JP2018500042A - マイクロアレイ分析によって同定されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)種子特異的プロモーター - Google Patents
マイクロアレイ分析によって同定されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)種子特異的プロモーター Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018500042A JP2018500042A JP2017535667A JP2017535667A JP2018500042A JP 2018500042 A JP2018500042 A JP 2018500042A JP 2017535667 A JP2017535667 A JP 2017535667A JP 2017535667 A JP2017535667 A JP 2017535667A JP 2018500042 A JP2018500042 A JP 2018500042A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- transgene
- transgenic
- sequence
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
- C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
- C12N15/8226—Stem-specific, e.g. including tubers, beets
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Physiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
Abstract
セイヨウアブラナ(Brassica napus)から得られる遺伝子調節要素を用いて植物細胞および/または植物組織において導入遺伝子を発現させるための構築物および方法が提供される。
Description
優先権主張
本出願は、その全体が本明細書に組み込まれる、2015年1月6日に出願された米国仮特許出願第62/100,394号「マイクロアレイ分析によって同定されたセイヨウアブラナ種子特異的プロモーター(BRASSICA NAPUS SEED SPECIFIC PROMOTERS IDENTIFIED BY MICROARRAY ANALYSIS)」の出願日の利益を主張する。
本出願は、その全体が本明細書に組み込まれる、2015年1月6日に出願された米国仮特許出願第62/100,394号「マイクロアレイ分析によって同定されたセイヨウアブラナ種子特異的プロモーター(BRASSICA NAPUS SEED SPECIFIC PROMOTERS IDENTIFIED BY MICROARRAY ANALYSIS)」の出願日の利益を主張する。
本発明は、概して、植物分子生物学の分野に関し、より具体的には植物における導入遺伝子の発現の分野に関する。
多くの植物種は、農学的に望ましい形質または特徴を導入するために、導入遺伝子で形質転換することができる。得られるトランスジェニック植物種は、特定の所望の形質を有するように開発および/または改変される。一般的に、所望の形質としては、例えば、栄養価の品質を改善すること、収量を増加させること、害虫または病害抵抗性を付与すること、干ばつおよびストレス耐性を増加させること、園芸品質(例えば、色素形成および成長)を向上させること、除草剤耐性を付与すること、植物由来の工業的に有用な化合物および/または材料の生産を可能にすること、および/または医薬品の生産を可能にすることが挙げられる。
単一のゲノム遺伝子座に積み重ねられた複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物種は、植物形質転換技術を介して製造される。植物形質転換技術は、植物細胞への導入遺伝子の導入、植物ゲノムにおいて安定に組み込まれた導入遺伝子のコピーを含有する稔性トランスジェニック植物の回収をもたらし、ならびに植物ゲノムの転写および翻訳を介したその後の導入遺伝子発現は、所望の形質および表現型を有するトランスジェニック植物をもたらす。しかしながら、形質の積み重ねとして遺伝子操作された複数の導入遺伝子を高度に発現するようにトランスジェニック植物種の生産を可能にする機構が望まれる。
同様に、植物の特定の組織または器官内で導入遺伝子の発現を可能にする機構が望まれる。例えば、土壌媒介性病原体による感染に対する植物の抵抗性の増大は、病原体抵抗性タンパク質が植物の根内で着実に発現されるように、病原体抵抗性遺伝子で植物ゲノムを形質転換することにより達成されてもよい。あるいは、例えば、細胞分裂または伸長などの特定の成長または発達段階にある植物組織において導入遺伝子を発現することが望ましい場合がある。さらに、植物の葉および茎組織において導入遺伝子を発現することが望ましい場合がある。
本明細書には、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター調節要素、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター調節因子を含有する構築物/ベクター、およびセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター調節因子を利用する方法が記載される。
植物細胞および/または植物組織において導入遺伝子を発現させるための配列、構築物および方法が本明細書に開示される。一実施形態において、本開示は、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子発現カセットに関し、ここで、該プロモーターは、配列番号1の相補体に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、プロモーターは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。追加の実施形態において、プロモーターは、イントロンを含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する。一実施形態において、プロモーターは、5’非翻訳領域を含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子は、ポリペプチドまたは小型RNAをコードする。続く実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。さらに別の実施形態において、遺伝子発現カセットは、3’非翻訳領域をさらに含む。一実施形態において、3’非翻訳領域は、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、組換えベクターは遺伝子発現カセットを含む。実施形態のさらなる態様において、組換えベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルスおよびバクテリオファージからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。実施形態の続く局面において、細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。実施形態のさらなる態様において、トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子は、トランスジェニック植物から得られる。続く実施形態において、プロモーターは組織優先プロモーターである。さらなる実施形態において、組織優先プロモーターは、胚珠または種子組織優先プロモーターである。一実施形態において、種子組織優先プロモーターは、胚乳組織優先プロモーターである。さらに別の実施形態において、プロモーターは、配列番号1のヌクレオチド1〜1483のポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本開示は、ストリンジェントな条件下で、配列番号1の相補体に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズする合成ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞に関する。追加の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する。追加の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、イントロンを含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する。一実施形態において、合成ポリヌクレオチドは5’非翻訳領域を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。続く実施形態において、トランスジェニック植物細胞は、植物形質転換法により生産される。追加の実施形態において、植物形質転換法は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。他の実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、イネ植物およびコムギ植物からなる群から選択される。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子は、トランスジェニック植物から得られる。さらなる実施形態において、プロモーターは組織優先プロモーターである。さらなる実施形態において、組織優先プロモーターは、胚珠または種子組織優先プロモーターである。一実施形態において、種子組織優先プロモーターは、胚乳組織優先プロモーターである。別の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド1〜1483のポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本開示は、精製されたポリヌクレオチドプロモーターに関し、ここで、該プロモーターは、ストリンジェントな条件下で、配列番号1の相補体に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、精製されたポリヌクレオチドプロモーターは、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する。追加の実施形態において、精製されたポリヌクレオチドプロモーターは、イントロンを含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンに対して少なくとも90%の同一性を有する。一実施形態において、精製されたポリヌクレオチドプロモーターは5’非翻訳領域を含む。別の実施形態において、精製されたポリヌクレオチドは導入遺伝子に作動可能に連結される。続く実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子は、ポリペプチドをコードするまたは小型RNAである。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、3’非翻訳領域に作動可能に連結された導入遺伝子に作動可能に連結された、精製されたポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、3’非翻訳領域は、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。一実施形態において、組換えベクターは、遺伝子発現カセットを含む。追加の実施形態において、組換えベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびBACベクターからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は、遺伝子発現カセットを含む。その後の実施形態において、トランスジェニック細胞は、トランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物は、トランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物である。なおさらなる実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物、およびイネ植物からなる群から選択される。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子は、トランスジェニック植物から得られる。その後の実施形態において、精製されたポリヌクレオチド配列は、導入遺伝子の組織優先発現を促進する。さらなる実施形態において、組織優先プロモーターは、胚珠または種子組織優先プロモーターである。一実施形態において、種子組織優先プロモーターは、胚乳組織優先プロモーターである。他の実施形態において、精製されたポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド1〜1483のポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本開示は、トランスジェニック植物において異種コード配列を発現させるための方法であって、
a)3’非翻訳領域に作動可能に連結された異種コード配列に作動可能に連結された、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること;
b)遺伝子発現カセットを含む形質転換された植物細胞を単離すること;
c)形質転換された植物細胞を再生してトランスジェニック植物にすること;および
d)配列番号1を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ること
を含む、方法に関する。
a)3’非翻訳領域に作動可能に連結された異種コード配列に作動可能に連結された、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること;
b)遺伝子発現カセットを含む形質転換された植物細胞を単離すること;
c)形質転換された植物細胞を再生してトランスジェニック植物にすること;および
d)配列番号1を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ること
を含む、方法に関する。
追加の実施形態において、ポリヌクレオチド配列はイントロンを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する。さらなる実施形態において、異種コード配列は、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、DNA結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される。追加の実施形態において、植物細胞の形質転換は、植物形質転換法を利用する。なお別の実施形態において、植物形質転換法は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される。他の実施形態において、トランスジェニック植物は、単子葉トランスジェニック植物または双子葉トランスジェニック植物である。さらなる実施形態において、単子葉トランスジェニック植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。さらなる実施形態において、異種コード配列は、組織において優先的に発現される。さらなる実施形態において、組織優先プロモーターは、胚珠または種子組織優先プロモーターである。一実施形態において、種子組織優先プロモーターは、胚乳組織優先プロモーターである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド1〜1483の配列を含む。
一実施形態において、本開示は、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を単離するための方法であって、
a)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること;
b)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること;
c)複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、DNA試料から配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を増幅すること;および
d)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること
を含む、方法に関する。
a)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること;
b)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること;
c)複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、DNA試料から配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を増幅すること;および
d)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること
を含む、方法に関する。
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド配列はイントロンを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列は5’非翻訳領域を含む。追加の実施形態において、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む単離されたポリヌクレオチド配列は、導入遺伝子に作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子はポリペプチドをコードする。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、3’非翻訳領域に作動可能に連結された導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、3’非翻訳領域は、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、DNA結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される。一実施形態において、組換えベクターは遺伝子発現カセットを含む。さらなる実施形態において、ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびBACベクターからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。追加の実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。追加の実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。さらなる実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド1〜1483のポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本開示は、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造するための方法であって、
a)配列番号1を含むポリヌクレオチド配列を同定すること;
b)配列番号1を含むポリヌクレオチド配列を単離すること;
c)配列番号1の少なくとも90%の配列同一性を含む複数のポリヌクレオチド配列を画定すること;
d)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること;および
e)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造すること
を含む。
a)配列番号1を含むポリヌクレオチド配列を同定すること;
b)配列番号1を含むポリヌクレオチド配列を単離すること;
c)配列番号1の少なくとも90%の配列同一性を含む複数のポリヌクレオチド配列を画定すること;
d)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること;および
e)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造すること
を含む。
さらなる実施形態において、合成することは、
a)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること;
b)オリゴヌクレオチドプライマー配列が、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること;
c)複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列をライゲートして、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること
を含む、方法に関する。
a)配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を同定すること;
b)オリゴヌクレオチドプライマー配列が、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること;
c)複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列をライゲートして、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること
を含む、方法に関する。
追加の実施形態において、合成されたポリヌクレオチド配列はイントロンを含む。他の実施形態において、イントロンは、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、またはシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する。一実施形態において、合成されたポリヌクレオチド配列は5’非翻訳領域を含む。追加の実施形態において、合成されたポリヌクレオチド配列は、導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む。なお別の実施形態において、作動可能に連結された導入遺伝子はポリヌクレオチドをコードする。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、3’非翻訳領域に作動可能に連結された導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む合成されたポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、3’非翻訳領域は、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。なお別の実施形態において、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される。一実施形態において、組換えベクターは遺伝子発現カセットを含む。追加の実施形態において、組換えベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびBACベクターからなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック細胞は遺伝子発現カセットを含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック細胞はトランスジェニック植物細胞である。一実施形態において、トランスジェニック植物はトランスジェニック植物細胞を含む。さらなる実施形態において、トランスジェニック植物は、単子葉植物または双子葉植物である。他の実施形態において、単子葉植物は、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される。この実施形態の他の態様において、双子葉植物は、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される。一実施形態において、トランスジェニック種子はトランスジェニック植物から得られる。他の実施形態において、合成ポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド1〜1483のポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、構築物は、配列番号1のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子または異種コード配列に作動可能に連結された配列番号1のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号2のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された配列番号2のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む。さらなる実施形態において、遺伝子発現カセットは、配列番号1のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターに作動可能に連結された配列番号2のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子または異種コード配列に作動可能に連結された配列番号1のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれを超える導入遺伝子を含む。
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、独立して、a)配列番号1のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター、およびb)配列番号2のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む。
配列番号1のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターおよび配列番号2の3’UTRを用いて導入遺伝子を発現する植物を成長させる方法が本明細書に開示される。また、配列番号1のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターおよび配列番号2の3’UTRを用いて導入遺伝子を発現する植物組織および細胞を培養する方法が本明細書に開示される。一実施形態において、本明細書に開示する方法は、植物の葉および茎における組織特異的遺伝子発現を含む。
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子から得られた配列番号1のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む。
定義
本明細書で使用するとき、冠詞の「1つの(a)」「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈において明確かつ一義的な他の指示がない限り、複数への言及も含む。
本明細書で使用するとき、冠詞の「1つの(a)」「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈において明確かつ一義的な他の指示がない限り、複数への言及も含む。
本明細書で使用するとき、用語「戻し交配」とは、ブリーダーが雑種子孫をその親の片方と再び交配する方法を指し、例えば、第一世代のFl雑種が、Fl雑種の親の片方の遺伝子型を有することである。
本明細書で使用するとき、用語「イントロン」とは、転写されるが、翻訳はされない遺伝子に含まれる任意の核酸配列(または対象とする発現されたヌクレオチド配列)を指す。イントロンは、DNAの発現された配列内の非翻訳核酸配列、ならびにそれから転写されたRNA分子の対応する配列を含む。
本明細書に記載される構築物はまた、イントロンなどの、翻訳および/またはmRNAの安定性を高める配列を含むことができる。このようなイントロンの1つの例は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のヒストン変異体の遺伝子IIの第1イントロン、または任意の他の一般的に知られているイントロン配列である。イントロンは、翻訳および/またはmRNAの安定性を高めるために、プロモーター配列と組み合わせて使用することができる。
本明細書で使用するとき、用語「5’−非翻訳領域」または「5’−UTR」とは、プレmRNAまたは成熟mRNAの5’末端における非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟したmRNAに関して、5’−UTRは、典型的には、その5’上に7−メチルグアノシンキャップを有し、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質へのmRNAの排出、翻訳機構によるmRNAの5’端の識別、および分解に対するmRNAの保護などの多数のプロセスに関与する。
本明細書で使用するとき、用語「3’−非翻訳領域」または「3’−UTR」とは、プレmRNAまたは成熟mRNAの3’末端における非翻訳セグメントを指す。例えば、成熟したmRNAに関して、この領域は、ポリ(A)テールを有し、mRNA安定性、翻訳開始およびmRNA排出における多数の役割を有することが公知である。
本明細書で使用するとき、用語「ポリアデニル化シグナル」とは、ポリ(A)ポリメラーゼの存在下である場合、例えば、ポリ(A)シグナルの下流の10〜30塩基に位置した、ポリアデニル化部位上でポリアデニル化されるように転写を可能にするmRNA転写物に存在する核酸配列を指す。多数のポリアデニル化シグナルは当該技術分野において公知であり、本発明に有用である。典型的な配列には、AAUAAAおよびその改変体が含まれ、Loke J., et al, (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468に記載されている。
本明細書で使用するとき、用途「単離された」とは、生物学的成分(例えば、核酸またはタンパク質)が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分(すなわち、他の染色体および染色体外のDNA)から区別された上記生物学的成分を指す。
本明細書で使用するとき、核酸分子に関して「精製された」という用語は、絶対的な純度(例えば、均質な調製)を要求しない;代わりに、それは、配列が、その天然の細胞環境におけるものよりも相対的に純粋であるという指示を表す(天然レベルと比較して、このレベルは、例えば、濃度または遺伝子発現レベルの点で少なくとも2〜5倍大きいことが必要である)。DNA分子は、全ゲノムDNAまたは全ゲノムRNAから直接得ることができる。さらに、cDNAクローンは天然には存在しないが、むしろ好ましくは、部分的に精製された天然に存在する物質(逆転写酵素ポリメラーゼによって逆転写されるメッセンジャーRNA)の操作によって得られる。mRNAからのcDNAライブラリーの構築は、合成物質(cDNA)を作製することを伴う。個々のcDNAクローンは、cDNAライブラリーを有する細胞のクローン選択により合成ライブラリーから精製することができる。したがって、mRNAからのcDNAライブラリーの構築、および異なるcDNAクローンの精製を伴うプロセスは、天然のメッセージのおよそ106倍の精製をもたらす。同様に、プロモーターDNA配列をプラスミドにクローニングすることができる。このようなクローンは天然に存在しないが、むしろ好ましくは、ゲノムDNAライブラリーなどの部分的に精製された天然に存在する物質の操作によって、またはゲノムDNAから直接得られる。したがって、少なくとも1桁の、好ましくは2桁または3桁の、より好ましくは4桁または5桁の精製が、これらの技術において好まれる。
同様に、精製は、成分のDNA配列における化学的または機能的な変化が生じたという指示を表す。「精製」された核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸分子およびタンパク質を含む。用語「精製された」はまた、宿主細胞(例えば、植物細胞)において組換えDNA法により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドを包含する。
用語「組換え体」は、遺伝子組換えが起こった細胞または生物を指す。また、ヒトの介入により、人工的にまたは合成的に(すなわち、非天然に)改変された分子(例えば、ベクター、プラスミド、核酸、ポリペプチドまたは小型RNA)を含む。改変は、その天然の環境もしくは状況内の分子またはそこから取り出された分子について行うことができる。
本明細書で使用するとき、用語「発現」とは、ポリヌクレオチドがmRNA(小型RNA分子を含む)に転写されるプロセス、および/または転写されたmRNA(「転写物」とも呼ばれる)が、続いて、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加または減少させる薬剤への細胞、組織または生物の曝露により影響を与える場合がある。また、遺伝子の発現は、DNAからRNAからタンパク質への経路におけるいずれかの場所で調節され得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、RNA輸送およびプロセッシングに作用する制御を介して、mRNAなどの中間分子の分解、または作製された後の特定のタンパク質の活性化、不活性化、コンパートメント化もしくは分解を介して、あるいはこれらの組合せによって起こる。遺伝子発現は、限定されないが、ノーザンブロット、RT−PCR、ウェスタンブロット、またはインビトロの、インサイチュのもしくはインビボのタンパク質活性アッセイ(単数または複数)などの当該技術分野において公知の任意の方法により、RNAレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。
本明細書で使用するとき、用語「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」または「HBGS」は、転写遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、プロモーターまたは転写された配列に対応する二本鎖RNA(dsRNA)の生成に起因して、それぞれ転写阻害(転写遺伝子サイレンシング;TGS)またはmRNA分解(転写後遺伝子サイレンシング;PTGS)に起因し得る。それぞれのプロセスへの異なる細胞コンポーネントの関与は、dsRNA誘導TGSおよびPTGSが、おそらく古代の共通な機構の多様化に起因することを示唆している。しかしながら、TGSとPTGSを厳密に比較することは、その比較が一般的に異なるサイレンシング遺伝子座の分析に依拠しているために達成が困難であった。単一トランス遺伝子座は、異なる標的遺伝子のプロモーターおよび転写された配列に対応するdsRNAの生成に起因して、TGSとPTGSの両方を始動させると説明することができる。
本明細書で使用するとき、用語「核酸分子」、「核酸」または「ポリヌクレオチド」(3つ全ての用語は互いに同義である)とは、ヌクレオチドのポリマー形態を指し、これには、RNA、cDNA、ゲノムDNAおよび合成形態のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の混合ポリマーを含み得る。「ヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの改変された形態を指してもよい。核酸分子は、通常、他に指定されなければ、少なくとも10塩基長である。これらの用語は、未定長のRNAまたはDNAの分子を指してもよい。これらの用語には、一本鎖形態および二本鎖形態のDNAが含まれる。核酸分子は、天然に存在するおよび/または天然には存在しないヌクレオチド連鎖により互いに連結された天然に存在するおよび改変されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含んでもよい。
核酸分子は、当業者により容易に認識されるように、化学的にもしくは生化学的に改変されてもよく、または非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換、ヌクレオチド間修飾(例えば、非荷電結合:例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど;荷電結合:例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど;ペンダント部分:例えば、ペプチド;インターカレーター:例えば、アクリジン、ソラレンなど;キレート剤;アルキル化剤;および修飾された結合:例えば、アルファアノマー核酸など)が挙げられる。また、用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的な二重鎖、三重鎖、ヘアピン、環状、およびパドロックコンフォメーションなどの任意の位相的コンフォメーションを含む。
転写は、DNA鎖に沿って5’から3’への様式で進行する。これは、RNAが、成長している鎖の3’末端へのリボヌクレオチド−5’−三リン酸の連続付加(ピロリン酸の不可欠な除去とともに)により作製されることを示す。線形または環状の核酸分子のいずれかにおいて、別々の要素(例えば、特定のヌクレオチド配列)は、その要素から5’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、さらなる要素に対して「上流」にあると呼んでもよい。同様に、別々のエレメントは、そのエレメントから3’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、さらなる要素に対して「下流」にあることになり得る。
本明細書で使用するとき、用語「塩基位置」とは、指定された核酸内の所与の塩基またはヌクレオチド残基の位置を指す。指定された核酸は、参照核酸とのアライメントにより定義されてもよい。
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴヌクレオチドとそれらの類似体が水素結合によりハイブリダイズするプロセスを指し、水素結合としては、相補的塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合が含まれる。一般的に、核酸分子は、ピリミジン(シトシン(C)、ウラシル(U)およびチミン(T))またはプリン(アデニン(A)およびグアニン(G))のいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリン間で水素結合を形成し、プリンへのピリミジンの結合は「塩基対合」と呼ばれる。さらに具体的には、AはTまたはUと水素結合し、GはCと結合する。「相補的」とは、2つの異なる核酸配列間または同じ核酸配列の2つの異なる領域間で起こる塩基対合を指す。
本明細書で使用するとき、用語「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、オリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的の間で、安定であり特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を指す。特異的にハイブリダイズするために、オリゴヌクレオチドは、その標的配列に100%相補的である必要はない。標的DNAまたはRNA分子へのオリゴヌクレオチドの結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能と干渉し、特異的結合が望ましい条件下で、例えば、インビボのアッセイまたは系の場合の生理的条件下で非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在するとき、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。特定の程度のストリンジェンシーを生じるハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーション法の性質、ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度(特に、Na+および/またはMg2+濃度)は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに寄与するが、洗浄時間もまたストリンジェンシーに影響を与える。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989で考察されている。
本明細書で使用するとき、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とDNA標的の間のミスマッチが50%未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」には、さらに特定レベルのストリンジェンシーが含まれる。したがって、本明細書で使用するとき、「中程度のストリンジェンシー」条件とは、50%を超える配列ミスマッチを有する分子ではハイブリダイズしない条件であり;「高ストリンジェンシー」の条件とは、20%を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件であり;「超高ストリンジェンシー」の条件とは、10%を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件である。
特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、65℃でのハイブリダイゼーション、続く、0.1×SSC/0.1%SDSを用いた65℃での40分間の洗浄を含むことができる。以下は、代表的な非限定的ハイブリダイゼーション条件である:
超高ストリンジェンシー:5×SSC緩衝液中、65℃で16時間のハイブリダイゼーション;2×SSC緩衝液中、室温でそれぞれ15分間の洗浄2回;および0.5×SSC緩衝液中、65℃でそれぞれ20分間の洗浄2回。
高ストリンジェンシー:5〜6×SSC緩衝液中、65〜70℃で16〜20時間のハイブリダイゼーション;2×SSC緩衝液中、室温でそれぞれ5〜20分間の洗浄2回;および1×SSC緩衝液中、55〜70℃でそれぞれ30分間の洗浄を2回。
中程度ストリンジェンシー:6×SSC緩衝液中、室温から55℃で16〜20時間のハイブリダイゼーション;2×〜3×SSC緩衝液中、室温から55℃でそれぞれ20〜30分間の洗浄を少なくとも2回。
超高ストリンジェンシー:5×SSC緩衝液中、65℃で16時間のハイブリダイゼーション;2×SSC緩衝液中、室温でそれぞれ15分間の洗浄2回;および0.5×SSC緩衝液中、65℃でそれぞれ20分間の洗浄2回。
高ストリンジェンシー:5〜6×SSC緩衝液中、65〜70℃で16〜20時間のハイブリダイゼーション;2×SSC緩衝液中、室温でそれぞれ5〜20分間の洗浄2回;および1×SSC緩衝液中、55〜70℃でそれぞれ30分間の洗浄を2回。
中程度ストリンジェンシー:6×SSC緩衝液中、室温から55℃で16〜20時間のハイブリダイゼーション;2×〜3×SSC緩衝液中、室温から55℃でそれぞれ20〜30分間の洗浄を少なくとも2回。
一実施形態において、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、超高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。一実施形態において、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。一実施形態において、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、中程度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。
本明細書で使用するとき、用語「オリゴヌクレオチド」とは、短い核酸ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、さらに長い核酸セグメントを切断することにより、または個々のヌクレオチド前駆体を重合することにより形成し得る。自動合成装置により、最大数百塩基対長のオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるため、DNAまたはRNAを検出するためのプローブとして使用し得る。DNAで構成されているオリゴヌクレオチド(オリゴデオキシリボヌクレオチド)は、小型DNA配列の増幅のための技術であるポリメラーゼ連鎖反応において使用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応において、オリゴヌクレオチドは、典型的には、「プライマー」と呼ばれ、これによりDNAポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長し、相補鎖を複製することができる。
本明細書で使用するとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」とは、微量の核酸、RNAおよび/またはDNAが、米国特許第4,683,195号明細書に記載されたように増幅される手順または技術を一般に指す。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーが設計できるように、目的とする領域の末端からのまたはそれを超えた配列情報を入手できる必要がある;これらのプライマーは、増幅されるべき鋳型の対向する鎖と配列が同一または類似している。2つのプライマーの5’末端ヌクレオチドは、増幅された材料の末端と一致してもよい。PCRを用いて、特異的RNA配列、全ゲノムDNAからの特異的DNA配列、および全細胞性RNA、バクテリオファージ配列またはプラスミド配列から転写されたcDNAなどを増幅することができる。一般に、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51 :263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)を参照されたい。
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」とは、条件がプライマー伸長産物の合成に適している場合、相補鎖に沿った合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。合成条件には、4つの異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、逆転写酵素またはDNAポリメラーゼなどの少なくとも1つの重合誘導剤の存在が含まれる。これらは、適切な緩衝液中に存在し、該緩衝液は、補因子である、または様々な適切な温度でpHなどの条件に影響を与える構成物質を含んでもよい。プライマーは、好ましくは一本鎖配列であり、それにより、増幅効率が最適化されるが、二本鎖配列を利用することができる。
本明細書で使用するとき、用語「プローブ」とは、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を指す。TAQMAN(登録商標)またはTAQMAN(登録商標)形式のアッセイ手法において、プローブは、2つのプライマーのアニーリング部位間に位置する標的の部分にハイブリダイズする。プローブは、約8ヌクレオチド、約10ヌクレオチド、約15ヌクレオチド、約20ヌクレオチド、約30ヌクレオチド、約40ヌクレオチドまたは約50ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブは、約8ヌクレオチドから約15ヌクレオチドを含む。
サザンブロットアッセイ手法において、プローブは、メンブレンに結合されたDNA断片にハイブリダイズする。プローブは、約10個のヌクレオチド、約100個のヌクレオチド、約250個のヌクレオチド、約500個のヌクレオチド、約1,000個のヌクレオチド、約2,500個のヌクレオチド、または約5,000個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プローブは、約500個のヌクレオチド〜約2,500個のヌクレオチドを含む。
プローブは、検出可能な標識、例えば、放射性標識、ビオチン化標識、フルオロフォア(TEXAS−RED(登録商標)、フルオレセインイソチオシアネートなど)をさらに含むことができる。検出可能な標識は、例えば、プローブの5’末端またはプローブの3’末端に位置したプローブオリゴヌクレオチドに直接、共有結合され得る。また、フルオロフォアを含むプローブはまた、クエンチャー、例えば、BLACK HOLE QUENCHER(登録商標)、IOWA BLACK(商標)などをさらに含むことができる。
本明細書で使用するとき、用語「配列同一性」または「同一性」は交換可能に使用され得、ポリヌクレオチドまたはタンパク質断片のいずれかについて特定の比較ウィンドウにわたって、最大一致となるように整列させた場合に、類似の塩基組成を共有する2つの配列の核酸残基を指す。
本明細書で使用するとき、用語「配列同一性の割合」とは、比較ウィンドウにわたって、2つの最適に整列された配列(例えば、核酸配列またはアミノ酸配列)を比較することにより決定される値を指し、ここで、比較ウィンドウにおける配列の一部は、この2つの配列の最適アライメントの(付加または欠失を含まない)参照配列と比較した場合に、付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでもよい。割合は、同一の核酸またはアミノ酸の残基が両方の配列に生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を算出し、マッチした位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に100を掛けて、配列同一性の割合を算出することにより計算される。比較のために配列を整列させる方法は周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al., (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al., (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al., (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。
国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)ベーシックローカルアライメント検索ツール(BLAST;Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)は、複数の配列分析プログラムと連結して使用するために、複数の供給元、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター(Bethesda,MD)から、および、インターネット上で入手可能である。このプログラムを使用する配列同一性の決定方法の説明は、インターネット上で、BLASTの「help」欄で利用可能である。核酸配列の比較について、BLAST(Blastn)プログラムの「Blast2配列」機能を、デフォルトパラメーターを用いて採用することができる。参照配列に対してより一層大きな類似性を有する核酸配列は、この方法により評価した場合、同一性の割合が高くなることを示す。
本明細書で使用するとき、用語「作動可能に連結された」とは、別の核酸と機能的な関係に置かれた核酸を指す。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結された核酸が連続していることを意味し得る。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成することができる。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが核酸にライゲートまたはアニーリングされ、連続したポリヌクレオチド断片を連結させるために使用される。しかしながら、作動可能に連結しようとする要素は、必ずしも連続していなくてもよい。
本明細書で使用するとき、用語「プロモーター」とは、遺伝子の上流(遺伝子の5’領域方向)に一般的に配置されているDNAの領域を指し、該遺伝子の転写を開始および駆動するため必要とされる。プロモーターは、それが調節する遺伝子を適切に活性化または抑制することができる。プロモーターは、転写因子によって認識される特定配列を含有し得る。これらの因子は、プロモーターDNA配列に結合してもよく、遺伝子のコード領域からRNAを合成する酵素である、RNAポリメラーゼの漸増をもたらす。プロモーターは、一般的に、上流プロモーター、5’−UTR、イントロンおよびリーダー配列を含む、遺伝子の上流に配置された全ての遺伝子調節要素を指す。
本明細書で使用するとき、用語「上流プロモーター」とは、転写の開始を指向するのに十分である連続したポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用するとき、上流プロモーターは、TATAボックス、イニシエーター配列、TFIIB認識要素および他のプロモーターモチーフを含む、いくつかの配列モチーフを有する転写の開始部位を包含する(Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592)。上流プロモーターは、TFIIA、B、D、E、FおよびHのような基本のまたは一般的な転写因子を含むマルチサブユニット酵素であるRNAポリメラーゼIIに対する作用部位を提供する。これらの因子は、DNA鋳型からRNAの合成を触媒する転写開始前の複合体に集合する。
上流プロモーターの活性化は、様々なタンパク質が結合し、続いて、遺伝子発現を活性化するために、転写開始複合体と相互作用する調節DNA配列要素の追加配列によって行われる。これらの遺伝子調節要素配列は、特異的DNA結合因子と相互作用する。これらの配列モチーフは、しばしば、シス要素と呼ばれることがある。このようなシス要素は、それに組織特異的または発生特異的な転写因子が結合するが、個々にまたは組み合わせて、転写レベルでプロモーターの時空間的発現パターンを決定することができる。これらのシス要素は、それらが作動可能に連結された遺伝子に影響を与える制御の種類の点で大きく異なる。いくつかの要素は、環境応答(例えば、温度、湿度および創傷)に応答して、作動可能に連結された遺伝子の転写を増大させるように作用する。他のシス要素は、発生の合図(例えば、発芽、種子成熟および開花)または空間情報(例えば、組織特異性)に応答することができる。例えば、Langridge et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23を参照されたい。これらのシス要素は転写開始点から様々な距離に配置され、いくつかのシス要素(近位要素と呼ばれる)は最小コアプロモーター領域に隣接し、一方、他の要素は、プロモーター(エンハンサー)の数キロベース上流または下流に位置する場合もある。
「DNA結合導入遺伝子」は、DNA結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドコード配列である。DNA結合タンパク質は、続いて、別の分子に結合することができる。結合タンパク質は、例えば、DNA分子(DNA結合タンパク質)、RNA分子(RNA結合タンパク質)および/またはタンパク質分子(タンパク質結合タンパク質)に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合において、それは自分自身に結合する(ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する)ことができる、および/またはそれは異なるタンパク質もしくは複数のタンパク質の1つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、1より多い種類の結合活性を有してもよい。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、DNA結合、RNA結合およびタンパク質結合活性を有する。
DNA結合タンパク質の例としては、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝性操作され」得るメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、CRISPRおよびTALE結合ドメインが含まれる。典型的には、遺伝子操作されたDNA結合タンパク質(例えば、ジンクフィンガー、CRISPRまたはTALE)は、天然に存在しないタンパク質である。DNA結合タンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたDNA結合タンパク質は、その設計/組成が主として合理的基準によってもたらされる、天然には生じないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のZFP、CRISPRおよび/またはTALE設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第6,140,081号明細書;同第6,453,242号明細書;および同第6,534,261号明細書;さらに国際公開第98/53058号パンフレット;同第98/53059号パンフレット;同第98/53060号パンフレット;同第02/016536号パンフレットおよび同第03/016496号パンフレット、ならびに米国特許出願公開第20110301073号明細書、同第20110239315号明細書および同第20119145940号明細書を参照されたい。
「ジンクフィンガーDNA結合タンパク質」(または結合ドメイン)は、構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、1つ以上のジンクフィンガーにより配列特異的様式でDNAに結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質なる用語は、ジンクフィンガータンパク質またはZFPと省略されることが多い。ジンクフィンガー結合ドメインを「遺伝子操作」して、所定のヌクレオチド配列に結合させることができる。ジンクフィンガータンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定な例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、設計/組成が主に合理的基準に基づく自然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のZFP設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第6,140,081号明細書、第6,453,242号明細書、第6,534,261号明細書および第6,794,136号明細書を参照されたい。さらに、国際公開第98/53058号パンフレット、国際公開第98/53059号パンフレット、国際公開第98/53060号パンフレット、国際公開第02/016536号パンフレットおよび国際公開第03/016496号パンフレットも参照されたい。
他の例において、1つ以上のヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、天然に存在するまたは遺伝子操作された(天然に存在しない)TALエフェクターDNA結合ドメインを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20110301073号明細書を参照されたい。キサントモナス(Xanthomonas)属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことが知られている。キサントモナス(Xanthomonas)の病原性は、植物細胞内により多くの異なるエフェクタータンパク質を注入する保存されたIII型分泌(T3S)系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、植物のトランスクリプトームを操作する転写活性化因子様(TALEN)エフェクターがある(Kay et al., (2007) Science 318:648-651を参照されたい)。これらのタンパク質は、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けされたTALエフェクターの1つは、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリア(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)に由来するAvrBs3である(Bonas et al., (1989) Mol Gen Genet 218: 127- 136および国際公開第2010079430号パンフレットを参照されたい)。TALエフェクターは、タンデム反復の集中ドメインを含有し、各反復が、これらのタンパク質のDNA結合特異性の要である約34個のアミノ酸を含有する。さらに、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する(概説については、Schornack S, et al., (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照されたい)。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌(Ralstonia solanacearum)において、brg11およびhpx17と表記される2つの遺伝子が、青枯病菌(R. solanacearum)の次亜種1系統GMI1000および次亜種4系統RS1000において、キサントモナス(Xanthomonas)のAvrBs3ファミリーと相同であることが見出されている(Heuer et al., (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384を参照されたい)。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに98.9%同一であるが、hpx17の反復ドメインにおいて1,575bpの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、キサントモナス(Xanthomonas)のAvrBs3ファミリータンパク質と40%未満の配列同一性を有する。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20110301073号明細書を参照されたい。
これらのTALエフェクターの特異性は、タンデム反復に見出される配列に依存する。反復した配列は、およそ102bpを含み、反復は、典型的には、互いに91〜100%相同である(Bonas et al.、同書)。反復の多型性は、通常、12および13位に位置し、12および13位の超可変ジ残基の正体と、TALエフェクターの標的配列における連続したヌクレオチドの正体との間に1対1の対応関係が存在するようである(Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501およびBoch et al., (2009) Science 326: 1509-1512を参照されたい)。12および13位のHD配列がシトシン(C)への結合をもたらし、NGがTに、NIがA、C、GまたはTに結合し、NNがAまたはGに結合し、およびINGがTに結合するように、これらのTALエフェクターのDNA認識のための天然コードが実験的に決定されている。これらのDNA結合反復を、新たな反復の組合せおよび数を用いてタンパク質へと組み立てて、新たな配列と相互作用し、植物細胞内の非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することが可能である人工転写因子を作製した(Boch et al.、同書)。遺伝子操作されたTALタンパク質をFokI切断ハーフドメインに連結して、酵母レポーターアッセイ(プラスミドベースの標的)において活性を示すTALエフェクタードメインヌクレアーゼ融合(TALEN)を得た。
CRISPR(クラスター化された等間隔短鎖回文反復(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))/Cas(CRISPR関連)ヌクレアーゼ系は、ゲノム遺伝子操作に使用され得る細菌系に基づいて、最近遺伝子操作されたヌクレアーゼ系である。それは、多くの細菌および古細菌の適応的免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが細菌に侵入するとき、侵入体のDNAのセグメントは、「免疫」応答によってCRISPR RNA(crRNA)に変換される。次に、このcrRNAは、部分的に相補的な領域を通じて、tracrRNAと呼ばれる別の種類のRNAと会合して、Cas9ヌクレアーゼを「プロトスペーサー」と呼ばれる標的DNAにおけるcrRNAと相同な領域に導く。Cas9は、DNAを切断して、crRNA転写物内に含有される20ヌクレオチドガイド配列によって特定される部位でDSBの平滑末端を生成する。Cas9は、部位特異的DNA認識および切断のために、crRNAおよびtracrRNAの両方を必要とする。この系は、今では、crRNAおよびtracrRNAが1つの分子に組み合わされ得るように遺伝子操作されており(「単一ガイドRNA」)、単一ガイドRNAのcrRNAに匹敵する部分は、Cas9ヌクレアーゼが任意の所望の配列を標的とするように導くように遺伝子操作され得る(Jinek et al., (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, およびDavid Segal, (2013) eLife 2:e00563を参照されたい)。したがって、CRISPR/Cas系は、ゲノム内の所望の標的において二本鎖切断(DSB)を作製するように遺伝子操作することができ、DSBの修復は、修復阻害因子を使用して、誤りがちな修復の増加を引き起こすことによって影響を受け得る。
他の例において、DNA結合導入遺伝子は、遺伝子操作された(天然に存在しない)メガヌクレアーゼ(ホーミングエンドヌクレアーゼとも呼ばれる)を含む部位特異的ヌクレアーゼである。I−SceI、I−CeuI、PI−PspI、PI−Sce、I−SceIV、I−CsmI、I−PanI、I−SceII、I−PpoI、I−SceIII、I−CreI、I−TevI、I−TevIIおよびI−TevIIIなどのホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。また、米国特許第5,420,032号明細書;米国特許第6,833,252号明細書;Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon et al., (1989) Gene 82:115-118; Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al., (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al., (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびNew England Biolabsカタログを参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのDNA結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905;Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res. 5 31 :2952-2962;Ashworth et al., (2006) Nature 441: 656-659;Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66;米国特許出願公開第20070117128号明細書を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、全体としてのヌクレアーゼという文脈において改変され得る(すなわち、ヌクレアーゼが同族の切断ドメインを含むように)または異種の切断ドメインに融合され得る。
本明細書で使用するとき、用語「形質転換」は、核酸分子をこのような細胞内に導入することができる全ての技術を包含する。例としては、限定されないが、ウイルスベクターによるトランスフェクション;プラスミドベクターによる形質転換;エレクトロポレーション、リポフェクション;マイクロインジェクション(Mueller et al., (1978) Cell 15:579-85);アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介による移入;DNA直接取り込み;WHISKERS(商標)媒介による形質転換;および微粒子銃が挙げられる。これらの技術は、植物細胞の安定した形質転換と一過性の形質転換の両方に使用することができる。「安定した形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝的形質をもたらす宿主生物のゲノムへの核酸断片の導入を指す。安定に形質転換されると、核酸断片は、宿主生物およびいずれかの後続世代のゲノムに安定に組み込まれる。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」生物と呼ばれる。「一過性の形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝的形質なしに遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核またはDNA含有細胞小器官への核酸断片の導入を指す。
本明細書で使用するとき、用語「導入遺伝子」とは外因性核酸配列を指す。一例において、導入遺伝子は、遺伝子配列(例えば、除草剤抵抗性遺伝子)、工業的もしくは薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業形質をコードする遺伝子である。さらに別の例において、導入遺伝子は、小型RNA配列、例えば、アンチセンス核酸配列であり、ここで、小型RNAの発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入遺伝子に作動可能に連結された調節配列(例えば、プロモーター、イントロンまたは3’−UTR)を含有し得る。いくつかの実施形態において、目的とする核酸(または目的とする遺伝子として代替的に記載される)は導入遺伝子である。しかしながら、他の実施形態において、目的とする核酸は、内因性核酸の付加的なゲノムコピーが所望される内因性核酸、または宿主生物における標的核酸の配列に対してアンチセンス方向である核酸である。
本明細書で使用するとき、用語「小型RNA」とは、いくつかの種類の非コードリボ核酸(ncRNA)を指す。小型RNAなる用語は、細菌細胞、動物、植物および菌類において生成されるncRNAの短鎖を記述する。ncRNAのこれらの短鎖は、細胞内で天然に生成され得て、または短鎖もしくはncRNAを発現する外因性配列を導入することにより生成され得る。小型RNA配列は、タンパク質を直接コードせず、小型RNA配列が転写されるのみであり、翻訳されない点で他のRNAと機能において相違する。小型RNA配列は、遺伝子発現および修飾を含む、他の細胞機能に関与する。小型RNA分子は、通常、約20〜30ヌクレオチドから構成される。小型RNA配列は、より長い前駆体から誘導することができる。前駆体は、自己相補性領域において、互いに折り畳む構造を形成する;次に、それらは、動物のヌクレアーゼであるダイサーまたは植物のDCL1により処理される。
多種類の小型RNAは、天然に存在しまたは人工的に生成され、マイクロRNA(miRNA)、短鎖干渉RNA(siRNA)、アンチセンスRNA、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)および短鎖核小体RNA(snoRNA)が含まれる。マイクロRNAおよびsiRNAなどのある種の小型RNAは、遺伝子サイレンシングおよびRNA干渉(RNAi)において重要である。遺伝子サイレンシングは、正常に発現される遺伝子が、細胞内の要素、この場合は小型RNAによって「止め」られる遺伝子調節のプロセスである。通常、この遺伝情報によって形成されるタンパク質は、干渉により形成されず、該遺伝子においてコードされる情報は発現からブロックされる。
本明細書で使用するとき、用語「小型RNA」には、文献に記載されているRNA分子が包含され、例えば、「小さなRNA」(Storz, (2002) Science 296: 1260-3; Illangasekare et al., (1999) RNA 5 : 1482-1489);原核生物の「小型RNA」(sRNA)(Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45);真核生物の「非コードRNA(ncRNA)」:「マイクロRNA(miRNA)」;「小型非mRNA(smmRNA)」、「機能的RNA(fRNA)」、「転移RNA(tRNA)」、「触媒RNA」[例えば、リボザイム、例えば自己アシル化リボザイム(Illangaskare et al., (1999) RNA 5 : 1482-1489)];「小型核小体RNA(snoRNA)」、「tmRNA」(別名「10S RNA」、Muto et al., (1998) Trends Biochem Set. 23 :25-29;およびGillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885);限定されないが、「小型干渉RNA(siRNA)」を含むRNAi分子、「エンドヌクレアーゼ調製siRNA(e−siRNA)」、「短鎖ヘアピンRNA(shRNA)」、および「小型一時的調節RNA(stRNA)」、「角切りsiRNA(d−siRNA)」、ならびにアプタマー、オリゴヌクレオチド、および少なくとも1つのウラシル塩基を含む他の合成核酸が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」とは、細胞内に導入されると形質転換細胞を生成する核酸分子を指す。ベクターは、複製起点などの宿主細胞中での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。例としては、限定されないが、細胞内に外来DNAを運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体(BAC)またはウイルスが含まれる。また、ベクターは、1つ以上の遺伝子、アンチセンス分子および/または選択マーカー遺伝子、ならびに当該技術分野において公知の他の遺伝的要素を含むことができる。ベクターは、細胞を形質導入すること、形質転換すること、または細胞に感染することが可能であり、それによって、細胞が、ベクターによってコードされた核酸分子および/またはタンパク質を発現するようにさせる。ベクターは、場合により、細胞への核酸分子の侵入を達成するのを助けるための材料(例えば、リポソーム)を含んでもよい。
本明細書で使用するとき、用語「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」は、特定の制限部位で、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるDNAのセグメントを指す。DNAのセグメントは、目的とする小型RNAまたはポリペプチドをコードする目的とする遺伝子を含有するポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳に適切なリーディングフレームにカセットの挿入を確実にするために設計される。一実施形態において、発現カセットは、目的とする小型RNAまたはポリペプチドをコードし、ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を含むことができる。一実施形態において、遺伝子発現カセットはまた、宿主細胞において目的とするポリペプチドをコードする小型RNAまたはポリヌクレオチドの発現を増強され得る要素を含んでもよい。これらの要素は、限定されないが、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答要素、イントロン、5’−非翻訳領域配列、3’−非翻訳領域配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などを含んでもよい。
本明細書で使用するとき、用語「異種コード配列」は、宿主生物に通常は存在しないが、適切な条件下で宿主細胞において発現されることができる、ペプチドまたはタンパク質またはその等価なアミノ酸配列、例えば酵素をコードするまたは最終的にコードする、任意のポリヌクレオチドを示すために使用される。したがって、「異種コード配列」は、宿主細胞に通常存在しないコード配列の1つまたは追加のコピーを含んでもよく、よって該細胞は、該細胞に通常存在しないコード配列の追加のコピーを発現している。異種コード配列は、RNAもしくはその任意の種類、例えば、mRNA、DNAもしくはその任意の種類、例えば、cDNA、またはRNA/DNAのハイブリッドであり得る。コード配列の例としては、限定されないが、コード配列、イントロン、プロモーター領域、5’−UTR、3’−UTRおよびエンハンサー領域などのような特徴を含む完全長の転写単位が挙げられる。
「異種コード配列」はまた、ペプチドまたは酵素のコード部分、すなわち、ペプチドまたは酵素のcDNAまたはmRNA配列、ならびに、完全長の転写単位のコード部分、すなわち、イントロンおよびエクソンを含む遺伝子、ならびに、酵素をコードするもしくはその等価なアミノ酸配列をコードする「コドン最適化された」配列、切断された配列、または他の形態の改変された配列を含み、ただし、等価なアミノ酸配列は、機能的タンパク質を生成する。このような等価なアミノ酸配列は、1つ以上のアミノ酸の欠失を有することができ、この欠失はN末端、C末端またはその中間である。切断された形態は、それらが本明細書に示された触媒能を有する限り想定される。
本明細書で使用するとき、用語「対照」は、比較目的で分析手法において使用される試料を指す。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、分析手法の目的が、細胞または組織中で示差的に発現された転写物またはポリペプチドを検出することである場合、一般的に、所望の発現を示す公知の植物からの試料などの陽性対照を含み、所望の発現を欠いている公知の植物由来の試料などの陰性対照を含むことが好ましい。
本明細書で使用するとき、用語「植物」には、植物および植物の部分が含まれ、限定されないが、植物細胞および植物組織、例えば、葉、茎、根、花、花粉および種子が挙げられる。本発明において使用することができる植物の種類は、一般的に、被子植物、裸子植物、シダおよび多細胞藻類を含む突然変異誘発に適した、高等植物および下等植物の種類と同程度に広い。したがって、「植物」とは、双子葉植物および単子葉植物を含む。双子葉植物の例としては、タバコ、アラビドプシス属(Arabidopsis)、ダイズ、トマト、パパイヤ、キャノーラ、ヒマワリ、綿、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウの木、キマメ、エンドウ、アブラナ属(Brassica)、ヒヨコマメ、テンサイ、ナタネ、スイカ、メロン、ペッパー、ピーナッツ、カボチャ、ダイコン、ホウレンソウ、スクワッシュ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、白菜、キュウリ、ナスおよびレタスが挙げられる。単子葉植物の例としては、トウモロコシ、イネ、キムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、竹、バナナ、ガマ、ユリ、オートムギ、タマネギ、キビおよびライコムギが挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「植物材料」とは、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養物、または植物の任意の他の部分または生成物を指す。一実施形態において、植物材料は、子葉および葉を含む。一実施形態において、植物材料には、種子、胚または胚珠が含まれる。一実施形態において、植物材料は、根組織、地下に位置する他の植物組織を含む。
本明細書で使用するとき、用語「選択マーカー遺伝子」とは、例えば、選択剤から植物細胞を保護し、または選択剤に対して抵抗性/耐性を提供するために、場合により植物形質転換に使用される遺伝子を指す。さらに、「選択マーカー遺伝子」は、レポーター遺伝子を包含することを意味する。機能的選択マーカーを受け入れるそれらの細胞または植物だけが、選択剤を有する条件下で分裂または成長することができる。選択剤の例としては、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびハイグロマイシンなどの抗生物質を挙げることができる。これらの選択マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を付与する酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(npt II)、ならびにハイグロマイシンに抵抗性を付与する酵素を発現する、関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびG418またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hpt)の遺伝子が含まれる。他の選択マーカー遺伝子は、barまたはpat(グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンに対する抵抗性)、アセト乳酸合成酵素(ALS、分岐鎖アミノ酸の合成における第一段階を妨げる、スルホニルウレア(SU)、イミダゾリノン(IMl)、トリアゾロピリミジン(TP)、ピリミジニルオキシベンゾエート(POB)およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する抵抗性)、グリホサート、2,4−D、および金属抵抗性または感受性を含む除草剤抵抗性をコードする遺伝子を含むことができる。選択マーカー遺伝子として使用することができる「レポーター遺伝子」の例には、β−グルクロニダーゼ(GUS)、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、DsRed、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アルカリホスファターゼなどをコードするタンパク質などの発現するレポーター遺伝子タンパク質の目視観察が含まれる。成句「マーカー陽性」とは、選択マーカー遺伝子を含むように形質転換された植物を指す。
本明細書で使用するとき、用語「検出可能なマーカー」とは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素などの検出を可能にする標識を指す。検出可能なマーカーの例としては、限定されないが、以下:蛍光標識(例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体)、酵素標識(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)が挙げられる。一実施形態において、検出可能なマーカーは、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって結合させることができる。
本明細書で使用するとき、用語「検出」は、特定の分子の定性的測定と定量的測定の両方、例えば、特定のポリペプチドの測定を含むために、最も広い意味で使用される。
他に特に説明がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術的用語は、本開示が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994; Kendrew et al., (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994;およびMeyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995において見出すことができる。
調節要素
基礎研究またはバイオテクノロジー用途に使用される植物プロモーターは、一般的に、一方向性であり、その3’末端(下流)に融合した導入遺伝子の発現を指示する。代謝工学および形質の積み重ねに関して、植物内で導入遺伝子を確実に発現させることがしばしば必要である。さらに、複数の新規なプロモーターは、典型的には、複数の遺伝子の発現を駆動するためにトランスジェニック作物において必要とされる。本明細書には、3’末端(下流)に融合した第1の遺伝子の発現を指向することができるプロモーターが開示される。
基礎研究またはバイオテクノロジー用途に使用される植物プロモーターは、一般的に、一方向性であり、その3’末端(下流)に融合した導入遺伝子の発現を指示する。代謝工学および形質の積み重ねに関して、植物内で導入遺伝子を確実に発現させることがしばしば必要である。さらに、複数の新規なプロモーターは、典型的には、複数の遺伝子の発現を駆動するためにトランスジェニック作物において必要とされる。本明細書には、3’末端(下流)に融合した第1の遺伝子の発現を指向することができるプロモーターが開示される。
トランスジェニック産物の開発は、ますます複雑になり、確実に導入遺伝子を発現させ、単一の遺伝子座に複数の導入遺伝子を積み重ねる必要がある。伝統的に、それぞれの導入遺伝子は、発現のために固有のプロモーターを必要とし、複数のプロモーターが、1つの遺伝子の積み重ね内に異なる導入遺伝子を発現させるために必要とされる。サイズが増加した遺伝子の積み重ねを用いることは、多くの場合、単一の多遺伝子形質の発現のための異なる導入遺伝子の発現パターンの類似のレベルを得るために、同一のプロモーターの反復使用をもたらす。同じプロモーターによって駆動される多重遺伝子構築物は、この分野において、有効性が低いトランスジェニック産物を生じさせる遺伝子サイレンシングを引き起こすことは公知である。プロモーターの反復に起因した過剰の転写因子(TF)結合部位は、転写不活性化をもたらす内因性TFの枯渇を引き起こす可能性がある。導入遺伝子のサイレンシングは、おそらくは、導入遺伝子を発現するように生成されたトランスジェニック植物の性能に不必要に影響を及ぼす。導入遺伝子内の反復配列は、ポリヌクレオチドの再配列をもたらす遺伝子内の遺伝子座相同組換えをもたらす可能性がある。
組織特異的(すなわち、組織優先)または器官特異的プロモーターは、植物の胚珠、胚、種子、仁、根、葉またはタペータムなどの特定の組織における遺伝子発現を駆動する。組織および発育段階の特異的プロモーターは、特定の組織においてまたは植物の発育中の特定の期間に発現される遺伝子の発現を導く。組織特異的プロモーターは、トランスジェニック植物産業における特定の用途に必要とされ、組織および/または発育段階の選択的方法で異種遺伝子の特異的発現を可能にするために望ましく、様々な器官、組織および/または時間で示差的に異種遺伝子の発現を示し、その他は示さない。例えば、土壌媒介性病原体による感染に対する植物の抵抗性の増加は、病原体抵抗性遺伝子で植物ゲノムを形質転換することによって達成され得、それにより、病原体抵抗性タンパク質は植物の根内で確実に発現される。あるいは、例えば、細胞の分裂または伸長などの特定の成長または発達時期にある植物組織において導入遺伝子を発現することが望ましい場合がある。別の用途は、例えば、木部の発育において農業形質をコードする導入遺伝子の発現を付与するように、望ましくは組織特異的プロモーターを用いることである。別の用途は、種子、胚珠、または胚内の導入遺伝子の発現を駆動するためのものである。組織特異的プロモーターの同定において残された1つの特定の課題は、潜在的に最も重要な遺伝子およびそれらの対応するプロモーターをどのように同定し、細胞の特定の発生特性にこれらがどのように関連するのかということである。別の課題は、クローニングされたDNA断片が望まれる特定の発現パターンにおいて転写を駆動するように、全ての関連するシス作用の転写調節要素をクローニングすることである。具体的な課題は、他の植物組織では発現されない植物の特定の細胞型、発育段階および/または機能に関連する組織特異的プロモーターを同定することである。
セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター調節要素を用いて、植物に導入遺伝子を発現させるための方法および構築物が提供される。一実施形態において、プロモーターは、以下のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターであり得る:
一実施形態において、遺伝子発現カセットはプロモーターを含む。一実施形態において、プロモーターは、本開示のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターであり得る。一実施形態において、遺伝子発現カセットはプロモーターを含み、該プロモーターは、配列番号1に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%または100%同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む。一実施形態において、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットは、2つ以上の導入遺伝子の発現を駆動し得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されているセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
導入遺伝子発現はまた、遺伝子のコード配列の下流に位置する3’非翻訳遺伝子領域(すなわち、3’UTR)によって調節され得る。プロモーターと3’UTRの両方が導入遺伝子発現を調節することができる。プロモーターは転写を駆動するために必要であるが、3’UTR遺伝子領域は転写を終結させ、翻訳およびタンパク質合成のために得られたmRNA転写物のポリアデニル化を開始することができる。3’UTR遺伝子領域は、導入遺伝子の安定した発現を助ける。一実施形態において、3’UTRは、以下のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRであり得る:
一実施形態において、遺伝子発現カセットは3’UTRを含む。一実施形態において、3’UTRは、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRであり得る。一実施形態において、遺伝子発現カセットは3’UTRを含み、ここで、3’UTRは、配列番号2に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%、98%、99%、99.5%、99.8%または100%同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されている3’−UTRを含み、ここで、該導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子から精製されたプロモーターおよび3’−UTRを含む。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、a)配列番号1に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%または100%同一であるイントロン;および/またはb)配列番号2に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%または100%同一である3’−UTRを含む。
例えば、遺伝子発現カセットは、プロモーターと3’−UTRの両方を含んでもよく、ここで、プロモーターは配列番号1のポリヌクレオチドであり、3’−UTRは配列番号2のポリヌクレオチドである。遺伝子発現カセットが1つ以上の導入遺伝子を含む場合、プロモーターおよび3’−UTRは、遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子に作動可能に連結することができる。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター(配列番号1)を含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTR(配列番号2)を含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せであり得る。
一実施形態において、ベクターは、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージ、ウイルス、またはドナーDNAなどの形質転換もしくは遺伝子標的において使用するための切り出されたポリヌクレオチド断片であり得る。
一実施形態において、細胞または植物は、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、細胞または植物は、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。それにより、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む細胞または植物は、それぞれトランスジェニック細胞またはトランスジェニック植物である。一実施形態において、トランスジェニック植物は単子葉植物であり得る。一実施形態において、トランスジェニック単子葉植物は、限定されないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、オートムギ、ライムギ、バナナ、サトウキビおよびキビであり得る。一実施形態において、トランスジェニック植物は双子葉植物であり得る。一実施形態において、トランスジェニック双子葉植物は、限定されないが、ダイズ、綿、ヒマワリおよびカノーラであり得る。また、実施形態は、本明細書に開示されるトランスジェニック植物からのトランスジェニック種子を含む。
一実施形態において、遺伝子発現カセットは、2つ以上の導入遺伝子を含む。2つ以上の導入遺伝子は、本明細書に開示されるセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターまたは3’−UTRに作動可能に連結されていてもよい。一実施形態において、遺伝子発現カセットは1つ以上の導入遺伝子を含む。1つ以上の導入遺伝子を有する実施形態において、少なくとも1つの導入遺伝子は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターもしくは3’−UTRまたは本開示に作動可能に連結されている。
選択マーカー
レポーター遺伝子としても記載される様々な選択マーカーは、形質転換植物(「形質転換体」)の同定および選択を可能にする選ばれた発現ベクターに組み込むことができる。形質転換植物における選択マーカーの発現を確認するために、多数の方法が利用可能であり、例えば、DNA配列決定およびPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、サザンブロッティング、RNAブロッティング、ベクターから発現されたタンパク質、例えば、ホスフィノトリシン抵抗性を媒介する沈殿タンパク質を検出するための免疫学的方法、または他のタンパク質、例えば、β−グルクロニダーゼ(GUS)、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、赤色蛍光タンパク質(DsRed)、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アルカリホスファターゼなどをコードするレポーター遺伝子などの他のタンパク質の目視観察が挙げられる(その全体が参照により本明細書に組み込まれるSambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001を参照されたい)。
レポーター遺伝子としても記載される様々な選択マーカーは、形質転換植物(「形質転換体」)の同定および選択を可能にする選ばれた発現ベクターに組み込むことができる。形質転換植物における選択マーカーの発現を確認するために、多数の方法が利用可能であり、例えば、DNA配列決定およびPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、サザンブロッティング、RNAブロッティング、ベクターから発現されたタンパク質、例えば、ホスフィノトリシン抵抗性を媒介する沈殿タンパク質を検出するための免疫学的方法、または他のタンパク質、例えば、β−グルクロニダーゼ(GUS)、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、赤色蛍光タンパク質(DsRed)、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アルカリホスファターゼなどをコードするレポーター遺伝子などの他のタンパク質の目視観察が挙げられる(その全体が参照により本明細書に組み込まれるSambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001を参照されたい)。
選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織の選択に利用される。選択マーカー遺伝子としては、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(NptII)およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)をコードするもの、ならびに除草剤化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子が挙げられる。除草剤抵抗性遺伝子は、一般的に、除草剤に対して非感受性の修飾された標的タンパク質をコードしている、または植物中の除草剤をそれが作用し得る前に分解もしくは解毒する酵素をコードしている。例えば、グリホサートに対する抵抗性は、突然変異型標的酵素、5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)をコードする遺伝子を使用することによって得られた。EPSPSについての遺伝子および突然変異体は周知であり、下記でさらに説明される。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニルおよび2,4−ジクロロフェノキシアセテート(2,4−D)に対する抵抗性は、それぞれの除草剤を解毒する、patもしくはDSM−2をコードする細菌遺伝子、ニトリラーゼ、aad−1またはaad−12遺伝子を使用することによって得られた。
一実施形態において、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含む除草剤は、生長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤に対するアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)およびアセト乳酸シンターゼ(ALS)の抵抗性/耐性のための遺伝子は周知である。グリホサート抵抗性遺伝子としては、突然変異5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPs)およびdgt−28遺伝子(組換え核酸の導入および/もしくは天然EPSPs遺伝子の様々な形態のインビボ突然変異誘発による)、aroA遺伝子ならびにグルホサートアセチルトランスフェラーゼ(GAT)遺伝子がそれぞれ挙げられる)。他のホスホノ化合物に対する抵抗性遺伝子としては、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridichromogenes)を含むストレプトマイセス属(Streptomyces)種からのbar遺伝子、ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン(AACアーゼ阻害剤コード遺伝子)が挙げられる。シクロヘキサンジオンおよび/またはアリールオキシフェノキシプロパン酸(ハロキシフォップ、ジクロホップ、フェノキシプロプ、フルアジホップ、キザロホップを含む)に対する抵抗性を付与する例示的遺伝子としては、アセチル補酵素Aカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)の遺伝子−−Acc1−S1、Acc1−S2およびAcc1−S3が挙げられる。一実施形態において、トリアジン(psbAおよび1s+遺伝子)またはベントニトリル(ニトリラーゼ遺伝子)を含む除草剤は、光合成を阻害することができる。
一実施形態において、選択マーカー遺伝子としては、限定されないが、以下をコードする遺伝子が挙げられる:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII;シアナミドヒドラターゼ;アスパラギン酸キナーゼ;ジヒドロジピコリン酸シンターゼ;トリプトファンデカルボキシラーゼ;ジヒドロジピコリン酸シンターゼおよび脱感作型アスパラギン酸キナーゼ;bar遺伝子;トリプトファンデカルボキシラーゼ;ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NEO);ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPTまたはHYG);ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR);ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ;2,2−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ;アセトヒドロキシ酸シンターゼ;5−エノールピルビルシキミ酸−リン酸シンターゼ(aroA);ハロアリールニトリラーゼ;アセチル補酵素Aカルボキシラーゼ;ジヒドロプテロイン酸シンターゼ(sul I);および32kD光化学系IIポリペプチド(psbA)。
一実施形態はまた、2,4−D;クロラムフェニコール;メトトレキサート;ハイグロマイシン;スペクチノマイシン;ブロモキシニル;グリホサート;およびホスフィノスリシンに対する耐性をコードする遺伝子を含む。
選択マーカー遺伝子の上記リストは、限定を意図したものではない。任意のレポーターまたは選択可能マーカー遺伝子が本発明によって包含される。
選択マーカー遺伝子は、植物における最適な発現のために合成される。例えば、一実施形態において、遺伝子のコード配列は、植物における発現を高めるためにコドン最適化によって修飾されている。選択マーカー遺伝子は、特定の植物種における発現のために最適化され得、または代替的に双子葉植物もしくは単子葉植物における最適な発現のために修飾され得る。植物の好ましいコドンは、目的とする特定の植物種において最大量で発現されるタンパク質における最高の頻度のコドンから決定されてもよい。一実施形態において、選択マーカー遺伝子は、より高い形質転換効率をもたらす、より高いレベルで植物中に発現されるように設計される。遺伝子の植物最適化のための方法は周知である。合成ポリヌクレオチド配列の最適化および製造に関する指針は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2013016546号パンフレット、同第2011146524号パンフレット、同第1997013402号パンフレット、米国特許第6166302号明細書、および同第5,380,831号明細書に見出すことができる。
導入遺伝子
開示されている方法および組成物は、植物ゲノム内でポリヌクレオチド遺伝子配列を発現させるために使用することができる。したがって、除草剤耐性、害虫抵抗性、栄養分、抗生物質または治療用分子をコードする遺伝子の発現を植物プロモーターによって駆動することができる。
開示されている方法および組成物は、植物ゲノム内でポリヌクレオチド遺伝子配列を発現させるために使用することができる。したがって、除草剤耐性、害虫抵抗性、栄養分、抗生物質または治療用分子をコードする遺伝子の発現を植物プロモーターによって駆動することができる。
一実施形態において、本開示のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子調節要素は、グリホサートまたは別の除草剤に対する抵抗性または耐性を付与するポリヌクレオチド配列をコードする遺伝子と組み合わせられまたはそれに作動可能に連結され、ならびに/あるいは害虫もしくは病害に対する抵抗性および/または栄養強化、および/または改善された農業特性、および/または食事、食物、産業上、医薬的もしくは他の使用に有用なタンパク質もしくは他の生産物を与える。導入遺伝子は、植物ゲノム内の目的とする2つ以上の核酸配列と「積み重ね」ることができる。積み重ねは、2つ以上の事象を用いた従来の植物育種、目的とする配列を含有する構築物を用いた植物の形質転換、トランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによる標的組み込みを介した新しい形質の付与によって達成され得る。
目的とするこのようなポリヌクレオチド配列としては、限定されないが、以下に示す例が含まれる:
1.有害生物または病害に対して抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列(例えば、iRNA)
(A)植物病害抵抗性遺伝子。植物防御は、多くの場合、植物中の病害抵抗性遺伝子(R)の生成物と、病原体中の対応する非病原性(Avr)遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化される。ある植物種を、クローニングされた抵抗性遺伝子で形質転換し、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に遺伝子操作することができる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum)に対する抵抗性のためのトマトCf−9遺伝子(Jones et al., 1994 Science 266:789)、トマト斑葉細菌病(Pseudomonas syringae pv. tomato)に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードするトマトPto遺伝子(Martin et al., 1993 Science 262: 1432)およびシュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)に対する抵抗性のための、アラビドプシス属RSSP2遺伝子(Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089)が挙げられる。
(B)Btδ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列などの、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)タンパク質、その誘導体またはそれをモデルにした合成ポリペプチド(Geiser et al., 1986 Gene 48:109)および栄養型殺虫性(VIP)遺伝子(例えば、Estruch et al., (1996)、Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94を参照されたい)。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするDNA分子は、American Type Culture collection(Rockville、Md.)からATCC受託番号40098、67136、31995および31998の下で購入可能である。
(C)いくつかのクンシラン(Clivia miniata)マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列などのレクチン(Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825)。
(D)昆虫有害生物に対する幼虫駆除剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体などのビタミン結合タンパク質。米国特許第5,659,026号明細書を参照されたい。
(E)酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。このような遺伝子の例には、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤(Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793)、タバコプロテイナーゼ阻害剤I(Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985)、およびα−アミラーゼ阻害剤(Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243)が挙げられる。
(F)昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドおよび幼若ホルモンその改変体、それをベースとした模倣体またはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活化(Hammock et al., 1990 Nature 344:458)。
(G)発現すると、影響を受ける有害生物の生理学を撹乱する、昆虫特異的ペプチドまたはニューロペプチド(J. Biol. Chem. 269:9)。このような遺伝子の例として、昆虫利尿ホルモン受容体(Regan, 1994)、ディプロプテラ・プンクタータ(Diploptera punctata)において同定されたアロスタチン(Pratt, 1989)および昆虫特異的、麻痺性神経毒(米国特許第5,266,361号明細書)が挙げられる。
(H)ヘビ、スズメバチなどによって天然に産生される昆虫特異的毒液、例えば、サソリ昆虫毒ペプチド(Pang, 1992 Gene 116:165)。
(I)モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与している酵素。
(J)生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含めた、修飾に関与している酵素、例えば、天然または合成にかかわらず、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼおよびエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。このような遺伝子の例として、callas遺伝子(PCT公開出願第93/02197号パンフレット)、キチナーゼをコードする配列(例えば、ATCCから受託番号3999637および67152の下で入手できる)、タバコ鉤虫キチナーゼ(Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691)およびパセリubi4−2ポリユビキチン遺伝子(Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673)が挙げられる。
(K)シグナル変換をシミュレートする分子。このような分子の例として、リョクトウカルモジュリンcDNAクローンのヌクレオチド配列(Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757)およびトウモロコシカルモジュリンcDNAクローンのヌクレオチド配列(Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467)が挙げられる。
(L)疎水性モーメントペプチド。米国特許第5,659,026号明細書および第5,607,914号明細書を参照されたい;後者は、病害抵抗性を付与する合成抗菌ペプチドを教示している。
(M)膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤、例えば、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム(Pseudomonas solanacearum)に対して抵抗性にする、セクロピン−ベータ溶菌性ペプチド類似体(Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43)。
(N)ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染および/またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、ならびに関連ウイルスによって達成される病害発生に対する抵抗性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスX、ジャガイモウイルスY、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して、コートタンパク質媒介性抵抗性が形質転換植物に付与されている。例えば、Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451を参照されたい。
(O)昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸において重大な代謝機能にターゲッティングされる抗体は、影響を受ける酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。例えば、Taylor et al., (1994), Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片の製造によるトランスジェニックタバコにおける酵素性不活性化を示す。
(P)ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護されるということを示すTavladoraki et al., (1993)、Nature 266:469を参照されたい。
(Q)病原体または寄生生物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質。したがって、真菌エンドα−1,4−Dポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−1,4−D−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌コロニー形成および植物栄養放出を促進する(Lamb et al., 1992), Bio/Technology 10:1436。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定が、Toubartら(1992 Plant J. 2:367)に記載されている。
(R)植物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質、例えば、真菌病害に対する増大した抵抗性を提供するオオムギリボソーム不活化遺伝子(Longemann et al., 1992), Bio/Technology 10:3305。
(S)RNA分子が、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される、RNA干渉。一例では、RNA分子は、部分的または完全に二本鎖であり、サイレンシング反応を引き起こし、dsRNAの低分子干渉RNAへの切断をもたらし、次いで、これが、相同mRNAを破壊するターゲッティング複合体中に組み込まれる。例えば、Fire et al., 米国特許第6,506,559号明細書;Graham et al., 米国特許第6,573,099号明細書を参照されたい。
1.有害生物または病害に対して抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列(例えば、iRNA)
(A)植物病害抵抗性遺伝子。植物防御は、多くの場合、植物中の病害抵抗性遺伝子(R)の生成物と、病原体中の対応する非病原性(Avr)遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化される。ある植物種を、クローニングされた抵抗性遺伝子で形質転換し、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に遺伝子操作することができる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum)に対する抵抗性のためのトマトCf−9遺伝子(Jones et al., 1994 Science 266:789)、トマト斑葉細菌病(Pseudomonas syringae pv. tomato)に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードするトマトPto遺伝子(Martin et al., 1993 Science 262: 1432)およびシュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)に対する抵抗性のための、アラビドプシス属RSSP2遺伝子(Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089)が挙げられる。
(B)Btδ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列などの、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)タンパク質、その誘導体またはそれをモデルにした合成ポリペプチド(Geiser et al., 1986 Gene 48:109)および栄養型殺虫性(VIP)遺伝子(例えば、Estruch et al., (1996)、Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94を参照されたい)。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするDNA分子は、American Type Culture collection(Rockville、Md.)からATCC受託番号40098、67136、31995および31998の下で購入可能である。
(C)いくつかのクンシラン(Clivia miniata)マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列などのレクチン(Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825)。
(D)昆虫有害生物に対する幼虫駆除剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体などのビタミン結合タンパク質。米国特許第5,659,026号明細書を参照されたい。
(E)酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。このような遺伝子の例には、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤(Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793)、タバコプロテイナーゼ阻害剤I(Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985)、およびα−アミラーゼ阻害剤(Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243)が挙げられる。
(F)昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドおよび幼若ホルモンその改変体、それをベースとした模倣体またはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活化(Hammock et al., 1990 Nature 344:458)。
(G)発現すると、影響を受ける有害生物の生理学を撹乱する、昆虫特異的ペプチドまたはニューロペプチド(J. Biol. Chem. 269:9)。このような遺伝子の例として、昆虫利尿ホルモン受容体(Regan, 1994)、ディプロプテラ・プンクタータ(Diploptera punctata)において同定されたアロスタチン(Pratt, 1989)および昆虫特異的、麻痺性神経毒(米国特許第5,266,361号明細書)が挙げられる。
(H)ヘビ、スズメバチなどによって天然に産生される昆虫特異的毒液、例えば、サソリ昆虫毒ペプチド(Pang, 1992 Gene 116:165)。
(I)モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与している酵素。
(J)生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含めた、修飾に関与している酵素、例えば、天然または合成にかかわらず、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼおよびエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。このような遺伝子の例として、callas遺伝子(PCT公開出願第93/02197号パンフレット)、キチナーゼをコードする配列(例えば、ATCCから受託番号3999637および67152の下で入手できる)、タバコ鉤虫キチナーゼ(Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691)およびパセリubi4−2ポリユビキチン遺伝子(Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673)が挙げられる。
(K)シグナル変換をシミュレートする分子。このような分子の例として、リョクトウカルモジュリンcDNAクローンのヌクレオチド配列(Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757)およびトウモロコシカルモジュリンcDNAクローンのヌクレオチド配列(Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467)が挙げられる。
(L)疎水性モーメントペプチド。米国特許第5,659,026号明細書および第5,607,914号明細書を参照されたい;後者は、病害抵抗性を付与する合成抗菌ペプチドを教示している。
(M)膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤、例えば、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム(Pseudomonas solanacearum)に対して抵抗性にする、セクロピン−ベータ溶菌性ペプチド類似体(Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43)。
(N)ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染および/またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、ならびに関連ウイルスによって達成される病害発生に対する抵抗性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスX、ジャガイモウイルスY、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して、コートタンパク質媒介性抵抗性が形質転換植物に付与されている。例えば、Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451を参照されたい。
(O)昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸において重大な代謝機能にターゲッティングされる抗体は、影響を受ける酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。例えば、Taylor et al., (1994), Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片の製造によるトランスジェニックタバコにおける酵素性不活性化を示す。
(P)ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護されるということを示すTavladoraki et al., (1993)、Nature 266:469を参照されたい。
(Q)病原体または寄生生物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質。したがって、真菌エンドα−1,4−Dポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−1,4−D−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌コロニー形成および植物栄養放出を促進する(Lamb et al., 1992), Bio/Technology 10:1436。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定が、Toubartら(1992 Plant J. 2:367)に記載されている。
(R)植物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質、例えば、真菌病害に対する増大した抵抗性を提供するオオムギリボソーム不活化遺伝子(Longemann et al., 1992), Bio/Technology 10:3305。
(S)RNA分子が、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される、RNA干渉。一例では、RNA分子は、部分的または完全に二本鎖であり、サイレンシング反応を引き起こし、dsRNAの低分子干渉RNAへの切断をもたらし、次いで、これが、相同mRNAを破壊するターゲッティング複合体中に組み込まれる。例えば、Fire et al., 米国特許第6,506,559号明細書;Graham et al., 米国特許第6,573,099号明細書を参照されたい。
2.除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子
(A)成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン(imidazalinone)、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的遺伝子は、突然変異体アセト乳酸シンターゼ(ALS)をコードし(Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241)、これは、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素としても知られている(Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449)。
(B)突然変異体EPSPシンターゼおよびaroA遺伝子によって、またはDGT−28、2mEPSPS、GAT(グリホサートアセチルトランスフェラーゼ)もしくはGOX(グリホサートオキシダーゼ)などの遺伝子およびグルホシネート(pat、bar、およびdsm−2遺伝子)などのその他のホスホノ化合物ならびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン(ACCアーゼ阻害剤をコードする遺伝子)による代謝不活性化によって与えられる、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードする1つ以上のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を付与できるEPSPの形態のヌクレオチド配列を開示する米国特許第4,940,835号明細書を参照のこと。突然変異体aroA遺伝子をコードするDNA分子は、ATCC受託番号39256の下で得ることができ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第4,769,061号明細書に開示されている。欧州特許出願公開第0333033号明細書および米国特許第4,975,374号明細書には、L−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願公開第0242246号明細書に提供されている。De Greef et al., (1989), Bio/Technology 7:61には、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性のためにキメラbar遺伝子コーディングを発現するトランスジェニック植物の製造が記載されている。アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびセトキシジムおよびハロキシフォップなどのシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を付与する遺伝子の例示的なものとして、Marshall et al., (1992), Theor. Appl. Genet. 83:435に記載される、Accl−S1、Accl−S2およびAccl−S3遺伝子がある。
(C)光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子(psbAおよびgs+遺伝子)およびベンゾニトリル(ニトリラーゼ遺伝子)。Przibilla et al., (1991), Plant Cell 3:169には、クラミドモナス(Chlamydomonas)を形質転換するための突然変異体psbA遺伝子をコードするプラスミドの使用が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第4,810,648号明細書に開示されており、これらの遺伝子を含有するDNA分子は、ATCC受託番号53435、67441および67442の下で入手可能である。グルタチオンS−トランスフェラーゼのDNAコーディングのクローニングおよび発現は、Hayes et al., (1992), Biochem. J. 285:173に記載されている。
(D)ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸(HPP)がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素と結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これは、イソキサゾール(欧州特許第418175号明細書、欧州特許第470856号明細書、欧州特許第487352号明細書、欧州特許第527036号明細書、欧州特許第560482号明細書、欧州特許第682659号明細書、米国特許第5,424,276号明細書)、特に、トウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル(欧州特許第496630号明細書、欧州特許第496631号明細書)、特に、2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−SO2CH3−4−CF3フェニル)プロパン−1,3−ジオンおよび2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−SO2CH3−4−2,3Cl2フェニル)プロパン−1,3−ジオン、トリケトン(欧州特許第625505号明細書、欧州特許第625508号明細書、米国特許第5,506,195号明細書)、特に、スルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤を含む。例えば、米国特許第6,268,549号明細書および同6,245,968号明細書および米国特許出願公開第20030066102号明細書に記載される遺伝子を含めた、植物において過剰量のHPPDを生成する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を提供し得る。
(E)フェノキシオーキシン除草剤、例えば、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオネート(AOPP)除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、米国特許第7,838,733号明細書に記載される、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素(aad−1)遺伝子が挙げられる。
(F)2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、国際公開第2007/053482号パンフレットに記載されるα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子(aad−12)が挙げられる。
(G)ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子(例えば、米国特許公開第20030135879号明細書を参照されたい)。
(H)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(PPO)を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子(米国特許第5,767,373号明細書を参照されたい)。
(I)光化学系II反応中心(PS II)のコアタンパク質と結合する、トリアジン除草剤(アトラジンなど)および尿素誘導体(ジウロンなど)除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子(Brussian et al., (1989), EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245を参照されたい。
(A)成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン(imidazalinone)、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的遺伝子は、突然変異体アセト乳酸シンターゼ(ALS)をコードし(Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241)、これは、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)酵素としても知られている(Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449)。
(B)突然変異体EPSPシンターゼおよびaroA遺伝子によって、またはDGT−28、2mEPSPS、GAT(グリホサートアセチルトランスフェラーゼ)もしくはGOX(グリホサートオキシダーゼ)などの遺伝子およびグルホシネート(pat、bar、およびdsm−2遺伝子)などのその他のホスホノ化合物ならびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン(ACCアーゼ阻害剤をコードする遺伝子)による代謝不活性化によって与えられる、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードする1つ以上のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を付与できるEPSPの形態のヌクレオチド配列を開示する米国特許第4,940,835号明細書を参照のこと。突然変異体aroA遺伝子をコードするDNA分子は、ATCC受託番号39256の下で得ることができ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第4,769,061号明細書に開示されている。欧州特許出願公開第0333033号明細書および米国特許第4,975,374号明細書には、L−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願公開第0242246号明細書に提供されている。De Greef et al., (1989), Bio/Technology 7:61には、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性のためにキメラbar遺伝子コーディングを発現するトランスジェニック植物の製造が記載されている。アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびセトキシジムおよびハロキシフォップなどのシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を付与する遺伝子の例示的なものとして、Marshall et al., (1992), Theor. Appl. Genet. 83:435に記載される、Accl−S1、Accl−S2およびAccl−S3遺伝子がある。
(C)光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子(psbAおよびgs+遺伝子)およびベンゾニトリル(ニトリラーゼ遺伝子)。Przibilla et al., (1991), Plant Cell 3:169には、クラミドモナス(Chlamydomonas)を形質転換するための突然変異体psbA遺伝子をコードするプラスミドの使用が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第4,810,648号明細書に開示されており、これらの遺伝子を含有するDNA分子は、ATCC受託番号53435、67441および67442の下で入手可能である。グルタチオンS−トランスフェラーゼのDNAコーディングのクローニングおよび発現は、Hayes et al., (1992), Biochem. J. 285:173に記載されている。
(D)ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸(HPP)がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素と結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これは、イソキサゾール(欧州特許第418175号明細書、欧州特許第470856号明細書、欧州特許第487352号明細書、欧州特許第527036号明細書、欧州特許第560482号明細書、欧州特許第682659号明細書、米国特許第5,424,276号明細書)、特に、トウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル(欧州特許第496630号明細書、欧州特許第496631号明細書)、特に、2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−SO2CH3−4−CF3フェニル)プロパン−1,3−ジオンおよび2−シアノ−3−シクロプロピル−1−(2−SO2CH3−4−2,3Cl2フェニル)プロパン−1,3−ジオン、トリケトン(欧州特許第625505号明細書、欧州特許第625508号明細書、米国特許第5,506,195号明細書)、特に、スルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤を含む。例えば、米国特許第6,268,549号明細書および同6,245,968号明細書および米国特許出願公開第20030066102号明細書に記載される遺伝子を含めた、植物において過剰量のHPPDを生成する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を提供し得る。
(E)フェノキシオーキシン除草剤、例えば、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオネート(AOPP)除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、米国特許第7,838,733号明細書に記載される、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素(aad−1)遺伝子が挙げられる。
(F)2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、国際公開第2007/053482号パンフレットに記載されるα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子(aad−12)が挙げられる。
(G)ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子(例えば、米国特許公開第20030135879号明細書を参照されたい)。
(H)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(PPO)を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子(米国特許第5,767,373号明細書を参照されたい)。
(I)光化学系II反応中心(PS II)のコアタンパク質と結合する、トリアジン除草剤(アトラジンなど)および尿素誘導体(ジウロンなど)除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子(Brussian et al., (1989), EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245を参照されたい。
3.価値が付加された形質を付与するまたはそれに貢献する遺伝子
(A)植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ACP不飽和化酵素で、トウモロコシまたはアブラナ属(Brassica)を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝(Knultzon et al., 1992), Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624。
(B)減少したフィチン酸含量
(1)クロコウジカビ(Aspergillus niger)フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入(Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
(2)フィチン酸含量を低下させる遺伝子は導入され得る。トウモロコシにおいて、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体に関与する単一の対立遺伝子と関連しているDNAを再導入することによって達成され得る(Raboy et al., 1990 Maydica 35:383)。
(C)例えば、植物を、デンプンの分岐パターンを変更する酵素をコードする遺伝子で形質転換することによって達成される修飾された炭水化物組成物。このような酵素の例として、ストレプトコッカス・ミューカス(Streptococcus mucus)のフルクトース転移酵素遺伝子(Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)のレバンスクラーゼ遺伝子(Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)のα−アミラーゼ(Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292)、トマトインベルターゼ遺伝子(Elliot et al., 1993)、オオムギアミラーゼ遺伝子(Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480)およびトウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素II(Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450)が挙げられる。
(A)植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ACP不飽和化酵素で、トウモロコシまたはアブラナ属(Brassica)を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝(Knultzon et al., 1992), Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624。
(B)減少したフィチン酸含量
(1)クロコウジカビ(Aspergillus niger)フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入(Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
(2)フィチン酸含量を低下させる遺伝子は導入され得る。トウモロコシにおいて、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体に関与する単一の対立遺伝子と関連しているDNAを再導入することによって達成され得る(Raboy et al., 1990 Maydica 35:383)。
(C)例えば、植物を、デンプンの分岐パターンを変更する酵素をコードする遺伝子で形質転換することによって達成される修飾された炭水化物組成物。このような酵素の例として、ストレプトコッカス・ミューカス(Streptococcus mucus)のフルクトース転移酵素遺伝子(Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)のレバンスクラーゼ遺伝子(Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)のα−アミラーゼ(Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292)、トマトインベルターゼ遺伝子(Elliot et al., 1993)、オオムギアミラーゼ遺伝子(Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480)およびトウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素II(Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450)が挙げられる。
形質転換
植物の形質転換に適した方法は、DNAが細胞内に導入され得る任意の方法を含み、例えば、限定されないが、エレクトロポレーション(米国特許第5,384,253号明細書参照)、微粒子銃(例えば、米国特許第5,015,580号明細書;第5,550,318号明細書;第5,538,880号明細書;第6,160,208号明細書;第6,399,861号明細書;および第6,403,865号明細書参照);アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介性形質転換(例えば、米国特許第5,635,055号明細書;第5,824,877号明細書;第5,591,616号明細書;第5,981,840号明細書;および第6,384,301号明細書参照);およびプロトプラスト形質転換(例えば、米国特許5,508,184号明細書参照)が挙げられる。これらの方法は、植物を安定的に形質転換しまたは一過性に形質転換するために使用されてもよい。
植物の形質転換に適した方法は、DNAが細胞内に導入され得る任意の方法を含み、例えば、限定されないが、エレクトロポレーション(米国特許第5,384,253号明細書参照)、微粒子銃(例えば、米国特許第5,015,580号明細書;第5,550,318号明細書;第5,538,880号明細書;第6,160,208号明細書;第6,399,861号明細書;および第6,403,865号明細書参照);アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介性形質転換(例えば、米国特許第5,635,055号明細書;第5,824,877号明細書;第5,591,616号明細書;第5,981,840号明細書;および第6,384,301号明細書参照);およびプロトプラスト形質転換(例えば、米国特許5,508,184号明細書参照)が挙げられる。これらの方法は、植物を安定的に形質転換しまたは一過性に形質転換するために使用されてもよい。
DNA構築物は、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌などの技術を用いて植物細胞のゲノムDNA内に直接導入されてもよく(例えば、米国特許第5,302,523号明細書および第5,464,765号明細書参照)、またはDNAパーティクル銃などのバイオリスティック法を用いて、植物組織に直接導入することができる(例えば、Klein et al., (1987) Nature 327:70-73参照)。あるいは、DNA構築物は、ナノ粒子形質転換を介して植物細胞に導入することができる(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第2009/0104700号明細書を参照されたい)。
さらに、遺伝子導入は、リゾビウム属(Rhizobium)種のNGR234、アルファルファ根粒菌(Sinorhizoboium meliloti)、ミヤコグサ根粒菌(Mesorhizobium loti)、ジャガイモウイルスX、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスおよび/またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム属(Agrobacterium)細菌またはウイルスを用いて達成されてもよい。
形質転換技術の適用により、実質的に任意の植物種の細胞を安定に形質転換してもよいし、これらの細胞を周知技術によってトランスジェニック植物に発育させてもよい。例えば、綿の形質転換との関連で特に有用であり得る技術は米国特許第5,846,797号明細書、第5,159,135号明細書、第5,004,863号明細書、および第6,624,344号明細書に記載されている;アブラナ属(Brassica)植物を形質転換するための技術は、例えば、米国特許第5,750,871号明細書に詳細に記載されている;ダイズを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第6,384,301号明細書に記載されている;トウモロコシを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第7,060,876号明細書および第5,591,616号明細書、ならびに国際PCT出願公開第95/06722号パンフレットに記載されている。
レシピエント細胞への外因性核酸の送達を行った後、形質転換された細胞は、一般的に、さらに培養および植物再生のために識別される。形質転換体を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するために使用される形質転換ベクターとともに選択マーカー遺伝子を使用することが望まれる場合がある。例示的な実施形態において、形質転換された細胞集団は、選択剤(単数または複数)に細胞を暴露することによってアッセイすることができ、または細胞は、所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。
選択剤への暴露に対して生き残った細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性のスコアが示された細胞は、植物の再生を支持する培地で培養することができる。一実施形態において、任意の適切な植物組織培地は、成長調節因子などのさらなる物質を含むことによって修飾されてもよい。組織は、十分な組織が植物の再生取り組みを開始するために利用可能になるまで、または反復ラウンドの手動選択後、組織の形態学が再生に適切であり(例えば、少なくとも2週間)、続いてシュート形成を促す培地に移されるまで、成長調節剤を含む基礎培地に維持することができる。十分シュート形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。シュートが形成されると、それらは根形成を促す培地に移される。十分な根が形成されると、植物はさらなる成長と成熟のために土壌に移され得る。
再生中の植物に付与される構築物を含む所望の核酸の存在を確認するために、様々なアッセイを行ってもよい。このようなアッセイには、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロットおよびノーザンブロットならびにPCR;生化学的アッセイ、例えば、タンパク質産物の存在を、例えば、免疫学的方法(ELISA、ウェスタンブロットおよび/またはLC−MS MS分光光度法)により、または酵素機能により検出するアッセイ;植物部分アッセイ、例えば、葉または根アッセイ;および/または再生した植物全体の表現型の分析などが挙げられる。
トランスジェニック事象は、例えば、目的とする核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR増幅によってスクリーニングすることができる。PCR遺伝子型決定には、限定されないが、ゲノムに組み込まれた目的とする核酸分子を含むことが予期された、単離された宿主植物カルス組織由来のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、続く、PCR増幅産物の標準的なクローニングおよび配列分析が含まれることは理解される。PCR遺伝子型決定の手段は、十分に報告され(例えば、Rios et al., (2002) Plant J. 32:243-53)、任意の植物種または組織タイプ由来のゲノムDNAに適用されてもよく、細胞培養が含まれる。標的配列と導入された配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを順次使用しまたはPCR増幅反応において多重化されてもよい。標的部位にアニーリングするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸配列を導入し、および/またはこれらの2つの組合せが生成され得る。したがって、PCR遺伝子型決定の戦略は、例えば、限定されないが、植物ゲノム中の特定の配列の増幅;植物ゲノム中の複数の特定の配列の増幅;植物ゲノム中の非特異的配列の増幅;および上記の任意の組合せを含んでもよい。当業者は、ゲノムを調べるために、プライマーおよび増幅反応の追加の組合せを考案することができる。例えば、フォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドプライマーのセットは、導入された核酸配列の境界外で標的に特異的である核酸配列(単数または複数)にアニーリングするように設計されてもよい。
フォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、そこに含まれる目的とするヌクレオチド配列内のコード領域に対応する配列、または核酸分子の他の部分で、導入された核酸分子に特異的にアニーリングするように設計されてもよい。プライマーは、本明細書に記載されるプライマーと組み合わせて使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、所望の配列に従って合成されてもよく、(例えば、Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IAから)市販されている。増幅は、クローニングおよび配列決定、または増幅産物の直接的な配列分析に続いてもよい。一実施形態において、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをPCR増幅において採用する。
導入遺伝子を発現させる方法
一実施形態において、植物において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターおよび3’UTRを含む植物を成長させることを含む。
一実施形態において、植物において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターおよび3’UTRを含む植物を成長させることを含む。
一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’−UTRを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターおよびセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’−UTRを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
一実施形態において、植物において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。一実施形態において、植物において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターおよびトウモロコシ(Zea mays)クロロフィルa/b結合遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させることを含む。
一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において少なくとも1つの導入遺伝子を発現させる方法は、少なくとも1つの導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターおよびセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養することを含む。
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター(上流プロモーターも含む)を含む。一実施形態において、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターは配列番号1であり得る。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、プロモーターは、配列番号1に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%または100%同一である。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せを含み得る。
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含む。一実施形態において、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRは、配列番号2のポリヌクレオチドである。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX1遺伝子3’UTRは、配列番号2に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.8%または100%同一である。一実施形態において、遺伝子発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含み、ここで、プロモーターは、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター、または植物が起源であるプロモーター(例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ユビキチン10プロモーター)、ウイルスが起源であるプロモーター(例えば、キャサバベインモザイクウイルスプロモーター)または細菌が起源であるプロモーター(例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)デルタマス)である。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的な実施形態において、植物、植物組織、または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子、またはそれらの組合せを含み得る。
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターおよびセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRを含む遺伝子発現カセットを含む。プロモーターおよび3’−UTRは、遺伝子発現カセットが2つ以上の導入遺伝子を含む場合、遺伝子発現カセット内で異なる導入遺伝子に作動可能に連結され得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。例示的な実施形態において、遺伝子発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’−UTRを含み、ここで、導入遺伝子は、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組合せであり得る。
一実施形態において、本明細書に記載される方法を用いた導入遺伝子発現は、植物の胚珠および種子組織内で発現される。一実施形態において、導入遺伝子発現は、植物の胚珠および種子組織において発現される1を超える導入遺伝子を含む。一実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニック植物を成長させる方法は、胚珠および種子の好ましい導入遺伝子発現を含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において導入遺伝子を発現させる方法は、胚珠および種子の好ましい組織ならびに胚珠および種子の好ましい細胞を含む。一実施形態において、胚珠および種子の好ましい発現には、双子葉および茎の好ましい発現が含まれる。
さらなる実施形態において、本明細書に記載される方法を用いた導入遺伝子発現は、地上の植物組織(例えば、胚珠または種子)内で発現される。一実施形態において、導入遺伝子発現は、胚珠または種子などの地上の植物組織において発現される1を超える導入遺伝子を含む。他の実施形態において、導入遺伝子の発現は、種子の内胚乳組織内である。一実施形態において、本明細書に記載されるトランスジェニック植物を成長させる方法は、地上の植物組織の導入遺伝子発現を含む。一実施形態において、植物組織または植物細胞において導入遺伝子を発現させる方法は、地上の植物組織および地上の植物細胞を含む。一実施形態において、地上の植物組織発現は、双子葉植物の地上の植物組織発現を含む。
一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、本明細書に開示されるセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター、または3’−UTR調節要素を含むベクターを含む。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、導入遺伝子に作動可能に連結されている、本明細書に開示されるセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター、または3’−UTR調節要素を含むベクターを含む。一実施形態において、植物、植物組織または植物細胞は、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージまたはウイルス断片であり得る。
一実施形態において、本明細書に開示される方法に係る植物、植物組織または植物細胞は単子葉植物であり得る。単子葉植物、植物組織または植物細胞は、限定されないが、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、竹、バナナ、ガマ、ユリ、オートムギ、タマネギ、キビおよびライコムギであり得る。
一実施形態において、本明細書に開示される方法に係る植物、植物組織または植物細胞は双子葉植物であり得る。双子葉植物、植物組織または植物細胞は、限定されないが、ナタネ、カノーラ、カラシナ、エチオピアカラシ、ダイズ、ヒマワリおよび綿であり得る。
遺伝的に修飾された植物の作製に関して、植物を遺伝子操作するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、植物形質転換のための多数の方法が開発されており、双子葉植物および単子葉植物についての生物学的および物理学的な形質転換プロトコルが挙げられる(例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 77:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993))。さらに、植物細胞または組織の形質転換および植物の再生のためのベクターおよびインビトロ培養法は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)において利用可能である。
当業者は、外因性配列がトランスジェニック植物に安定に導入され、作動可能であることが確認された後、それを有性交配によって他の植物に導入することができることを認識する。多数の標準的な育種技術のうちのいずれかは、交配される種に応じて使用することができる。
形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物を同定し、DNAの形質転換時に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について遺伝子操作された植物材料を選択またはスクリーニングすることによって単離し得る。例えば、選択は、形質転換遺伝子構築物が抵抗性を付与する抗生物質または除草剤の阻害量を含む培地上で、遺伝子操作された植物材料を成長させることによって行うことができる。さらに、形質転換された細胞はまた、組換え核酸構築物に存在し得る任意の可視マーカー遺伝子(例えば、yfp、gfp、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、BまたはCI遺伝子)の活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。このような選択およびスクリーニング法は、当業者に周知である。
物理的および生化学的方法もまた、挿入された遺伝子構築物を含む植物または植物細胞の形質転換体を同定するために使用することができる。特定の実施形態において、本開示は、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットなどのゲノムDNAの修飾を確認することを含む方法に関する。特定の実施形態において、このようなゲノムの修飾を確認する方法には、PCRベースのアッセイ、サザンブロットアッセイ、ノーザンブロットアッセイ、タンパク質発現アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、ELISAアッセイ、または次世代シーケンシングアッセイによる確認が含まれる。
したがって、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットなどのゲノムDNAの修飾は、その配列のプライマーまたはプローブの使用を含む様々な方法で確認することができる。特定の実施形態において、安定に組み込まれた導入遺伝子は、植物のいくつかの組織もしくはいくつかの発育段階で導入遺伝子の構成的または選択的発現に基づいて検出され得るか、あるいは導入遺伝子は、実質的に全ての植物組織において、実質的にその全ライフサイクルに沿って発現され得る。
植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットの確認は、任意の適切な増幅方法によって行うことができる。一般的には、Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990)を参照されたい。適切な増幅技術の例には、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅(一般的には、G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker et al., Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)を参照されたい)、転写ベース増幅(D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 1173-1177 (1989)を参照されたい)、自家持続配列複製(または「3SR」)(J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878 (1990)を参照されたい)、Qβレプリカーゼシステム(P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)を参照されたい)、核酸配列ベース増幅(または「NASBA」)(R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)を参照されたい)、修復鎖反応(または「RCR」)(R. Lewis、上記参照)、およびブーメランDNA増幅(または「BDA」)(R. Lewis、上記参照)が挙げられる。一般的には、ポリメラーゼ連鎖反応が好ましい。
「増幅」は、鋳型特異性を伴う核酸複製の特別な場合である。これは、非特異的な鋳型複製(すなわち、鋳型依存性であるが、特定の鋳型に依存しない複製)と対照的である。鋳型特異性は、ここでは、複製(すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成)およびヌクレオチド(リボまたはデオキシリボ)特異性の忠実度から区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性に関して頻繁に記載される。
本明細書で使用するとき、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」および「PCR」は、一般的に、クローニングおよび精製なしにゲノムDNAの混合物中で標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法を指す(米国特許第4,683,195号明細書;同第4,683,202号明細書;同第4,965,188号明細書;参照により本明細書に組み込まれる)。標的配列を増幅するこの方法は、所望の標的配列を含有するDNA混合物に対して、過剰な2つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、続いて、DNAポリメラーゼの存在下でサーマルサイクリングを正確に繰り返すことを含む。2つのプライマーは、二本鎖標的配列の個々の鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性し、次に、プライマーと標的分子内の相補的配列がアニーリングする。アニーリング後に、ポリメラーゼでプライマーを伸長させ、新しい相補鎖対を形成する。所望の標的配列の増幅セグメントを高い濃度で得るために、変性ステップ、プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによる伸長を多数回繰り返すことができる(すなわち、変性、アニーリング、および伸長が1回の「サイクル」を構成する;多数回の「サイクル」が存在し得る)。所望の標的配列における増幅セグメントの長さは、プライマー相互の相対位置で決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメーターである。このプロセスの繰り返しの態様により、本方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」(以下「PCR」)と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントは、混合物中で(濃度に関して)主たる配列となるため、「PCR増幅した」と表現される。
用語「逆転写酵素」または「RT−PCR」は、出発物質がmRNAである一種のPCRを意味する。開始mRNAは、逆転写酵素を用いて相補的DNAまたは「cDNA」に酵素的に変換される。次に、cDNAを「PCR」反応の「鋳型」として使用する。
一実施形態において、増幅反応を定量化する。他の実施形態において、増幅反応は、シグネチャープロファイルが融解温度または蛍光シグネチャープロファイルからなる群から選択されるシグネチャープロファイルを用いて定量化される。
本開示の実施形態の核酸分子またはそのセグメントは、PCR増幅のためのプライマーとして使用することができる。PCR増幅を実施する際に、ある程度のミスマッチが、プライマーと鋳型の間で許容され得る。したがって、例示されたプライマーの突然変異、欠失および挿入(特に、5’または3’末端へのヌクレオチドの付加)は、本開示の範囲内である。突然変異、挿入および欠失は、当業者に公知である方法によって所定のプライマー中に生成することができる。
分子ビーコンは、配列検出に使用するために記載されている。簡単に述べると、FRETオリゴヌクレオチドプローブは、隣接ゲノムおよび挿入DNA接合と重複するように設計される。FRETプローブの固有の構造は、蛍光および消光部分を近接して保持する二次構造を含有する結果となる。FRETプローブおよびPCRプライマー(挿入DNA配列中の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の1つのプライマー)は、熱安定性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下でサイクルされる。PCR増幅の成功に続いて、FRETプローブ(単数または複数)の標的配列へのハイブリダイゼーションは、プローブ二次構造の除去、ならびに蛍光部分および消光部分の空間的分離をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションに起因する隣接ゲノム/導入遺伝子挿入配列の存在を示す。増幅反応としての検出のためのこのような分子ビーコンアッセイは、本開示の実施形態である。
加水分解プローブアッセイは、他にはTAQMAN(登録商標)(Life Technologies,Foster City,CA)として知られ、DNA配列の存在を検出および定量する方法である。簡単に述べると、事象特異的検出のために、導入遺伝子内に1つのオリゴおよび隣接ゲノム配列に1つのオリゴを用いて、FRETオリゴヌクレオチドプローブを設計する。FRETプローブおよびPCRプライマー(挿入DNA配列中の1つのプライマーおよび隣接ゲノム配列中の1つのプライマー)は、熱安定性ポリメラーゼおよびdNTPの存在下でサイクルされる。FRETプローブのハイブリダイゼーションは、FRETプローブ上の消光部分から離れた蛍光部分の切断および放出をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションに起因する隣接する/導入遺伝子挿入配列の存在を示す。増幅反応としての検出のためのこのような加水分解プローブアッセイは、本開示の実施形態である。
KASPAR(登録商標)アッセイは、DNA配列の存在を検出および定量する方法である。簡単に述べると、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットを含むゲノムDNA試料は、KASPAR(登録商標)アッセイシステムとして知られるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくアッセイを用いてスクリーニングされる。本開示の実施において使用されるKASPAR(登録商標)アッセイは、複数のプライマーを含有するKASPAR(登録商標)PCRアッセイ混合物を利用することができる。PCRアッセイ混合物において使用されるプライマーは、少なくとも1つのフォワードプライマーおよび少なくとも1つのリバースプライマーを含むことができる。フォワードプライマーは、ドナーDNAポリヌクレオチドの特定の領域に対応する配列を含有し、リバースプライマーは、ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。さらに、PCRアッセイ混合物において使用されるプライマーは、少なくとも1つのフォワードプライマーおよび少なくとも1つのリバースプライマーを含むことができる。例えば、KASPAR(登録商標)PCRアッセイ混合物は、2つの異なる対立遺伝子に対応する2つのフォワードプライマー、および1つのリバースプライマーを使用することができる。フォワードプライマーの1つは、内因性ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。第2のフォワードプライマーは、ドナーDNAポリヌクレオチドの特定の領域に対応する配列を含有する。リバースプライマーは、ゲノム配列の特定の領域に対応する配列を含有する。増幅反応の検出のためのこのようなKASPAR(登録商標)アッセイは、本開示の実施形態である。
いくつかの実施形態において、蛍光シグナルまたは蛍光色素は、HEX蛍光色素、FAM蛍光色素、JOE蛍光色素、TET蛍光色素、Cy3蛍光色素、Cy3.5蛍光色素、Cy5蛍光色素、Cy5.5蛍光色素、Cy7蛍光色素、およびROX蛍光色素からなる群から選択される。
他の実施形態において、増幅反応は、フローサイトメトリーによって検出可能な濃度範囲で細胞DNAを染色することができ、リアルタイムサーモサイクラーによって検出可能な蛍光発光スペクトルを有する適切な第2の蛍光DNA色素を用いて実施される。当業者であれば、他の核酸色素が公知であり、絶えず同定されていることを理解すべきである。適切な励起および発光スペクトルを有する任意の適切な核酸色素を使用することができ、例えば、YO−PRO−1(登録商標)、SYTOX(登録商標) Green、SYBR(登録商標) Green I、SYTO11(登録商標)、SYTO12(登録商標)、SYTO13(登録商標)、BOBO(登録商標)、YOYO(登録商標)およびTOTO(登録商標)が挙げられる。一実施形態において、第2の蛍光DNA色素は、10μM未満、4μM未満、または2.7μM未満で使用されるSYTO13(登録商標)である。
さらなる実施形態において、次世代シーケンシング(NGS)は、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットを確認するために使用することができる。Brautigma et al., 2010に記載されるように、DNA配列分析を用いて、単離され、増幅された断片のヌクレオチド配列を決定することができる。増幅された断片を単離し、ベクターにサブクローニングし、鎖ターミネーター法(サンガー配列決定とも呼ばれる)または色素ターミネーター配列決定を用いて配列決定することができる。さらに、アンプリコンは、次世代シーケンシングで配列決定することができる。NGS技術は、サブクローニングステップを必要とせず、複数のシーケンシングリードを1回の反応で完了することができる。3つのNGSプラットフォームが市販されている:454 Life Sciences/RocheのGenome Sequencer FLX、SolexaのIllumina Genome Analyser、Applied BiosystemsのSOLiD(「Sequencing by Oligo Ligation and Detection」の頭字語)。さらに、現在開発中の2つの単一分子配列決定法が存在する。これには、Helicos Bioscienceの真のSingle Molecule Sequencing(tSMS)、およびPacific BiosciencesのSingle Molecule Real Time Sequencing(SMRT)が含まれる。
454 Life Sciences/Rocheによって市販されているGenome Sequencher FLXは、長いリードのNGSであり、エマルジョンPCRおよびパイロシーケンシングを使用してシーケンシングリードを生成する。300〜800bpのDNA断片、または3〜20kbpの断片を含有するライブラリーを用いることができる。反応は、実施1回あたり100万個超の約250〜400塩基のリードを生成することができ、全収量は250〜400メガ塩基になる。この技術は、最長リードを生成するが、実施1回あたり全シーケンスのアウトプットは他のNGS技術に比べて低くなる。
Solexaによって市販されているIllumina Genome Analyserは、蛍光色素で標識されたリバーシブルターミネーターヌクレオチドを用いた合成アプローチによる配列決定を使用し、固相ブリッジPCRに基づく短いリードのNGSである。最大10kbのDNA断片を含有する対になった末端配列決定ライブラリーの構築を使用することができる。この反応は、長さが35〜76塩基である1億超の短いリードを生成する。このデータは、実施1回あたり3〜6ギガ塩基を生成することができる。
Applied Biosystemsによって市販されているOligo Ligation and Detection(SOLiD)システムによる配列決定は、短いリード技術である。このNGS技術は、長さが最大10kbpの断片化された二本鎖DNAを用いる。このシステムは、色素標識されたオリゴヌクレオチドプライマーのライゲーションによる配列決定およびエマルジョンPCRを使用して、10億の短いリードを生成し、結果として、実施1回あたり最大30ギガ塩基の全シーケンスのアウトプットをもたらす。
Helicos BioscienceのtSMSおよびPacific BiosciencesのSMRTは、配列反応に単一のDNA分子を用いる異なるアプローチを適用する。tSMS Helicosシステムは、最大8億の短いリードを生成し、実施1回あたり21ギガ塩基をもたらす。これらの反応は、「合成による配列決定」アプローチとして記載されている蛍光色素標識された仮想ターミネーターヌクレオチドを使用して完了する。
Pacific Biosciencesによって市販されているSMRT次世代シーケンシングシステムは、合成によるリアルタイムシーケンシングを使用する。この技術は、リバーシブルターミネーターに制限されない結果、長さが最大1000bpのリードを生成することができる。この技術を用いて、1日あたり二倍体ヒトゲノムの1倍のカバレッジに等しい生のリードスループットを生成することができる。
別の実施形態において、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットの確認は、ウェスタンブロット、ノーザンブロットおよびサザンブロットなどのブロッティングアッセイを用いて完了することができる。このようなブロッティングアッセイは、生物学的試料の同定および定量のための生物学的研究において一般的に使用されている技術である。これらのアッセイは、最初に、電気泳動法によってゲル中で試料成分を分離し、その後、電気泳動により分離された成分をゲルからニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)またはナイロンなどの材料から作製された転写膜に転写することを含む。また、分析物は、これらの支持体上に直接スポットされてもよく、または予め分離せずに、真空、毛細管作用または圧力を適用することによって、支持体上の特定の領域に指向させてもよい。次に、転写膜は、視覚的にまたは自動化されたリーダーによって、分析物が互いに区別されて検出される能力を高めるために、通常、転写後処理に供される。
さらなる実施形態において、植物のゲノム内に挿入された遺伝子発現カセットの確認は、固相酵素イムノアッセイを用いて、液体試料または湿潤試料中の物質、通常は抗原、の存在を検出するELISAアッセイを用いて完了させることができる。試料由来の抗原は、プレートの表面に付着する。次に、さらなる特異的な抗体は、抗原に結合することができるように表面上に適用される。この抗体は酵素に連結され、最終段階で酵素基質を含有する物質が添加される。続く反応は、検出可能なシグナルを生成し、最も一般的には、基質における色の変化を生成する。
本開示はまた、種子が導入遺伝子または遺伝子発現カセットを含む、上述のトランスジェニック植物の種子を包含する。本開示は、さらに、子孫、クローン、細胞株または細胞が導入遺伝子または遺伝子構築体を含む、上述のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞を包含する。
本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載されているが、様々な修正および変更が、本発明から逸脱することなしに行うことができることは理解されよう。
[実施例]
[実施例]
セイヨウアブラナ(Brassica napus)からの調節要素の同定
セイヨウアブラナ(Brassica napus)遺伝子調節要素は、マイクロアレイプロファイリングアプローチによって同定された。次に、調節要素を単離し、クローニングして、トランスジェニック植物において使用するための調節要素の発現プロファイルを特徴付けた。Phiyfp遺伝子およびpat選択マーカー遺伝子で安定に形質転換されたトランスジェニックアラビドプシス属(Arabidopsis)系統を生成し、導入遺伝子発現レベルおよび組織特異性を評価した。このようなものとして、セイヨウアブラナ(Brassica napus)調節要素が同定され、特徴付けられた。遺伝子発現構築物において使用するためのプロモーターおよび3’UTR調節要素が初めて開示される。
セイヨウアブラナ(Brassica napus)遺伝子調節要素は、マイクロアレイプロファイリングアプローチによって同定された。次に、調節要素を単離し、クローニングして、トランスジェニック植物において使用するための調節要素の発現プロファイルを特徴付けた。Phiyfp遺伝子およびpat選択マーカー遺伝子で安定に形質転換されたトランスジェニックアラビドプシス属(Arabidopsis)系統を生成し、導入遺伝子発現レベルおよび組織特異性を評価した。このようなものとして、セイヨウアブラナ(Brassica napus)調節要素が同定され、特徴付けられた。遺伝子発現構築物において使用するためのプロモーターおよび3’UTR調節要素が初めて開示される。
マイクロアレイプロファイリングアプローチ
発育中のセイヨウアブラナ(Brassica napus)種子は、受粉後の15日、20日、25日、30日、35日および42日目(DAP)に、トランスジェニックホモ接合体系統と非形質転換野生型植物の両方から採取された。次に、種子を単一色の全体的な遺伝子発現プロファイリング設計により分析して、規定された各時点について遺伝子発現の全体レベルを決定した。個々の60マーのオリゴヌクレオチドアレイ(Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA)の3つの同一複製物を、各試料からの増幅したCy3標識cRNAとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを実施するために、カスタム設計された60マーの包括的トランスクリプトーム−ワイドキャノーラオリゴヌクレオチドアレイ(eArray,Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)を使用した。オリゴヌクレオチドアレイは、公開されたデータ源(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)から得られた37,000個を超える様々なキャノーラ転写物を含有する。
発育中のセイヨウアブラナ(Brassica napus)種子は、受粉後の15日、20日、25日、30日、35日および42日目(DAP)に、トランスジェニックホモ接合体系統と非形質転換野生型植物の両方から採取された。次に、種子を単一色の全体的な遺伝子発現プロファイリング設計により分析して、規定された各時点について遺伝子発現の全体レベルを決定した。個々の60マーのオリゴヌクレオチドアレイ(Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA)の3つの同一複製物を、各試料からの増幅したCy3標識cRNAとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを実施するために、カスタム設計された60マーの包括的トランスクリプトーム−ワイドキャノーラオリゴヌクレオチドアレイ(eArray,Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)を使用した。オリゴヌクレオチドアレイは、公開されたデータ源(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)から得られた37,000個を超える様々なキャノーラ転写物を含有する。
60マーのオリゴヌクレオチドは、製造業者(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)からのSURE−PRINT(商標)技術を用いてインサイチュで合成された。各転写物の発現レベルを効率的に測定するために、アレイ中に存在するオリゴヌクレオチドは、予測された標的配列と効率的にハイブリダイズするように、各標的に対して固有であり、特異的であるように設計された。1を超える転写物を有する二重鎖を形成したオリゴヌクレオチドは、アレイから排除された。各オリゴヌクレオチドはまた、マイクロアレイ処理にわたって最適な性能に必要とされる化学的および物理的特性を満たした。加えて、新たに導入された遺伝子、ならびに目的とする他のいくつかの他の遺伝子を表す特異的であり、固有のオリゴヌクレオチドはまた、カスタム設計されたキャノーラオリゴヌクレオチドアレイに含まれた。これらの基準を用いて、カスタム設計された60マーの包括的トランスクリプトーム−ワイドキャノーラオリゴヌクレオチドアレイを生成した。
発育中の種子の試料は、各遺伝子型の複数の植物(NEX710(登録商標)野生型およびAnD9DSトランスジェニック系統)からの受粉後の15日、20日、25日、30日、35日および42日(DAP)に得られた。種子を凍結し、RNA単離および精製用の出発物質として使用するためにプールした。標識について、Agilent One−Color Microarrayベースの遺伝子発現QuickAmp標識プロトコル(商標)(Agilent,Santa Clara,CA)に続いて、各試料から精製された合計1.0μgの総RNAを逆転写し、増幅し、Cy3 CTPで標識した。オリゴヌクレオチド遺伝子発現アレイをAgilent Technologies Gene Expression Hybridization kit(商標)およびWASH BUFFER KIT(商標)(Agilent,Santa Clara,CA)を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、完全に自動化されたTECAN HS4800 PRO(商標)(TECAN,Research Triangle Park,NC)ハイブリダイゼーションステーション上で実施された。
走査および特徴抽出後、生データファイルをGENESPRING(登録商標) GXバージョン10.0.2(商標)(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)にアップロードした。GENESPRING(登録商標)によるレポートを作成する前に、生成されたデータが十分な品質であることを確認するために、スパイクインコントロールに基づく試料の品質管理を実施した。次に、結果として得られたデータは、体系的な非生物学的差異を最小化し、相互比較のためにアレイを標準化するために、グローバルパーセンタイルシフト標準化法を用いて標準化された。次に、調査中の全ての単一の試料において「存在」とフラグ付けされた物体を選択し、「限界」または「不在」とフラグ付けされた物体を排除することによって、標準化されたデータをフィルタリングした。標準化およびフィルタリングしたリストを、パラメーターとしてDAPおよび遺伝子型を定義するp<0.05の補正されたp値カットオフを用いた2元ANOVA法を使用した統計分析のためのインプットとして使用した。セイヨウアブラナ(Brassica napus)種子発生の全体的な遺伝子発現プロファイルは、調査における全ての時点で画定された。初期のセイヨウアブラナ(Brassica napus)種子の発生中に全試料において高レベル(>50,000ピクセル/スポット)で一貫して発現する遺伝子を同定するために、選択基準の追加セットを適用した。
さらなる遺伝子を遺伝子注釈に基づいて手動で選択して、全候補プールを88個の標的にした。このプールを改良するために、発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT−qPCR)を用いて公知の油生合成遺伝子発現レベルに対して確認された。15および20DAP時点からのRNAを調べ、若いキャノーラの葉から総RNAを抽出および精製した。RT−qPCRのcDNA合成はSUPERSCRIPTIII(商標)(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて行った。リアルタイムPCR反応は、AbGene Absolute Blue SYBR green master mix(商標)(Thermo Fisher)を使用して、LIGHTCYCLER(登録商標)480機器(商標)(Roche,Indianapolis、IN)で行った。RT−qPCRのプライマーは、PRIMER3(商標)(MIT,Cambridge,MA)を用いて設計した。プライマーは、60℃の最適Tmに設計された。アンプリコンのサイズは、100〜224bpの範囲であった。プライマーを選択して、転写された標的配列の3’領域にアンプリコンを生成した。標準化の目的で、4つの内因性油生合成遺伝子はまた測定され、BnACP05(アシル−担体タンパク質)、BnKCS(ケトアシル−CoAシンターゼ)、BnKASIII(ケトアシル−ACPシンターゼ)、およびBnSAD(ステアロイル−ACPデサチュラーゼ)が含まれた。
候補プールをさらにろ過するために、ACP05(GenBank:X16114.1)より高い初期種子で発現を示す遺伝子を選択した。遺伝子はまた、KASII(GenBank:AF244520.1)の種子/葉の発現差よりも大きい葉から初期種子への発現増加を示すことが必要であった。これらのフィルターは、標的プロモーターの同定のために候補のリストを特定の遺伝子にまで減少させた。したがって、マイクロアレイアッセイを用いて、15DAPでcDNAを高度に発現し、種子中で優先的に発現されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)由来のプロモーターおよび3’UTR遺伝子調節要素を同定した。
遺伝子調節要素の同定
上記のスクリーニングパラメーターを用いて、セイヨウアブラナ(Brassica napus)マイクロアレイ生成データから特定の配列を選択した。セイヨウアブラナ(Brassica napus)c.v.Nex710由来の特異的プロモーターおよび3’UTR配列を単離するためにPCR反応を使用した。PCRプライマーは、公的に入手可能なEST Genbank:EV001081.1、CD813186.1、ES989902.1およびEV088583.1から組み立てられた、発現配列タグコンティグ27160、およびESTコンティグ27160に相同性を有するものとして同定された、芽キャベツ(Brassica oleracea)c.v.TO1000からのゲノムコンティグctg7180009837416から設計された。抽出されたプロモーターおよび3’−UTRセイヨウアブラナ(Brassica napus)調節配列を得て、DNA配列決定によりさらに特徴付けた。セイヨウアブラナ(Brassica napus)c.v.Nex710ゲノム由来のACC OXとして表示されるセイヨウアブラナ(Brassica napus)遺伝子のプロモーター配列は、配列番号1の1483bpのプロモーター配列として提供される。500bpの3’UTR配列は、配列番号2として以下に提供される。
上記のスクリーニングパラメーターを用いて、セイヨウアブラナ(Brassica napus)マイクロアレイ生成データから特定の配列を選択した。セイヨウアブラナ(Brassica napus)c.v.Nex710由来の特異的プロモーターおよび3’UTR配列を単離するためにPCR反応を使用した。PCRプライマーは、公的に入手可能なEST Genbank:EV001081.1、CD813186.1、ES989902.1およびEV088583.1から組み立てられた、発現配列タグコンティグ27160、およびESTコンティグ27160に相同性を有するものとして同定された、芽キャベツ(Brassica oleracea)c.v.TO1000からのゲノムコンティグctg7180009837416から設計された。抽出されたプロモーターおよび3’−UTRセイヨウアブラナ(Brassica napus)調節配列を得て、DNA配列決定によりさらに特徴付けた。セイヨウアブラナ(Brassica napus)c.v.Nex710ゲノム由来のACC OXとして表示されるセイヨウアブラナ(Brassica napus)遺伝子のプロモーター配列は、配列番号1の1483bpのプロモーター配列として提供される。500bpの3’UTR配列は、配列番号2として以下に提供される。
セイヨウアブラナ(Brassica napus)プロモーターおよび3’UTR構築物
配列番号1の全長セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、軽度特異的組織誘導性LS−1遺伝子(ST−LS1イントロン;Genbank Acc番号X04753)を含有する黄色蛍光タンパク質遺伝子(Phiyfp;Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21; 841-50)、および配列番号2のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX 3’UTRを含む遺伝子発現カセットは、標準的な組換えDNA技術を用いて構築された。この遺伝子発現カセットはatt部位が隣接した。次に、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターの制御下で、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’−UTRによって終結された、yfp遺伝子発現カセットを含有する、得られたエントリープラスミド、および最終発現ベクターpDAB113904に至るデスティネーションベクターを用いて、GATEWAY(登録商標)LR CLONASE II(登録商標)(Life Technologies,Carlsbad,CA)反応を行った。デスティネーションベクターは、キャサバベインモザイクウイルスプロモーター(CsVMVプロモーター;Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129-1139; 1996)によって駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のオープンリーディングフレーム1の3’UTR(AtuORF1 3’UTR;Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822; 1990)によって終結されるpat遺伝子(Wohlleben et al., Gene 70:25-37; 1988)を含む選択マーカーカセットを含有した。得られた構築物pDAB113904は、yfp遺伝子発現カセット(配列番号3)を含有する異種発現構築物であり、pat遺伝子発現構築物(配列番号4)は、図1のプラスミドマップとして提示される。
配列番号1の全長セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーター、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、軽度特異的組織誘導性LS−1遺伝子(ST−LS1イントロン;Genbank Acc番号X04753)を含有する黄色蛍光タンパク質遺伝子(Phiyfp;Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21; 841-50)、および配列番号2のセイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX 3’UTRを含む遺伝子発現カセットは、標準的な組換えDNA技術を用いて構築された。この遺伝子発現カセットはatt部位が隣接した。次に、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターの制御下で、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’−UTRによって終結された、yfp遺伝子発現カセットを含有する、得られたエントリープラスミド、および最終発現ベクターpDAB113904に至るデスティネーションベクターを用いて、GATEWAY(登録商標)LR CLONASE II(登録商標)(Life Technologies,Carlsbad,CA)反応を行った。デスティネーションベクターは、キャサバベインモザイクウイルスプロモーター(CsVMVプロモーター;Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129-1139; 1996)によって駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のオープンリーディングフレーム1の3’UTR(AtuORF1 3’UTR;Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822; 1990)によって終結されるpat遺伝子(Wohlleben et al., Gene 70:25-37; 1988)を含む選択マーカーカセットを含有した。得られた構築物pDAB113904は、yfp遺伝子発現カセット(配列番号3)を含有する異種発現構築物であり、pat遺伝子発現構築物(配列番号4)は、図1のプラスミドマップとして提示される。
配列番号3(pDAB113904由来の黄色蛍光タンパク質遺伝子発現カセットの核酸配列を提供する)
配列番号4(pDAB113904由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子発現カセットの核酸配列を提供する)
黄色蛍光タンパク質(yfp)遺伝子発現カセットおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子発現カセットを含有する陽性対照構築物pDAB9381を組み立てた。具体的には、黄色蛍光タンパク質遺伝子発現カセットは、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ユビキチン10遺伝子プロモーター(Ubi10プロモーター;Callis et al., 1990, J Biol Chem 265:12486- 12493)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、軽度特異的組織誘導性LS−1遺伝子(ST LS1イントロン;Genbank Acc番号X04753)を含有する黄色蛍光タンパク質コード配列(PhiYFP;Shagin et al., 2004 Molecular Biology and Evolution, 21(5), 841-850)を含有し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のオープンリーディングフレーム23 3’−非翻訳領域(AtuORF23 3’−UTR)で終結される。選択マーカー遺伝子発現カセットは、キャサバベインモザイクウイルスプロモーター(CsVMVプロモーター;Verdaguer et al., Plant Molecular Biology 31:1129-1139; 1996)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT;Wohlleben et al., Gene 70:25-37; 1988)およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のORF1 3’−非翻訳領域(AtuORF1 3’−UTR;Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822; 1990)を含有する。得られた構築物pDAB9381は、yfp遺伝子発現カセット(配列番号5)を含有する異種発現構築物であり、pat遺伝子発現構築物(配列番号5)は図2に提示される。
配列番号5(pDAB9381由来の黄色蛍光タンパク質遺伝子発現カセットの核酸配列を提供する)
配列番号6(pDB9381由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子発現カセットの核酸配列を提供する)
植物の形質転換および分子確認
アグロバクテリウム(Agrobacterium)の調製
次に、上記のバイナリープラスミドのうちいずれか1つを含有する、50%グリセロール(予め調製し、−80℃で凍結した)中の60μlのアグロバクテリウム(Agrobacterium)菌株を用いて、スペクチノマイシン(100mg/L)、カナマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(10mg/L)を含有するYEP液の5mlスターター培養物(BACTO PEPTONE(商標)10.0gm/L、酵母エキス10.0gm/Lおよび塩化ナトリウム5.0gm/L)を調製し、通気しながら28℃で一晩インキュベートした。次に、アグロバクテリウム(Agrobacterium)スターターは、滅菌500mLバッフルフラスコ(単数または複数)中で、スペクチノマイシン(100mg/L)、カナマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(10mg/L)を含む300mLのYEP液体に接種され、200rpm、28℃で一晩振とうされた。培養物を6000rpmで遠心分離し、10%(w/v)ショ糖、10μg/Lの6−ベンジルアミノプリンおよび0.03%Silwet L−77を含有する等体積の1/2×MS培地に再懸濁し、その後、植物組織を形質転換した。
アグロバクテリウム(Agrobacterium)の調製
次に、上記のバイナリープラスミドのうちいずれか1つを含有する、50%グリセロール(予め調製し、−80℃で凍結した)中の60μlのアグロバクテリウム(Agrobacterium)菌株を用いて、スペクチノマイシン(100mg/L)、カナマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(10mg/L)を含有するYEP液の5mlスターター培養物(BACTO PEPTONE(商標)10.0gm/L、酵母エキス10.0gm/Lおよび塩化ナトリウム5.0gm/L)を調製し、通気しながら28℃で一晩インキュベートした。次に、アグロバクテリウム(Agrobacterium)スターターは、滅菌500mLバッフルフラスコ(単数または複数)中で、スペクチノマイシン(100mg/L)、カナマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(10mg/L)を含む300mLのYEP液体に接種され、200rpm、28℃で一晩振とうされた。培養物を6000rpmで遠心分離し、10%(w/v)ショ糖、10μg/Lの6−ベンジルアミノプリンおよび0.03%Silwet L−77を含有する等体積の1/2×MS培地に再懸濁し、その後、植物組織を形質転換した。
アラビドプシス属(Arabidopsis)形質転換
アラビドプシス属(Arabidopsis)は、CloughおよびBent(1998)から適応されたフローラルディップ法を用いて形質転換された。上記バイナリープラスミドの1つを含有する、確認されたアグロバクテリウム(Agrobacterium)グリセロールストックを使用して、スペクチノマイシン(100mg/L)、カナマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(10mg/L)を含有するYEPブロスの5mL前培養物に接種した。培養物を通気しながら28℃で一晩インキュベートした。次に、前培養物を同じ抗生物質選択物で300mLまで嵩張らせ、225rpmで一定の撹拌をしながら再び28℃でインキュベートした。細胞を約5,000×g、4℃で15分間ペレット化し、上清を捨てた。細胞ペレットは、10%(w/v)ショ糖、10μg/Lの6−ベンジルアミノプリン、および0.03%Silwet L−77を含有する300mL接種培地に静かに再懸濁された。41日齢の植物(35日目に切断した初代花序)を逆さにして培地に浸漬した。植物(ここではT0と表示される)を一晩、透明な覆われたプラスチック製タブに入れ、次に、翌日成長チャンバーに直立させた。植物を22℃、16時間の明期/8時間の暗期で成長させた。浸漬の4週間後、水を切り、植物をT1種子収集の準備として1週間乾燥させた。
アラビドプシス属(Arabidopsis)は、CloughおよびBent(1998)から適応されたフローラルディップ法を用いて形質転換された。上記バイナリープラスミドの1つを含有する、確認されたアグロバクテリウム(Agrobacterium)グリセロールストックを使用して、スペクチノマイシン(100mg/L)、カナマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(10mg/L)を含有するYEPブロスの5mL前培養物に接種した。培養物を通気しながら28℃で一晩インキュベートした。次に、前培養物を同じ抗生物質選択物で300mLまで嵩張らせ、225rpmで一定の撹拌をしながら再び28℃でインキュベートした。細胞を約5,000×g、4℃で15分間ペレット化し、上清を捨てた。細胞ペレットは、10%(w/v)ショ糖、10μg/Lの6−ベンジルアミノプリン、および0.03%Silwet L−77を含有する300mL接種培地に静かに再懸濁された。41日齢の植物(35日目に切断した初代花序)を逆さにして培地に浸漬した。植物(ここではT0と表示される)を一晩、透明な覆われたプラスチック製タブに入れ、次に、翌日成長チャンバーに直立させた。植物を22℃、16時間の明期/8時間の暗期で成長させた。浸漬の4週間後、水を切り、植物をT1種子収集の準備として1週間乾燥させた。
T1種子を10.5インチ×21インチ発芽トレイに播種し、それぞれに、予め0.1%寒天溶液40mL中に懸濁させた層状化されたT1種子(約10,000種子)の200mgアリコートを与え、4℃で2日間保存し、同期した種子発芽(春化)を確実にした。
サンシャインミックスLP5土壌培地は、微細なバーミキュライトで覆われ、湿った状態になるまでホーグランドの溶液で地下潅漑され、重力排水を可能にした。層状化された種子の各40mLアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均等に播種され、湿度ドームで4〜5日間覆った。グルホシネート(リバティー)を用いて最初の形質転換体選択の1日前にドームを外した。
植え付けの7日後(DAP)および再度9DAPにて、T1植物(それぞれ、子葉および2〜4葉期)に0.2%リバティー除草剤溶液(200g ai/Lグルホシネート、Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)で、適用あたり280g ai/haグルホシネートの有効速度を送達するために、DeVilbiss圧縮空気噴霧先端を使用して10ml/トレイ(703L/ha)の噴霧容量で噴霧した。最後の噴霧の3日後に生存している生存植物(活動的に成長している推定の形質転換植物)を同定し、最終噴霧選択(16DAP)の7日後に温室内でサンシャインミックスLP5で調製した3インチのポットに個々に移植した。移植体を温室内で飼育した(22±5℃、50±30%室温、14時間の明期:10時間の暗、最低500μE/m2s1の自然光+補助光)。生存しているT1植物について分子生物学的分析を完了し、pat除草剤選択マーカー遺伝子が植物のゲノムに組み込まれたことを確認した。
分子確認
推定トランスジェニックアラビドプシス属(Arabidopsis)植物は、patについて定量的PCRアッセイを使用して、導入遺伝子の存在を検出するためにサンプリングされた。QIAGEN(登録商標)BioSprint96 Kit DNA抽出キット(Qiagen,Valencia,CA)を製造者の指示に従って使用して、葉試料から総DNAを抽出した。
推定トランスジェニックアラビドプシス属(Arabidopsis)植物は、patについて定量的PCRアッセイを使用して、導入遺伝子の存在を検出するためにサンプリングされた。QIAGEN(登録商標)BioSprint96 Kit DNA抽出キット(Qiagen,Valencia,CA)を製造者の指示に従って使用して、葉試料から総DNAを抽出した。
目的とする遺伝子を検出するために、pat遺伝子のCy5標識した蛍光プローブおよび内因性TafII−15参照遺伝子対照(Genbank ID:NC 003075;Duarte et al., BMC Evol. Biol., 10:61)のHEX標識した蛍光プローブを含有する、加水分解(TAQMAN(登録商標)に類似する)プライマー/プローブセットを用いて遺伝子特異的DNA断片を増幅した。patおよび内因性TafII−15参照遺伝子増幅のために以下のプライマーを使用した。プライマー配列は以下の通りであった:
patプライマー/プローブ:
Patフォワードプライマー:TQPATS:ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT(配列番号7)
Patリバースプライマー:TQPATA:CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT(配列番号8)、および
Patプローブ:5’−/5Cy5/AGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCT/3BHQ_2/−3’(配列番号9)
TafII−15プライマー/プローブ:
フォワードプライマー:TafII−15 F:GAGGATTAGGGTTTCAACGGAG(配列番号10)
リバースプライマー:TafII−15 R:GAGAATTGAGCTGAGACGAGG(配列番号11)、および
TafII−15プローブ:5’−/5HEX/AGAGAAGTTTCGACGGATTTCGGGC/3BHQ_2/−3’(配列番号12)
patプライマー/プローブ:
Patフォワードプライマー:TQPATS:ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT(配列番号7)
Patリバースプライマー:TQPATA:CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT(配列番号8)、および
Patプローブ:5’−/5Cy5/AGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCT/3BHQ_2/−3’(配列番号9)
TafII−15プライマー/プローブ:
フォワードプライマー:TafII−15 F:GAGGATTAGGGTTTCAACGGAG(配列番号10)
リバースプライマー:TafII−15 R:GAGAATTGAGCTGAGACGAGG(配列番号11)、および
TafII−15プローブ:5’−/5HEX/AGAGAAGTTTCGACGGATTTCGGGC/3BHQ_2/−3’(配列番号12)
次に、qPCR反応は、5μlのRoche LIGHTCYCLER(登録商標)480プローブマスターミックス(Roche Applied Sciences,Indianapolis,IN);10μMストックから400nMの最終濃度までの各0.4μlのTQPATA、TQPATS、TafII−15FプライマーおよびTafII−15Rプライマー;5μMストックから200nMの最終濃度までの各0.4μlのPatプローブおよびTafII−15プローブ;水の1:5に希釈した2μlのゲノムDNA、および0.5μLの水を含有する10μl反応の最終容量で実施された。DNAをRoche LIGHTCYCLER(登録商標)480システムで、以下の条件下で増幅した:95℃で10分間の1サイクル、続いて以下の3ステップ:95℃で10秒間;60℃で40秒間および72℃で1秒間の40サイクル。patコピー数は、未知試料(LIGHTCYCLER(登録商標)480によるアウトプット)についての標的(目的とする遺伝子)/参照(インベルターゼ遺伝子)値とpatコピー数対照の標的/参照値を比較することによって決定された。
分子確認から、上記のプラスミドの単一導入遺伝子挿入物を含有する特異的なアラビドプシス属(Arabidopsis)トランスジェニック事象が同定された。これらの植物を自己受精させ、得られたT1種子を植えて、T1実生をモニタリングし、異なる発育段階の異なる植物組織におけるYFPタンパク質発現についてアッセイした。
トランスジェニック植物発現スクリーニング
アラビドプシス属(Arabidopsis)T1トランスジェニック事象を実生に成長させ、蛍光顕微鏡検査および目視観察により15DAPでYFP蛍光について評価した。アラビドプシス属(Arabidopsis)T1トランスジェニック事象のさらなる観察は、植え付けから7週間後に完了し、ここで、葉、花序および絹糸を蛍光顕微鏡検査および目視観察によって観察した。最後に、アラビドプシス属(Arabidopsis)T1トランスジェニック事象の観察は、植え付けから10週間後に完了し、ここで、発育中の実生を蛍光顕微鏡検査および目視観察によって観察した。実生および発育中の種子は、以下の設定(例えば、最大励起−525nmおよび最大発光−482nm)を有するLeica DFC310 FX Stereoscope(商標)(Leica,Buffalo Grove,IL)を用いて画像化された。葉、花序および絹糸は、以下の設定(例えば、Blue 488nmレーザー、クロロフィル(chllorophyll)の場合は670BP 30、Phiyfpの場合は520BP 40、350PMT)を有するTYPHOON SCANNER(商標)(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)を用いて画像化された。
アラビドプシス属(Arabidopsis)T1トランスジェニック事象を実生に成長させ、蛍光顕微鏡検査および目視観察により15DAPでYFP蛍光について評価した。アラビドプシス属(Arabidopsis)T1トランスジェニック事象のさらなる観察は、植え付けから7週間後に完了し、ここで、葉、花序および絹糸を蛍光顕微鏡検査および目視観察によって観察した。最後に、アラビドプシス属(Arabidopsis)T1トランスジェニック事象の観察は、植え付けから10週間後に完了し、ここで、発育中の実生を蛍光顕微鏡検査および目視観察によって観察した。実生および発育中の種子は、以下の設定(例えば、最大励起−525nmおよび最大発光−482nm)を有するLeica DFC310 FX Stereoscope(商標)(Leica,Buffalo Grove,IL)を用いて画像化された。葉、花序および絹糸は、以下の設定(例えば、Blue 488nmレーザー、クロロフィル(chllorophyll)の場合は670BP 30、Phiyfpの場合は520BP 40、350PMT)を有するTYPHOON SCANNER(商標)(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)を用いて画像化された。
T1実生および植物組織のYFP画像は、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子プロモーターの制御下で発現され、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子3’UTRによって終結される該タンパク質の種子優先的発現が、単一コピー事象で検出されることを示した。目視観察は、これらの調節要素によって駆動される発現が、初期の種子発育および初期の花発育に特異的であることを示唆している。このように、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX調節要素によって駆動される発現パターンは、花序を発達させる胚珠内で観察された(図3)。YFPタンパク質組織の発現は、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物内の種子の発育中に胚乳組織内に局在化する可能性が最も高い。胚乳組織における発現は、この組織型が初期の種子発育中に種子組織の大部分を占めるため、重要である。YFPタンパク質のさらなる発現は、yfp導入遺伝子の複数のコピーを含有するトランスジェニック事象の花、茎、葉および種子において観察された。
アラビドプシス属(Arabidopsis)における発現タンパク質の定量化
アラビドプシス属(Arabidopsis)植物種子の試料は、PhiYFP ELISAによりアッセイされ、種子は採取され、ビーズミルに供された。約10mgの種子材料を、KLECCO(商標)ビーズミルにおいて、2つのBB(4.5mm鋼球;Daisy;Rogers,AR)を用いて1分間叩いた。300μlの抽出緩衝液(0.05%のTween20および0.05%ウシ血清アルブミンが補充されたPBS)を添加した。試料を穏やかにタッピングしながら懸濁させ、プラットフォームシェーカー上で室温にて30分間揺らした。次に、試料を遠心分離機で14,000×gにて5分間スピンダウンした。上清を除去し、ELISAによって分析した。Maxisorbプレート(商標)(Thermo Fisher Scientific)は、1×PBS中の1.0μg/mlの濃度で抗YFPモノクローナル抗体(Origene #TA150028)を用いてコーティングされた。4℃で一晩インキュベーション後、プレートは、0.5%ウシ血清アルブミンを含むPBST(PBS+0.5%のTWEEN(登録商標)−20)を用いて37℃にて2時間ブロックされた。分析前に、プレートは、洗浄ごとに350μLのPBSTを用いてプレート洗浄機で4回洗浄された。精製されたタンパク質の参照抗原(Evrogen)をブロッキング緩衝液中に2ng/mlになるまで希釈し、2ng/ml〜0.0313ng/mlの連続希釈による標準曲線を作成するために使用した。試料は、1:4の開始希釈までブロッキング緩衝液中に希釈され、1:4の比率でさらに3倍に希釈された(1:4、1:16、1:64、1:256)。次に、100μlの全ての標準および試料希釈液をELISAプレート上に二連でローディングした。試料をELISAプレート上で室温にて1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを上記のように洗浄した。ウサギ抗PhiYFPポリクローナル抗体(Evrogen)をブロッキング緩衝液中で1μg/mlに希釈し、100μl/ウェルでプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした後、洗浄した。抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした検出抗体(Pierce)を1:5000希釈でプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、上記のように洗浄した。次に、1ステップUltra TMB基質(商標)(Thermo Scientific)を100μl/ウェルでプレートに添加した。標準曲線の最も低い希釈を有するウェルが青色を示し始めたため、50μlの停止溶液(0.4N H2SO4)を添加することによって反応を停止させた。プレートは、450nmの波長から650nmの参照を差し引いてSOFTMAX(登録商標)Pro v5(Molecular Devices)を用いてプレートリーダー(Molecular Devices)で読み取った。試験試料のPhiYFP濃度は、二次標準曲線の線形回帰によって計算された。
アラビドプシス属(Arabidopsis)植物種子の試料は、PhiYFP ELISAによりアッセイされ、種子は採取され、ビーズミルに供された。約10mgの種子材料を、KLECCO(商標)ビーズミルにおいて、2つのBB(4.5mm鋼球;Daisy;Rogers,AR)を用いて1分間叩いた。300μlの抽出緩衝液(0.05%のTween20および0.05%ウシ血清アルブミンが補充されたPBS)を添加した。試料を穏やかにタッピングしながら懸濁させ、プラットフォームシェーカー上で室温にて30分間揺らした。次に、試料を遠心分離機で14,000×gにて5分間スピンダウンした。上清を除去し、ELISAによって分析した。Maxisorbプレート(商標)(Thermo Fisher Scientific)は、1×PBS中の1.0μg/mlの濃度で抗YFPモノクローナル抗体(Origene #TA150028)を用いてコーティングされた。4℃で一晩インキュベーション後、プレートは、0.5%ウシ血清アルブミンを含むPBST(PBS+0.5%のTWEEN(登録商標)−20)を用いて37℃にて2時間ブロックされた。分析前に、プレートは、洗浄ごとに350μLのPBSTを用いてプレート洗浄機で4回洗浄された。精製されたタンパク質の参照抗原(Evrogen)をブロッキング緩衝液中に2ng/mlになるまで希釈し、2ng/ml〜0.0313ng/mlの連続希釈による標準曲線を作成するために使用した。試料は、1:4の開始希釈までブロッキング緩衝液中に希釈され、1:4の比率でさらに3倍に希釈された(1:4、1:16、1:64、1:256)。次に、100μlの全ての標準および試料希釈液をELISAプレート上に二連でローディングした。試料をELISAプレート上で室温にて1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを上記のように洗浄した。ウサギ抗PhiYFPポリクローナル抗体(Evrogen)をブロッキング緩衝液中で1μg/mlに希釈し、100μl/ウェルでプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした後、洗浄した。抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした検出抗体(Pierce)を1:5000希釈でプレートに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、上記のように洗浄した。次に、1ステップUltra TMB基質(商標)(Thermo Scientific)を100μl/ウェルでプレートに添加した。標準曲線の最も低い希釈を有するウェルが青色を示し始めたため、50μlの停止溶液(0.4N H2SO4)を添加することによって反応を停止させた。プレートは、450nmの波長から650nmの参照を差し引いてSOFTMAX(登録商標)Pro v5(Molecular Devices)を用いてプレートリーダー(Molecular Devices)で読み取った。試験試料のPhiYFP濃度は、二次標準曲線の線形回帰によって計算された。
YFPの発現レベルを定量し、以下の表1に提示する。セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX調節要素によるYFPの発現は、低コピー数事象(すなわち、1〜2コピー)を含有するトランスジェニック事象について、アラビドプシス属(Arabidopsis)種子内で0.004〜0.020ng/mgの範囲であった。さらに、この結果は、低コピー数事象の平均発現が約0.00875ng/mgであることを示した。最後に、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX調節要素によるYFPの発現は、高いコピー数事象(すなわち、2コピーを超える)を含有するトランスジェニック事象についてアラビドプシス属(Arabidopsis)種子内で1.079ng/mgであった。
このように、セイヨウアブラナ(Brassica napus)ACC OX遺伝子調節要素が同定され、特徴付けられた。遺伝子発現構築物において使用するための新規なプロモーターおよび3’−UTR調節要素が初めて開示される。
Claims (107)
- 導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子発現カセットであって、前記プロモーターは、配列番号1の相補体に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、遺伝子発現カセット。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記ポリヌクレオチドがイントロンを含む、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項3に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記ポリヌクレオチドが、5’非翻訳領域を含む、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドまたは小型RNAをコードする、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 3’非翻訳領域をさらに含む、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記3’非翻訳領域が、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項8に記載の遺伝子発現カセット。
- 請求項1に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
- 前記ベクターが、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ウイルスおよびバクテリオファージからなる群から選択される、請求項10に記載の組換えベクター。
- 請求項1に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
- トランスジェニック植物細胞である、請求項12に記載のトランスジェニック細胞。
- 請求項13に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
- 単子葉植物または単子葉植物である、請求項14に記載のトランスジェニック植物。
- 前記双子葉植物が、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項15に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項14に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
- 前記プロモーターが、組織優先プロモーターである、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記組織優先プロモーターが、または胚珠または種子組織優先プロモーターである、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記プロモーターが、配列番号1のヌクレオチド1〜1483のポリヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 配列番号1の相補体に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする合成ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞。
- 前記合成ポリヌクレオチドが、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項21に記載のトランスジェニック細胞。
- 前記合成ポリヌクレオチドがイントロンを含む、請求項21に記載のトランスジェニック細胞。
- 前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項21に記載のトランスジェニック細胞。
- 前記合成ポリヌクレオチドが、5’非翻訳領域を含む、請求項21に記載のトランスジェニック細胞。
- 前記トランスジェニック細胞が、トランスジェニック植物細胞である、請求項21に記載のトランスジェニック細胞。
- 前記トランスジェニック植物細胞が、植物形質転換法により生成される、請求項26に記載のトランスジェニック細胞。
- 前記植物形質転換法が、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、請求項27に記載のトランスジェニック細胞。
- 請求項26に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
- 前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項29に記載のトランスジェニック植物。
- 前記双子葉植物が、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項30に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項29に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
- 前記プロモーターが組織優先プロモーターである、請求項21に記載のトランスジェニック細胞。
- 前記組織優先プロモーターが、胚珠または種子組織優先プロモーターである、請求項21に記載のトランスジェニック細胞。
- 前記合成ポリヌクレオチドが、配列番号1のヌクレオチド1〜1483のポリヌクレオチド配列を含む、請求項21に記載のトランスジェニック細胞。
- 配列番号1の相補体に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、精製されたポリヌクレオチド配列。
- 前記精製されたポリヌクレオチドが、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項36に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
- 前記精製されたポリヌクレオチドがイントロンを含む、請求項36に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
- 前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項36に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
- 前記精製されたポリヌクレオチドが5’非翻訳領域を含む、請求項36に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
- 前記精製されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項36に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
- 前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドをコードするまたは低分子RNAである、請求項41に記載の作動可能に連結された導入遺伝子。
- 3’非翻訳領域に作動可能に連結されている請求項41に記載の導入遺伝子に作動可能に連結された精製されたポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセット。
- 前記3’非翻訳領域が、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項43に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、請求項43に記載の遺伝子発現カセット。
- 請求項43に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
- 前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびBACベクターからなる群から選択される、請求項46に記載の組換えベクター。
- 請求項43に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
- 前記トランスジェニック細胞が、トランスジェニック植物細胞である、請求項48に記載のトランスジェニック細胞。
- 請求項49に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
- 前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項50に記載のトランスジェニック植物。
- 前記双子葉植物が、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項51に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項50に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
- 前記精製されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子の組織優先発現を促進する、請求項36に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
- 前記精製されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子の胚珠または種子組織優先発現を促進する、請求項54に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
- 前記精製されたポリヌクレオチド配列が、配列番号1のヌクレオチド1〜1483のポリヌクレオチド配列を含む、請求項36に記載の精製されたポリヌクレオチド配列。
- トランスジェニック植物において異種コード配列を発現させるための方法であって、
3’非翻訳領域に作動可能に連結された異種コード配列に作動可能に連結された、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットで植物細胞を形質転換すること;
前記遺伝子発現カセットを含む形質転換された植物細胞を単離すること;
前記形質転換された植物細胞を再生してトランスジェニック植物にすること;および
配列番号1を含む前記ポリヌクレオチド配列を含む前記遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック植物を得ること
を含む、方法。 - ポリヌクレオチド配列がイントロンを含む請求項57に記載の方法。
- 前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項58に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド配列が5’非翻訳領域を含む、請求項57に記載の方法。
- 前記異種コード配列が、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、DNA結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される、請求項57に記載の方法。
- 植物細胞を形質転換することが、植物形質転換法である、請求項57に記載の方法。
- 前記植物形質転換法が、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換法、微粒子銃形質転換法、炭化ケイ素形質転換法、プロトプラスト形質転換法およびリポソーム形質転換法からなる群から選択される、請求項62に記載の方法。
- 前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項57に記載の方法。
- 前記双子葉植物が、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項64に記載の方法。
- 請求項57に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
- 前記異種コード配列が、組織において優先的に発現される、請求項57に記載の方法。
- 前記異種コード配列が、胚珠または種子組織において発現される、請求項57に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号1のヌクレオチド1〜1483の配列を含む、請求項57に記載の方法。
- 配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を単離するための方法であって、
配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を同定すること;
配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること;
前記複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、DNA試料から配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を増幅すること;および
配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を単離すること
を含む、方法。 - 前記単離されたポリヌクレオチド配列がイントロンを含む、請求項70に記載の方法。
- 前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項71に記載の方法。
- 前記単離されたポリヌクレオチド配列が5’非翻訳領域を含む、請求項70に記載の方法。
- 前記単離されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項70に記載の方法。
- 前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドをコードする、請求項74に記載の方法。
- 3’非翻訳領域に作動可能に連結されている導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセット。
- 前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性コード配列、除草剤耐性コード配列、窒素利用効率コード配列、水利用効率コード配列、栄養価コード配列、DNA結合コード配列および選択マーカーコード配列からなる群から選択される、請求項76に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記3’非翻訳領域が、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項76に記載の遺伝子発現カセット。
- 請求項76に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
- 前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびBACベクターからなる群から選択される、請求項79に記載の組換えベクター。
- 請求項76に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
- 前記トランスジェニック細胞が、トランスジェニック植物細胞である、請求項81に記載のトランスジェニック細胞。
- 請求項82に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
- 前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項83に記載のトランスジェニック植物。
- 前記双子葉植物が、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項84に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項83に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
- 前記単離されたポリヌクレオチド配列が、配列番号1のヌクレオチド1〜1483の配列を含む、請求項76に記載の方法。
- 配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造するための方法であって、
配列番号1を含むポリヌクレオチド配列を同定すること;
配列番号1を含む前記ポリヌクレオチド配列を単離すること;
配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む複数のポリヌクレオチド配列を画定すること;
配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含むポリヌクレオチド配列を合成すること;および
配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む合成ポリヌクレオチド配列を製造すること
を含む、方法。 - 合成することが、
配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を同定すること;
配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列に結合する、複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列を生成すること;
前記複数のオリゴヌクレオチドプライマー配列をライゲートして、配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む前記ポリヌクレオチド配列を合成すること
を含む、請求項88に記載の方法。 - 前記合成ポリヌクレオチド配列がイントロンを含む、請求項88に記載の方法。
- 前記イントロンが、イネアクチンイントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、およびシロイヌナズナ(Arabadiopsis thaliana)ユビキチン10イントロンからなる群から選択されるイントロンに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項90に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが有する、請求項1に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記合成ポリヌクレオチド配列が5’非翻訳領域を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記合成されたポリヌクレオチド配列が、導入遺伝子に作動可能に連結されている、請求項88に記載の方法。
- 前記作動可能に連結された導入遺伝子が、ポリペプチドをコードする、請求項93に記載の方法。
- 3’非翻訳領域に作動可能に連結されている請求項93に記載の導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を含む合成されたポリヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセット。
- 前記導入遺伝子が、殺虫剤抵抗性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、DNA結合導入遺伝子および選択マーカー導入遺伝子からなる群から選択される、請求項96に記載の遺伝子発現カセット。
- 前記3’非翻訳領域が、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項96に記載の遺伝子発現カセット。
- 請求項96に記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
- 前記ベクターが、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびBACベクターからなる群から選択される、請求項99に記載の組換えベクター。
- 請求項96に記載の遺伝子発現カセットを含むトランスジェニック細胞。
- 前記トランスジェニック細胞が、トランスジェニック植物細胞である、請求項101に記載のトランスジェニック細胞。
- 請求項102に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
- 前記トランスジェニック植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項103に記載のトランスジェニック植物。
- 前記双子葉植物が、アラビドプシス属(Arabidopsis)植物、タバコ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物および綿花植物からなる群から選択される、請求項104に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項103に記載のトランスジェニック植物由来のトランスジェニック種子。
- 前記合成ポリヌクレオチド配列が、配列番号1のヌクレオチド1〜1483の配列を含む、請求項88に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562100394P | 2015-01-06 | 2015-01-06 | |
US62/100,394 | 2015-01-06 | ||
PCT/US2015/067590 WO2016111860A1 (en) | 2015-01-06 | 2015-12-28 | Brassica napus seed specific promoters identified by microarray analysis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018500042A true JP2018500042A (ja) | 2018-01-11 |
Family
ID=56356317
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017535667A Pending JP2018500042A (ja) | 2015-01-06 | 2015-12-28 | マイクロアレイ分析によって同定されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)種子特異的プロモーター |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10392628B2 (ja) |
EP (1) | EP3242943A4 (ja) |
JP (1) | JP2018500042A (ja) |
CN (1) | CN107109429A (ja) |
AU (1) | AU2015375395B2 (ja) |
BR (1) | BR112017013970A2 (ja) |
CA (1) | CA2972589A1 (ja) |
RU (1) | RU2017124652A (ja) |
WO (1) | WO2016111860A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2972589A1 (en) | 2015-01-06 | 2016-07-14 | Dow Agrosciences Llc | Brassica napus seed specific promoters identified by microarray analysis |
CN107794264A (zh) * | 2017-10-17 | 2018-03-13 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 用于构建多倍体植物突变体库的接头序列及鉴定方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6441270B1 (en) * | 1996-04-26 | 2002-08-27 | New York University | Scarecrow gene |
US8877916B2 (en) * | 2000-04-26 | 2014-11-04 | Ceres, Inc. | Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof |
CN101880657A (zh) * | 2004-09-24 | 2010-11-10 | 孟山都技术有限公司 | 用于植物的启动子分子 |
US9150877B2 (en) * | 2007-09-27 | 2015-10-06 | Dow Agrosciences Llc | Construct and method for expressing transgenes using a Brassica bidirectional constitutive promoter |
EP2222856A2 (en) * | 2007-12-14 | 2010-09-01 | BASF Plant Science GmbH | Promoters from brassica napus for seed specific gene expression |
EP2318533A2 (en) * | 2008-07-01 | 2011-05-11 | BASF Plant Science GmbH | Promoters from brassica napus for seed specific gene expression |
CA2972589A1 (en) | 2015-01-06 | 2016-07-14 | Dow Agrosciences Llc | Brassica napus seed specific promoters identified by microarray analysis |
-
2015
- 2015-12-28 CA CA2972589A patent/CA2972589A1/en active Pending
- 2015-12-28 WO PCT/US2015/067590 patent/WO2016111860A1/en active Application Filing
- 2015-12-28 RU RU2017124652A patent/RU2017124652A/ru not_active Application Discontinuation
- 2015-12-28 US US15/542,044 patent/US10392628B2/en active Active
- 2015-12-28 AU AU2015375395A patent/AU2015375395B2/en not_active Ceased
- 2015-12-28 EP EP15877351.5A patent/EP3242943A4/en not_active Withdrawn
- 2015-12-28 BR BR112017013970A patent/BR112017013970A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-12-28 CN CN201580073367.9A patent/CN107109429A/zh active Pending
- 2015-12-28 JP JP2017535667A patent/JP2018500042A/ja active Pending
-
2017
- 2017-07-06 US US15/643,364 patent/US10428337B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20180273968A1 (en) | 2018-09-27 |
US10428337B2 (en) | 2019-10-01 |
US10392628B2 (en) | 2019-08-27 |
BR112017013970A2 (pt) | 2018-01-16 |
EP3242943A1 (en) | 2017-11-15 |
WO2016111860A1 (en) | 2016-07-14 |
CA2972589A1 (en) | 2016-07-14 |
AU2015375395B2 (en) | 2018-11-01 |
CN107109429A (zh) | 2017-08-29 |
AU2015375395A1 (en) | 2017-07-06 |
RU2017124652A (ru) | 2019-02-08 |
EP3242943A4 (en) | 2018-06-27 |
US20170305978A1 (en) | 2017-10-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20170247711A1 (en) | Zea mays regulatory elements and uses thereof | |
US20170306344A1 (en) | Brassica napus seed specific promoters identified by microarray analysis | |
US20170275637A1 (en) | Novel maize ubiquitin promoters | |
US10428337B2 (en) | Brassica napus ACC OX promoter identified by microarray analysis | |
US20170306340A1 (en) | Brassica napus seed specific promoters identified by microarray analysis | |
US9909133B2 (en) | Root specific expression conferred by chimeric gene regulatory elements | |
JP2017500877A (ja) | 新規トウモロコシユビキチンプロモーター | |
US20170137834A1 (en) | Zea mays regulatory elements and uses thereof | |
JP2017500875A (ja) | 新規トウモロコシユビキチンプロモーター |