CN104178485B

CN104178485B - TmDGAT1a基因的启动子及其应用

Info

Publication number: CN104178485B
Application number: CN201310189088.1A
Authority: CN
Inventors: 许亦农; 李敏春
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2013-05-21
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2033-05-21
Also published as: CN104178485A

Abstract

本发明公开了TmDGAT1a基因的启动子及其应用，属于生物技术领域。所述启动子为如下任一所示：1）核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1的DNA；2）核苷酸序列与SEQ ID No.1互补的DNA；3）在高严紧条件下能够与上述1）或2）DNA杂交且具有启动子功能的DNA；4）对上述1）或2）所示DNA进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有启动子功能的DNA；5）与上述1）或2）所示DNA具有至少90％同源性且具有启动子功能的DNA。本发明的启动子能特异调控外源基因表达，能使外源基因在拟南芥根输导组织、茎输导组织、叶输导组织、花输导组织、果荚输导组织中均得到表达，具有重要应用价值。

Description

TmDGAT1a基因的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的一种启动子，特别是涉及一种来源于四合木的TmDGAT1a基因的启动子，及其用于调控植物目的基因表达的应用。

背景技术

三脂酰甘油（Triacylglycerol，TAG）是人类和动物赖以生存的重要化合物之一，也是石油的可能替代品之一。随着人们对植物油需求的日益增长，提高植物油的产量与开发新型油料作物成为人们关心的重要问题。研究表明，在植物营养器官中积累油脂是提高植物油产量的最为有效的手段之一。四合木（Tetraenamongolica）是我国内蒙古地区特有的一种强旱生落叶小灌木，属蒺藜科（Zygophyllaceac）四合木属的单型种植物。研究表明，四合木茎组织中含有大量的三脂酰甘油，含量高达46mg/g干重。因此，研究四合木茎组织中TAG合成和积累的分子机制，对能源植物的开发和利用具有重要的意义。

二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT，EC2.3.1.20）是催化TAG生物合成的关键酶和限速酶，在调控植物油脂积累水平过程中起决定作用。研究表明，四合木中存在两个DGAT1基因，分别为TmDGAT1a和TmDGAT1b（GenBank登录号分别为JX163929与JX163930），均对TAG的合成具有重要的作用。通过对这两个基因调控机理的研究，从而解析四合木在营养器官中积累三脂酰甘油的分子机理，为植物营养器官积累油脂的基因工程研究提供理论基础和重要的基因资源。

发明内容

本发明涉及一种启动子，所述启动子为如下任一所示：

1）核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1的DNA；

2）核苷酸序列与SEQIDNo.1互补的DNA；

3）在高严紧条件下能够与上述1）或2）DNA杂交且具有启动子功能的DNA；

4）对上述1）或2）所示DNA进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有启动子功能的DNA；

5）与上述1）或2）所示DNA具有至少90％同源性且具有启动子功能的DNA。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度（Tm）为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃（低于探针Tm5℃）；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

在本发明中，所述对SEQIDNo.1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5′端和/或3′端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

本发明还涉及一种核酸构建体，其包含本发明所述的启动子，与所述的启动子可操作连接的基因，其中所述启动子与所述基因来源相同或者不同。

本发明还涉及一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明所述的启动子或核酸构建体，所述载体可以通过例如将上述启动子或核酸构建体插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到；具体地，所述载体为将上述启动子或核酸构建体与pMD19-T质粒经重组得到的重组载体。

本发明还涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞，所述重组细胞可以通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。

本发明还涉及一种植物愈伤组织或外植体，所述愈伤组织或外植体转化有本发明的启动子和/或核酸构建体和/或载体和/或感染有本发明的重组细胞。

本发明还涉及一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物转化有本发明的启动子和/或核酸构建体和/或载体和/或感染本发明的重组细胞。

本发明还涉及用于扩增本发明所述启动子的引物对，其特征在于，所述引物对的两条引物分别含有序列表中SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；优选的，所述引物对的两条引物在5′端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基；具体地，所述引物对的两条引物的核苷酸序列分别为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3或SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示。

本发明还涉及制备SEQIDNo.1所示的启动子的方法，包括以四合木基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增；所述扩增引物根据SEQIDNo.1在四合木DNA中的序列分别针对首尾进行设计，例如为本发明所述的引物对。

本发明还涉及一种调控植物中目的基因表达的方法，所述方法包括将本发明的核酸构建体和/或载体转化入植物愈伤组织或外植体中的步骤，或用本发明的重组细胞感染植物愈伤组织或外植体的步骤。

本发明还涉及一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养本发明的重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体。

本发明还涉及本发明的启动子和/或核酸构建体和/或载体和/或重组细胞用于调控植物目的基因表达的用途，特别是用在使目的基因在植物的输导组织中表达的应用，更具体的，在植物的根输导组织、茎输导组织、叶输导组织、花输导组织和/或果实输导组织中表达的应用；其中，所述的植物为双子叶植物，具体为拟南芥；以及用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。

本发明还涉及本发明的愈伤组织或外植体用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。

实验证明，本发明SEQIDNo.1所示DNA具有启动子功能，能使外源基因在输导组织中表达，能使外源基因在拟南芥的根输导组织、茎输导组织、叶输导组织、花输导组织、果荚输导组织中均得到表达。本发明SEQIDNo.1所示DNA能够特异调控外源基因的表达，具有重要的应用价值。

附图说明

图1是双元表达载体构建流程。

图2是转基因拟南芥GUS组织化学染色结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步说明：

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1、启动子的制备及功能验证

一、启动子的制备

以四合木的基因组DNA为模板，用引物对Pro_TmDGAT1af和Pro_TmDGAT1ar进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR体系如下：

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。

所使用的引物序列组成如下：

Pro_TmDGAT1af：GCAAGCTTTGTGTTGTTATTGACGAA（SEQIDNo.4）

其中下划线代表HindIII酶切位点；

Pro_TmDGAT1ar：CGGGATCCGCTGTAAGTGAATTGAAT（SEQIDNo.5）

其中下划线代表BamHI酶切位点。

将PCR扩增产物进行测序验证，结果所得PCR扩增产物为SEQIDNo.1所示的DNA。

也可人工合成得到SEQIDNo.1所示的DNA。

二、构建重组表达载体

将步骤一中所得PCR扩增产物克隆至pMD19-T载体，并测序验证：

因通过上述PCR反应获得的产物为平末端，在进行T/A克隆之前，还需在平末端的PCR产物的5′端加A，才能与3′端T突出的载体pMD19-T（购自Takara）配对连接。所述的5′端加A反应如下：

在1.5mL离心管中建立如下反应体系：

将反应样品混匀之后，70℃温育15～30min，-20℃保存。此处的TaqDNAPolymerase购自北京泽星生物科技有限公司。

PCR产物5′末端加A之后按如下体系与pMD19-T载体进行连接：

PCR产物5′末端加A的产物9μL

pMD19-T1μL

SolutionI10μL

上述体系混匀之后置于16℃温育至少30min。

取10μL上述连接产物按照以下方法转化DH5α：

a）取DH5α感受态细胞（购自全式金生物公司），于冰浴中融化；

b）加入10μL连接产物，用枪头轻轻吹吸混匀后，冰浴30min；

c）42℃热激45s，冰上迅速冷却2min；

d）加入500μLLB液体培养基，37℃150rpm温育1小时；

取50～200μL培养产物涂布于含有Amp抗生素的LB平板上，超净台中吹干培养基表层液体，37℃倒置平板培养12～16小时至菌斑长出。

用引物Pro_TmDGAT1af和Pro_TmDGAT1ar，以单克隆菌斑小摇之后的菌液为模板，进行菌液PCR鉴定；通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将鉴定之后含有目的条带的单克隆菌液送样测序。

将上述测序正确的菌液以及含有表达载体pBI121的DH5α菌液，按Genstar质粒提取试剂盒提供的方法进行质粒抽提并通过琼脂糖凝胶检测。

将抽提得到的并通过琼脂糖凝胶检测的质粒按以下体系进行HindⅢ和BamHI双酶切处理：

上述体系混匀之后，置于37℃温育2h，参照Axygen胶回收试剂盒提供的方法进行切胶回收目的片段以及载体片段，并通过琼脂糖凝胶检测。

将回收得到的启动子序列及pBI121载体大片段按以下体系进行连接：

启动子序列片段0.3pmol

pBI121载体大片段0.03pmol

SolutionI5μL

当启动子序列片段和pBI121载体片段体积之和小于5μL时，加ddH₂O补足至5μL；当启动子序列片段和pBI121载体片段体积之和大于5μL时，无需加ddH₂O，此时，SolutionⅠ用量为两者体积之和。

连接产物按前述方法转化大肠杆菌DH5α，并通过菌液PCR检测，结果得到基因插入方向和插入序列均正确的重组表达载体，即在的pBI121的HindⅢ和BamHI酶切位点之间插入了SEQIDNo.1所示DNA，将其命名为pBI121-Pro_TmDGAT1a。在pBI121-Pro_TmDGAT1a中，GUS基因的上游除了SEQIDNo.1所示DNA外，无其它任何启动子序列。

三、拟南芥的转化

1、提取检测无误的菌液的质粒再次进行HindⅢ和BamHⅠ双酶切检测，正确无误之后按照以下方法转化根癌农杆菌GV3101：

a）向冰浴预冷的100μL农杆菌感受态细胞中加入1μg左右的纯化质粒，混匀后冰浴30min；

b）液氮中冷冻2min，立即取出后置于37℃水浴2min；

c）加入500μLYEP液体培养基，28℃、200rpm振荡培养3-5小时；

d）取200μL菌体涂布于含有合适抗性的YEP固体培养基的平板上；

将平板置于28℃温箱中倒置培养2～3天至菌斑出现。

经菌液PCR鉴定之后，挑选阳性菌斑转化拟南芥。

2、将含有目的载体pBI121-Pro_TmDGAT1a或pBI121质粒的菌株GV3101按以下方法转化拟南芥：

1）将含有目的载体的农杆菌GV3101接种于YEP液体培养基（附加100mg/LKan、100mg/LRif及50mg/LStr）中，28℃振荡培养至OD₆₀₀达到1.2～1.6；

2）3,750rpm离心10min，收集菌体；

3）将菌体重悬于转化缓冲液中（1/2MS附加3%蔗糖、0.02%～0.05%silwetL-77，pH5.7）至OD₆₀₀达到0.8左右；

4）浸染拟南芥的花蕾10s，黑暗培养放置24小时后，放置于光照培养室培养。

3、拟南芥转基因植株的筛选

1）用70%的乙醇将转基因拟南芥种子消毒10min后，无菌水洗涤3次；

2）将转基因拟南芥种子均匀地铺在含50mg/LKan（卡那霉素）的MS平板上，于4℃春化72小时，然后置于温室进行光照培养；

3）在抗性培养基上萌发的小苗，子叶呈绿色、根系生长正常的默认为拟阳性苗，移栽后进行进一步的检测以用于后续实验。

4）分子鉴定：将拟阳性苗移栽至土中约1月后，标记取样。通过TRIZOL法提取RNA并反转录成cDNA，用引物Pro_TmDGAT1af和Pro_TmDGAT1ar进行PCR鉴定，经琼脂糖凝胶鉴定出阳性植株进行GUS组织化学染色。

四、GUS组织化学染色

将转基因拟南芥株系按以下方法进行GUS组织化学染色，结果见图2：

1）GUS染色液的配制：GUS染色液中含有0.5%（V/V）TritonX-100，0.05mMK₃[Fe(CN)₆]，0.05mMK₄[Fe(CN)₆]，0.1M的磷酸钠缓冲液（pH7.0）和0.5mg/mLX-Gluc。配好后分装于无菌小管中，于-20℃保存备用；

2）GUS的组织化学染色检测：参考Kosugi等（1990）（KosugiS,OhashiY,NakajimaK,AraiY(1990)Animprovedassayforβ-glucuronidaseintransformedcells:methanolalmostcompletelysuppressesaputativeendogenousβ-glucuronidaseactivity.PlantSci.70,133-140.）的方法。取转基因拟南芥材料，加入适量的GUS染色液，在37℃条件下保温过夜；然后用70%乙醇脱色，观察记录。

图A是Pro_TmDGAT1a::GUS的转基因拟南芥萌发后5天，GUS基因的表达情况；

图B是Pro_35S::GUS的转基因拟南芥萌发后5天，GUS基因的表达情况；

图C是Pro_TmDGAT1a::GUS的转基因拟南芥果荚中GUS基因的表达情况；

图D是Pro_TmDGAT1a::GUS的转基因拟南芥萌发后15天，GUS基因的表达情况；

图E是Pro_35S::GUS的转基因拟南芥萌发后15天，GUS基因的表达情况；

图F是Pro_TmDGAT1a::GUS的转基因拟南芥花中GUS基因的表达情况。

上述结果表明，本发明的SEQIDNo.1所示DNA具有启动子的功能，能使GUS基因在输导组织中表达，具体地，能使GUS基因在拟南芥的根输导组织、茎输导组织、叶输导组织、花输导组织、果荚输导组织中均得到表达。

Claims

1.一种启动子，为如下任一所示：

1)核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1的DNA；

2)核苷酸序列与SEQIDNo.1互补的DNA。

2.一种核酸构建体，其包含权利要求1所述的启动子和与所述启动子可操作连接的基因，其中所述启动子与所述基因来源相同或者不同。

3.一种载体，其特征在于：所述载体含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体；所述载体通过将权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体插入克隆载体或表达载体而得到，或者通过人工合成得到。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体与pMD19-T质粒经重组得到的重组载体。

5.一种重组细胞，其特征在于：所述重组细胞含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体；所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。

6.一组引物对，其特征在于：所述引物对的两条引物的核苷酸序列分别为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3或SEQIDNo.4和SEQIDNo.5。

7.一种调控植物中目的基因表达的方法，包括如下步骤：将权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体或权利要求5中所述的重组农杆菌细胞导入植物。

8.权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体或权利要求5中所述的重组农杆菌细胞在调控植物目的基因表达中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体或权利要求5中所述的重组农杆菌细胞在使目的基因在植物输导组织中表达的应用。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体或权利要求5中所述的重组农杆菌细胞在使在植物的根输导组织、茎输导组织、叶输导组织、花输导组织和/或果实输导组织中表达的应用；其中，所述的植物为双子叶植物。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的植物为拟南芥。