JP2002505848A

JP2002505848A - デサチュラーゼ遺伝子およびそれらの使用

Info

Publication number: JP2002505848A
Application number: JP2000522252A
Authority: JP
Inventors: ネイピア，ジョナサン，エー．
Original assignee: ザユニバーシティオブブリストル
Priority date: 1997-11-24
Filing date: 1998-11-24
Publication date: 2002-02-26
Also published as: IN1998KO02070A; HUP0004484A3; ZA9810716B; US6897050B1; BR9815419A; CN1285874A; KR20010032433A; PL340760A1; CA2311472A1; GB9724783D0; EP1032682A1; EE200000304A; AU1249799A; RU2248397C2; AU762750B2; WO1999027111A1; HUP0004484A2; MXPA00005109A

Abstract

(57)【要約】セノラブディティスエレガンスΔ⁶デサチュラーゼをコードするｃＤＮＡがクローン化され、配列決定がされて、そしてΔ⁶デサチュラーゼアミノ酸配列が決定された。セノラブディティスエレガンスΔ⁶デサチュラーゼは、既知のルリヂサΔ⁶デサチュラーゼとは、意外にも低いレベルの配列同一性しか有しない。セノラブディティスエレガンスΔ⁶デサチュラーゼは、酵母菌中で発現された。そして、その他のデサチュラーゼは宿主生物（例えば植物）中でクローン化され、有用な代謝物質を提供するために用いるここができる。

Description

【発明の詳細な説明】

［技術分野］本発明は、特に、新規のデサチュラーゼおよびその使用に関する。過去２〜３年に亘り、多数のミクロソーム性および可溶性脂肪酸デサチュラーゼ
が、高等植物、特にArabidopsis thalianaから単離されている。これは、脂肪酸
不飽和化または伸張を欠いた突然変異体Arabidopsis株の生成および相補性への遺伝学的および生化学的アプローチの組合せの結果から生じた（Somerville C,
Browse J（1996）Trends Cell Biol. 6, 148-1153）。このアプローチの重要性は、それらの疎水性のために古典的精製技術の手に負えないことが過去に立証さ
れた酵素であるミクロソームデサチュラーゼ、例えばΔ¹²（Okuley J. et al,（
1994）, Plant Cell 6, 147-158）およびΔ¹⁵（Arondel V, et al,（1992）Scie
nce 258, 1353-1355）デサチュラーゼ（それぞれＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子
によりコードされる）をコードする遺伝子の単離および特性化により確認されて
いる。これらのおよび関連する酵素、例えばRicinus communisからのΔ１２ヒド
ロキシラーゼ（van de Loo FN et al（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
6743-6747）の単離は、植物ミクロソームデサチュラーゼにおける多数の保存モチーフ、特にいわゆる「ヒスチジンボックス」の同定を可能にした（Shanklin,
J et al（1997） Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6743-6747）。これらのモチーフを含有するタンパク質は、二鉄中心含有酵素と分類され得る（Shanklin,
J et al（1997） Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2981-1986）。

【０００１】 WO93/11245（Du Pont）は、種々の植物から単離されたデサチュラーゼ、特に Δ¹²およびΔ¹⁵デサチュラーゼをコードする種々の核酸断片を開示する。近年、
ｃＤＮＡクローンが、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）を蓄積する植物であるルリヂサ
（Borago officinalis）から、これらのヒスチジンモチーフに対する高変性ＰＣ
Ｒを用いて単離された。米国特許第5614393号（Rhone-Poulenc Agrochimie）は、ルリヂサΔ⁶デサチュラーゼのヌクレオチド配列を開示し、特許請求する。明細書はΔ⁶デサチュラーゼコード化核酸が難なく当業者により動物細胞から単離され得たことを示唆する一方、適切な動物が示唆されていず（真菌および細菌細
胞が示唆されているのに対比して）、そして動物細胞からのこのような核酸の単
離の開示もない。単離ＤＮＡクローンは、ミクロソームΔ⁶デサチュラーゼをコードすることが、トランスジェニックタバコにおける異種発現により示された（
Sayanova O et al（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 4211-4216）。Δ⁶ 位置での脱飽和は高等植物では例外的修飾であって、種子および／または葉中に
Δ⁶不飽和脂肪酸ＧＬＡおよびオクタデカテトラエン酸（ＯＴＡ；１８；４Δ^6,9 ^,12,15 。ステアリドン酸としても知られている）を蓄積する少数の種、例えばル
リヂサ、マツヨイグサ（Oenothera種）およびアカフサスグリ（Ribes種）におい
てのみ生じる。

【０００２】ＧＬＡは非常に有益な植物脂肪酸であり、多数の医学的症状、例えば湿疹およ
び乳房痛の治療に広範に用いられる。ＧＬＡの適用は、内生的Δ⁶不飽和脂肪酸の損失を元に戻すか、またはそれに対する要件増大に応じる、と仮定されている
（Horrobin, D.F.（1990）Rev. Contemp. Pharmacother. 1:1-45）。

【０００３】参照のために、第５図が提供され、ある種の生物体（例えばヒト）において生
じると考えられるそしてΔ⁶デサチュラーゼを伴う代謝経路を、簡略化した形態で示す。ＧＬＡはΔ⁶デサチュラーゼの作用下でリノール酸からインビトロ（in
vivo）で合成され得ること、そしてＧＬＡを用いてジホモ−ＧＬＡを合成し、こ
れはΔ⁵デサチュラーゼの影響下でアラキドン酸に転化され得る、ということも観察され得る。アラキドン酸は種々の重要なエイコサノイド（例えば、プロスタ
グランジンおよびロイコトリエン）の前駆体である。Δ⁶デサチュラーゼはさらにα−リノレン酸をＯＴＡに転化する。したがって、Δ⁶デサチュラーゼがこれらの生物学的活性分子の生合成経路における第一参画工程である、ということは
明らかである（第５図参照）。

【０００４】予備単離ルリヂサミクロソームΔ⁶デサチュラーゼの配列は、シトクロムｂ₅と
の相同性を示すＮ末端延長を含有する点で、そしてさらに第三（最もＣ末端）ヒ
スチジンボックスがコンセンサス配列（Shanklin J et al（1997）Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 94, 2981-1986）Ｈ−Ｘ−Ｘ−Ｈ−Ｈから変わって、グルタミンが第一ヒスチジンに取って代わる点で、予備特性化された植物ミクロソームデ
サチュラーゼ／ヒドロキシラーゼと異なる。これは、藍細菌類のSynechocystis のΔ⁶デサチュラーゼの場合にも観察された（GenBank ID; L11421）。WO93/0671
2（Rhone Poulenc Agrochimie）は、Synechocystisから単離されたΔ⁶デサチュラーゼをコードする単離核酸を開示し、細菌Δ⁶デサチュラーゼおよびそれらの使用を特許請求する。

【０００５】 Δ⁶脂肪酸脱飽和は高等植物においては例外的修飾であるが、しかし動物においては一般的であると考えられる。必須脂肪酸であるリノール酸（１８；２Δ^9, ¹² ）は、エイコサノイド（例えばプロスタグラジンおよびロイコトリエン）の生
合成経路の第一工程としてのΔ⁶デサチュラーゼによりＧＬＡに脱飽和される。これはＧＬＡの迅速な代謝（ジホモＧＬＡおよびアラキドン酸への、即ちそれぞ
れ２０；３Δ^8,11,14および２０；４Δ^5,8,11,14への）をもたらす。したがって
、ＧＬＡの蓄積は、通常は観察されない。

【０００６】線虫セノラブディティスエレガンス（Caenorhabitis elegans）は、それが十分に理解された属であり、そして高等動物、例えばヒトと多数の類似性を有する
という点で非常に有用であり、したがって、このような動物に用いるためのデサ
チュラーゼの開発に非常に有用である。本発明によれば、第１図に示したアミノ酸配列を含む、デサチュラーゼ活性を有
するポリペプチドが提供される。

【０００７】第１図に示したアミノ酸配列は、線虫セノラブディティスエレガンス中に存在
するΔ⁶デサチュラーゼの配列である。これは、本発明の前には、動物Δ⁶デサチ
ュラーゼの配列決定または精製の成功例が報告されていないため、非常に有意で
ある。線虫セノラブディティスエレガンスはＧＬＡを蓄積しないので、それから
のΔ⁶デサチュラーゼの単離は、デサチュラーゼ遺伝子を単離するための思いも寄らぬ目標であった。

【０００８】本発明のデサチュラーゼは、既知のデサチュラーゼとは有意に異なる。本発明
のΔ⁶デサチュラーゼとWO93/11245に記載されたArabidopsisからのミクロソーム
Δ¹²およびΔ¹⁵デサチュラーゼとの間の相同性は、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを
用いて確定した場合、それぞれ２４％および１６％である。本発明のΔ⁶デサチュラーゼ遺伝子は、Spychalla, J.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 114
2-1147に記載されたC. elegansＦＡＴ−１デサチュラーゼと２１％の同一性を示
す。本発明のΔ⁶デサチュラーゼとWO93/06712に記載されたSynechochocystisΔ⁶ との間の配列相同性は２３％に過ぎない。したがって、本発明の別の態様によれば、単離動物Δ⁶デサチュラーゼが提供される。

【０００９】第１図に示したアミノ酸配列はさらに、それがルリヂサΔ⁶デサチュラーゼ（本発明の前にシーケンシングされた唯一のその他の真核生物Δ⁶デサチュラーゼ）と非常に低レベルの配列同一性を有するため、意義を有する。実際、このレベ
ルの配列同一性は、３２％より低い。このような低レベルの同一性では、２つの
ポリペプチドは完全に異なる機能を有すると予測され得る。意外にも、両方とも
Δ⁶デサチュラーゼ活性を有する。

【００１０】しかしながら、本発明は、第１図に示した配列を有するΔ⁶デサチュラーゼに限定されない。それは、それと少なくとも３２％の配列同一性を有する他のデサ
チュラーゼも含む。本発明の好ましいポリペプチドは、それとの少なくとも４０
％、さらに好ましくは少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する。さらに
好ましくは、配列同一性の程度は、少なくとも７５％である。少なくとも９０％
、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列同一性が最も好ましい。

【００１１】本発明の目的のために、配列同一性（アミノ酸またはヌクレオチド）は、Wisc
onsin Sequence Analysis Package GCG 8.0の「ＢＥＳＴＦＩＴ」プログラムを用いることにより確定され得る。高度の配列同一性が存在する場合には、アミノ酸配列の差は相対的に少ない。し
たがって、例えば差は２０未満、１０未満または５未満でさえあり得る。

【００１２】前記のポリペプチドの断片も本発明の範囲内であるが、但し、それらはデサチ
ュラーゼ活性を有し、即ちそれらは、ＧＣＭＣにより確定されるように、特定の
位置で基質に二重結合を導入する能力を有する。活性の最小の限界がある。これ
らの断片は、好ましくは、少なくとも１００アミノ酸鎖長である。さらに好まし
くは、断片は少なくとも１５０アミノ酸鎖長である。

【００１３】要するに、本発明のポリペプチドはデサチュラーゼ活性を有し、そして：ａ）第１図に示されたアミノ酸配列を含む、ｂ）前記ａ）で定義されるポリペプチドに対して１又は２以上のアミノ酸の欠
失、挿入または置換を有するが、前記ポリペプチドとアミノ酸配列が少なくとも
３２％は同一である、または、ｃ）少なくとも１００アミノ酸鎖長を有する前記ａ）またはｂ）で定義される
ポリペプチドの断片である、ポリペプチドである。「ポリペプチド」という用語は、特定の分子が、ペプチド結合により一緒に連結
される複数のアミノ酸を包含する、ということを示すために広範な意味で本明細
書中で用いられる。したがって、それはその範囲内に、文献中で時としてペプチ
ド、ポリペプチドまたはタンパク質として言及され得る物質を含む。

【００１４】望ましくは、本発明のポリペプチドは、シトクロムドメインを有する。シトク
ロムドメインは、ヘム補欠分子族を含有する電子伝達ドメインと定義され得る。
好ましくは、シトクロムｂドメインが存在する。さらに好ましくは、シトクロム
ｂ₅ドメインが存在する（望ましくは、これはＨ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｘ₁₅−Ｆ−Ｘ_3-6 −Ｈ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）モチーフを含む）。シトクロムｂ₅ ドメインは、第２Ｂ図に示したルリヂサΔ⁶デサチュラーゼおよびセノラブディティスエレガンスΔ⁶デサチュラーゼのアミノ酸配列の両方に存在する。シトクロムｂ₅ドメインは、好ましくは、Ｎ末端ドメインである。即ち、それはデサチュラーゼのＣ末端よりＮ末端により近い。これは、他のデサチュラーゼと対照を
成す。例えば、酵母菌Δ⁹デサチュラーゼはＣ末端シトクロムｂ₅ドメインを有し
、そして植物Δ¹²およびΔ¹⁵デサチュラーゼはいかなるｂ₅ドメインも有さない。

【００１５】本発明のポリペプチドは、好ましくは、１又は２以上（最も好ましくは３つ）
のヒスチジンボックスを有する。これらのうちの１つは、Ｈ→Ｑ置換を有する（
これは、一連の動物／植物種に亘って保存されると考えられる変異体ヒスチジン
ボックスを提供する）。

【００１６】本発明のポリペプチドは任意の領域特異性、例えばシス／トランス活性を有し
得るが、しかしそれらが、基のＣＯＯＨ（Δ末端）から測定されるＣ３〜Ｃ７位
置間に二重結合を導入するフロントエンドデサチュラーゼであるのが好ましい。
デサチュラーゼにより導入された二重結合の異なる位置を確定することにより、
当業者は容易に異なるデサチュラーゼを識別し得る。これは、既知の分析技法に
より、例えばガスクロマトグラフィーおよび質量分析法を用いることにより成さ
れ得る。本発明の特に好ましいデサチュラーゼはΔ⁶デサチュラーゼである。

【００１７】望ましくは、デサチュラーゼは、ＧＬＡを蓄積しない（即ち、ＧＬＡは産生さ
れ得るが、しかしそれは迅速に代謝されるため、普通は検出可能でない）１又は
２以上の生物中に天然に存在する。このようなデサチュラーゼは、１又は２以上
の動物において天然に存在する。デサチュラーゼは、１又は２以上の線虫、例え
ばセノラブディティスエレガンス中に天然に存在する。

【００１８】本発明の範囲をさらに十分に理解するために、前記のａ）、ｂ）およびｃ）の
各々の範囲内のポリペプチドを、ここでさらに詳細に説明する。＜ａ）の範囲内のポリペプチド＞ａ）の範囲内のポリペプチドは、第１図に示したアミノ酸配列で構成され得るか
、または付加的Ｎ末端および／または付加的Ｃ末端アミノ酸配列を有し得る。

【００１９】付加的Ｎ末端またはＣ末端配列は種々の理由のために提供され得るし、このよ
うな付加的配列を提供する技法は、当業界で周知である。このような技法として
は、遺伝子クローニング技術を用い、それにより核酸分子が一緒に結合されて、
適切な宿主でポリペプチドを発現するために用いられる。

【００２０】付加的配列は、特定のポリペプチドの特徴を変えるために提供され得る。これ
は、特定の発現系における発現の改良の場合にまたは発現の調節に有用であり得
る。例えば、付加的配列は、タンパク質分解的切断に対する何らかの保護を提供
し得る。

【００２１】付加的配列は、ポリペプチドの特性を変えて、同定または精製に役立てるのに
有用でもあり得る。例えば、シグナル配列が存在して、細胞内の特定の位置への
ポリペプチドの輸送を指図し、あるいは細胞からポリペプチドを運び出し得る。

【００２２】異なるシグナル配列が、異なる発現系に関して用いられる。付加的配列の提供の別の例は、ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィ
ーにより単離され得る部分に連結される場合である。その部分はエピトープであ
り得るし、アフィニティーカラムは前記のエピトープ（望ましくは、高度の特異
性を有する）と結合する固定化抗体または固定化抗体断片を包含し得る。その結
果生じる融合タンパク質は、通常は、適切な緩衝液の付加によりカラムから溶離
され得る。

【００２３】しかしながら、付加的Ｎ末端またはＣ末端配列は、本発明のポリペプチドを得
るために用いられる特定の技法の結果として単に存在し、任意の特定の有益な特
徴を提供する必要はない。＜ｂ）の範囲内のポリペプチド＞ここで前記のｂ）に限定されるポリペプチドに目を向けると、これらは前記の
ａ）に示されたポリペプチドの変異体である、と理解される。

【００２４】変異体を産生するために所望の特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列にし
ばしば種々の変更が成され得るが、変異体は依然としてその特性を有する。前記
のａ）に記載したポリペプチドのこのような変異体は本発明の範囲内であり、以
下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の項でさらに詳細に考察される。それらは、対立遺伝子
および非対立遺伝子変異体を含む。

【００２５】（ｉ）置換本発明の変異体の一例は、１又は２以上のアミノ酸の１又は２以上のその他の
アミノ酸による置換に加えて、前記のａ）に定義されたようなポリペプチドであ
る。種々のアミノ酸が同様の特徴を有するということに、当業者は気づく。ポリペプ
チドの１又は２以上のこのようなアミノ酸は、しばしば、そのポリペプチドの所
望の特性（例えばデサチュラーゼ活性）を排除することなく、１又は２以上のそ
の他のこのようなアミノ酸により置換され得る。

【００２６】例えば、アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロ
イシンは、しばしば互いに置換され得る（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これ
らの考え得る置換のうち、グリシンおよびアラニンが用いられて互いに置換し（
それらは相対的に短い側鎖を有するため）、そしてバリン、ロイシンおよびイソ
ロイシンが用いられて互いに置換する（それらは、疎水性であるより大きい脂肪
族側鎖を有するため）のが好ましい。しばしば互いに置換され得るその他のアミ
ノ酸としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖
を有するアミノ酸）；リシン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖を有す
るアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸
）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびに
システインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。
この種の置換は、しばしば、「同類」または「半同類」アミノ酸置換と呼ばれる
。

【００２７】（ｉｉ）欠失アミノ酸欠失は、ポリペプチドの全長および分子量が低減される一方、所望の
活性を依然保持し得るために、有益であり得る。これは、特定の目的に必要なポ
リペプチドの量を低減させ得る。

【００２８】（ｉｉｉ）挿入前記のａ）に定義されたようなポリペプチドに関するアミノ酸挿入も成され得
る。これは、ポリペプチドの性質を変えるために（例えば、同定、精製または発
現を手助けするために）成され得る。前記のａ）に定義されたようなポリペプチドの配列に関するアミノ酸変更（置換
、欠失または挿入のいずれか）を組み入れるポリペプチドが、任意の適切な技法
を用いて提供され得る。例えば、所望の配列変更を組み入れる核酸配列は、特定
部位の突然変異誘発により提供され得る。次にこれを用いて、そのアミノ酸配列
の対応する変化を有するポリペプチドの発現を可能にし得る。＜ｃ）の範囲内のポリペプチド＞上記のように、ポリペプチドの長さを低減することは、しばしば有益である。
したがって、本発明の特徴ｃ）は前記のポリペプチドａ）またはｂ）の断片を網
羅し、これらは少なくとも１００アミノ酸鎖長であるが、第１図に示した全長ポ
リペプチドと同じ長さである必要はない。望ましくは、これらの断片は少なくと
も２００，少なくとも３００または少なくとも４００アミノ酸鎖長である。

【００２９】本発明のポリペプチドの種々の使用は、例としてのみここに記載される。本発明のポリペプチドは、とりわけ有用な分子を得るのに用いられ得る。例えば
、Δ⁶デサチュラーゼは、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）を得るのに、またはＧＬＡが前駆体であるものに関しては代謝物質を得るのに用いられ得る。例えば、ｎ−
３（またはω−３）脂肪酸の一成員であるオクタデカテトラエン酸（ＯＴＡ；１
８；４Δ^6,9,12,15）は、α−リノレン酸のΔ⁶−脱飽和により産生され得る。

【００３０】ＧＬＡ、ＯＴＡおよびそれらの代謝物質は、薬剤として有用である。それらは
、ＧＬＡのまたはＧＬＡからインビボ（in vivo）で得られる代謝物質（例えば、エイコサノイド）の欠乏を伴う疾患を治療するための薬剤の調製に用いられ得
る。治療され得る疾患としては、湿疹、乳房痛、高コレステロール血症、アテロ
ーム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、糖尿病性ニューロパシー、ウイルス感染、ア
クネ、高血圧、肝硬変および癌が挙げられる。

【００３１】代謝物質は、適切な宿主中でインビボに、あるいはインビトロ（in vitro）で
産生され得る。代謝物質がインビトロで産生される場合、本発明のデサチュラーゼおよびその基
質は、普通は別々に提供され、次に代謝物質を産生するのが望ましい場合には併
用される。したがって、本発明は、ＧＬＡまたはＯＴＡの製造方法であって、本
発明のΔデサチュラーゼを用いてリノール酸基質またはα−リノレン酸基質をそ
れぞれＧＬＡまたはＯＴＡに転化する工程を含む方法を、その範囲内に含む。

【００３２】代謝物質が、植物または動物のような生物体中、インビボで産生されるもので
ある場合、本発明のデサチュラーゼのための基質は、普通は、関連非ヒト生物そ
れ自体により提供される。したがって、代謝物質のインビボ産生は、本発明のデ
サチュラーゼをコードする遺伝子を生物中に挿入し、生物体にデサチュラーゼを
発現させることにより成し遂げられ得る。デサチュラーゼは次に、その基質上で
作用し得る。したがって、本発明のポリペプチドは、普通はこのような活性を保
有しない生物体中にデサチュラーゼ活性を提供し、またはすでに何らかのデサチ
ュラーゼ活性を有する生物体中のデサチュラーゼ活性レベルを増大するために用
いられる、と理解される。所望により、有用な代謝物質がこのような生物体から
精製され得る。あるいは、生物体それ自体が、代謝物質の供給源として直接用い
られ得る。デサチュラーゼ活性を有するトランスジェニック生物体を提供するた
めに用いられ得る特定のクローニング技術に関して以下で考察する。

【００３３】本発明のポリペプチドは、生物体の形質転換の指標としても用いられ得る。例
えば、形質転換されるよう意図された生物体は特定のデサチュラーゼを有さず、
そして形質転換に用いられるよう意図された核酸は、そのデサチュラーゼをコー
ドし、検定は、デサチュラーゼが存在するか否かを確定するために試みられる形
質転換の後に実施され得る。したがって、Δ⁶デサチュラーゼの場合には、ＧＬＡの存在に関する検定が成され、そしてＧＬＡはΔ⁶デサチュラーゼコード配列を含む機能性導入遺伝子カセットの存在に関する簡単なマーカーとして役立ち得
る。

【００３４】本発明のさらなる使用は、抗体を提供する場合である。本発明は、本発明のポ
リペプチドと結合する抗体をその範囲内に含む。好ましい抗体は本発明のポリペプチドと特異的に結合し、したがって、このよう
なポリペプチドを精製するために用いられ得る（例えば、それらは固定化され、
本発明のポリペプチドと結合するために用いられる。ポリペプチドは次に、適切
な条件下で適切な溶離液で洗浄することにより溶離され得る）。本発明の範囲内の抗体またはその誘導体は、診断に用いられ得る。例えば、この
ような抗体または誘導体を用いる結合検定は、特定のデサチュラーゼが存在する
か否かを確定するために用いられ得る。これは、機能性デサチュラーゼの非存在
のために生じる疾患を診断する場合に有用である。

【００３５】本発明の範囲内の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。
ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドが動物中に注入される場合、適切
な動物宿主（例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギまたは
サル）中でのそれらの産生を刺激することにより生成され得る。必要な場合には
、アジュバントが本発明のポリペプチドと一緒に投与され得る。抗体は次に、本
発明のポリペプチドとのそれらの結合によって精製され得る。

【００３６】モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから産生され得る。これらは、不死細
胞株を生成するために、骨髄腫細胞および所望の抗体を産生する脾臓細胞を融合
することにより生成され得る。したがって、周知のケラー＆ミルスタイン技法（
Nature 256, 52-55（1975））またはこの技術の変法が用いられ得る。特定のポリペプチドと結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を産生
するための技術は、現在、当業界では十分に開発されている。それらは、標準的
免疫学教科書に、例えばRoitt et al, Immunology second edition（1989）, Ch
urchill Livingstone, Londonで考察されている。

【００３７】全抗体の他に、本発明は、本発明のポリペプチドと結合し得るその誘導体を含
む。したがって、本発明は、抗体断片および合成構築物を含む。抗体断片および
合成構築物の例は、Dougall et al, in Tibtech 12, 372-379（September 1994 ）により示される。抗体断片としては、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦｖ断片が挙げられる（これらは、例えばRoitt et al（上記）に考察されている）。Ｆｖ断片は、修飾されて、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子として既知の合成構築物を産生し得る。
これは、ペプチドリンカー共有結合Ｖ_hおよびＶ_l領域を含み、分子の安定性に寄
与する。用いられ得るその他の合成構築物としては、ＣＤＲペプチドが挙げられ
る。これらは、抗原結合決定基を包含する合成ペプチドである。ペプチド模倣物
も用いられ得る。これらの分子は、通常は、ＣＤＲループの構造を模倣し、抗原
相互作用性側鎖を含む配座的制限化有機環である。

【００３８】合成構築物としては、キメラ分子が挙げられる。したがって、例えばヒト化（
または霊長類化）抗体またはそれらの誘導体は、本発明の範囲内である。ヒト化
抗体の例は、齧歯類超可変領域以外にヒトフレームワーク領域を有する抗体であ
る。合成構築物としては、抗原結合の他に何らかの望ましい特性を有する分子を提供
する付加的部分を含む分子も挙げられる。例えば、その部分は標識（例えば、蛍
光または放射能標識）であり得る。あるいは、それは製薬的に活性な作用物質で
あり得る。

【００３９】本発明は、核酸分子もその範囲内に含む。このような核酸分子は：ａ）本発明のポリペプチドをコードし、または、ｂ）前記のａ）に定義したような分子と相補的であり、またはｃ）前記のａ）またはｂ）に定義したような分子とハイブリダイズする。

【００４０】これらの核酸分子およびそれらの使用を、以下でさらに詳細に考察する。本発明のポリペプチドは、遺伝子コードの周知の縮重を考慮に入れて、多数の種
々の核酸分子によりコードされ得る。これらのコード核酸分子はすべて、本発明
の範囲内である。好ましいコード核酸分子は、第１図に示したポリペプチドをコ
ードする。これらは、第１図に示したコード配列を含む核酸分子およびそれらの
変性変異体を含む。核酸分子は、直接用いられ得る。あるいは、それらはベクター中に挿入され得る
。

【００４１】核酸またはそれらを含むベクターは、クローニングに際して用いられ得る。そ
れらは、当業者に既知の技法を用いて本発明のポリペプチドの発現を可能にする
ために、非ヒト宿主中に導入され得る。あるいは、細胞無含有発現系が用いられ
得る。

【００４２】ポリペプチドをクローニングし、発現しおよび精製するための技法は、当業者
には周知である。種々のこのような技法は、標準的教科書、例えばSambrook et
al.（Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）; Old & Primrose（Principles of Gene Manipulation, 5th Edition,
Blackwell Scientific Publications （1994）;およびStryer（Biochemistry, 4
th Edition, W H Preeman and Company（1995））に開示されている。

【００４３】適切な発現系を用いることにより、ポリペプチドは望ましい形態で産生され得
る。例えば、ポリペプチドは、微生物、例えば細菌または酵母菌により、培養昆
虫細胞（バキュロウイルス感染され得る）により、あるいは哺乳類細胞（例えば
ＣＨＯ細胞）により産生され得る。

【００４４】しかしながら、好ましい宿主は、植物または植物繁殖材、例えば脂肪種子セイ
ヨウアブラナ、ヒマワリ、穀類、例えばトウモロコシ、タバコ、豆類、例えば落
花生およびダイズ、ベニバナ、ギネアアブラヤシ、ココヤシおよびその他のヤシ
、ワタ、ゴマ、カラシ、亜麻、ヒマ、ルリヂサおよびマツヨイグサであるか、あ
るいは前記のいずれかの植物のための繁殖材である。植物または植物繁殖材を提供するための技術は、現在、十分に開発されている。
それは、例えばWO96/21022で簡潔に考察されている。動物から単離されるデサチ
ュラーゼは、植物中で首尾よく発現されている。例えば、Spychalla, J.P. 等（
上記）は、トランスジェニックArabidopsisにおけるC. elegansデサチュラーゼの発現を記載する。さらに、欧州特許第0550162号（Pioneer Hi-Bred Internati
onal, Inc）は、ラットから単離されたΔ⁹デサチュラーゼをコードするキメラ遺
伝子構築物、および脂肪酸の生成のための構築物で形質転換された植物を開示す
る。その出版物中に記載されたデサチュラーゼは、本発明のΔ⁶デサチュラーゼと２２％の同一性を有するに過ぎない。

【００４５】用いられ得る特定の技法を以下で考察する。もちろん、このような技法は限定
されるものではないと理解されるべきである。（ｉ）癌腫菌（Agrobacterium tumefaciens）を基礎にしたベクター系これらは、Ｔ−ＤＮＡがアーム切断されたＴｉベース系、例えばｐＧＶ３８５
０を含む。望ましくは、選択可能なマーカーが存在する（例えば、抗生物質に対
する耐性を提供するマーカー）。

【００４６】中間体ベクター（ＩＶ）も用いられ得る。それらは、サイズが小さくなりがち
であり、したがって、通常は、大型Ｔｉベースのベクターより操作が容易である
。ＩＶは一般に、大腸菌由来プラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２中にクロ
ーン化されたＴ−ＤＮＡに起因するベクターである。ＩＶは、しばしば接合欠乏
性であり、したがって、接合熟達プラスミド（例えばｐＲＫ２０１３）を用いて
、ＩＶを可動化し、したがってそれは癌腫菌受容体（レシピエント）に移され得
る。次に、癌腫菌中で自律的に複製可能である同時組込み体が生成され得るため
に、インビボ相同組換えが癌腫菌中で起きて、ＩＶを内在するアーム切断化Ｔｉ
プラスミド中に挿入させ得る。

【００４７】別の代替物は、二元性Ｔｉベクターを用いることである。ここでは、外来ＤＮ
Ａを保有する修飾化Ｔ−ＤＮＡ領域が、大腸菌中で複製する小型プラスミド（例
えば、ｐＲＫ２５２）上に提供される。このプラスミド（時としてはミニＴｉま
たはミクロＴｉと呼ばれる）は次に、接合的に、三親交配を経て、適合性ｖｉｒ
遺伝子を含有する（トランス型でｖｉｒ機能を提供する）A. tumefaciens中に移
され得る。Ｔｉ配列を有さない二元性ベクターが用いられさえし得る。ここでは、細菌ｍｏ
ｂおよびｏｒｉＴ機能は、プラスミド転移を促進するために用いられ得る。さら
に、ｖｉｒ機能は、トランス型で提供され得る。

【００４８】前記で考察したベクター系は、Horsch等（Science 227, 1229-31（1985））の
プロトコールまたはその変法を用いて、植物中に遺伝子を転移するために用いら
れ得る。ここでは、小型円板が双子葉植物の葉から穴を開けて得られ、それらは
表面を滅菌されて、次に、転移される外来遺伝子が選択可能なマーカーを伴う（
例えばｎｃｏ遺伝子）組換え体Ｔ−ＤＮＡを含有するA. tumefaciensを含む培地
中に入れられる。円板は次に、２日間培養され、その後選択可能性マーカーを選
択するために培地に移される（これは、カナマイシンを含有する培地を用いた培
養によりｎｅｏ選択可能マーカーに関して成され得る）。A. tumefaciensは、カ
ルベニシリン含有培地を用いることにより殺され得る。新芽は、普通は約２〜４
週間後にカルスから発育する。次にそれらを切り取って、根誘導培地に移植し、
十分大きくなったら土に植える。

【００４９】（ｉｉ）癌腫菌（Agrobacterium rhizogenes）を基礎にしたベクター系これらは、Ｒｉ由来プラスミドを含む。ＲｉＴ−ＤＮＡは一般に、有害ではな
いと考えられ、したがってこのようなプラスミドはアーム切断化Ｔｉプラスミド
と等価であると考えられる。Ｒｉプラスミドを基礎にしたＩＶ同時組込み系が開
発された。

【００５０】（ｉｉｉ）植物プロトプラストベースの形質転換系適切な技法は、「”Plant Gene Transfer and Expression Protocols” ed. H
. Jones, Human Press Methods in Molecular Biology, 49,1995」に記載されて
いる。植物の形質転換は、植物細胞壁を除去してプロトプラストを提供することにより
促進され得る。細胞壁は、任意の適切な手段、例えば機械的破壊またはセルロー
ス分解およびペクチン分解酵素を用いた処理により除去され得る。プロトプラス
トは次に、遠心分離により他の構成成分から分離されて、次にエレクトロポレー
ションのような技法が用いられて、異種ＤＮＡを有するプロトプラストを形質転
換し得る。適切な培養条件下で、形質転換化プロトプラストは新規の細胞壁を増
殖し、さらに分裂する。新芽および根が次に誘導されて、小植物体が形成される
。

【００５１】（ｉｖ）生体分解法によるトランスフェクションＤＮＡまたはＲＮＡを含有する高速ミクロ射出粒子を用いて、そのＤＮＡまた
はＲＮＡを植物細胞中に送達し得る。これは、広範な種々のトランスジェニック
植物を産生させており、単子葉および双子葉の両方の植物に適している。例えば
、ＤＮＡまたはＲＮＡで被覆された金またはタングステン粒子が用いられ得る。
ミクロ射出粒子を噴射するのに適した用具としては、火薬ベースの用具、放電ベ
ースの用具および空気作動性用具が挙げられる。

【００５２】（ｖ）ウイルスベースの系ＤＮＡ植物ウイルスベクターは、カリフラワーモザイクウイルス（一連の双子
葉植物に感染する）およびジェミニウイルス（広範囲の双子葉および単子葉植物
に感染）を含む。ＲＮＡ植物ウイルスは多数を占め、その例としてはスズメノチ
ャヒキモザイクウイルス（多数のイネ科植物、例えばオオムギに感染）およびタ
バコモザイクウイルス（タバコ植物体に感染）が挙げられる。前記の説明から、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、広範な種々の
生物体中でクローン化されそして発現され得る、と理解される。

【００５３】本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（本明細書中では「コード」核酸
分子と呼ばれる）の他に、本発明は、それと相補的な核酸分子も含む。したがっ
て、例えば二重鎖核酸分子の両方の鎖が、本発明の範囲内に含まれる（それらが
互いに関連してもしなくても）。ｍＲＮＡ分子および相補的ＤＮＡ分子（例えば
ｃＤＮＡ分子）も含まれる。

【００５４】前記の１又は２以上の核酸分子とハイブリダイズし得る核酸分子も、本発明に
網羅される。このような核酸分子は、本明細書中では、「ハイブリダイズ」核酸
分子と呼ばれる。

【００５５】本発明のハイブリダイズ核酸分子は、その長さに沿って、前記のａ）またはｂ
）の範囲内の核酸分子と高度の同一性を有し得る（例えば、少なくとも５０％、
少なくとも７５％、または少なくとも９０％の配列同一性）。当業者に理解されるように、所定の一本鎖核酸分子が別の一本鎖核酸分子と有す
る配列同一性の程度が大きいほど、適切な条件下で相補的一本鎖核酸分子が他方
の一本鎖核酸分子とハイブリダイズする程度は大きくなる。

【００５６】望ましくは、本発明のハイブリダイズ分子は、少なくとも１０ヌクレオチド鎖
長、好ましくは少なくとも２５、少なくとも５０，少なくとも１００または少な
くとも２００ヌクレオチド鎖長である。好ましいハイブリダイズ分子は、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリ
ダイズする。緊縮ハイブリダイゼーション条件の一例は、試験されるハイブリダ
イゼーションが約０．９モルの塩溶液を用いて約３５℃〜約６５℃の温度で実行
される場合である。しかしながら、当業者は、プローブ鎖長、塩基組成、存在す
るイオンの種類等を考慮するために、このようなパラメーターを適宜変え得る。

【００５７】最も好ましくは、本発明のハイブリダイズ核酸分子は、第１図に示したコード
配列を有するＤＮＡと、そのＲＮＡ等価物と、あるいは前記の分子のいずれかの
相補的配列とハイブリダイゼーションする。ハイブリダイズ核酸分子は、例えばプローブまたはプライマーとして有用であり
得る。

【００５８】プローブは、核酸を精製および／または同定するために用いられ得る。例えば
、それらはデサチュラーゼ遺伝子の全体または一部の存在を同定するために用い
られ、したがって診断に有用である。プライマーは、例えばＰＣＲ技術により核酸またはその一部を増幅するのに有用
である。

【００５９】プローブまたはプライマーとして用いられる他に、本発明のハイブリダイズ核
酸分子は、相補的核酸分子と結合することにより本発明のポリペプチドの発現を
変えるためのアンチセンス分子として用いられ得る（一般的に、これは、普通は
翻訳されるＲＮＡ分子と結合する核酸分子を提供し、それにより二重鎖の形成に
より翻訳を防止することにより成し遂げられる）。

【００６０】ハイブリダイズ分子は、リボザイムとしても提供され得る。リボザイムは、リ
ボザイムにより認識される特定の標的配列を含むＲＮＡ分子と結合し、それを開
裂することにより発現を調節するためにも用いられ得る。

【００６１】前記の考察から、多数の核酸が本発明の範囲内であると理解される。別記しな
い限り、本発明の核酸分子は、したがって、１又は２以上の以下の特徴を有し得
る。

【００６２】１）それらはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る（非天然型塩基および／または非
天然型主鎖を有する天然型ＤＮＡまたはＲＮＡ構造の変異体を含む）。２）それらは一本鎖または二本鎖であり得る。

【００６３】３）それらは組換え形態で提供され得る。即ち異種５‘および／または３’フ
ランキング配列と共有結合して、天然ではないキメラ分子（例えばベクター）を
提供する。

【００６４】４）それらは、天然に普通に存在する５‘および／または３’フランキング配
列を伴わずに提供され得る。５）それらは、例えば所望の標的配列を有するクローン化分子を単離するため
のプローブを用いることにより、またはキメラ合成技法を用いることにより、実
質的に純粋な形態で提供され得る。したがって、それらは、夾雑タンパク質およ
び／またはその他の核酸を実質的に含まない形態で提供され得る。

【００６５】６）それらは、イントロンを伴って（例えば、全長遺伝子として）、またはイ
ントロンを伴わずに（例えば、ｃＤＮＡとして）提供され得る。ここで、添付の図面である第１図〜第６図を参照しながら、実例のみにより本
発明を説明する。 [実施例１−Δ⁶デサチュラーゼ遺伝子の単離および酵母菌中での発現] 既知のルリヂサΔ⁶脂肪酸デサチュラーゼ（Sayanova O et al（1997））を用いて、変異体ヒスチジンボックスＱ−Ｘ−Ｘ−Ｈ−Ｈを含有する配列に検索を限
定して、アミノ酸配列に関してＮＣＢＩＥＳＴ配列データベースを検索した。

【００６６】セノラブディティスエレガンス（C. elegans）ＥＳＴ８を検出した。セノラブ
ディティスエレガンスＥＳＴプロジェクトデータベース（Prof. Y. Kohara lab （National Institute of Genetics, Mishima, Japan））を検索して関連コスミ
ドクローンを同定することにより、それらをさらに特性化した。

【００６７】これらの検索により同定されるｙｋ４３６ｂ１２と呼ばれる部分４４８塩基対
ｃＤＮＡクローンをセノラブディティスエレガンスＥＳＴプロジェクトから得て
、これを用いてセノラブディティスエレガンスｃＤＮＡライブラリー（混合ス
テージ；Prof Koharaによっても供給された）をスクリーニングした。これは、クローンｙｋ４３６ｂ１２が、第四染色体の一部として生成するコスミドＷ０８
Ｄ２（Genbank寄託番号Ｚ７０２７１）上に存在する遺伝子の一部と相同であることを示した。コスミドＷ０Ｄ２の塩基２１−２９５７は、５つのイントロンに
より中断される４７３残基のＯＲＦをコードするために、タンパク質予測プログ
ラムGenefinder（Wilson R et al.（1994）, Nature 368, 32-38）により予測さ
れる。 Wilson,R.等は、セノラブディティスエレガンスの第三染色体の配列の一
部を開示する。セノラブディティスエレガンスゲノムプロジェクトによりシーケンシングされた遺伝子のデータベース検索により確定されるような、コスミド
Ｗ０８Ｄ２上のＷ０８Ｄ２．４と呼ばれる遺伝子から転写されたと思われる転写
体をコード化するために、多数の陽性物を同定し、さらに精製して、シーケンシ
ングにより決定した。

【００６８】この予測ポリペプチド（Sanger Centre Nematode Sequencing Project, Hinxt
on, UKによりＷ０８Ｄ２．４と命名された）の検査により、それは、３つのヒス
チジンボックスを含めたミクロソーム脂肪酸デサチュラーゼを暗示する多数の特
徴を有する、ということが明示された。しかしながら、予測タンパク質配列は、
シトクロムｂ₅タンパク質に見出された（Lederer F（1994）Biochimie. 76,674-
692）診断的Ｈ−Ｐ−Ｇ−Ｇモチーフを含有するシトクロムｂ₅と類似のＮ末端ド
メインの存在を示した。ルリヂサから我々が単離したΔ⁶デサチュラーゼもＮ末端ｂ₅ドメインを含有したため、これは、Ｗ０Ｄ２．４がＤ⁶デサチュラーゼをコ
ードし得ることを示した。

【００６９】配列のより綿密な検査により、Ｈ→Ｑ置換を有する変異体第三ヒスチジンボッ
クスの存在が明示された（ルリヂサΔ⁶デサチュラーゼにおいても観察された）。Ｗ０８Ｄ２．４およびルリヂサΔ⁶デサチュラーゼ間の類似性の程度は＜５２％で、したがって低い。同一性に関して得られた＜３１％という数字も低い。

【００７０】Ｗ０８Ｄ２．４は多数（６個）のイントロンによりコードされたため、全長ｃ
ＤＮＡを単離してGenefinderプログラムにより予測された配列を立証することが
、そしてＯＲＦの発現を可能にしてコード化機能を限定することも必要であった
。

【００７１】ＥＳＴ挿入体ｙｋ４３６ｂ１２（Prof Y. Koharaのご厚意により提供された）
を用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして多数の陽性プラー
クを同定した。これらをさらに精製して均質物とし、切り出して、その結果生じ
た奪回ファ−ジミドからの最大挿入物（〜１４５０ｂｐ）をシーケンシングした
。これは、我々が単離したｃＤＮＡがＷ０８Ｄ２．４と事実上相同であり、ｃＤ
ＮＡの５‘および３’末端はコスミドＷ０８Ｄ２．４の配列の塩基９−３０７９
と等価であった。遺伝子生成物の開始であるとGenefinderプログラムにより予測
されたＡＴＧ開始コドンは、実際、ｃＤＮＡクローンにおける最初のメチオニン
であるため、bona fide全長ｃＤＮＡを単離した、と我々は理由づけた。代表的一ｃＤＮＡクローン（ｐＣｅＤ６．１と命名。１４６３ｂｐ鎖長）のＤＮＡ配列
および推定アミノ酸配列を第１図に示す。推定アミノ酸配列は、大多数のタンパ
ク質を通して、Ｗ０８Ｄ２．４に関して予測されたものと同一である。Ｎ末端シ
トクロムｂ₅ドメインおよび変異体第三ヒスチジンボックスの位置に下線を付す。このｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は、Ｗ０８Ｄ２．４の残基１−３８および６
８−４７３に関して予測されたものと同一である。

【００７２】しかしながら、Ｗ０８Ｄ２．４に関して予測される残基３８−６７（Ｙ−Ｓ−
Ｉ−…・・Ｌ−Ｙ−Ｆ）をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡクローン中に存在
しない。これは、Ｗ０８Ｄ２．４に関して予測された４７３残基長に対して、Ｃ
ｅＤ６．１の推定アミノ酸配列が、実際には４４３アミノ酸鎖長であることを意
味する。２つのアミノ酸配列間の唯一のその他の差は、Ａ→Ｇ塩基変化（塩基１
２１１）に起因する残基４０１でのＭ→Ｖ置換である。ルリヂサΔ⁶デサチュラーゼの推定アミノ酸配列とＣｅＤ６．１の配列（第２Ｂ図）と同様に、２つの配
列を第２Ａ図で比較する。Ｗ０８Ｄ２．４に関して予測された余分の配列は、イ
ントロン−エキソン境界の不正確な予測から得られると考えられる。

【００７３】Ｎ末端のＨ−Ｐ−Ｇ−Ｇシトクロムｂ₅モチーフ（塩基９６−１０８によりコードされる）および第三ヒスチジンボックス中のＨＱ置換（塩基１１５７−１１
７２によりコードされる）の存在に留意していただきたい。

【００７４】Ｗ０８Ｄ２．４のコード配列を、ＰＣＲにより酵母菌発現ベクターｐＹＥＳ２
中に導入した。５’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを用いて、それ
ぞれ５’および３’末端にＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位を導入した。ＴｎＴ系（
Promega）を用いたインビトロ転写および翻訳により、構築物の忠実度を調べた。

【００７５】特に、次にクローンｐＣｅＤ６．１を全予測コード配列（４４３アミノ酸残基
長）のＰＣＲ増幅のための鋳型として用いて、酵母菌発現ベクターｐＹＥＳ２（
Invitrogen）中でクローン化して、ｐＹＣｅＤ６を生成した。ｐＹＥＳ２中に存
在するＴ７ＤＮＡポリメラーゼプロモーターを用いたプラスミドのインビトロ転
写／翻訳により、このＰＣＲ生成配列の忠実度を調べた。

【００７６】メーカーの使用説明書により、PromegaＴｎＴ結合転写／翻訳系を用いて、翻訳生成物を生成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびラジオオートグラフィーにより分析
した。これにより、プラスミドｐＹＣｅＤ６は〜５５ｋＤの生成物を生成するが
、一方、対照（ｐＹＥＳ２）はいかなるタンパク質も産生できないことが明示さ
れた（データは示されていない）が、これは構築物が正確であることを示す。

【００７７】その結果生じたプラスミドを、リチウムアセテート法（Guthrie C, Fink GR（
1991）Meths. Enz. 194）により酵母菌（S. cerevisiae）中に導入し、導入遺伝
子の発現をガラクトースの付加により誘導した。１％テルギトールＮＰ−４０の
存在下で０．２ｍＭのリノレエート（ナトリウム塩）を、酵母菌に補充した。

【００７８】ウラシル欠乏培地上での増殖を可能にする酵母菌の形質転換および選定により
、ｐＹＥＳ２に保有されるＵＲＡ３選択可能マーカーに基づいて、酵母菌コロニ
ーが組換え体プラスミドｐＹＣｅＤ６を保有するということが明示された。ｐＹ
ＥＳ２中に存在するＧＡＬプロモーターを誘導することにより、ｐＹＣｅＤ６の
発現を得た。これは、炭素供給源としてのラフィノースとともに細胞を一夜増殖
させた後に実行し、低レベルの界面活性剤の存在下でリノレエート（１８：２）
を添加することにより培地に補充した。この後者の添加は、Δ⁶脱飽和のための通常の基質が酵母菌中に普通は生じない１８：２脂肪酸であるために必要であっ
た。

【００７９】メチルエステルのＧＣにより、酵母菌の全脂肪酸を分析した。ＧＬＡの存在の
確認は、ＧＣ−ＭＳ（Sayanova et al（1997）、上記）により実行した。さらに詳細に、次に培養を誘導後連続増殖させ、ＧＣによる分析のためにアリ
コートを取り出した。プラスミドＹＣｅＤ６を保有し、ガラクトースおよびリノ
レエートの存在下で増殖させた酵母菌から単離された全脂肪酸のメチルエステル
をＧＣにより分析した場合、追加的なピークが観察された（第３図）。第３図に
おいて、パネルＡは対照（空）ベクターｐＹＥＳ２で形質転換された酵母菌であ
り、パネルＢはｐＹＣｅＤ６．１で形質転換された酵母菌である。１６：０（ピ
ーク１）、１６：１（ピーク２）、１８：０（ピーク３）、１８：１（ピーク４
）、１８：２（ピーク５；外部から供給）として、共通脂肪酸−メチルエステル
を同定した。パネルＢの追加的ピーク（６）は１８：３ＧＬＡに対応し、矢印に
より示されている。これは、真正ＧＬＡ標準と同じ保持時間を有し、このことは
トランスジェニック酵母菌がΔ⁶脱飽和化リノール酸を有することができたことを示す。このようなピークは、いずれの対照試料（ｐＹＥＳ２による形質転換）
でも観察されなかった。ＧＣ−ＭＳによりこの余分のピークの同一性を確認した
が、これは、ＧＬＡとして化合物を陽性に同定した（第４図）。第４図の実験で
は、前記（Sayanova O et al（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4211-42
16）と同様に質量スペクトルにより試料を分析し、そのデータを用いてプロフィ
ールのライブラリーを検索した。試料は、ＧＬＡと同定された。新規のピーク（
Ａ）と真正ＧＬＡ（Ｂ）の質量スペクトルの比較を示す：肉眼的およびコンピュ
ーターベースの検査により、それらが同一であることが示された。これは、Ｃｅ
Ｄ６．１がセノラブディティスエレガンスΔ⁶デサチュラーゼをコードすることを、そしてこのｃＤＮＡはＯＲＦＷ０８Ｄ２．４をコードすると予測された遺
伝子から転写されると考えられるが、しかしＣｅＤ６．１の推定アミノ酸配列は
Ｗ０８Ｄ２．４のものより３０残基小さい、ということが確認された。 [実施例２−植物中でのセノラブディティスエレガンスΔ⁶デサチュラーゼの発現
] セノラブディティスエレガンスΔ⁶脱飽和物のコード配列を、ウイルス３５ＳプロモーターおよびＮｏｓターミネーターを含む植物発現ベクターｐＪＤ３３０
中でサブクローニングした。その結果生じたカセットまたはプロモーター／コー
ド配列／ターミネーターを次に植物二元生形質転換ベクターｐＢｉｎ１９中でサ
ブクローニングし、その結果生じたプラスミドを癌腫菌（Agrobacterium tumefa
ciens）中に導入した。次にこの癌腫菌株を用いて、花の真空浸潤によりArabido
psisを形質転換した。種子を収穫し、カナマイシンを含む選択培地上でプレート
化した。ｐＢｉｎ１９はこの抗生物質に対する耐性を付与するため、形質転換化
植物材だけが増殖する。耐性株を同定し、自家受精させて、同型接合物質を生成
した。酵母菌において線虫のデサチュラーゼの発現に関して用いたのと同じ方法
を用いて、脂肪酸プロフィールに関して葉物質を分析した。ＧＣにより脂肪酸メ
チルエステルを分離し、第６図に示した新規のピークを、既知の標準およびＧＣ
ＭＣとの比較により同定した。２つの新規のピークが観察され、これは、γ−リ
ノレン酸（ピーク１）およびオクタデカテトラエン酸（ピーク２）と同定された
。これらは、それぞれ、前駆体脂肪酸リノール酸とα−リノレン酸のΔ⁶脱飽和の生成物である。

【００８０】本発明は、セノラブディティスエレガンスｃＤＮＡ（ＣｅＤ６．１）がΔ⁶デサチュラーゼをコードすることを、そしてこの配列が予測されたＯＲＦＷ０８
Ｄ２．４と同一であるが、但し、後者タンパク質のＮ末端には３０残基挿入が存
在することを示した。ＣｅＤ６．１に関して予測された推定アミノ酸配列がＷ０
８Ｄ２．４のスプライシング変異体を表すか、あるいはGenefinderプログラムに
よるイントロン／エキソン接合部の誤った予測の結果であるかは、不明である。
しかしながら、ＣｅＤ６．１がΔ⁶デサチュラーゼをコードすることは明らかである。

【００８１】このセノラブディティスエレガンス配列によりコードされるＯＲＦは、それら
がともにシトクロムｂ₅との相同性を示すＮ末端ドメインを含有するという点で、我々が以前単離した（Sayanova O et al（1997）、上記）高等植物Δ⁶脂肪酸デサチュラーゼに関連すると考えられる。ミクロソーム脂肪酸デサチュラーゼは
、その電子供与体として遊離ミクロソームシトクロムｂ₅を使用することが立証されており（Smith MA, et al（1990） Biochem. J. 272,23-29; Smith MA et a
l（1992）Biochem. J. 287, 141-144）、そしてこれらの酵素に関して同定された配列の大多数がこの付加的シトクロムｂ₅ドメインを含有しないと思われる（O
kuley J et al（1994） Plant Cell 6, 147-158; Aronel V. et al（1992）Scie
nce 258, 1353-1355およびNapier, J.A. et al（1997） Biochemical J. 328:71
7-8 ）。

【００８２】本発明の前には、シトクロムｂ₅−ドメインを含むデサチュラーゼの２つの例だけが知られており、その１つはルリヂサΔ⁶デサチュラーゼであり、もう１つは酵母菌ミクロソームΔ⁹（ＯＬＥ１）デサチュラーゼである（Napier JA et al
（1997） Biochemical J. 上記、およびMitehell AG, Martin CE （1995）J. Bi
ol. Chem.270, 29766-29772）。しかしながら、ＯＬＥ１はＣ末端シトクロムｂ⁵ ドメインを含有する（Napier JA et al（1997） Biochemical J. 印刷中、およびMitehell AG, Martin CE （1995）J. Biol. Chem.270, 29766-29772）。シトクロムｂ₅の理由は、Δ⁶デサチュラーゼが「フロントエンド」デサチュラーゼで
あるということであり得る（「フロントエンド」脱飽和は、脂肪酸鎖上の最終脱
飽和反応と定義され、通常は既存の結合とカルボキシ基のΔ末端との間に二重結
合を導入する（Mitchell AG, Martin CE（1995） J. Biol. Chem. 270,29766-29
772およびAitzetmuller K, Tseegsuren, N（1994）J. Plant Physiol. 143, 538
-543））。

【００８３】いかなる場合にも、変異体ヒスチジンボックスとＮ末端シトクロムｂ₅ドメインはともに、ルリヂサおよび線虫Δ⁶デサチュラーゼの両方でのそれらの存在により立証されるように、動物および植物の両方に保存される、と考えられる。

【００８４】したがって、本発明は、他のΔ⁶デサチュラーゼの同定を、そしてこれらのモチーフの存在により同定されるその他の「フロントエンド」デサチュラーゼの同
定をも可能にする。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、セノラブディティスエレガンスのｃＤＮＡｐＣｅＤ６．１の全長Ｄ
ＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。Ｎ末端シトクロムｂ₅ドメインの位置、ならびに変異体第三ヒスチジンボックスには下線を付してある。このｃＤＮＡ
の推定アミノ酸配列は、Ｗ０８Ｄ２．４の残基１−３８および６８−４７３に関
して予測されたものと同一である。

【図２】第１図の続きである。

【図３】第１図の続きである。

【図４】第２Ａ図は、セノラブディティスエレガンスのｃＤＮＡＣｅＤ６．１とセノラ
ブディティスエレガンスの予測タンパク質Ｗ０８Ｄ２．４の推定アミノ酸配列の
比較を示す（本発明の線虫Ｄ６＝ＣｅＤ６．１；ｃｅｗ０８ｄ２＝ＯＲＦＷ０８
Ｄ２．４）。

【図５】第２Ｂ図は、ルリヂサΔ⁶デサチュラーゼの推定アミノ酸配列(Sayanova O et
at(1997) Proc.Natl.Acad,Sci.USA 94,4211-4216)とセノラブディティスエレガンスのｃＤＮＡｐＣｅＤ６．１との比較を示す（Boofd6=Borage officianalisの
Δ⁶デサチュラーゼ；ceeld6=CeD6.1.)。

【図６】第３図は、誘導条件（リノロレートおよびガラクトース）下で増殖させたセノ
ラブディティスエレガンスの総脂質のメチルエステルを示す。

【図７】第４図は、ｐＹＣｅＤ６．１を保有する酵母菌で同定された新規のピークのＧ
Ｃ−ＭＳ分析を示す。

【図８】第５図は、哺乳類におけるｎ−６必須脂肪酸の代謝の簡略化バージョンを示す
。

【図９】第６図は、対照形質転換化Arabidopsis植物体（Ａ）、または、セノラブディティスエレガンスΔ⁶デサチュラーゼを発現する形質転換化Arabidopsis植物体（
Ｂ）、の葉からの脂肪酸およびメチルエステルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 9/12 ４Ｃ０８４ 9/10 17/10 ４Ｈ０４５ 9/12 29/00 17/10 31/12 29/00 35/00 31/12 Ｃ０７Ｋ 16/40 35/00 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｐ 7/64 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/26 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/50 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 4B024 AA01 AA08 AA11 BA08 BA53 CA04 CA09 DA01 DA12 DA20 EA04 GA11 GA17 HA01 HA03 HA12 4B050 CC01 CC03 DD11 EE10 LL05 4B063 QA01 QA19 QQ22 QQ42 QR32 QR48 QR51 QR56 QR62 QS33 QS34 4B064 AD88 AD89 AG27 CA06 CA11 CA19 CC24 DA01 DA13 4C084 AA02 AA06 DC01 NA14 ZA361 ZA451 ZA891 ZB261 ZB331 ZC191 ZC331 ZC351 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA30 DA75 DA76 DA89 EA50 FA72 FA74 HA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ａ）第１図に示されるアミノ酸配列を有する、ｂ）前記ａ）で定義されるポリペプチドに対して１または２以上のアミノ
酸の欠失、挿入または置換を有するが、前記ポリペプチドとアミノ酸配列が少な
くとも３２％は同一である、または、ｃ）少なくとも１００アミノ酸鎖長を有する前記ａ）またはｂ）で定義さ
れるポリペプチドの断片である、ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】シトクロムドメインを有する請求項１のポリペプチド。
【請求項３】シトクロムｂ₅ドメインを有する請求項２のポリペプチド。
【請求項４】少なくとも１つのヒスチジンボックスを有する請求項１〜３の
何れか一項のポリペプチド。
【請求項５】３つのヒスチジンボックスを有する請求項１〜４の何れか一項
のポリペプチド。
【請求項６】フロントエンドデサチュラーゼである請求項１〜５の何れか一
項のポリペプチド。
【請求項７】Δ⁶デサチュラーゼである請求項１〜６の何れか一項のポリペプチド。
【請求項８】ＧＬＡを蓄積しない生物の天然型である請求項１〜７の何れか
一項のポリペプチド。
【請求項９】真核生物の天然型である請求項１〜８の何れか一項のポリペプ
チド。
【請求項１０】動物の天然型である請求項１〜９の何れか一項のポリペプチ
ド。
【請求項１１】線虫の天然型である請求項１〜１０の何れか一項のポリペプ
チド。
【請求項１２】セノラブディティスエレガンスの天然型である請求項１〜１
１の何れか一項のポリペプチド。
【請求項１３】第１図に示したアミノ酸配列またはその一部を含む請求項１
のポリペプチド。
【請求項１４】別の部分と共有結合される、請求項１〜１３の何れか一項の
ポリペプチドを含むポリペプチド。
【請求項１５】抗体を生じさせ、または選択する際における請求項１〜１４
の何れか一項のポリペプチドの使用。
【請求項１６】形質転換用のマーカーとしての請求項１〜１４の何れか一項
のポリペプチドの使用。
【請求項１７】植物形質転換用のマーカーとしての請求項１６のポリペプチ
ドの使用。
【請求項１８】請求項１〜１４の何れか一項のポリペプチドと結合する抗体
またはその誘導体。
【請求項１９】診断に使用する請求項１８の抗体またはその誘導体。
【請求項２０】生物が請求項１〜１４の何れか一項のポリペプチドを有する
か否かを評価する方法であって、生物が請求項１８の抗体またはその誘導体と結
合するポリペプチドを有するか否かを決定する工程を含む方法。
【請求項２１】生物がヒトである請求項２０の方法。
【請求項２２】インビトロで行う請求項２０または２１の方法。
【請求項２３】薬剤として使用する請求項１〜１４の何れか一項のポリペプ
チド。
【請求項２４】ＧＬＡからインビトロで得られる代謝物質におけるＧＬＡの
欠乏を伴う疾患を治療するための薬剤の調製における請求項１〜１４の何れか一
項のポリペプチドの使用。
【請求項２５】代謝物質がエイコサノイドである請求項２３のポリペプチド
の使用。
【請求項２６】疾患が湿疹、乳房痛、高コレステロール血症、アテローム性
動脈硬化症、冠状動脈疾患、糖尿病性ニューロパシー、ウイルス感染、アクネ、
肝硬変、高血圧および癌である請求項２３，２４または２５の使用。
【請求項２７】請求項１〜１４の何れか一項のポリペプチドを用いてリノー
ル酸をＧＬＡに転化する工程を含むＧＬＡの製造方法。
【請求項２８】請求項１〜１４の何れか一項のポリペプチドを用いてα−リ
ノレン酸をＯＴＡに転化する工程を含むＯＴＡの製造方法。
【請求項２９】ａ）請求項１〜１４の何れか一項のポリペプチドをコードする、ｂ）前記ａ）で定義される核酸分子の相補鎖である、または、ｃ）前記ａ）またはｂ）で定義される核酸分子とハイブリダイズする、ことを特徴とする核酸分子。
【請求項３０】請求項２９の核酸分子を含むベクター。
【請求項３１】請求項２９の核酸分子または請求項３０のベクターを含む宿
主。
【請求項３２】植物または植物繁殖材である請求項３１の宿主。
【請求項３３】脂肪種子セイヨウアブラナ、ヒマワリ、トウモロコシ等の穀
類、タバコ、落花生およびダイズ等の豆類、ベニバナ、ギネアアブラヤシ、ココ
ヤシおよびその他のヤシ、ワタ、ゴマ、カラシ、亜麻、ヒマ、ルリヂサおよびマ
ツヨイグサ、または前記いずれかの植物のための繁殖材である請求項３１または
３２の宿主。
【請求項３４】前記ポリペプチドの発現を引き起こす条件下で請求項３１〜
３３の何れか一項の宿主を培養する工程、そして前記ポリペプチドを精製する工
程を含む、請求項１〜１４の何れか一項のポリペプチドの製造方法。
【請求項３５】プローブとしてまたはプライマーとしての請求項２９の核酸
分子の使用。
【請求項３６】生物中にＧＬＡまたはＧＬＡから得られる代謝物質を蓄積す
る生物を調製するための請求項２９の核酸分子または請求項３０のベクターの使
用。
【請求項３７】耐寒冷性である生物を調製するための請求項２９の核酸分子
または請求項３０のベクターの使用。
【請求項３８】請求項２９の核酸または請求項３０のベクターを生物中に組
入れる工程を含む請求項３１〜３３の何れか一項の宿主の製造方法。