WO2010018693A1 - ＰＰＲＴｐ遺伝子を利用した植物脂質合成の促進法 - Google Patents

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WO2010018693A1
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plant
protein
pprtp
gene
subunit
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研吾 金丸
裕士 山形
知秀 宇野
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国立大学法人神戸大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting lipid production in a plant, a plant having high lipid-producing ability obtained by the method, and a seed thereof.
  • BDF biodiesel fuel
  • rapeseed oil and palm oil are not sufficient, and deforestation is carried out for the purpose of securing agricultural land in order to increase the production of these vegetable oils.
  • Various problems have arisen, such as the suppression of food production due to the expansion of production of vegetable fuel with higher profitability. In particular, the latter is seen as a serious problem on a global scale, coupled with food problems accompanying rapid population growth in developing countries in recent years.
  • the problem to be solved by the present invention is to develop a method for improving lipid production ability by enhancing the plastid function of plants such as rape and soybean by using genetic manipulation techniques, and to obtain plants that satisfy the demand for food, fuel, etc. Was that.
  • the present inventor has conducted intensive research and expressed functional plastid localized lipid synthase protein or a subunit thereof, and RNA editing was performed on mRNA encoding them.
  • RNA editing was performed on mRNA encoding them.
  • a gene encoding a PPR protein involved in the RNA editing and / or a gene encoding NEP is introduced into a plant that needs to be exposed, the lipid production ability of the plant is improved, and the present invention It came to complete.
  • the present invention relates to: (1) To express a functional lipid synthase protein or a subunit thereof, a plant that requires RNA editing to be performed on mRNA encoding the protein or the subunit; A gene encoding a PPR protein involved in the RNA editing, a method for promoting lipid production in a plant, comprising introducing either or both of genes encoding NEP; (2) The method according to (1), wherein the lipid synthase protein subunit is an ACCase protein; (3) The method according to (1) or (2), wherein both the gene encoding the PPR protein involved in the RNA editing and the gene encoding NEP are introduced; (4) In order to express the CT ⁇ subunit of the functional plastid-localized multi-subunit type ACCase protein, plants that require RNA editing to be performed on accD mRNA, Gene encoding PPRTp (pprTp) Gene encoding RpoTp (rpoTp) A method for promoting lipid production
  • FIG. 1 is a scheme showing the reaction of ACCase.
  • BCCP represents a biotin carboxyl carrier protein.
  • FIG. 2 is a photograph of a plant of an Arabidopsis wild-type strain and a pprTp gene mutant grown on an MS medium.
  • FIG. 3 shows the phenotype of the rpoTp gene mutant.
  • a to C show a sprout (A), an abnormal leaf morphology (B), and a flower stem (C) showing the albino of the rpoTp gene mutant, respectively.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining analysis of RNA editing efficiency by restriction enzyme treatment.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of sequencing the RNA editing site.
  • FIG. 1 is a scheme showing the reaction of ACCase.
  • BCCP represents a biotin carboxyl carrier protein.
  • FIG. 2 is a photograph of a plant of an Arabidopsis wild-type strain and a pprTp gene mutant grown
  • FIG. 6 shows the results of acrylamide gel electrophoresis in which the RNA editing efficiency was examined.
  • FIG. 7 shows the construction scheme of the PPRTp protein overexpression construct.
  • FIG. 8 shows the results of gas chromatography analysis of a sample obtained from a wild strain leaf.
  • FIG. 9 shows the results of gas chromatographic analysis of a sample obtained from leaves of a PPRTp protein overexpressing strain.
  • lipids used in oil seeds is fatty acids, which are catalyzed by various lipid synthases after acetyl CoA is converted to malonyl CoA by acetyl CoA carboxylase (ACCase) (see FIG. 1). Is generated. It is known that conversion of acetyl CoA by ACCase is the rate-determining step of lipid synthesis, and lipid synthesis in plants is regulated depending on the activity of ACCase (see Non-Patent Document 1). In order to promote lipid production ability in plants, it is necessary to increase the activity of ACCase.
  • ACCases involved in plant lipid synthesis, each of which is a multi-subunit ACCase localized in plastids including plastids and a multifunctional ACCase mainly localized in the cytoplasm.
  • the multi-subunit type ACCase is composed of four subunits (biotin carboxylase (BC), biotin carboxyl carrier protein (BCCP), carboxyltransferase ⁇ and ⁇ (CT ⁇ and ⁇ ), respectively, and the activity of ACCase is CT ⁇ in cells. It has been reported that it depends on the state of the subunit (see Non-Patent Document 2).
  • the genes encoding the remaining subunits other than CT ⁇ are present in the nuclear DNA, but only the accD gene encoding the CT ⁇ subunit is known to be present in the plastid DNA. .
  • the cruciferous plant has not yet established a technique for gene transfer into plastid DNA. Therefore, for the purpose of improving lipid production ability, it is still limited to apply genetic manipulation techniques to plants using genes encoded in plastids as direct targets. Therefore, in many plants, it was considered effective to perform genetic manipulations on factors encoded in the nucleus related to the expression of the target protein, CT ⁇ subunit.
  • Plant PPR proteins have a transit peptide sequence characteristic of organelle translocation protein at the N-terminus, and most of them are presumed to function in plastids or mitochondria.
  • mRNA transcribed from a gene in DNA is translated through various maturation processes. These maturation processes are collectively referred to as post-transcriptional regulation, but there are known cases in which the precursor RNA before undergoing post-transcriptional regulation is not translated, and even if translated, the protein is inactive.
  • Post-transcriptional regulation is particularly important for gene expression processes in the plastid.
  • the possibility that each PPR binds to a specific RNA sequence has been suggested as a property widely found in the PPR motif, and examples already involved in post-transcriptional regulation have begun to be reported one after another.
  • RNA editing is also one of the major post-transcriptional regulation in plastids. It is known that RNA editing in this plastid is a reaction that converts C in the mRNA sequence to U.
  • the inventors have searched for a PPR protein whose expression pattern is highly correlated with the nuclear-encoded T7 phage RNA polymerase (NEP) in the transcription system of the plastid in particular in a database, and eager to analyze their functions.
  • NEP nuclear-encoded T7 phage RNA polymerase
  • the present invention requires that RNA editing is performed on mRNA encoding the protein or its subunit in order to express a functional lipid synthase protein or its subunit.
  • RNA editing is performed on mRNA encoding the protein or its subunit in order to express a functional lipid synthase protein or its subunit.
  • a gene encoding a PPR protein involved in RNA editing A method for promoting lipid production in a plant is provided, which comprises introducing either or both of genes encoding NEP.
  • lipid synthase protein or a subunit thereof is expressed, and then RNA editing is performed on mRNA encoding the protein or the subunit.
  • Any plant may be used if it is necessary. Examples include rape, soybean, bean and pine, but are not limited thereto.
  • the functional lipid synthesis protein of the present invention may be any protein that participates in lipid synthesis, but is preferably ACCase that catalyzes the rate-limiting step of the lipid synthesis pathway.
  • ACCase is classified into a multi-subunit type and a multi-function type because of its structure.
  • ACCase may be a multi-subunit type ACCase
  • the ACCase subunit may be any of BC subunit, BCCP subunit, CT ⁇ or ⁇ subunit, preferably CT ⁇ subunit.
  • the term “functional” means a state having a desired activity, and is a state capable of producing a desired effect.
  • the PPR protein of the present invention may be any protein as long as it has a PPR motif encoding 35 amino acids, which is a structural feature of the PPR protein, and a C-terminal DYW motif, but is preferably post-transcriptional regulation, more preferably Is a PPR protein involved in RNA editing.
  • the PPR protein is a PPRTp protein in Arabidopsis thaliana or a corresponding PPR protein in the case of plant types other than Arabidopsis thaliana.
  • the Arabidopsis PPRTp protein of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the gene encoding the protein (pprTp) has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • RNA editing of the present invention is that the sequence is changed at a specific site on the RNA transcribed from the DNA sequence, and the protein derived from the RNA changed by the RNA editing has a desired activity. Any one is acceptable.
  • RNA editing in plastids is such that C in the nucleotide sequence of RNA is replaced with U.
  • the 794th C of the nucleotide sequence of the accD mRNA of Arabidopsis thaliana shown in SEQ ID NO: 1, or the C at the corresponding position in the accD mRNA in the case of plants other than Arabidopsis thaliana Is replaced with U but is not limited thereto.
  • RNA polymerase of the present invention may be any protein as long as it is recruited to the RNA transcription start site and has an RNA elongation ability, but an RNA polymerase involved in the plastid transcription system is preferred.
  • RNA polymerases involved in the plastid transcription system include T7 phage RNA polymerase (NEP) encoded by nuclear DNA (NEP: nuclear-encoded RNA polymerase) and plastid-encoded RNA polymerase (PEP: plastid-). Any of (encoded RNA-polymerase) may be used, but NEP is preferable.
  • NEP T7 phage RNA polymerase
  • NEP plastid-encoded RNA polymerase
  • Any of (encoded RNA-polymerase) may be used, but NEP is preferable.
  • RNA polymerase is NEP, its localization may be any, but it is preferably localized in plastids.
  • the NEP is the RpoTp protein in Arabidopsis or the corresponding RNA polymerase in the case of plant types other than Arabidopsis.
  • the Arabidopsis thaliana RpoTp protein of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the gene encoding the protein (rpoTp) has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • a gene includes a mutant thereof, and the mutant has a nucleotide sequence encoding a protein exhibiting the same activity as the protein encoded by the original non-mutated gene.
  • it may be a gene having a nucleotide sequence in which 1 to about 30 nucleotides are deleted, substituted or added.
  • the mutant may generally be a gene having a nucleotide sequence having at least 20% homology with a gene derived from Arabidopsis thaliana, preferably 40%, more preferably 50%, still more preferably 60%, most preferably
  • it may be a gene having a nucleotide sequence having homology of 70% or more (for example, 90%, 95%, 97%, 98% or 99%).
  • the variant may be a gene having a nucleotide sequence that can hybridize under stringent conditions to an unmutated nucleotide sequence.
  • Examples of the stringent conditions include conditions described in J. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Standard, Second Edition,” 1989, “Cold Spring Harbor Laboratory Press”. For example, after hybridization with a probe at 68 ° C. in a solution containing 6 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 100 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, the washing conditions are 2 ⁇ SSC, 2 ⁇ SSPE (Frederick M.
  • the protein includes a mutant thereof, and the mutant may be any one as long as it has a desired activity.
  • the variant may be a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acid sequences are deleted, substituted or added.
  • the mutant may generally be a protein having an amino acid sequence having at least 40% homology with a protein derived from Arabidopsis thaliana, preferably 60%, more preferably 70%, still more preferably 80%, most preferably May be a protein having an amino acid sequence having a homology of 90% or more (eg, 90%, 95%, 97%, 98% or 99%).
  • the method for introducing the gene into a plant may be any method as long as a desired effect can be obtained, and various methods are known to those skilled in the art.
  • gene transfer is performed on plant nuclear DNA.
  • the gene introduction method include, in addition to the Agrobacterium-mediated gene introduction method using Agrobacterium, various physical methods and chemical methods for directly introducing a DNA fragment containing a target gene into a plant cell. May be.
  • the physical method include an electroporation method, a particle gun method, and a microinjection method.
  • Examples of the chemical method include a method using polyethylene glycol, but are not limited thereto.
  • conventional techniques may be used for selection of transformed cells generated by gene transfer and acquisition of a desired plant.
  • both of the genes may be used.
  • both genes may be used.
  • the gene is preferably overexpressed in transformed plant cells or plants.
  • a natural promoter derived from a plant to be transformed may be used to express a gene. However, as long as a desired expression level can be obtained, either a corresponding promoter of another type of plant or an artificial promoter is used. May be used.
  • the natural promoter include a CaMV 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus, a napin promoter that is specifically expressed in seeds, and a kukumycin promoter that is specifically expressed in fruit fruit cores.
  • Examples of the artificial promoter include promoters described in JP-A-2000-139477.
  • the present invention provides a plant with enhanced lipid production obtained by the method of the present invention.
  • the present invention provides a seed of the plant obtained by the method of the present invention.
  • Murashige-Skoog medium (MS medium, Murashige and Skoog, 1962) for plant growth was prepared using mixed salts for Murashige-Skoog medium (Nippon Pharmaceutical).
  • culture soil Jiffy 7 (AS Jiffy Products) was used for growing plant individuals for the purpose of collecting seeds.
  • An optical microscope SZX-12 (Olympus) was used for microscopic observation.
  • the obtained seeds were sterilized and then seeded on Murashige-Skoog (MS) medium. Unless otherwise specified in the following description, 0.5% gellan gum was used as a solidifying agent in MS solid medium, and 1% sucrose was added.
  • the seeds were put in a 1.5 ml tube and washed with 1 ml of 70% ethanol. After removing ethanol, 500 ⁇ l of bleach solution (50% commercial bleach, 0.02% Triton X-100) was added and left to sterilize for 5 minutes. Next, the bleach solution was removed and washed with sterilized water three times. After washing, an appropriate amount of sterilized water was added, and the seeds were sucked up by Pipetman and planted on the MS medium. The seeded plate was subjected to low temperature treatment at about 4 ° C. for 24 hours. Plants were grown in a constant temperature incubator at 22 ° C. under continuous white light conditions.
  • bleach solution 50% commercial bleach, 0.02% Triton X-100
  • the target mutant strain in which T-DNA is homogeneously inserted into the pprTp gene by genomic PCR using a set of a T-DNA specific primer and a pprTp specific primer has a white phenotype (FIG. 2). See). Furthermore, it showed a more severe growth disorder than the mutant mutant of RpoTp gene encoding NEP (see FIG. 3), and PPRTp protein is predicted to be involved in the post-transcriptional control of the gene transcribed by plastid RNA polymerase. Thus, it was predicted that PPRTp protein is involved in post-transcriptional regulation of PEP core subunit gene or accD gene transcribed by RpoTp protein.
  • RNA was extracted by performing Sephasol-RNA treatment, isoamyl alcohol precipitation, removal of polysaccharides by CTAB treatment, and ethanol precipitation. The concentration of extracted RNA was measured using NanoDrop (NanoDrop). About 2 ⁇ l of the extracted RNA solution was run on a 0.8% agarose gel, and it was confirmed that no degradation occurred.
  • the PCR product was subjected to electrophoresis. After confirming that it was a single band, it was purified using NucleoSpin.
  • a second reaction (labeling) was performed using the reaction solution shown in Table 4 under the reaction conditions shown in Table 5.
  • RNA solution was concentrated to 2 mg / ml using Micro vac (TOMY).
  • TOMY Micro vac
  • 0.5 ml of 20 ⁇ MOPS buffer, 1.75 ml of formaldehyde and 5 ml of formamide were added. After incubating at 60 ° C. for 10 minutes, it was rapidly cooled on ice. Then, 2 ml of the sample dye was added and electrophoresis was performed for 40 minutes using 1 ⁇ MOPS buffer. The gel was shaken in pure water for 10 minutes to wash off formamide after electrophoresis. The pure water was replaced with a new one and shaken for another 10 minutes.
  • the solution was replaced with a solution obtained by adding anti-DIG antibody (Anti-Dioxygenin-AP, Roche) to the blocking buffer at 1/5000 (v / v), and shaken vigorously for 45 minutes. Thereafter, the membrane was washed with a washing buffer, gently shaken for 10 minutes in a detection buffer (1 ⁇ detection buffer A, 1 ⁇ detection buffer B mixture), placed on a wrap, and CDP-Star (Roche) Was dropped on the entire detection surface of the membrane, packed, and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. This was detected with a chemiluminescence detector FAS-1000 (TOYOBO).
  • a chemiluminescence detector FAS-1000 TOYOBO
  • Table 6 shows the results of analysis by the Northern blot method.
  • the amount of transcript of accD transcribed depending on NEP alone does not change, the amount of transcript of the gene encoding the core subunit of PEP (rpoB) is increasing, and the contribution ratio of transcription by NEP is The amount of transcripts of large genes clpP and rpl16 also increased, suggesting that at least transcription by NEP is not suppressed in the pprTp mutant.
  • PPRTp protein is considered to be involved in post-transcriptional processes, that is, post-transcriptional regulation, rather than gene transcription itself by NEP.
  • RNA editing by PPRTp protein The inventors confirmed that when fluorescent protein GFP was linked to the transit peptide site of PPRTp protein and expressed in cells, it was localized in the plastids, It can be said that the PPRTp protein functions in a plastid. It is also reported that the DYW motif on the C-terminal side of PPRTp protein is involved in RNA editing, one of post-transcriptional regulation (Okuda, K., Myouga, F., Motohashi, R. Shinozaki, K., and Shikanai, T. (2008) conserveed domain structure of pentatricopeptide repeat proteins involved in chloroplast RNA editing. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • RNA editing activity of PPRTp protein in the plastid was examined.
  • PPRTp As a gene highly correlated with RpoTp protein in Examples 1 and 2, rpoB is known to be encoded by plastid DNA and transcribed by RpoTp protein. And RNA editing in the accD gene were examined.
  • RT-PCR was performed in the reaction solution shown in Table 8.
  • a template cDNA solution was prepared based on RNA extracted from a 14-day-old wild strain and a pprTp gene mutant. As a negative control, it was confirmed that the sequence was not amplified even when RNA that had not undergone reverse transcription was used as a template.
  • the RT-PCR product was purified using NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel).
  • PCR reaction was performed under the reaction solutions shown in Table 9 and the conditions shown in Table 10.
  • RNA editing efficiency The peripheral 4 bp including the RNA editing site of accD is a recognition sequence (TCGA) of the restriction enzyme TaqI. 500 bp before and after the editing site were amplified by RT-PCR using cDNA derived from the wild type and the ppr-Tp strain as templates. The RT-PCR product was treated with a restriction enzyme and subjected to acrylamide electrophoresis.
  • RT-PCR RNA extraction, DNase treatment, and reverse transcription reaction were carried out by the above-described methods to prepare cDNA solutions derived from wild strains and pprTp mutants.
  • genomic DNA extracted from a wild strain was also used.
  • RT-PCR was carried out using these as templates and the primers shown in Table 11 and the conditions shown in Tables 12 and 13.
  • As a negative control it was confirmed that the sequence was not amplified even when RNA not reverse-transcribed was used.
  • a 60 ⁇ l solution was prepared per sample and purified with NucleoSpin. Ethanol precipitation was performed and subjected to agarose gel electrophoresis to confirm a single band.
  • FIG. 5 shows the results of sequencing the RNA editing site
  • FIG. 6 shows the results of RNA editing efficiency.
  • RNA editing for accD mRNA did not occur at all in the pprTp gene mutant. That is, it can be said that the PPRTp protein functions for RNA editing of accD mRNA. And it is already known that proteins without this amino acid substitution have no ACCase activity in legumes (Sasaki Y, Kozaki A, Ohmori A, Iguchi H, Nagano Y. (2001) Chloroplast RNA editing required for functional acetyl-CoA carboxylase in plants. J Biol Chem. 276, 3937-40).
  • A Construction of transformant overexpressing PPRTp protein
  • Arabidopsis thaliana ecotype columnia hereinafter referred to as Colombia
  • Colombia Arabidopsis thaliana ecotype columnia
  • 70% (v / v) ethanol After removing ethanol, it was immersed in commercially available bleach (kitchen bleach (trade name), manufactured by Kobe Bussan RS Co., Ltd.) (2 times diluted) for 5 minutes.
  • the bleach was removed and washed three times with sterilized water, and then swollen with sterilized water.
  • Sterilized Colombian seeds were sown in 1 ⁇ MS medium and vernalized for 24 hours to grow.
  • DNA was extracted from a Colombian individual on the 8th day from the beginning. The operation followed the manual attached to the product. The final concentration of the obtained DNA solution was about 2 ⁇ g / ⁇ l (measured by ND-1000 (manufactured by NanoDrop)).
  • a PCR reaction was performed to amplify an insert consisting of a nucleotide sequence encoding pprTp (approximately 2.6 kb).
  • the reagent used was KOD-Plus (TOYOBO).
  • the reaction composition, reaction conditions and primers used are shown in Table 17, Table 18 and Table 19, respectively.
  • the obtained amplification product and a vector (pBI121, 13.0 kb) containing the CMV 35S promoter were subjected to restriction enzyme treatment.
  • the compositions of the reaction solutions are shown in Tables 20 and 21.
  • the concentration of the obtained DNA solution was 42.1 ng / ⁇ l for the vector pBI121 and 11.3 ng / ⁇ l for the PCR product as the insert.
  • DNA Ligation Kit Ver. 2.1 (TAKARA BIO INC.) was used, and the above-mentioned insert (about 2.6 kb) that was also restricted was placed on the 3 ′ end side of the CMV 35S promoter in pBI121 (about 13.0 kb) subjected to restriction treatment. Ligated.
  • the reaction solution composition used is shown in Table 22.
  • the above reaction solution was incubated at 16 ° C. for 30 minutes, and the whole amount was added to 100 ⁇ l of E. coli (DH5 ⁇ ) competent cell. After incubating on ice for 30 minutes, it was subjected to a heat shock at 42 ° C. for 45 seconds and returned to ice. This solution was added to 1 ml of SOC medium and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. The culture solution was inoculated on LB medium (kanamycin 30 ⁇ g / ml) and cultured at 37 ° C. overnight. The colonies of E.
  • LB medium kanamycin 30 ⁇ g / ml
  • coli cultured by ligation and transformation were cultured with shaking in 2 ml of LB medium (kanamycin 30 ⁇ g / ml) for 14 hours, and the plasmid obtained from the cells was used as a pBI-35S-pprTp solution. Restriction processing was performed using SmaI and XbaI, and it was confirmed that the target construct was constructed.
  • Agrobacterium containing the overexpression construct (Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain) was inoculated into 2 ml of LB medium (10 g tryptone, 5 g yeast extract, 5 g sodium chloride, pH 7.0) containing 12.5 ⁇ g / ml kanamycin. And overnight at 28 ° C. 1 ml of this culture was inoculated into 30 ml of LB medium containing 12.5 ⁇ g / ml of kanamycin, and cultured in an incubator at 28 ° C. until OD 600 was 2.0.
  • LB medium 10 g tryptone, 5 g yeast extract, 5 g sodium chloride, pH 7.0
  • Seeds were collected from the transformed plants, sterilized, and spread on MS medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin. After low-temperature treatment for 24 hours, transferred to an incubator at 23 ° C., it was grown under conditions of under continuous white light (50 ⁇ moles / m 2 / sec) . After growing for about 2 weeks, an individual (FIG. 3) showing kanamycin resistance was transplanted to Jiffy7 and further grown.
  • the amplified insert was analyzed by 0.8% agarose gel electrophoresis. It was confirmed that an insert of about 2.7 kb (including CMV 35S promoter partial length (about 0.1 kb) and pprTp (about 2.6 kb)) containing pprTp was inserted in the genome of the transformant.
  • the upper layer (n-hexane layer) was transferred to a gas chromatography minivial using a pipetman.
  • a mini vial was set on a heat block heated to 40 ° C., and the solvent (n-hexane) was completely volatilized.
  • 100 ⁇ l of dichloromethane was added, and the cap was closed and sealed while blowing nitrogen gas.
  • a 1000 ⁇ g / ml FAME mixed sample 21-component standard sample (GL Science Co., Ltd.) was diluted to 100 ⁇ g / ml or 500 ⁇ g / ml with dichloromethane and then injected into gas chromatography. Based on the area obtained from each, a calibration curve was created and the amount of fatty acid was calculated.
  • Table 24 shows the change in the amount of fatty acid shown from each peak shown in FIGS. C4, 6 and 8 (butyric acid, caproic acid and caprylic acid, respectively) were not detected in both wild-type and PPRTp protein overexpression strains.
  • the total amount of fatty acids (the total of C10 to 24) increased by 30% compared to the wild strain.
  • C10 capric acid
  • the present invention provides a method for improving the lipid-producing ability of plants such as rape and soybean, and a plant obtained by the method and seeds thereof, the food field using the plant oil obtained from the seeds, and the field of fuel production. Etc. are available.

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Abstract

　本発明によって、機能的な脂質合成酵素タンパク質またはそのサブユニットを発現する上で該タンパク質またはそのサブユニットをコードするｍＲＮＡに対してＲＮＡエディティングが行われることを必要とする植物に、 　　該ＲＮＡエディティングに関与するＰＰＲタンパク質をコードする遺伝子 　　ＮＥＰをコードする遺伝子 のいずれかまたは両方を導入することを特徴とする、植物における脂質産生を促進する方法、該方法によって得られる植物およびその種子が提供される。

Description

ＰＰＲＴｐ遺伝子を利用した植物脂質合成の促進法
　本発明は、植物における脂質産生を促進する方法、並びにその方法により得られる脂質産生能の高い植物およびその種子に関する。
　今日、石油資源の枯渇に対する懸念や環境問題への関心の高まりから、化石燃料に依存しない代替エネルギーに対する需要は飛躍的に高まりつつある。とりわけ、植物油を主な原料とするバイオディーゼル燃料（ＢＤＦ）はクリーンな燃料とされ、石油の代替燃料として有望視されている。しかし、ＢＤＦの需要が高まる一方で、その原料となるナタネ油、パーム油などの植物油の供給は十分でなく、これらの植物油の生産量を増加させるために農地確保を目的として森林伐採が行われたり、より収益性の高い植物性燃料の生産拡大のために食料生産が抑制されるなどの様々な問題が生じている。特に、後者は近年の発展途上国での急激な人口増加に伴う食料問題と相まって、世界規模での深刻な問題として捉えられている。
　そのため、食料としてのみならず、バイオディーゼル燃料の原料にもなる植物油の安定した供給を実現するために、植物油を得るためのより効率的な方法の開発が必要とされており、多くの試みがなされている。
　これまでに、交配等の品種改良によって脂質産生量の多い植物品種を作成する試みがなされている。これらの試みによってある程度の成果が得られているものの、その多くは未だ不十分といわざるを得ない。また、タバコにおいては、色素体遺伝子操作技術を用いて脂質産生増加を行う試みもなされているが（特許文献１を参照）、アブラナやダイズ等の植物においては、色素体遺伝子操作がいまだできず色素体をターゲットにした脂質産生増加に成功した例は見あたらない。
特開２００２－３３５７８６号公報 Page RA, Okada S, Harwood JL (1994) Acetyl-CoA carboxylase exerts strong flux control over lipid synthesis in plants. Biochem Biophys Acta 1210, 369-372 Kozaki, A., Kamada, K., Nagano, Y., Iguchi, H., and Sasaki, Y. (2000) Recombinant Carboxyltransferase Responsive to Redox of Pea Plastidic Acetyl-CoA Carboxylase. J. Biol. Chem. 275, 10702-10708
　本発明の解決課題は、遺伝子操作技術を用いて、アブラナやダイズ等の植物の色素体機能を亢進させて脂質産生能を向上させる方法を開発し、食料や燃料等の需要を満たす植物を得ることであった。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、機能的な色素体局在性脂質合成酵素タンパク質またはそのサブユニットを発現する上で、それらをコードするｍＲＮＡにＲＮＡエディティングが行われることを必要とする植物に、該ＲＮＡエディティングに関与するＰＰＲタンパク質をコードする遺伝子および／またはＮＥＰをコードする遺伝子を導入したところ、該植物において脂質産生能が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は下記に関するものである：
（１）機能的な脂質合成酵素タンパク質またはそのサブユニットを発現する上で、該タンパク質またはそのサブユニットをコードするｍＲＮＡに対してＲＮＡエディティングが行われることを必要とする植物に、
　　該ＲＮＡエディティングに関与するＰＰＲタンパク質をコードする遺伝子
　　ＮＥＰをコードする遺伝子
のいずれかまたは両方を導入することを特徴とする、植物における脂質産生を促進する方法；
（２）該脂質合成酵素タンパク質サブユニットがＡＣＣａｓｅタンパク質である（１）記載の方法；
（３）該ＲＮＡエディティングに関与するＰＰＲタンパク質をコードする遺伝子
　　　ＮＥＰをコードする遺伝子
の両方を導入することを特徴とする（１）または（２）記載の方法；
（４）機能的な色素体局在性マルチサブユニット型ＡＣＣａｓｅタンパク質のＣＴβサブユニットを発現する上で、ａｃｃＤ　ｍＲＮＡに対してＲＮＡエディティングが行われることを必要とする植物に、
　　ＰＰＲＴｐをコードする遺伝子（ｐｐｒＴｐ）
　　ＲｐｏＴｐをコードする遺伝子（ｒｐｏＴｐ）
のいずれかまたは両方を導入することを特徴とする、植物における脂質産生を促進する方法；
（５）ｐｐｒＴｐ、ｒｐｏＴｐの両方を導入することを特徴とする（３）記載の方法；
（６）該植物がアブラナ、ダイズ、マメおよびマツからなる群より選択される植物である（１）～（５）のいずれか記載の方法；
（７）ｐｐｒＴｐがアブラナ、ダイズ、マメおよびマツからなる群より選択される植物に由来するものである（６）記載の方法；
（８）ｐｐｒＴｐが脂質産生を促進すべき植物と同種の植物に由来するものである（７）記載の方法；
（９）ｒｐｏＴｐがアブラナ、ダイズ、マメおよびマツからなる群より選択される植物に由来するものである（５）記載の方法；
（１０）ｒｐｏＴｐが脂質産生を促進すべき植物と同種の植物に由来するものである（６）記載の方法；
（１１）ｐｐｒＴｐおよびｒｐｏＴｐが脂質産生を促進すべき植物と同種の植物に由来するものである（６）記載の方法；
（１２）ＲＮＡエディティングが、配列番号：１に示すシロイヌナズナのａｃｃＤ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の７９４番のＣ、またはシロイヌナズナ以外の種類の植物の場合にはａｃｃＤ　ｍＲＮＡ中の対応する位置のＣがＵに置換されるものである（１）～（１１）のいずれか記載の方法；
（１３）（１）～（１２）のいずれか記載の方法により得られる、脂質産生が促進された植物；
（１４）（１３）記載の植物の種子。
　本発明によれば、効率的な脂質の産生、さらには植物油およびバイオディーゼル燃料等の植物性燃料の安定した供給を可能にすることができる。
図１は、ＡＣＣａｓｅの反応を示すスキームである。図中、ＢＣＣＰは、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質を表す。 図２は、ＭＳ培地上で生育させたシロイヌナズナ野生型株、およびｐｐｒＴｐ遺伝子変異株の植物体の写真である。 図３は、ｒｐｏＴｐ遺伝子変異株の表現型を示す図である。Ａ～Ｃは、それぞれｒｐｏＴｐ遺伝子変異株のアルビノを示す芽生え（Ａ）、葉の形態異常（Ｂ）、および花茎（Ｃ）を示す。 図４は、制限酵素処理によるＲＮＡエディティング効率の解析を説明する図である。 図５は、ＲＮＡエディティング部位のシークエンスの結果を示す図である。 図６は、ＲＮＡエディティング効率を調べたアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。 図７は、ＰＰＲＴｐタンパク質過剰発現コンストラクトの構築スキームを示す。 図８は、野生株の葉から得られた試料のガスクロマトグラフィーによる分析結果を示す。 図９は、ＰＰＲＴｐタンパク質過剰発現株の葉から得られた試料のガスクロマトグラフィーによる分析結果を示す。
　一般に、植物油は植物の種子から得られるが、種子には貯蔵物質として脂質を利用する脂肪種子と、澱粉を利用する澱粉種子の二種類が存在する。脂肪種子で利用される脂質の主成分は脂肪酸であり、脂肪酸は、アセチルＣｏＡがアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）によってマロニルＣｏＡに変換された後（図１を参照）、種々の脂質合成酵素によって触媒されることで生成される。ＡＣＣａｓｅによるアセチルＣｏＡの変換は脂質合成の律速段階であり、植物における脂質合成はＡＣＣａｓｅの活性に依存して調節されていることが知られている（非特許文献１を参照）。植物において脂質産生能を促進するためには、ＡＣＣａｓｅの活性を増加させる必要がある。
　植物の脂質合成に関わるＡＣＣａｓｅは２種類存在することが知られており、それぞれ、色素体を含む色素体に局在するマルチサブユニット型ＡＣＣａｓｅと、主に細胞質に局在するマルチファンクション型ＡＣＣａｓｅである。マルチサブユニット型ＡＣＣａｓｅは、４つのサブユニット（それぞれビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、カルボキシルトランスフェラーゼαおよびβ（ＣＴαおよびβ）からなるが、ＡＣＣａｓｅの活性は細胞中でのＣＴβサブユニットの状態に依存することが報告されている（非特許文献２を参照）。
　ＡＣＣａｓｅのサブユニットのうち、ＣＴβを除く残りのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子は核ＤＮＡ中に存在するが、ＣＴβサブユニットをコードするａｃｃＤ遺伝子のみ色素体ＤＮＡ中に存在することが知られている。だが、一部の植物を除き、少なくともアブラナ科植物ではまだ色素体ＤＮＡへの遺伝子導入技術は確立されていない。そのため、脂質産生能の向上を目的として、色素体にコードされている遺伝子を直接のターゲットとして遺伝子操作技術を植物に適用することはいまだ限定的である。そのため、多くの植物においては、目的とするタンパク質、ＣＴβサブユニットの発現に関連した核にコードされている因子を対象に遺伝子操作を行うことが有効であると考えた。
　発明者らは、シロイヌナズナで約４５０種類存在するものの、その大部分がいまだ機能未解明であるＰＰＲ（pentatricopeptide repeat）タンパク質に着目した。植物のＰＰＲタンパク質は、Ｎ末端にオルガネラ移行タンパク質に特徴的なトランジットペプチド配列を有しており、大部分が色素体かミトコンドリアで機能していることが推定されている。一方、色素体において、ＤＮＡ中の遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、種々の成熟過程を経て翻訳される。これら成熟過程は一括して転写後調節といわれるが、転写後調節を受ける前の前駆体ＲＮＡのままでは翻訳されないケースや、翻訳されてもそのタンパク質は不活性型である例が知られており、転写後調節はとくに色素体での遺伝子発現プロセスに重要であるとされている。ＰＰＲモチーフに広く見られる性質として各ＰＰＲが特定のＲＮＡ配列に結合する可能性が示唆されており、すでに転写後調節に関与している例が近年次々と報告され始めている。転写後調節には複数の機構が存在するが、ＲＮＡプロセッシングやＲＮＡスプライシングと同じく、ＲＮＡエディティングも色素体における主要な転写後調節の１つとして挙げられる。この色素体でのＲＮＡエディティングは、すべてｍＲＮＡ配列中のＣをＵに変換する反応であることが知られている。
　発明者らは、その発現パターンが色素体の転写系のうち特に核コードＴ７ファージ型ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＰ）と高い相関性を示すＰＰＲタンパク質をデータベース上で検索し、それらの機能解析を行うべく鋭意研究を重ねたところ、シロイヌナズナＰＰＲタンパク質の１つ、ＰＰＲＴｐタンパク質がａｃｃＤ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列中のＣをＵに変換するＲＮＡエディティングに関与していることを明らかにした。ａｃｃＤ遺伝子は、核コードＴ７ファージ型ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＰ）によってのみ転写されることが知られている。これらのことから、細胞内でＰＰＲＴｐタンパク質およびＮＥＰを発現させることによって、色素体内でより多くの機能的なＡＣＣａｓｅを構築させ、その活性を上昇させることが可能になり、植物の脂質産生能を促進することができる。
　従って、本発明は、第１の態様において、機能的な脂質合成酵素タンパク質またはそのサブユニットを発現する上で該タンパク質またはそのサブユニットをコードするｍＲＮＡに対してＲＮＡエディティングが行われることを必要とする植物に、
　　該ＲＮＡエディティングに関与するＰＰＲタンパク質をコードする遺伝子
　　ＮＥＰをコードする遺伝子
のいずれかまたは両方を導入することを特徴とする、植物における脂質産生を促進する方法を提供する。
　本発明の方法により脂質産生が促進される植物は、機能的な脂質合成酵素タンパク質またはそのサブユニットを発現する上で該タンパク質またはそのサブユニットをコードするｍＲＮＡに対してＲＮＡエディティングが行われることが必要な植物であればいずれでもよい。例えば、アブラナ、ダイズ、マメおよびマツなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の機能的な脂質合成タンパク質は、脂質合成に関与しているタンパク質ならいずれでもよいが、好ましくは脂質合成経路の律速段階を触媒するＡＣＣａｓｅである。ＡＣＣａｓｅは、その構造上、マルチサブユニット型およびマルチファンクション型に分類されるが、いずれでもよい。本発明において、ＡＣＣａｓｅはマルチサブユニット型ＡＣＣａｓｅであってもよく、該ＡＣＣａｓｅのサブユニットはＢＣサブユニット、ＢＣＣＰサブユニット、ＣＴαまたはβサブユニットのいずれでもよいが、好ましくはＣＴβサブユニットである。本発明において、機能的とは所望の活性を有している状態にあることをいい、所望の効果を生じうる状態である。
　本発明のＰＰＲタンパク質としては、ＰＰＲタンパク質の構造上の特徴である３５アミノ酸をコードするＰＰＲモチーフとＣ末端側のＤＹＷモチーフを有するタンパク質であればいずれでもよいが、好ましくは転写後調節、より好ましくはＲＮＡエディティングに関与するＰＰＲタンパク質である。本発明において、ＰＰＲタンパク質はシロイヌナズナにおけるＰＰＲＴｐタンパク質であるか、またはシロイヌナズナ以外の種類の植物の場合には対応するＰＰＲタンパク質である。なお、本発明のシロイヌナズナＰＰＲＴｐタンパク質は配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、該タンパク質をコードする遺伝子（ｐｐｒＴｐ）は配列番号：３に示すヌクレオチド配列を有する。
　本発明のＲＮＡエディティングは、ＤＮＡ配列から転写されたＲＮＡ上の特定の部位において配列が変化させられることであって、ＲＮＡエディティングによって変化したＲＮＡに由来するタンパク質が所望の活性を有するものであればいずれでもよい。例えば、色素体におけるＲＮＡエディティングは、すべてＲＮＡのヌクレオチド配列中のＣがＵに置換されるものである。例えば、本発明のＲＮＡエディティングは、配列番号：１に示すシロイヌナズナのａｃｃＤ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の７９４番目のＣ、またはシロイヌナズナ以外の種類の植物の場合には、ａｃｃＤ　ｍＲＮＡ中の対応する位置のＣがＵに置換されるものであるが、これらに限定されるものではない。
　本発明のＲＮＡポリメラーゼとしては、ＲＮＡの転写開始部位にリクルートされ、ＲＮＡ伸長能を有するタンパク質であればいずれでもよいが、色素体の転写系に関与するＲＮＡポリメラーゼが好ましい。本発明において、色素体の転写系に関与するＲＮＡポリメラーゼとしては、核ＤＮＡにコードされるＴ７ファージ型ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＰ：nuclear-encoded RNA polymerase）と、色素体コード型ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＥＰ：plastid-encoded RNA polymerase）のいずれでもよいが、好ましくはＮＥＰである。ＲＮＡポリメラーゼがＮＥＰである場合、その局在はいずれでもよいが、好ましくは色素体に局在する。より好ましくは、ＮＥＰはシロイヌナズナにおけるＲｐｏＴｐタンパク質であるか、またはシロイヌナズナ以外の種類の植物の場合には対応するＲＮＡポリメラーゼである。なお、本発明のシロイヌナズナＲｐｏＴｐタンパク質は配列番号：４に示すアミノ酸配列を有し、該タンパク質をコードする遺伝子（ｒｐｏＴｐ）は配列番号：５に示すヌクレオチド配列を有する。
　本発明において、遺伝子はその変異体を包含し、変異体は元の変異していない遺伝子がコードするタンパク質と同等の活性を示すタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するものである。例えば、１ないし約３０個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されたヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもよい。あるいは、変異体は、一般に、シロイヌナズナ由来の遺伝子と少なくとも２０％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもよく、好ましくは４０％、より好ましくは５０％、さらに好ましくは６０％、もっとも好ましくは７０％以上（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％など）の相同性を有するヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもよい。あるいは、変異体は、変異していないヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもよい。
　上記ストリンジェントな条件としては、例えば、J. Sambrook et al., ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt’s solution）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中６８℃でプローブとハイブリダイズさせた後、洗浄条件を２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温から０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中６８℃まで変化させる条件、６５℃で、２×ＳＳＰＥ（Frederick M. Ausubel et al., ”Current Protocols in Molecular Biology”, 1987, John Wiley & Sons, Hoboken NJ.に記載）および０．１％　ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥおよび０．１％　ＳＤＳを含む溶液中でさらに１５分を２回、次に、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％　ＳＤＳを含む溶液中で１５分を２回の条件、または６５℃で、２×ＳＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳおよびホルムアミド（５～５０％）を含む溶液中で１５分を２回、０．５×ＳＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳおよびホルムアミド（５～５０％）を含む溶液中でさらに１５分を２回、次に、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳおよびホルムアミド（５～５０％）を含む溶液中で１５分を２回の条件などである。
　また、本発明において、タンパク質はその変異体を包含し、変異体は所望の活性を有するものであればいずれでもよい。例えば、変異体は、１または数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。あるいは、変異体は、一般に、シロイヌナズナ由来のタンパク質と少なくとも４０％の相同性を有するアミノ酸配列のタンパク質であってもよく、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、もっとも好ましくは９０％以上（例えば、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％など）の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
　該遺伝子を植物に導入する方法は、所望の効果を得ることのできる方法であればいずれでもよく、種々の方法が当業者に公知である。本発明において、遺伝子導入は植物の核ＤＮＡに対して行われる。該遺伝子導入方法として、例えば、アグロバクテリウムを用いたアグロバクテリウム媒介遺伝子導入法のほかに、目的の遺伝子を含むＤＮＡ断片を植物細胞に直接導入する種々の物理的方法および化学的方法であってもよい。物理的方法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法やマイクロインジェクション法が挙げられ、化学的方法としては、ポリエチレングリコールを用いる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、遺伝子導入により生じた形質転換細胞の選抜、および所望の植物体の獲得には、従来技術を用いてもよい。
　本発明において、所望の効果が得られる限り、該遺伝子はいずれかまたは両方使用してもよく、例えば、両方の遺伝子を使用してもよい。
　該遺伝子は、形質転換した植物細胞または植物体において、好ましくは過剰発現される。遺伝子を発現させるために形質転換されるべき植物由来の天然プロモーターを使用してもよいが、所望の発現量を得られる限りにおいて、他の種類の植物の対応するプロモーター、あるいは人工プロモーターのいずれを使用してもよい。上記天然プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、種子特異的に発現するナピンプロモーター、および果実果芯部特異的に発現するククミシンプロモーターなどが挙げられる。また、上記人工プロモーターとしては、特開２０００－１３９４７７に記載のプロモーターなどが挙げられる。
　本発明は、第２の態様において、本発明の方法により得られた脂質産生が促進された植物を提供する。
　本発明は、第３の態様において、本発明の方法により得られた上記植物の種子を提供する。
　以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
データベースを利用した遺伝子の検索と、種々の遺伝子変異株の解析
　発明者らは、ＡＴＴＥＤ（Arabidopsis thaliana trans-factor and cis-element prediction database）(http://www.atted.bio.titech.ac.jp/browsing.shtml)を利用して、生育段階、環境ストレス、ホルモン処理などに対して、色素体ＲＮＡポリメラーゼのうちＮＥＰと同様の遺伝子発現パターンを示す遺伝子を検索した。その結果、絞り込まれたｐｐｒＴｐ遺伝子などについて、各遺伝子にアグロバクテリウムＴ－ＤＮＡ（約１３ｋｂ）が挿入されたシロイヌナズナ変異候補株の種子をＳＩＧｎＡＬ（Salk Institute Genomic Analysis Laboratory，米国）から入手した。
　ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬）を利用して植物育成用のムラシゲ・スクーグ培地（ＭＳ培地，Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ，　１９６２）を作製した。また，種子を回収する目的での植物個体の育成には培養土Ｊｉｆｆｙ　７（ＡＳ　Ｊｉｆｆｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を利用した。顕微鏡観察には光学顕微鏡ＳＺＸ－１２（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用した。
　入手した種を滅菌処理後、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地に播種した。以降の記述で特に断りのない限り、ＭＳ固体培地には固化剤として０．５％ゲランガムを使用し、１％スクロースを添加した。
　種子を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノール　１ｍｌを加え洗浄した。エタノールを除いた後でブリーチ液（５０％市販ブリーチ、０．０２％トライトンＸ－１００）　５００μｌを加え、５分間放置して殺菌した。次に、ブリーチ液を除き、滅菌水で３回洗浄した。洗浄した後に滅菌水を適量加え、ピペットマンで種子を吸い上げてＭＳ培地上に植えた。播種したプレートを２４時間、約４℃で低温処理を行った。植物は連続白色光条件下、２２℃の恒温インキュベーターにて育成した。
　得られたシロイヌナズナ植物体のうち、Ｔ－ＤＮＡ特異的プライマーとｐｐｒＴｐ特異的プライマーのセットを用いたゲノミックＰＣＲでｐｐｒＴｐ遺伝子にＴ－ＤＮＡがホモジニアスに挿入した目的変異株は白色の表現型（図２を参照）を示した。さらにＮＥＰをコードするＲｐｏＴｐ遺伝子の欠損変異株以上に深刻な生育障害を示したこと（図３を参照）、ＰＰＲＴｐタンパク質が、色素体ＲＮＡポリメラーゼが転写する遺伝子の転写後制御に関与すると予測されることから、ＰＰＲＴｐタンパク質は、ＲｐｏＴｐタンパク質が転写するＰＥＰのコアサブユニット遺伝子、またはａｃｃＤ遺伝子の転写後調節に関わることが予測された。
ノザンブロット法による各タンパク質の発現解析
　ＰＰＲＴｐタンパク質の機能を推測するため、色素体にコードされている遺伝子のノザンブロット法による解析を行った。
（Ａ）ＲＮＡの抽出
　１サンプルあたり０．５ｇの植物サンプルを用いて、Ｓｅｐａｓｏｌ－ＲＮＡ処理、イソアミルアルコール沈殿、ＣＴＡＢ処理による多糖類の除去、次いでエタノール沈殿を行うことにより、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて測定した。約２μｌの抽出ＲＮＡ溶液を０．８％　アガロースのゲルで泳動し、分解が起こっていないことを確認した。
（Ｂ）ノザンブロット法による解析
（ａ）調製試薬の組成
　以下の試薬を用いた。
・２０×ＭＯＰＳバッファー
４００ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ
・３０×ＳＳＣ
０．４５Ｍ　クエン酸３ナトリウム２水和物、４．５Ｍ　塩化ナトリウム
・メチレンブルー染色液
０．５Ｍ　酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、０．０４％（ｗ／ｖ）メチレンブルー
・Ｎ－ラウロイルサルコシンストック
１０％（ｗ／ｖ）Ｎ－ラウロイルサルコシン
・ＳＤＳストック
１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ
・高ＳＤＳハイブリダイゼーションバッファー（ＨＳＨＢ）
５０％　ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０５Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）、０．１％（ｖ／ｖ）Ｎ－ラウロイルサルコシンストック、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ＳＤＳが溶解するまで溶液を加熱しながら攪拌した）
・低ストリンジェンシー洗浄バッファー
２×ＳＳＣ、０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳストック
・高ストリンジェンシー洗浄バッファー
０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳストック
・１０×洗浄バッファー
１Ｍ　トリス－塩酸（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ　塩化ナトリウム
・ブロッキングバッファー
１×洗浄バッファー、１％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）
・１０×検出バッファーＡ
１Ｍ　トリス－塩酸（ｐＨ９．５）、１Ｍ　塩化ナトリウム
・２０×検出バッファーＢ
１Ｍ　塩化マグネシウム
（ｂ）プローブの作製
　プローブの作製にはＤＩＧ　ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｍｉｘ　１０×ｃｏｎｃ．（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。使用したプライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表２で示す反応溶液を用いて、表３で示す反応条件下、第１の反応（ＰＣＲ）を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　ＰＣＲ産物を電気泳動に供した。シングルバンドであることを確認した後に、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をＤＩＧラベリングするために、表４で示す反応溶液を用いて、表５で示す反応条件下、第２の反応（標識）を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（ｃ）変性アガロース電気泳動
　純水１７９ｍｌにアガロース２ｇを加え、１２１℃で３０分間オートクレーブした。十分に冷ました後、２０×ＭＯＰＳバッファー　１０ｍｌ、ホルムアルデヒド　１１ｍｌを加えた。よく撹拌した後、ゲルメーカーに流し込みゲルを作製した。
　１レーンあたり１０μｇのＲＮＡをアプライするために、Ｍｉｃｒｏ　ｖａｃ（ＴＯＭＹ社）を用いてＲＮＡ溶液を２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。ＲＮＡを変性させるために、２０×ＭＯＰＳバッファー　０．５ｍｌ、ホルムアルデヒド　１．７５ｍｌ、ホルムアミド　５ｍｌを加えた。６０℃にて１０分間インキュベートした後、氷上で急冷した。そしてサンプルダイを２ｍｌ加え、１×ＭＯＰＳバッファーを用いて、４０分間電気泳動した。泳動後ホルムアミドを洗い流すため、ゲルを純水中で１０分間震盪させた。純水を新しいものに交換してさらに１０分間振盪した。
（ｄ）ブロッティング
　バキュームブロッティング装置（バイオクラフト社）を用いて、ナイロンメンブレン（Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ｐｌｕｓ，Ｐａｌｌ社）に転写した。転写中は効率よく転写させるため、またゲルおよびメンブレンが乾燥しないように１０×ＳＳＣで十分に浸した。９０分後に０．２Ｎ　ＮａＯＨでＲＮＡを固定した。これをスキャナで取り込み，１レーンあたりのＲＮＡアプライ量を確認した。メンブレンを乾燥させ、ハイブリバック（コスモバイオ）で密封して，検出時まで冷凍保存した。
（ｅ）ハイブリダイゼーションおよび検出
　ハイブリバック中にＨＳＨＢ　１０ｍｌを加え、５５℃で３時間振盪しながらプレハイブリダイゼーションを行った。その後プレハイブリダイゼーション液を捨て、同じ温度にて、ＨＳＨＢ　７ｍｌとプローブを加えたもので１０～１２時間ハイブリダイゼーションを行った。プローブ溶液を回収した後、メンブレンをプラスチック容器中で低ストリンジェンシー洗浄バッファー（１０分間振盪を２回）、高ストリンジェンシー洗浄バッファー（１５分間振盪を２回）で洗浄した。メンブレンを１×洗浄バッファーに浸して５分静置した後に、メンブレンをハイブリバッグに移し変え，ブロッキングバッファー　３０ｍｌとともに３０分間激しく振盪した。次いで、ブロッキングバッファーに抗ＤＩＧ抗体（Ａｎｔｉ－Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ＡＰ，Ｒｏｃｈｅ）を１／５０００（ｖ／ｖ）で加えた溶液と交換し、４５分間激しく振盪した。その後、洗浄バッファーでメンブレンを洗浄し、検出バッファー（１×検出バッファーＡ、１×検出バッファーＢ混合液）中で１０分間穏やかに振盪した後、ラップ上にメンブレンを置き、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（Ｒｏｃｈｅ）をメンブレンの検出面全体に滴下してからパックし、３７℃にて１０分間インキュベートした。そしてこれを化学発光検出装置ＦＡＳ－１０００（ＴＯＹＯＢＯ）で検出した。
　表６に、ノザンブロット法による解析の結果を示す。ＮＥＰのみに依存して転写されるａｃｃＤの転写産物量は変動せず、ＰＥＰのコアサブユニットをコードする遺伝子（ｒｐｏＢ）の転写産物量は増加していること、ＮＥＰによる転写の寄与の割合が大きい遺伝子ｃｌｐＰ、ｒｐｌ１６の転写産物量も増加していることから、ｐｐｒＴｐ変異株では少なくともＮＥＰによる転写は抑制されていないことが示唆される。実施例１の結果を踏まえると、ＰＰＲＴｐタンパク質はＮＥＰによる遺伝子の転写そのものではなく、転写後のプロセス、つまり転写後調節に関与しているものと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
ＰＰＲＴｐタンパク質によるＲＮＡエディティングの解析
　発明者らは、蛍光タンパク質であるＧＦＰをＰＰＲＴｐタンパク質のトランジットペプチド部位に連結して細胞内で発現させたところ、色素体内に局在することを確認しており、ＰＰＲＴｐタンパク質は色素体で機能していると言える。また、ＰＰＲＴｐタンパク質のＣ末端側にあるＤＹＷモチーフが転写後調節の１つ、ＲＮＡエディティングに関与している可能性が報告されている（Okuda, K., Myouga, F., Motohashi, R., Shinozaki, K., and Shikanai, T. (2008) Conserved domain structure of pentatricopeptide repeat proteins involved in chloroplast RNA editing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 8178-8183を参照）。そこで、色素体におけるＰＰＲＴｐタンパク質のＲＮＡエディティング活性について検討した。シロイヌナズナの色素体ゲノムでは、ＲＮＡエディティングが行われる部位が約３０箇所あることが知られている。発明者らは、実施例１および２においてＰＰＲＴｐがＲｐｏＴｐタンパク質と高い相関性をもつ遺伝子として選抜したことから、特に、色素体ＤＮＡにコードされ、ＲｐｏＴｐタンパク質によって転写されることが知られているｒｐｏＢおよびａｃｃＤ遺伝子におけるＲＮＡエディティングについて検討した。
（Ａ）エディティング部位の解析
　野生株とｐｐｒＴｐ遺伝子変異株でのＲＮＡのエディティングを比較するため、両者のｃＤＮＡを鋳型に、ＲＮＡエディティング部位の上流３００ｂｐと下流２００ｂｐ、合計５００ｂｐをＲＴ－ＰＣＲで増幅させた。
（ａ）ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマーを表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　ＲＴ－ＰＣＲは表８に示す反応溶液中で行った。鋳型となるｃＤＮＡ溶液は１４日齢の野生株とｐｐｒＴｐ遺伝子変異株から抽出したＲＮＡを元に作製した。また、ネガティブコントロールとして、逆転写反応をしていないＲＮＡを鋳型に用いても配列は増幅されないことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　このＲＴ－ＰＣＲ産物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔ　ＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用して精製した。
（ｂ）ダイターミネーター法によるシークエンスのためのＰＣＲ反応
　ダイターミネーター法によるシークエンスはＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いた。
　ＢｉｇＤｙｅは４倍希釈して用いた。ＲＴ－ＰＣＲ反応液を解凍後、１．５倍容のＡＢＩ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒと０．５倍容の滅菌水で希釈した。これをＰＣＲ反応用チューブ１本あたり３μｌ分注した。表９に示す反応溶液、表１０に示す条件下、ＰＣＲ反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 （ｃ）ＰＣＲ産物の精製
　反応後のチューブに、３Ｍ　酢酸ナトリウム：１００％エタノール：ＭｉｌｌｉＱ水＝３０：６００：１８０の比率で混ぜた溶液４０μｌを加えて、１５分間室温で放置した。チューブを室温で２０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心した。上清を取り除いた後、７０％エタノール５０μｌを加え、５分間、１３，０００ｒｐｍで遠心を行った。上清をアスピレーターで除去し、１０分間自然乾燥させた。
（ｄ）ＰＣＲ産物の溶解と解析
　上記乾燥サンプルにＨｉＤｉＦｏｒｍａｍｉｄを２０μｌ加え、全量をＡＢＩ３１３０キャピラリーシークエンサーに供し、塩基配列の確認とＲＮＡエディティングの有無および効率を解析した。
（Ｂ）ＲＮＡエディティング効率の解析
　ａｃｃＤのＲＮＡエディティング部位を含む周辺４ｂｐは、制限酵素ＴａｑＩの認識配列（ＴＣＧＡ）である。エディティングサイトの前後５００ｂｐを、野生株とｐｐｒ－Ｔｐ株由来のｃＤＮＡをそれぞれ鋳型に、ＲＴ－ＰＣＲで増幅させた。ＲＴ－ＰＣＲ産物を制限酵素処理し、アクリルアミド電気泳動に供した。
（ａ）ＲＴ－ＰＣＲ
　ＲＮＡの抽出、ＤＮａｓｅ処理、逆転写反応は上記の方法で行い、野生株とｐｐｒＴｐ変異株由来のｃＤＮＡ溶液を作製した。またポジティブコントロールとして野生株から抽出したゲノムＤＮＡも用いた。これらを鋳型に表１１に示すプライマー、表１２および表１３に示す条件でＲＴ－ＰＣＲを行った。なお、ネガティブコントロールとして、逆転写していないＲＮＡを用いても、配列は増幅されないことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 　１サンプルあたり６０μｌの溶液を作製し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎで精製した。エタノール沈殿を行い、アガロースゲル電気泳動に供してシングルバンドを確認した。
（ｂ）制限酵素処理
　制限酵素処理は表１４に示す条件で、６５℃にて６時間を行った。反応はＰＣＲチューブ内で行い、インキュベートにＰＣＲ装置ｌｉｇｈｔ　ｇｅｎｅ（Ｂｉｏ　Ｆｌｕｘ）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（Ｃ）アクリルアミドゲル電気泳動
　表１５および１６に示す組成で１５％のアクリルアミドゲル作製し、電気泳動した。アクリルアミドゲル電気泳動にて分離した断片を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 　作製したゲルに１レーンあたりサンプル１５μｌをアプライした。またネガティブコントロールとして、制限酵素未処理のＲＴ－ＰＣＲ産物６．５μｌをアプライした。
　図５にＲＮＡエディティング部位のシークエンス結果、図６にＲＮＡエディティング効率の結果を示す。
　ｐｐｒＴｐ遺伝子変異株ではａｃｃＤ　ｍＲＮＡの７９４番目の塩基のＣからＵへの変換が起きておらず、その結果２６５番目のアミノ酸がロイシンにならず、ゲノム情報にコードされたセリンのままであることが明らかとなった。異なるクローンのｐｐｒＴｐ遺伝子変異株を定量的に評価したシークエンスにおいても同様の結果となった。また、ゲノムＤＮＡとｐｐｒＴｐ遺伝子変異株のｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ産物を制限酵素処理すると、２４ｂｐ長のバンドを検出できた。一方、野生株のｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ産物を制限酵素処理しても２４ｂｐ長のバンドは検出できず、代わりに９３ｂｐのバンドが特異的に検出できた。このことから、ｐｐｒＴｐ遺伝子変異株において、ａｃｃＤ　ｍＲＮＡに対するＲＮＡエディティングは全く起きていないことが明らかになった。つまり、ＰＰＲＴｐタンパク質がａｃｃＤ　ｍＲＮＡのＲＮＡエディティングに機能しているといえる。そしてマメにおいてこのアミノ酸置換が起こっていないタンパク質はＡＣＣａｓｅ活性を全く持たないことがすでに知られている（Sasaki Y, Kozaki A, Ohmori A, Iguchi H, Nagano Y. (2001) Chloroplast RNA editing required for functional acetyl-CoA carboxylase in plants. J Biol Chem. 276, 3937-40を参照）。
ＰＰＲＴｐタンパク質を過剰発現する形質転換体の作製
（Ａ）ＰＰＲＴｐ過剰発現用コンストラクトの構築
　図７に示すように、ＰＰＲＴｐ過剰発現用コンストラクトを構築した。
　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｅｃｏｔｙｐｅ　ｃｏｌｕｍｂｉａ（以下、コロンビアという）の種子を、７０％（ｖ／ｖ）のエタノールに５分間浸した。エタノールを除去した後に、市販のブリーチ（キッチンブリーチ（商品名）、株式会社神戸物産ＲＳ社製）（２倍希釈したもの）に５分間浸した。ブリーチを除去し滅菌水で３回洗浄した後で、滅菌水で膨潤させた。滅菌したコロンビアの種子を１×ＭＳ培地に播種し、春化処理を２４時間行い、生育させた。
　ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ　ＣＯ．，ＬＴＤ．）を用いて、芽生えから８日目のコロンビア個体からＤＮＡを抽出した。操作は製品に添付されたマニュアルに従った。得られたＤＮＡ溶液の終濃度は、約２μｇ／μｌ（ＮＤ－１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ社製）によって測定）であった。
　ｐｐｒＴｐをコードするヌクレオチド配列からなるインサート（約２．６ｋｂ）を増幅するために、ＰＣＲ反応を行った。試薬はＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。用いた反応組成、反応条件およびプライマーを表１７、表１８および表１９にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 　得られた増幅産物およびＣＭＶ　３５Ｓプロモーターを含むベクター（ｐＢＩ１２１、１３．０ｋｂ）を制限酵素処理に供した。反応溶液の組成を表２０および２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
 　３０℃で３時間反応させた後で、６５℃で１分間インキュベーションして、ＳｍａＩを失活させた。ＸｂａＩ（１０Ｕ／μｌ）１μｌを加え、３７℃で４時間反応させた。反応液を０．８％アガロースゲルの電気泳動に供し、目的のサイズのバンド（それぞれ、約２．６ｋｂおよび約１３．０ｋｂ）のみを切り出した。切り出したゲルからＵｌｔｒａＣｌｅａｎ　１５　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｆｒｏｍ　Ｇｅｌｓ　ａｎｄ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＭＯ　ＢＩＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して制限処理物を精製した。操作はキットに添付されたプロトコールに従って行った。得られたＤＮＡ溶液の濃度は、ベクターであるｐＢＩ１２１が４２．１ｎｇ／μｌ、インサートであるＰＣＲ産物が１１．３ｎｇ／μｌであった。
　ライゲーション反応の試薬としてＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．１（ＴＡＫＡＲＡ　ＢＩＯ　ＩＮＣ．）を使用し、制限処理に供したｐＢＩ１２１（約１３．０ｋｂ）中のＣＭＶ　３５Ｓプロモーターの３’末端側に、同じく制限処理した上記インサート（約２．６ｋｂ）をライゲーションした。用いた反応溶液組成を表２２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 　上記の反応溶液を１６℃で３０分間インキュベーションし、全量を１００μｌの大腸菌（ＤＨ５α）コンピテントセルに加えた。氷上で３０分間インキュベートした後で、４２℃で４５秒間ヒートショックに供し、氷上に戻した。この溶液を１ｍｌのＳＯＣ培地に加え、３７℃で１時間振盪培養した。培養液をＬＢ培地（カナマイシン３０μｇ／ｍｌ）に播種し、３７℃で一晩培養した。
　ライゲーション・形質転換を行い培養した大腸菌のコロニーを、ＬＢ培地２ｍｌ（カナマイシン３０μｇ／ｍｌ）で１４時間振盪培養し、菌体から得られたプラスミドをｐＢＩ－３５Ｓ－ｐｐｒＴｐ溶液とした。ＳｍａＩおよびＸｂａＩを用いて制限処理し、目的のコンストラクトが構築できたことを確認した。
（Ｂ）シロイヌナズナ形質転換体の作製
　アグロバクテリウムのコンピテントセル１００μｌに対して上記ｐＢＩ－３５Ｓ－ｐｐｒＴｐ　１μｇを加え、１５分間氷上静置した。その後、ＬＢ培地２ｍｌの中に加えて２８℃で２時間回復培養を行い、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に塗布し、２日間２８℃で培養した。
　形質転換する植物として、コロンビア株を、半径４２ｍｍのＪｉｆｆｙ７（ＡＳ　Ｊｉｆｆｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｒｓ社製培養土）に３個体ずつ、２５℃の植物栽培室で連続白色光下（６６μｍｏｌｅｓ／ｍ２／ｓｅｃ）の条件で生育させた。コロンビアが抽台（およそ４０日程度）し、つぼみを付け出す頃に、ｆｌｏｗｅｒ　ｄｉｐ法により形質転換を行った。
　過剰発現コンストラクトを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＥＨＡ１０５株）を１２．５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母抽出液５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）２ｍｌに植菌し、２８℃で一晩培養した。この培養液をカナマイシン１２．５μｇ／ｍｌ含む３０ｍｌのＬＢ培地に１ｍｌ植菌し、２８℃のインキュベーターでＯＤ６００が２．０になるまで培養した。次にこの培養液から菌体を集菌し、集菌した菌を０．０３％のＳｉｌｗｅｔ　Ｌ－７７を含む５％スクロース溶液１２０ｍｌで再懸濁した。この菌液をビニール袋にいれ、植物体を菌液に浸し、袋の上からつぼみを指で軽く押しながら１０秒間浸した。密閉できる容器に水で湿らせたキムタオルを敷き、植物体を置いてふたをして湿度の高い状態にして、暗所で２４時間放置した。２４時間後に植物体を蒸留水で洗い、植物栽培室に戻し、種が回収できるまで育種した。
　形質転換を行った植物から種子を回収し、種子の滅菌操作を行い、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＭＳ培地にまいた。２４時間の低温処理後、２３℃のインキュベーターに移し、連続白色光下（５０μｍｏｌｅｓ／ｍ２／ｓｅｃ）の条件で生育させた。２週間程度育成した後で、カナマイシン耐性を示した個体（図３）をＪｉｆｆｙ７に植え替え、さらに生育させた。
（Ｃ）形質転換の確認
　得られた形質転換候補株中のｐｐｒＴｐを含むインサーションを確認するために、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ　ＣＯ．，ＬＴＤ．）を用いて、芽生えから４０日目の形質転換候補株の葉からDNAを抽出した。操作は製品に添付のマニュアルに従った。インサートを増幅するために、得られたゲノムを用いてＰＣＲ反応を行った。試薬はＫＯＤ　Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。また、ネガティブコントロールとして、野生株の葉を用いて同様の操作を行った。ＰＣＲの反応組成、反応条件および用いたプライマーのヌクレオチド配列を、表２３、２４および２５にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
 　増幅したインサートを０．８％アガロースゲル電気泳動にて分析した。形質転換株のゲノム中にｐｐｒＴｐを含む約　２．７ｋｂのインサート（ＣＭＶ　３５Ｓプロモーター部分長（約０．１ｋｂ）およびｐｐｒＴｐ（約２．６ｋｂ）からなる）が挿入されていることを確認した。
（Ｄ）脂肪酸の抽出および測定
　野生株と得られた形質転換株それぞれの個体から葉を１０ｍｇ程度切りとった。ネジ口試験管に塩酸メタノールを５００μｌずつ分注し、切り取った葉をそれぞれ完全に浸し、キャップを強く締めた。８０℃に設定したヒートブロック上で１時間加温し、葉中の脂肪酸のメチルエステル化を行った。その後、室温で十分に冷却させ、５００μｌの０．９％食塩水と２００μｌのｎ－ヘキサンを各試験管に加え、ボルテックスにより５秒間激しく攪拌した。水層とｎ－ヘキサン層が完全に分離するまで静置した後に、ピペットマンを用いて上層（ｎ－ヘキサン層）をガスクロマトグラフィー用ミニバイアルに移した。４０℃に加温したヒートブロック上にミニバイアルをセットし、溶媒（ｎ－ヘキサン）を完全に揮発させた。室温で十分に冷却させた後で、１００μｌのジクロロメタンを加え、窒素ガスを吹き付けながらキャップを閉めて封入した。
　ガスクロマトグラフィーはＧＣ－４０００（ジーエルサイエンス社製）を用いて行い、キャピラリーカラムとしてＵＬＢＯＮ　ＨＲ－ＳＳ－１０　５０ｍ×０．２５ｍｍφ（信和化工株式会社社製）を使用した。分析条件等を表２３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
 　また、１０００μｇ／ｍｌのＦＡＭＥ混合試料２１成分標準試料（ジーエルサイエンス社）をジクロロメタンで１００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌに希釈した後に、それぞれガスクロマトグラフィーにインジェクションした。それぞれから得られた面積を元に、検量線を作成し、脂肪酸量を算出した。
　得られた結果を図８および９に示す。図７および８にて示された各ピークから示される脂肪酸量の変化を表２４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
 　Ｃ４、６および８（それぞれブチル酸、カプロン酸およびカプリル酸）は、野生株およびＰＰＲＴｐタンパク質過剰発現株の両方で検出されなかった。ＰＰＲＴｐタンパク質過剰発現株において、脂肪酸総量（上記Ｃ１０～２４の合計）が野生株と比較して３０％増加した。特に、野生株ではほとんど検出されなかったＣ１０（カプリン酸）が顕著に増加した。
　本発明は、アブラナやダイズ等の植物の脂質産生能を向上させる方法、および該方法によって得られる植物およびその種子を提供するものであり、該種子から得られる植物油を用いる食品分野、燃料生産分野などにおいて利用可能である。
SEQ ID NO: 6-26; PCR Primer

Claims (14)

  1. 　機能的な脂質合成酵素タンパク質またはそのサブユニットを発現する上で、該タンパク質またはそのサブユニットをコードするｍＲＮＡに対してＲＮＡエディティングが行われることを必要とする植物に、
    　　該ＲＮＡエディティングに関与するＰＰＲタンパク質をコードする遺伝子
    　　ＮＥＰをコードする遺伝子
    のいずれかまたは両方を導入することを特徴とする、植物における脂質産生を促進する方法。
  2. 　該脂質合成酵素タンパク質がＡＣＣａｓｅタンパク質である請求項１記載の方法。
  3. 　該ＲＮＡエディティングに関与するＰＰＲタンパク質をコードする遺伝子
    　ＮＥＰをコードする遺伝子
    の両方を導入することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
  4. 　機能的な色素体局在性マルチサブユニット型ＡＣＣａｓｅタンパク質のＣＴβサブユニットを発現する上で、該酵素サブユニットをコードするｍＲＮＡ（ａｃｃＤ　ｍＲＮＡ）に対してＲＮＡエディティングが行われることを必要とする植物に、
    　　ＰＰＲＴｐをコードする遺伝子（ｐｐｒＴｐ）
    　　ＲｐｏＴｐをコードする遺伝子（ｒｐｏＴｐ）
    のいずれかまたは両方を導入することを特徴とする、植物における脂質産生を促進する方法。
  5. 　ｐｐｒＴｐ、ｒｐｏＴｐの両方を導入することを特徴とする請求項３記載の方法。
  6. 　該植物がアブラナ、ダイズ、マメおよびマツからなる群より選択される植物である請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　ｐｐｒＴｐがアブラナ、ダイズ、マメおよびマツからなる群より選択される植物に由来するものである請求項６記載の方法。
  8. 　ｐｐｒＴｐが脂質産生を促進すべき植物と同種の植物に由来するものである請求項７記載の方法。
  9. 　ｒｐｏＴｐがアブラナ、ダイズ、マメおよびマツからなる群より選択される植物に由来するものである請求項５記載の方法。
  10. 　ｒｐｏＴｐが脂質産生を促進すべき植物と同種の植物に由来するものである請求項６記載の方法。
  11. 　ｐｐｒＴｐおよびｒｐｏＴｐが脂質産生を促進すべき植物と同種の植物に由来するものである請求項６記載の方法。
  12. 　ＲＮＡエディティングが、配列番号：１に示すシロイヌナズナのａｃｃＤ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の７９４番のＣ、またはシロイヌナズナ以外の種類の植物の場合にはａｃｃＤ　ｍＲＮＡ中の対応する位置のＣがＵに置換されるものである請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項記載の方法により得られる、脂質産生が促進された植物。
  14. 　請求項１３記載の植物の種子。
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