014-01-14 | Bayer Materialscience Ag | Production of polyurethane foams |
CA2659993C (en) | 2006-08-24 | 2016-01-05 | Basf Plant Science Gmbh | Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains |
BRPI0716075A2 (pt) | 2006-08-29 | 2013-08-06 | Commw Scient Ind Res Org | sÍntese de Ácidos graxos |
ES2531391T3 (es) | 2006-10-06 | 2015-03-13 | Basf Plant Science Gmbh | Delta-5 desaturasas y procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos no humanos |
WO2009016208A2 (de) | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Basf Plant Science Gmbh | Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen |
WO2009077478A2 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Basf Plant Science Gmbh | Promoters from brassica napus for seed specific gene expression |
WO2009133145A1 (en) | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Basf Plant Science Gmbh | Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
CA2989798C (en) | 2008-07-01 | 2019-11-05 | Basf Plant Science Gmbh | Promoters from brassica napus for seed specific gene expression |
US9090902B2 (en) | 2008-08-26 | 2015-07-28 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil |
BR122021003836B1 (pt) | 2008-11-18 | 2022-02-01 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Polinucleotídeo isolado e/ou exógeno que não ocorre de forma natural, vetor e método para produzir óleo contendo ácidos graxos insaturados |
DE112009003708T5 (de) | 2008-12-12 | 2012-09-13 | Basf Plant Science Gmbh | Desaturasen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenenOrganismen |
EP2821492A3 (en) | 2009-05-13 | 2015-04-08 | BASF Plant Science Company GmbH | Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production |
CA2765560C (en) * | 2009-06-22 | 2017-10-31 | Saga University | Mutation that increases the oleic acid content in soybean oil and responsible gene thereof |
CA2804925A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Basf Plant Science Company Gmbh | Acyltransferases from thraustochytrium species and uses thereof in fatty acid production |
BR112014025265A2 (pt) | 2012-04-12 | 2017-07-11 | Rothamsted Res Ltd | produção de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 de cadeia longa |
HUE033766T2 (en) | 2012-06-15 | 2018-01-29 | Commw Scient Ind Res Org | Preparation of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells |
GB201217524D0 (en) | 2012-10-01 | 2012-11-14 | Rothamsted Res Ltd | Recombinant organisms |
CA3241340A1 (en) | 2013-12-18 | 2015-06-25 | Grains Research And Development Corporation | Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids |
SG11201610596PA (en) | 2014-06-27 | 2017-01-27 | Commw Scient Ind Res Org | Lipid comprising docosapentaenoic acid |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8813766D0 (en) * | 1988-06-10 | 1988-07-13 | Efamol Holdings | Essential fatty acid compositions |
EP0400547A1 (en) * | 1989-06-02 | 1990-12-05 | Abbott Laboratories | Parenteral nutrition product |
IE892333A1 (en) * | 1989-07-19 | 1991-06-19 | Univ Galway College | Diagnostic assays and antibodies for use in said assays |
US5614393A (en) * | 1991-10-10 | 1997-03-25 | Rhone-Poulenc Agrochimie | Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase |
PT1598422E (pt) * | 1997-04-11 | 2013-04-03 | Abbott Lab | Métodos e composições para síntese de ácidos gordos poliinsaturados de cadeia longa em plantas |
US5968809A (en) * | 1997-04-11 | 1999-10-19 | Abbot Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
-
1997
- 1997-11-24 GB GBGB9724783.7A patent/GB9724783D0/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-11-24 EP EP98955769A patent/EP1032682A1/en not_active Withdrawn
- 1998-11-24 AU AU12497/99A patent/AU762750B2/en not_active Ceased
- 1998-11-24 HU HU0004484A patent/HUP0004484A3/hu unknown
- 1998-11-24 CA CA002311472A patent/CA2311472A1/en not_active Abandoned
- 1998-11-24 ZA ZA9810716A patent/ZA9810716B/xx unknown
- 1998-11-24 JP JP2000522252A patent/JP2002505848A/ja active Pending
- 1998-11-24 CN CN98812900A patent/CN1285874A/zh active Pending
- 1998-11-24 BR BRPI9815419-2A patent/BR9815419A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-11-24 KR KR1020007005673A patent/KR20010032433A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-11-24 EE EEP200000304A patent/EE200000304A/xx unknown
- 1998-11-24 RU RU2000113073/13A patent/RU2248397C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-11-24 US US09/555,093 patent/US6897050B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-24 PL PL98340760A patent/PL340760A1/xx unknown
- 1998-11-24 WO PCT/GB1998/003507 patent/WO1999027111A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-11-24 MX MXPA00005109 patent/MXPA00005109A/es unknown
- 1998-11-24 IN IN2070KO1998 patent/IN1998KO02070A/en unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. SWINBOURNE J. et al., EMBL ACCESSION № Z70271, 23.03.1996. 2. HILLIER L. et al., EMBL ACCESSION № R05219, 18.04.1995. 3. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IN1998KO02070A (ru) | 2005-03-11 |
CA2311472A1 (en) | 1999-06-03 |
ZA9810716B (en) | 1999-06-16 |
MXPA00005109A (es) | 2001-12-31 |
US6897050B1 (en) | 2005-05-24 |
KR20010032433A (ko) | 2001-04-25 |
AU762750B2 (en) | 2003-07-03 |
GB9724783D0 (en) | 1998-01-21 |
HUP0004484A3 (en) | 2002-11-28 |
EE200000304A (et) | 2001-06-15 |
CN1285874A (zh) | 2001-02-28 |
BR9815419A (pt) | 2007-05-22 |
EP1032682A1 (en) | 2000-09-06 |
WO1999027111A1 (en) | 1999-06-03 |
JP2002505848A (ja) | 2002-02-26 |
HUP0004484A2 (hu) | 2001-04-28 |
PL340760A1 (en) | 2001-02-26 |
AU1249799A (en) | 1999-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2248397C2 (ru) | Гены десатураз и их применение | |
KR100316068B1 (ko) | 델타6-불포화효소에 의한 감마리놀레산의 제조 | |
CN1268749C (zh) | 用于改变植物中酶和乙酰辅酶a水平的材料和方法 | |
JP4126102B2 (ja) | 脂肪アシル−CoA:脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ | |
AU776711B2 (en) | Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids | |
JP3313724B2 (ja) | 脂肪酸の不飽和化酸素遺伝子,当該遺伝子を含むベクター,当該遺伝子が導入された植物及びその作出方法 | |
JP4108765B2 (ja) | 植物脂肪酸エポキシゲナーゼ遺伝子及びその用途 | |
EP1656449B1 (en) | Fatty acid desaturases from primula | |
AU2005273230B2 (en) | Polypeptide having activity of unsaturating omega3-fatty acid, polynucleotide coding for the polypeptide and use thereof | |
US6825017B1 (en) | Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids | |
JPH09505739A (ja) | 脂肪アシル−CoA代謝に関与する植物細胞質タンパク質をコードする核酸配列 | |
JPH06500234A (ja) | 植物の脂肪酸シンターゼ | |
JPH05507199A (ja) | 植物チオエステラーゼ | |
KR100236483B1 (ko) | 종자 식물의 지방 아실 환원 효소 단백질 및 유전자 | |
AU3184999A (en) | Limanthes oil genes | |
US20090138992A1 (en) | Limnanthes oil genes | |
JP2009291204A (ja) | 植物における脂肪酸代謝の改変 | |
JPH09501325A (ja) | 形質転換植物における蝋エステル | |
US20030172398A1 (en) | Novel delta-12 desaturase and methods of using it for synthesis of polyunsaturated fatty acids | |
JP2004515223A (ja) | ピルビン酸:nadp+オキシドレダクターゼ、およびその使用 | |
JP2002532089A (ja) | 脂肪アシル−CoA:脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ | |
Napier | Desaturase Genes And Their Use (Patent WO 1999/027111 A1) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20051125 |