CN1346408A - 改变植物开花时间的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供开花基因座(FLC)基因家族的基因鉴定,并利用有关信息来调节植物开花的时间。这一信息可用来生成转基因植物,其开花时间被选择性地改变。由于这些基因原本的作用是延迟开花,所以,增强FLC蛋白质的活性将延迟开花时间,抑制FLC活性则将开花时间提前。本发明描述了该基因家族一定数量的样品,具有一定代表性。本发明证明,该基因家族的成员在其他品种的植物中同样有效。

Description

改变植物开花时间的方法

                      相关申请

本申请要求1999年2月25日临时申请No.60/121,572和1999年3月9日临时申请No.60/123,455的优先权。

              有关政府资助研究或开发的声明

待定。

                     发明领域

本发明涉及通过基因工程改变植物的开花时间。具体地说，本发明涉及通过操控开花基因座(FLC)基因家族的活性来控制开花时间。

                     发明背景

植株由营养性生长转向开花是植株生命周期中一个重要的发育转变。开花的开始时间对于野生型植物的成功繁殖至关重要，大多数植物都已进化形成了可准确调节开花时间的系统。这些系统同时监测环境信号和植物的发育状态，从而控制开花过程。

所监测的两种常见环境信号是光周期和温度。在光周期响应性植物中，由叶子感知日照时间，开花信号似乎是由叶子转移到分生组织的(Zeevaart，光与开花过程，Process，eds.，D.Vince-Prue，B.Thomas&K.E.Cockshull，137-142，AcademicPress，Orlando，1984)。低温可通过被称为春化作用的过程促进开花。春化直接作用于分生组织，可能是通过使得它们能够认知开花信号发挥作用(Lang，植物生理学百科，ed.，W.Ruhland，15(第1部分)，1371-1536，Springer-Verlag，Berlin，1965)。其他可影响开花的环境信号包括光的质量和营养状况。

植物的发育状态也会影响开花时间。大多数植物都会经历一个开花被抑制的不成熟期，最后过渡到成熟期，此时植物已具备了开花的条件(Poethig，科学，250，923-930，1990)。“阶段转变”使得植物可达到适当的大小以适合开花繁殖。

在谈到开花时，发育性的开花途径通常指自发性的，以表示与环境改变无关。然而，自发性和环境性途径不可能完全割裂。例如，烟草中的日-中性品种在形成一定数量结瘤后开花，因而可归为完全通过自发途径开花的品种，但是，嫁接研究发现，日-中性和光周期响应性烟草对类似的可转移开花信号有响应(Lang等，美国科学院院报，74，2412-2416，1977；McDaniel等，植物杂志，9，55-61，1996)。因此，这些途径潜在的生物化学反应似乎是保守性的。

对几个品种的基因分析已鉴定到了影响开花时间的基因。对开花时间基因最广泛的基因研究是对拟南芥进行的。在拟南芥中，曾用两种方法鉴定了开花时间基因。方法之一是在早开花的品种内诱导会影响开花时间的突变。这样的突变会延迟开花，或使得开花更早。延迟开花的突变鉴定其野生型作用为促进开花的基因，提早开花突变鉴定抑制开花的基因。以拟南芥进行的研究已鉴定了20个以上经突变可特异性地影响开花时间的基因座，以及影响开花又影响其他发育过程的其他几个基因座(例如，det2，copl，gal和phyB)(Koornneef等，植物生理学植物分子生物化学年度回顾，49，345-370，1998；Weigel，遗传学年度回顾，29，19-39，1995)。

鉴定开花时间基因的另一种方法是确定自然发生的开花时间改变的基因基础。虽然实验室常用的拟南芥品种是早开花型的，但大多数拟南芥是晚开花型的。晚开花品种与早开花品种的区别之一在于，晚开花品种在两个基因座：FRIGIDA(FRI)开花基因座(FLC)处具有抑制开花的显性等位基因(Sanda等，植物生理学，111，641-645，1996；Lee等，植物学杂志，6，903-909，1994；Clarke等，分子基因遗传学，242，81-89，1994；Koornneef等，植物学杂志，6，911-919，1994)。

对开花时间突变株和对开花时间自然改变的生理学研究发现，在拟南芥中，开花受到多种途径的控制(Koornneef等，植物生理学植物分子生物学年度回顾，49，345-370，1998)。一组晚开花突变体(fca，fpa，fve，fy，ld)和含有晚开花FLC和FRI等位基因的植株表现为在诱导条件下(长日照)开花延迟，日照短时，则延迟更严重。对这些晚开花品系的春化可抑制晚开花表型。另一组晚开花突变体(co，fd，fe，fha，ft，fwa，gi)在短日照和长日照条件下培养的开花时间几乎没有差异。而且，该组对春化也几乎没有反应。同组双突变株与单突变亲本相比，开花并未显著延迟，但各组一个的双突变株则开花迟于单突变的亲本(Koornneef等，遗传学，148，885-92，1998)。因此，似乎存在着平行的开花途径，介导对于环境和发育信号的开花响应。光周期途径在长日照时促进开花。文献中称为自发性的途径(因为光周期响应不受途径中突变的影响)似乎控制着开花的年龄，更具体地说是能够开花发育阶段。最近有信息可支持该途径在发育方面的作用，即，自发性途径突变株表现出诸如毛状体改变之类变化，表明这样的突变株由不成熟向成熟的转变延迟(Telfer等，发育，124，645-654，1997)。

因fca，fpa，fve，fy，ld等位基因突变或因存在显性的晚开花FLC和FRI等位基因而造成的自发性途径阻滞可被春化作用避绕(Koornneef等，植物生理学植物分子生物学年度回顾，49，345-370，1998)。因此，可将FLC和FRI看作造成春化需求的基因。其他品种，尤其是芜菁，似乎有着与拟南芥相同的“周期”。在对芜菁内开花显性抑制和春化剂之间关系的分析中，对这种相似性进行了最全面的分析。油籽蔓菁和芜菁一年生品种和两年生品种的主要区别来自于控制春化响应性开花时间的基因(Osborn等，美国遗传学协会，146，1123-1129，1997)。比较蔓菁和芜菁一年生和两年生品种分离种群的数量性状基因座(QTL)发现，2个主要QTL赋予蔓菁春化响应性晚开花特征，芜菁可能也是如此(Osborn等，美国遗传学协会，146，1123-1129，1997)。在芜菁中，这两个开花时间QTL在重组近交种群中是分开的，对开花时间影响最大的QTL是VFR2(芜菁2中的春化响应性开花时间)。而且，VFR2似乎对应于拟南芥的FLC：用杂交探针制定VFR2的高分辨率图谱，由此可在晚期等位基因渗入早开花一年生品种后进行拟南芥和芜菁之间的比较，只有对应于FLC的探针监测到VFR2(＜0.44cm)没有发生重组，这说明VFR2是FLC的类似物。

开花时间对农业和园艺来说至关重要。园艺作物通常以其花朵作为产品。例如稻米、小麦、玉米、大麦和燕麦等食物、饲料或纤维作物，以及大豆、低芥酸菜籽和棉花等双子叶植物，以及向日葵、西红柿、椰菜及其他豆科植物，通常以它们的花朵或开花后的结果--果实、种子或种荚作为产品。了解开花时间调控的分子机制将可以通过基因操作改变开花时间，优化花朵、果实和种子的生产。例如，在某些作物中提早开花将可以在生长季节过短的地区种植该作物，或者在目前只可以种植一种作物的地区种植多种作物。

在另一些作物中，有用的是植株的非开花部分。在这样的作物中，避免或延迟开花时间可提高这些有用部分的得率。此类植物的例子包括紫花苜蓿和三叶苜蓿等饲料，卷心菜等芥菜、菠菜和莴苣等蔬菜。在甜菜或土豆等使用地下部分的作物中，延迟或避免开花可提高得率。而且，避免甜菜开花还可以使得能量更多地用于产糖。同理，延迟开花也可以提高木料或植株体作物的得率。因此，理解开花时间控制的分子机制不仅有必要，而且具有重要意义。

                        发明概述

本发明包括了一族基因，即开花基因座(FLC)基因，它们是开花抑制的重要调控因素。本发明包括这些基因的DNA序列，及这些基因表达的多肽和蛋白质。

本发明还涉及转基因植物，它们因具有影响FLC蛋白质活性的水平及时机的转基因，与同种的非转基因植株相比改变了开花特性。

本发明的目的之一是提供可创造出新的植物品种的一种工具，从而可改变植物的开花时间。可根据种植者的需要，通过改变植物内FLC基因的水平，将开花时间提前或延迟。

这可以使得植物经修饰而变得非常有用。因为开花是开花植物一个重要生理阶段，所以，能够控制开花时间将可以促进其营养性生长或开花，从而更复合需要。

通过以下说明和附图，本发明的其他优点和特征将变得更明显。

                      附图简述

图1是植物基因中MADS盒成员之间相关程度的系统发生图。

详细描述

本发明涉及植物开花基因座(FLC)基因家族基因的核苷酸和蛋白质序列。如后文所述，植物的基因组内通常有一个以上FLC基因。然而，FLC基因之间相似或同源。本发明发现：用这些基因可产生改变开花特征的转基因植物。有了本发明对FLC基因的认识，就可以通过抑制FLC活性提早转基因植物的开花时间，或通过提高FLC活性延迟开花时间。这就为种植者和育种者提供了一种独特的工具，从而可改变作物的开花时间特征使之更符合种植者的需要。

以下是几个FLC基因的核苷酸序列和氨基酸序列。本发明的工作是由从拟南芥中分离出基因FLC1并进行测序开始的。利用这一信息以及其他基因信息发现了后文中的其他几个FLC基因。结果发现，拟南芥(因为其基因组是植物中最小的之一，所以在植物遗传实验室中研究较多)具有至少3个FLC基因，在此称为FLC1，FLC2和FLC3。利用拟南芥中这3个FLC基因的信息，目前已鉴定了芸苔属的2个FLC基因。这些基因有几个特征与所有其他植物的FLC基因是共同的。

FLC基因属于一类所谓MADS盒基因。MADS盒是一段高度保守的基序，为一组进化相关转录因子所共有。MADS是首次鉴定出具有MADS盒共有序列区的原基因的首字母缩写。至今已鉴定到许多MADS盒基因，目前正致力于进一步将这些基因区分成亚组。在植物中，MADS盒基因被认为影响着植物发育的许多方面，包括结构性发育。本发明鉴定的2个FLC基因(拟南芥FLC2和FLC3)曾是过去拟南芥基因组测序的一部分，但是其功能是此前未知的。

图1采用了原由Martin Yanofsky和Elean Alvarez-Buylla，UC San Diego汇总的数据，是说明迄今为止在拟南芥和玉米中鉴定的MADS盒蛋白质之间相关程度的系统发生树。值得注意的是，本发明鉴定的3个FLC基因的彼此关系比它们与任一其他MADS盒基因都更紧密。

后文序列表中列出的是拟南芥FLC1、FLC2和FLC3，以及芜菁BrFLC1A和BrFLC1B的cDNA序列，和推导氨基酸序列。还有一些序列比较数据。这些数据表明：拟南芥的FLC1和FLC2在其全长范围内的相同性为60％，除MADS盒基因以外全部区域的相同性仍在50％以上。后一比较更重要，因为所有MADS区的MADS盒基因之间本身具有较高的保守性。为了进行这一项分析，MADS盒区被认为是蛋白质序列氨基端的前60个氨基酸。这种序列相似性程度似乎是跨种类的。实际上，芸苔属基因BrFLC1A和BrFLC1B与FLC1的相似性大于FLC1与FLC2相似性。MADS盒之外FLC2与芸苔属基因的相同性略低于50％，所以，一般认为FLC基因家族变体间氨基酸水平上的相同性高于40％。因此，除MADS盒区之外氨基酸相同性高于40％是FLC基因家族成员的表征之一。

再次看图1系统发生树，重要的是本发明鉴定的3个拟南芥FLC基因的彼此关系比它们与其他拟南芥BADS盒基因之间的更紧密。因为据信对MADS盒基因已完全了解(至少根据近期完成的拟南芥全基因组测序)，所以可以用常规序列分析方法及匹配软件，从图中得出任一新测序的基因与图1所示MADS盒家族成员之间的关系。FLC基因家族成员是，根据系统发生图分析，与拟南芥FLC1、FLC2和FLC3的关系比其与任一其他拟南芥MADS盒基因更紧密的基因。

确认某基因是FLC基因族成员的方法之一是测定该基因对开花时间的影响。后文实施例描述了证明FLC基因实际上延迟转基因植物开花的试验。以拟南芥为模型，通过测试一个可能的FLC基因是否在转基因植物中具有类似的效果，可确认其他植物种类推定FLC基因的活性。

需要强调的是，以上工具所实现的是对植物开花时间的改变。FLC的正常功能是延迟或抑制开花。然而，获得FLC基因的序列可使得植物的开花时间向两个方向改变。目前已有数种方法可下调或上调某内源性植物基因的表达。要下调基因表达，可在植物内插入一段该基因编码序列的反义链，或者可通过共同抑制来下调基因表达水平，这是一种知之尚少的现象，即，一段人造基因构建物的插入有时会引起对该插入基因及与之同源的其他基因的抑制。要上调植物基因，可通过植物基因组的胚系转化，在植株内引入此基因的额外拷贝，或通过选择强度和特性适当的植物启动子，提高植物细胞内和组织内天然基因所产生蛋白质的活性水平。

需要理解的是，目前植物基因工程的水平以可以将任意基因构建物引物任何有用的植物品种。然而，这一过程仍具有一定随机性，最主要的是，外源DNA插入植物基因组仍是在植物基因组内任意位置发生的。结果，在植物转化所得的任何一组植株中，不同的基因插入的结果有时会差异极大。例如，就单基因插入某内源性植物基因的另一拷贝而言，所得许多植株的该内源性蛋白质活性会略有提高，另一些则没有可测知的改变，甚至可测得所述活性的降低，而有少数的活性则显著提高。然而，这种变数并不意味着不可能获得稳定的结果，因为对每一具体的基因插入来说，代与代之间的结果倾向于一致。因此，高活性植株具有的有效的高活性等位基因可通过正常的孟德尔遗传传递给它们的后代。

为了制造转基因植物，正如本领域技术人员所知的，需要在植株内制造一个能够表达插入的蛋白质编码序列(外源或内源)的基因构建物。还需要将该基因构建物插入所述植物的方法。

目前已知许多制造可在植物内表达蛋白质的基因构建物的工具和技术。欲在植物细胞内表达多肽或蛋白质的基因构建物必需包含编码蛋白质的DNA序列，该序列决定在所得植物内所表达的多肽或蛋白质的序列。欲在植物内表达多肽或蛋白质的蛋白质编码序列必需置于植物可表达启动子的调控之下，并后接一段植物转录终止序列，又称聚腺苷酸序列。植物可表达启动子即如下启动子：在植物内有效，来自植物或来自植物病原例如病毒(例如烟草花叶病毒)或细菌(例如农杆菌启动子，如胭脂氨酸合成酶启动子)。来自病原的启动子多为组成型启动子，即它们能始终在植株的所有组织内表达蛋白质编码序列。其他植物启动子则被认为是组织特异性的(例如果实或花朵特异性)或发育特异性(例如对植物生命周期的某一阶段具有特异性，例如出芽期特异性或衰老特异性)，另一些则是诱导型的(例如热休克或金属离子诱导型启动子)。这些类型的启动子都可根据预期对所得转基因植物的预期作用用于本发明。

并非所有基因构建物都是用来在转基因植物细胞内生产多肽或蛋白质。如果操作的目的是降低植物内靶蛋白的活性水平，则可能希望基因构建物在植物内降低内源性蛋白质水平而不是生产蛋白质。为此目的的一种著名方法是反义技术，即形成一基因构建物，在植物细胞内合成一段mRNA，它与靶基因表达时产生的mRNA的某些部分互补。反义RNA干扰靶mRNA的翻译，由此降低该植物内蛋白质的生产。

已证明有数种方法可将基因插入植物形成转基因植物。使用最广，说明最全面的是农杆菌介导转化或加速粒子介导转化。各种农杆菌介导植物转化技术利用了植物病原农杆菌将细菌质粒DAN转移到植物细胞基因组内的能力。粒子介导植物转化技术使用一加速装置(通常为基因抢)加速包有DNA的粒子，使之进入植物细胞。对于以上两种方法还需要辅以其他技术，从而可由转化细胞得到完全成熟的、形态正常的植株。因此，这些技术通常都包括鉴定转化细胞的选择或筛选方法，以及从单个转化细胞再生成完整植株的方法。如上所述，这些技术已被证明适用于多种植物，并适用于多种几乎所有具有经济价值的植物品种。也可用其他技术，例如电穿孔来形成转基因植物。但就本发明而言，具体的植物转化技术并不重要。植物只要经基因工程改造成为转基因植物，转化原植物的方法就变得无关紧要。然后，已插入植物基因组的转基因就可以通过经典植物育种法的一般规则被第一代基因工程植株的后代完全继承。“转基因”在此指靶植物细胞所携带的插入基因构建物。因此，“转基因植物”在此指带有这种转基因的植物。

本发明揭示了有关一组植物基因，即FLC基因的信息。虽然这些基因此前已经以其天然或改变状态存在于植物内，但本发明首次将它们分离了出来。“分离形式”表示：这些基因从其宿主植株内被分离出来。由此，可以获得有关这些基因的信息并用于对基因极其元件的体外操作，从而创建多种用途的基因构建物。用途之一就是形成转基因植物。另一种用途是对转基因或非转基因植物的诊断和分析，分析并确定它们的FLC基因活性方式，用来协助育种或形成开花时间特征符合需要的植物。

例如，如后文所述，因FLC内突变而缺乏FLC活性的植物开花比含有活性FLC等位基因的植株早得多。具有野生型FLC活性的植株的叶数是FLC活性降低的植株的约6倍。而且，FLC表达水平高于正常的转基因植物表现出明显的开花延迟。虽然以下实施例是用拟南芥进行的(因在该植物内的基因操作较简单)，但同样的技术也适用于其他植物品种。实际上，FLC基因之间的高度相同性表明，作为一种普遍规律，一种植物FLC基因家族的成员在其他植物品种中也是有功能的。

开花时间调节FLC基因是植物开花引发的抑制者。据信，FLC的开花引发聚核苷酸片段在开花引发的调控中起者核心作用，因为，其他基因是通过改变该基因的活性来调节开花的。然而，该基因并非决定植物开花时间的唯一因素。例如，已证明，FRIGIDA(FRI)基因座是开花的协同抑制者，可与FLC发生协同作用(参见，Lee等，植物杂志，6，903-909，1994)。相反，LUMINIDEPENDENS基因促进开花，它通过降低FLC水平发挥作用。在缺乏LUMINIDEPENDENS活性因而开花延迟的突变株中，FLC水平显著提高。因此，改变开花引发调节基因是控制开花时间的有效手段。

进一步发现，FRI的作用是提高FLC水平。事实上，FLC和FRI两基因是两个显性等位基因，可相互作用从而延迟开花。按照传统命名，小写(例如fri，flc)表示隐性或非活性等位基因，大写(例如FRI，FLC)表示活性的显性等位基因。要延迟开花，一般需要两个等位基因都承显性。这样，早开花的植物具有以下基因组合：fri/fri和flc/1flc1；fri/fri和FLC1/fri；fri/fri和FLC1/FLC1；FRI/fri和flc1/flc1；FRI/FRI和flc1/flc1。晚开花的基因组合为：FRI/fri和FLC1/flc1；FRI/FRI和FLC1/flc1；FRI/fri和FLC1/FLC1；FRI/FRI和FLC1/FLC1。因此，在非转基因品系中检测FLC1突变型时，可将含有未知活性的FLC1等位基因的植株与含有FRI等位基因(以纯合体为佳)杂交，看是否含有活性FLC1等位基因。

植物的生命周期可分成至少两个阶段：营养期和繁殖期。在大多数经济作物植物中，在营养期，植物不断生长，包括植物叶的增大和增多。繁殖期从开花引发开始。此时，许多植物的继续生长是花朵、果实和种子的生长(或发育)。经济作物植物已就所需的特性经历了选育，所述特征包括植物同时进入收获期。结果，种植于相同条件下的植物群中的每一植株的叶数高度一致。由于这种叶数的相同性，开花时间的改变常可根据作物植株上叶数来确定。例如，如果植物开花提早，则该植株的叶数将少于种植于相同条件下开花未提前的植株。而且，还可以认为，开花提前的植株其营养期短于种植于相同条件下开花未提前的植株。同理，如果开花被抑制而延迟，则植物的叶数将多于种植于相同条件下开花未延迟的植株。而且，开花受抑制的植株其营养期也将比种植于相同条件下开花未受抑制的植株延长。开花时间的改变也可根据时间来测定。

引入FLC基因拷贝的植物可能也含有抑制开花的野生型(即内源性)开花时间调控编码区。在引入基因组后，FLC基因可放大该内源性开花时间调控编码区的活性，从而延迟开花。例如，可在植物内引入第二份开花时间调控编码区，从而增加植物内开花时间调节FLC蛋白质的量。开花时间调控编码区部分所编码的部分FLC蛋白的表达也能激发植物开花。激发植物开花的部分多肽称之为显性阴性突变，后文有详细描述。

本发明还提供了一种基因修饰植物，其特征在于开花时间被改变的表型。即，本发明修饰后的植物，不论是通过在植物内引入表达新的或更多FLC蛋白质的FLC基因加以修饰，还是通过抑制植物内内源性FLC基因活性加以修饰，表现为开花引发时间比没有插入转基因的相同植物迟。较好的是，转基因植物的开花时间(平均)比没有转基因的相同植物晚至少3天，至少7天更好，至少12天最好。或者，转基因植物的开花时间(平均)比没有转基因的相同植物早至少3天，至少7天更好，至少12天最好。较好的是，将转基因植物与没有转基因的相同植物种植在相同条件下。后文拟南芥的数据显示，甚至可能得到开花时间更大的改变，如3周到3个月。

转基因植物与无转基因相同植物之间开花期开花引发时间的早晚差异也可根据开始开花时两者的叶数差异来测定。较好的是，开始开花时，转基因植物的叶数比无转基因的相同植物多至少10％，至少50％更好，至少80％最好。或者，转基因植物的叶数比无转基因的相同植物少至少10％，至少50％更好，至少80％最好。较好的是，将转基因植物与没有转基因的相同植物种植在相同条件下。

本发明实施例之一中，提供了一种核酸分子，包括一段核苷酸序列，代表拟南芥FLC基因编码区或其部分，FLC基因序列的等位变异体，以及来自其他品种的FLC基因编码区的同源序列。同源性即相关性，可用核酸杂交技术、数据库计算机检索，计算机或人工比较氨基酸和核酸序列，和用FLC特异性抗体进行的蛋白质检测等技术来测定。两段序列如果排列后有一定百分比的对应残基相同，则是“相似的”。较好的是，两段核苷酸序列的相同性高于31％，高于约50％更好，高于70％更好，高于80％最好。

所以，本发明包括这样的基因和蛋白质，它们是植物基因FLC家族的成员，且一级结构与后文所述的FLC1具有明显的相同性。将两段氨基酸序列(即，同源序列的氨基酸序列和FLC1的序列)排列对齐，使得MADS区，即氨基酸1-60对齐，然后对两段氨基酸序列的全长进行排列对齐，使得其中相同的氨基酸数量达到最大。排列中，序列之一或两者中允许留空，为使MADS区的残基对齐，并使氨基酸相同数量最大，但各序列内的氨基酸必需保持在其正确的序位。氨基酸相同性百分比是以下两值中的高值：(a)排列中两序列相同的氨基酸数量除以FLC1的氨基酸数再乘以100；或(b)排列中两序列相同的氨基酸数量除以后续多肽的氨基酸数再乘以100。较好的是，开花时间调控多肽在FLC1蛋白质全长上的相同性高于40％，高于50％更好，高于70％最好。

核苷酸水平的序列同源性或相同性不那么重要。正如本领域所熟知的，遗传密码子的简并性使得许多不同DNA蛋白编码序列可编码同样的氨基酸序列。甚至可以，而且经常，在制作植物表达盒时，出于方便克隆或密码子使用偏性上的原因而改变天然蛋白质编码序列，但不改变产物蛋白质的氨基酸序列。

本发明的分离核酸分子可用多种方法获得。例如，可用本领域熟知的方法来分离核酸分子。这些技术包括但不限于：1)可测性标记代表任一FLC基因全部或部分的探针，用其与基因组或cDNA库杂交，检测相似的核酸序列；2)抗体筛选表达文库，检测相似的结构特征；3)聚合酶链反应(PCR)合成；和4)核酸分子化学合成。特定的基因编码区还可以在GenBank，国家卫生研究院计算机数据库中找到。然后，可分离出编码区，将其连接入后文所述的载体中。

为了用可测性标记的探针鉴定分离所得核酸分子，或为鉴定互补链与FLC1杂交的聚核苷酸片段，标准的严谨性杂交条件是采用Church等(美国科学院院报，81，1991-1984)所述的方法并加以改进：在含0.5M磷酸盐缓冲液，Ph7.2，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，10mM EDTA的溶液中45℃培养12小时，在含2×SSC(1×SSC：150mM NaCl/15mM柠檬酸钠，pH7.0)和0.1％SDS的溶液中45℃洗涤3次，每次20分钟。较好的是，聚核苷酸(例如探针)可在标准严谨性杂交条件下与SEQ ID NO：1中的核苷酸序列杂交。通常，聚核苷酸(例如探针)不必与聚核苷酸片段的所有核苷酸互补，只要能在上述条件下杂交即可。或者，可采用更高严谨度的条件，例如，提高杂交和洗涤步骤的温度至65℃、60℃、55℃或50℃。而且，杂交所需的时间可不用上述的12小时。通常，严谨度越低的杂交条件允许相关而不一定相同FLC基因的杂交，因而可鉴定出其他品种中的FLC基因。较好的是杂交和洗涤温度为，按照优先顺序，68℃杂交65℃洗涤，60℃杂交和洗涤，55℃杂交和洗涤，50℃杂交和洗涤，最好的是45℃洗涤和洗涤。

本发明所述的植物包括各种可用转化技术改造的开花植物，包括单子叶和双子叶植物。单子叶植物例如但不限于苷蓝、洋葱和大蒜等蔬菜；例如玉米、大麦、小麦、水稻、高粱、珍珠粟、裸麦和燕麦等谷类；和草料或草皮等草类。双子叶植物的例如但不限于诸如西红柿、豆子、大豆、胡椒、莴苣、豌豆、紫花苜蓿、三叶草、芸苔(卷心菜、椰菜、花椰菜、芽苷蓝、油菜籽和萝卜)，胡萝卜，甜菜，茄子，菠菜，黄瓜，南瓜，西瓜，哈密瓜，向日葵；棉花等纤维作物；和花卉及灌木等观赏植物。

虽然后文实施例证明增强FLC的表达可延迟或抑制开花，FLC功能丧失则将促进开花，仍可用其他方法修饰FLC从而改变开花时间。例如，可在植物基因组内引入编码某开花时间调节多肽显性阴性转基因。显性阴性突变体即可活跃干扰正常的内源性蛋白质功能的蛋白质。于是可以阻抑某基因的作用但不致使结构基因本身或其RNA失活。该方法曾被成功地用于和FLC同属于MADS区家族的转录因子。(Gauthier-Rouviere等，实验细胞研究，209，208-215，1993；Mizukami等，植物细胞，8，831-845，1996)。在用MADS盒基因制造显性阴性突变的实验中，最有效的构建物是没有该多肽C末端区的那些。因为，FLC和大多数MADS盒基因一样具有相同的基本结构，所以类似的C末端截断对FLC同样有效。这一截断物包含全长FLC1蛋白质的氨基酸1-150，对应于FLC基因的核苷酸1-450。

以上大致描述了本发明。更全面的理解可通过以下具体实施例获得。实施例在此仅用于说明，并不限定本发明的范围。

                          实施例

实施例1FLC功能丧失致使开花提早

拟南芥天然的开花延迟主要是因为两显性基因即FLC1(Lee等，植物杂志，6，903-909，1994；Koornneef等，植物杂志，6，911-919，1994)和FRIGIDA(Lee等，分子基因遗传，237，171-176，1993；Clarke和Dean，分子基因遗传，242，81-89，1994)之间的相互作用。我们还证明，在拟南芥的Landsberg erecta(Ler)中，FRI的晚开花表型被FLC1基因的隐性等位基因所抑制(Lee等，植物杂志，6，903-909，1994；Koornneef等，植物杂志，6，911-919，1994)。类似的，在Ler背景中，LUMINIDEPENDENS(LD)基因突变引起的晚开花也被FLC1的Ler等位基因所抑制(Lee等，植物杂志，6，903-909，1994；Koornneef等，植物杂志，6，911-919，1994)。为了确定FLC1的Ler等位基因能够抑制FRI和ld突变的晚开花表型是否是因为FLC1功能性突变的丧失，我们制作了拟南芥诱变样群，用来筛选含有flc1突变的植株。在一种诱变中，用甲基磺酸乙酯诱变5,000株晚开花的ld突变株(ld-3)。从50,000株M2植株中，筛选出1株早开花植株，经互补试验证明，与Ler背景中的FLC1隐性等位基因等位。用一晚开花品系进行第二次筛选，该品系具有Columbia(Col)背景中的晚开花FRI纯合等位基因。用5-6krad快速中子对90,000粒种子进行辐照。在300,000株M2植株中筛选早开花植株，分离得到4种新的flc1等位基因。

对4种诱导后flc1等位基因中的损伤进行了测定。有关3种快速中子flc1等位基因早开花表型的数据见表1和2。4种flc1等位基因都含有可能造成功能完全丧失的突变。总之，FLC1基因功能的丧失在长日照和短日照条件下都完全抑制了FRI的晚开花作用。在早开花-无FRI的背景中，FLC1功能丧失只在短日照条件下影响开花时间。因此，野生型或活性FLC1显然是开花的抑制者。

                          表1flc1功能丧失突变在晚开花、含FRI背景中的影响

       品系          开花时的莲座叶数量长日照--含FRI的野生型    74(12)^*长日照--flc1-2           11.8(.75)^*长日照--flc1-3           12.0(0.6)长日照--flc1-4           11.8(0.4)^*短日照--含FRI的野生型    ＞100短日照--flc1-3           44(2.7)^*括弧内的数字表示标准误差。测定开花前形成的叶数作为开花时间。据此，在含FRI背景中，flc1突变植物其开花前的时间均为含FLC1野生型植物的1/6。

                         表2

flc1失能突变在早开花无FRI背景中的影响

          品系        开花时的莲座叶数量长日照--Col野生型         13.7(0.8)^*长日照--flc1-3            13.2(0.7)短日照--Col野生型         55.4(4.7)短日照--flc1-3            42.4(3.5)

^*括弧内的数字表示标准误差。测定开花前形成的叶数作为开花时间。

本发明的品系来自拟南芥生物学来源中心，Columbus，OH。除非另作说明，培养条件和本领域技术人员普遍所知和所用的相同。由于春化对开花引发的作用，培养条件不使植物长期经受低温(例如0-8℃)。对拟南芥进行基因分析的技术是本领域技术人员所已知的(参见，例如Koornneef等，基因分析，“拟南芥方法”，分子生物学方法，第8卷，Martinez-Zapater等(eds.)，Humana Press，Totowa，NewJersey，pp.105-227，1998)。

实施例2通过定位克隆分离FLC

为了产生可用于高分辨率制图和FLC定位克隆的分离样群，将Ler(fri/fri；flc1/flc1)与Col(fri/fri；FLC1/FLC1)杂交产生的F1植株与Ler(FRI/FRI；flc1/flc1)含FRI的测试品系杂交。这一测试品系含有晚开花FRI等位基因，但也含有flc1-Ler等位基因，因此表现为早开花。F1与Ler的FRI的杂交后代，晚开花和早开花各为1∶1，在有FLC1-Col(即FRI/fri；FLC1/flc1)时晚开花，这是因为FRI与FLC1之间的相互作用；但在有flc1-Ler(FRI/FRI；flc1/flc1)时则早开花。用微卫星标记nga158和nga151(Bell和Ecker，1994)筛选测试-杂交后代(4500株)，已知两标记位于FLCl两侧(Lee等，1994b)。然后用第三种微卫星标记nga249测试nga158和151发生重组的植株，发现，FLC1位于nga249与nga151之间。

4种酵母人造染色体(YAC)克隆中包含Nga249和nga151之间的区域。为了制作其他标记，我们测定YAC末端克隆的DNA序列，并设计用于扩增Ler和Col中对应序列的引物。测定这些Ler和Col的DNA序列，确定单核苷酸改变，然后用来产生衍生切割扩增多态序列(dCAPS)标记(Michaels和Amasino，1998；Neff等，1998)。用来自YAC CIC1B8左端和右端的标记检测到，FLC1两侧都发生重组，证明FLC1位于CIC1B8所覆盖的620kb区间内。

在覆盖CIC1B8的Kazusa拟南芥基因组课题中曾鉴定到13BAC，TAC和P1克隆。这些克隆中插入片段长70-100kb，用它们作为DNA印迹试验的探针，所述试验用含快速中子诱导的flc1突变植株的EcoRV-消化DNA进行。两个重叠克隆，K6M1和MYB9，鉴定到数条flc-2中有缺失的条带。用Sau3A1部分消化产生K6M1和MYB9的10-20kb随机片段，用它们在二元载体pPZP211(Hajdukiewicz等，1994)中建立一个文库，用该文库的各克隆转化Ler品系中的FRI。该文库由Col背景的DNA构成，该背景含有晚开花的FLC1等位基因。因此，用含FLC1-Col等位基因的构建物转化的Ler-FRI植物将晚开花。该文库中的一个克隆，211-31，产生了开花很晚的T₁植株。1/3以上的植株在培养8个月后，没有开花就开始衰老。

在211-31中测序发现了3个推定基因。为了确定哪一个是FLC1，对以下3个候选基因进行了检测，它们来自另两种快速中子flc1等位基因，flc1-3和flc1-4，和一个EMS产生的等位基因flc1-1。两种快速中子等位基因都表现出MADS盒转录因子所产生条带的多态性。测定flc1-1，flc1-3和flc1-4的序列发现，它们的MADS转录因子的第一个外显子中都存在损伤。flc1-3有一段104bp的缺失，因此失去了启动密码子，flc1-4有一段7bp的缺失，因此在前20个氨基酸后发生读码框改变。flc1-1在第一外显子/内含子的连接处有一处单碱基转换，因而将保守的GT供体位点变成了AT，并可能因而干扰剪接。通过RT-PCR从Col背景中分离出FLC1 cDNA，序列表中给出了其序列。实施例3晚开花转基因拟南芥的产生

为了确定FLC1是否可用于改变开花时间，培养了含两种不同FLC1构建物的转基因拟南芥。第一种构建物，211-31，由含FLC1的基因组DNA与其天然启动子构成。另一种，pSM7，含有位于烟草花叶病毒组成型35S启动子调控下的FLC1基因组编码区(Odell等，自然，313，810-2，1985)。

通过农杆菌介导的转化将211-31转化入Ler型FRI(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，316：1194，1993)。非转化的Ler-FRI约在长出14片原生莲座叶开花(Lee等，植物杂志，6，903-909，1994)。以211-31转化的Ler-FRI植物因FRI与FLC1的协同作用，开花显著延迟(表3)。90％以上的转化子在50多片以上时才开花，约38％始终未开花，即使培养在能够强烈促进拟南芥开花的富远红外线条件下亦是如此。因此，FLC1过表达可使植物在整个生命周期内不开花。由于211-31转化的植物其发育的营养期延长，生物量增加了10倍。这说明，一个FLC基因的过表达能够使得早开花的植物变成晚开花植物。

通过农杆菌介导的转化将pSM7转化入野生型Ler(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，316：1194，1993)，用于测定FLC1在正常早开花品系内组成型表达的效应。结果见表5。30％转基因植株开花未明显晚于其Ler亲本，35％中度延迟，35％明显延迟。转基因植物开花时间的不一致可能是因为它们在基因组内的插入位置不同引起表达水平不同。这说明，即使没有FRI活性，FLC1表达也足以实质性地延迟开花。而且，组成型FLC1表达引起的晚开花对春化不敏感(春化可有效促进含FRI和FLC1的天然晚开花品系早开花)。因此，通过以一组成型启动子取代原天然FLC启动子，就可以形成晚开花而此特征对环境因素不敏感的晚开花植物。同样，晚开花伴有生物量增加。

                          表3以FLC1转化的含FRI植物的开花时间^*

开花时的莲座叶数    占转化植物百分比

12-20                     8％

20-40                     0％

40-80                     54％

＞80                      38％

^*非转化的Ler-FRI，没有FLC1功能，在形成12-14片莲座叶后开花，引入了1份或多份FLC1拷贝的转基因植物中92％在形成了3倍于以上叶数后才开花。测定开花前的叶数作为开花时间指标。因此，在该品系内引入FLC1基因统一地改变了植物性状，使其开花延迟了6倍。数个品系始终不开花。

                          表4

以FLC1转化的含FRI植物的生物量增加^*

品系                      鲜重

Ler-FRI                   1.5g(.14)

211-31转化的Ler-FRI       15.5g(2.1)

^*以FLC1转化后，植物的鲜重增加了10倍。括弧内的数字是标准偏差。

                          表5

以组成型FLC1转化的Ler植物的开花时间^*

开花时的莲座叶数     占转化植物百分比

7-10                      30％

10-20                     35％

＞20                      35％

^*野生型Ler在形成7-8片叶时开花，70％第一代转化子开花延迟，其中35％开花前的叶数是非转化子的2倍。测定开花前的叶数作为开花时间指标。因此，组成型表达FLC1的该品系的开花时间统一延迟了3倍以上。

实施例4对芸苔属FLC1同源基因的检测

FLC活性可在除拟南芥以外的其他品种植物中调控开花时间。为了验证这种可能性，通过RT-PCR，用为拟南芥FLC1序列设计的引物，由芜菁mRNA分离出其FLC1同源基因。该芜菁同源基因(BrFLC1A和BrFLC1B)的核苷酸序列见后文序列表。FLC1与BrFLC1A和BrFLC1B之间的氨基酸相同性见表6。将BrFLC1A和BrFLC1B置于组成型35S启动子调控下，构建成过表达构建物。用这些构建物转化早开花的拟南芥，测定T1植株的开花时间。许多含芸苔属过表达构建物的拟南芥植株开花延迟，开花前的叶数是非转化对照的3倍。因此，和拟南芥FLC1的过表达一样，芜菁的FLC1同源基因在组成型表达时能够延迟拟南芥的开花。

                          表6

       FLC1与芜菁FLC1同源基因之间的氨基酸相同性

          MADS区内的相同性    MADS区外的相同性    总相同性

BrFLC1A         88％                  81％           83％

BrFLC1B         93％                  81％           85％

^*在以上比较中，氨基酸1-60被认定为MADS区。因为家族成员间在MADS区内高度保守，所以给出了MADS区内和区外的相同性。

实施例5拟南芥中FLC1样基因的鉴定

用FLC1序列检索数据库，又鉴定到2个MADS区，FLC2和FLC3，它们与FLC1具有显著的同源性。此前，这些基因曾在对拟南芥基因组的测序中被鉴定过，但并不知道它们的功能，在此，将它们称为FLC2和FLC3。通过RT-PCR获得FLC2和FLC3的cDNA克隆。FLC2和FLC3的核苷酸序列见序列表。FLC1与FLC2和FLC3之间的氨基酸相同性见表7。

                            表7

           FLC1与FLC2和FLC3之间的氨基酸相同性

           MADS区内的相同性    MADS区外的相同性    总相同性

FLC2            83％                  50％            60％

FLC3            83％                  50％            60％

^*在以上比较中，氨基酸1-60被认定为MADS区。因为家族成员间在MADS区内高度保守，所以给出了MADS区内和区外的相同性。

实施例6FLC2抑制拟南芥开花的作用

用已知技术，工具T-DNA插入诱变群筛选的PCR鉴定FLC2内的失能等位基因(Krysan，Young，Sussman，以T-DNA作为拟南芥内的插入诱变。植物细胞，v.11，p.2283-2290，1999)。发现了两个等位基因，flc2-1和flc2-2。在flc2-1等位基因中，T-DNA插入在基因组序列的第4138位，在flc2-2等位基因中，T-DNA插入在第442位。对这些失能突变对开花时间的作用进行了长日照和短日照条件下的检测。结果见表8。和FLC1一样，FLC2也具有延迟拟南芥开花的作用。在长日照和短日照条件下，flc2突变株开花早于对应的野生株；因此，FLC2野生型的作用是延迟开花。

                      表8

        flc2失能突变对开花时间的影响

品系             开花时的莲座叶数范围

长日照--野生型           8-9

长日照--flc2-1           6-7

长日照--flc2-2           6-7

短日照--野生型           25-30

短日照--flc2-1           7-9

短日照--flc2-2           9-11

实施例7

FLC2过表达延迟拟南芥开花

为了评价FLC2过表达对开花时间的作用，将FLC2基因组编码区置于组成型35S启动子调控下，通过标准技术(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，316，1194，1993)将其转化到拟南芥中。结果见表9。和FLC1一样，FLC2过表达足以延迟开花。许多转化植株开花期的叶数是对照的2-3倍。

                           表9

               FLC2过表达对开花时间的作用*

开花时的莲座叶数    占转化植物百分比

12-16                      55％

17-33                      45％

^*非转化的野生株在8-9叶时开花。

综合该试验的数据可确认：FLC家族基因在植物内起延迟开花的作用。以上数据表明：在许多(即使不是大多数)植物中有一个以上天然FLC基因。虽然FLC基因与其他开花时间基因诸如FRI基因相互作用，但仅FLC基因就能够改变植物开花的时间。FLC基因编码的蛋白质具有高度的种内和种间序列相同性，而且，一个品种的FLC在其他品种中也有效。本发明由此提供了一种有用的工具，可操纵或协助控制多种植物的开花时间。

本发明分别引用并参考了在此引用的各篇专利、专利申请、出版物，以及核酸和蛋白质数据库目录，包括BenBank的登录号和EMBL的登录号。需要理解的是，由于现有技术的限制，给出的数据中可能存在偶然的序列误差或缺失，但并不影响数据的使用价值。本发明精神和范围内的各种修改对本领域技术人员来说是显而易见的，因此，不应将本发明理解为仅限于说明性的实施例。

                                  序列表<110>Amasino，RichardSchomburg，FritzMichaels，ScottSung，Si-Bum<120>改变植物开花时间的方法<130>960296.96871<140>09/513，775<141>2000-02-25<150>60/121，572<151>1999-02-25<150>60/123，455<151>1999-03-05<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>797<212>DNA<213>拟南芥<220><221>CDS<222>(1)..(588)<400> 1atg gga aga aaa aaa cta gaa atc aag cga att gag aac aaa agt agc   48Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ser Ser1               5                  10                  15cga caa gtc acc ttc tcc aaa cgt cgc aac ggt ctc atc gag aaa gct   96Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Ile Glu Lys Ala20                  25                  30cgt cag ctt tct gtt ctc tgt gac gca tcc gtc gct ctt ctc gtc gtc   144Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu Leu Val Val35                  40                  45tcc gcc tcc ggc aag ctc tac agc ttc tcc tcc ggc gat aac ctg gtc   192Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Asn Leu Val50                  55                  60aag atc ctt gat cga tat ggg aaa cag cat gct gat gat ctt aaa gcc   240Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp Leu Lys Ala65                  70                  75                  80ttg gat cat cag tca aaa gct ctg aac tat ggt tca cac tat gag cta   288Leu Asp His Gln Ser Lys Ala Leu Asn Tyr Gly Ser His Tyr Glu Leu85                  90                  95ctt gaa ctt gtg gat agc aag ctt gtg gga tca aat gtc aaa aat gtg   336Leu Glu Leu Val Asp Ser Lys Leu Val Gly Ser Asn Val Lys Asn Val100                 105                 110agt atc gat gct ctt gtt caa ctg gag gaa cac ctt gag act gcc ctc   384Ser Ile Asp Ala Leu Val Gln Leu Glu Glu His Leu Glu Thr Ala Leu115                 120                 125tcc gtg act aga gcc aag aag acc gaa ctc atg ttg aag ctt gtt gag   432Ser Val Thr Arg Ala Lys Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys Leu Val Glu130                 135                 140aat ctt aaa gaa aag gag aaa atg ctg aaa gaa gag aac cag gtt ttg   480Asn Leu Lys Glu Lys Glu Lys Met Leu Lys Glu Glu Asn Gln Val Leu145                 150                 155                 160gct agc cag atg gag aat aat cat cat gtg gga gca gaa gct gag atg   528Ala Ser Gln Met Glu Asn Asn His His Val Gly Ala Glu Ala Glu Met165                 170                 175gag atg tca cct gct gga caa atc tcc gac aat ctt ccg gtg act ctc   576Glu Met Ser Pro Ala Gly Gln Ile Ser Asp Asn Leu Pro Val Thr Leu180                 185                 190cca cta ctt aat tagccacctt aaatcggcgg ttgaaatcaa aatccaaaac       628Pro Leu Leu Asn195atatataatt atgaagaaaa aaaaaataag atatgtaatt attccgctga taagggcgag 688cgtttgtata tcttaatact ctctctttgg ccaagagact ttgtgtgtga tacttaagta 748gacggaacta agtcaatact atccgtttta agacaaaaaa aaaaaaaaa             797<210>2<211>196<212>PRT<213>拟南芥<400> 2Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ser Ser1               5                  10                  15Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Ile Glu Lys Ala20                  25                  30Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu Leu Val Val35                  40                  45Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Asn Leu Val50                  55                  60Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp Leu Lys Ala65                  70                  75                  80Leu Asp His Gln Ser Lys Ala Leu Asn Tyr Gly Ser His Tyr Glu Leu85                  90                  95Leu Glu Leu Val Asp Ser Lys Leu Val Gly Ser Asn Val Lys Asn Val100                 105                 110Ser Ile Asp Ala Leu Val Gln Leu Glu Glu His Leu Glu Thr Ala Leu115                  120                 125Ser Val Thr Arg Ala Lys Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys Leu Val Glu130                 135                 140Asn Leu Lys Glu Lys Glu Lys Met Leu Lys Glu Glu Asn Gln Val Leu145                 150                 155                 160Ala Ser Gln Met Glu Asn Asn His His Val Gly Ala Glu Ala Glu Met165                 170                 175Glu Met Ser Pro Ala Gly Gln Ile Ser Asp Asn Leu Pro Val Thr Leu180                 185                 190Pro Leu Leu Asn195<210>3<211>906<212>DNA<213>拟南芥<220><221>CDS<222>(1)..(519)<400>3atg gga aga aga aaa atc gag atc aag cga atc gag aac aaa agc agt   48Met Gly Arg Arg Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ser Ser1               5                  10                  15cga caa gtc act ttc tcc aaa cga cgc aat ggt ctc atc gac aaa gct   96Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Ile Asp Lys Ala20                  25                  30cga caa ctt tcg att ctc tgt gaa tcc tcc gtc gct gtt gtc gtc gta  144Arg Gln Leu Ser Ile Leu Cys Glu Ser Ser Val Ala Val Val Val Val35                  40                  45tct gcc tcc gga aaa ctc tat gac tct tcc tcc ggt gac gac att tcc  192Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Asp Ser Ser Ser Gly Asp Asp Ile Ser50                  55                  60aag atc att gat cgt tat gaa ata caa cat gct gat gaa ctt aga gcc  240Lys Ile Ile Asp Arg Tyr Glu Il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Claims (20)

1.一种转基因植物，其基因组中含有编码FLC基因家族成员的转基因，该转基因植物的开花时间相对非转基因同种植物发生了改变。

2.根据权利要求1所述的转基因植物，其中转基因植物的开花早于非转基因同种植物。

3.根据权利要求1所述的转基因植物，其中转基因植物的开花迟于非转基因同种植物。

4.根据权利要求1所述的转基因植物，其中的FLC基因家族成员选自拟南芥的FLC1、FLC2、FLC3，和芜菁的BrFLC1A和BrFLC1B。

5.权利要求1所述转基因植物的种子。

6.转基因植物的种子，其基因组中含有一个转基因，该转基因包括一个植物可表达启动子和植物FLC蛋白质的编码区，该植物FLC蛋白(i)具有MADS盒区，(ii)其MADS盒区之外氨基酸序列与拟南芥FLC1或FLC2即SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的相同性至少40％，而且(iii)当其在转基因植物内表达时，能够有效延迟转基因植物的开花，使之迟于相同基因背景的非转基因植株。

7.由权利要求6所述种子长成的植物。

8.根据权利要求6所述的种子，其中FLC蛋白质MADS盒区之外的氨基酸序列与FLC1的相同性至少50％。

9.一种转基因植物的种子，其基因组中含有一个转基因，该转基因包括一个植物可表达启动子和植物FLC蛋白质家族成员的编码区，所述的FLC蛋白质家族成员在系统发育上与拟南芥FLC1或FLC2蛋白质的相关性比拟南芥的任何其他MADS盒区更密切。

10.由权利要求9所述的种子培养出的转基因植物。

11.一种转基因植物的种子，其基因组中含有一个转基因，该转基因包括一个植物可表达启动子，该启动子与植物FLC蛋白质编码序列足够部分的互补序列操作性连接，以降低由该种子长成的植株内内源性FLC蛋白质活性水平，所述的植物FLC蛋白质(i)具有MADS盒区，(ii)其MADS盒区之外氨基酸序列与拟南芥FLC1或FLC2即SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的相同性至少40％，而且(iii)当其在转基因植物内表达时能够有效延迟转基因植物的开花，使之迟于相同基因背景的非转基因植株。

12.一段分离的核苷酸序列，包含拟南芥FLC1基因即SEQ ID NO：1的编码序列。

13.一段分离的DNA序列，包含编码拟南芥FLC1蛋白质即SEQ ID NO：2的DNA序列。

14.一种基因构建物，包含一个植物可表达启动子，该启动子与FLC基因家族蛋白质的编码序列操作性连接，所述的植物FLC蛋白质(i)具有MADS盒区，(ii)其MADS盒区之外氨基酸序列与拟南芥FLC1(SEQ ID NO：2)或FLC2(SEQ IDNO：4)的相同性至少40％，而且(iii)当其在转基因植物内表达时能够有效延迟转基因植物的开花，使之迟于相同基因背景的非转基因植株。

15.一种植物，其基因组中含有权利要求14所述的基团构建物。

16.根据权利要求14所述的基因构建物，其中的FLC蛋白质选自拟南芥的FLC1、FLC2、FLC3，和芜菁的BrFLC1A和BrFLC1B。

17.根据权利要求14所述的基因构建物，其中植物FLC基因其氨基酸序列与拟南芥FLC1蛋白质(SEQ ID NO：1)的相同性至少50％。

18.一种基因构建物，包含一个植物可表达启动子，该启动子与植物FLC蛋白质编码序列足够部分的互补序列操作性连接，以降低由该种子长成的植株内内源性FLC蛋白质活性水平，所述的植物FLC蛋白质(i)具有MADS盒区，(ii)其氨基酸序列与拟南芥FLC1即SEQ ID NO：1的相同性至少40％，而且(iii)当其在转基因植物内表达时能够有效延迟转基因植物的开花，使之迟于相同基因背景的非转基因植株。

19.一种转基因植物，含有FLC基因家族成员的转基因，培养于相同的条件下时，该基因修饰植物的开花比相同基因背景的非转基因植株早或迟至少7天。

20.一种生产改变了开花时间的转基因植物的方法，包括：

将植物细胞与转基因接触，该转基因包含植物可表达启动子和植物FLC基因；

鉴定插入有该转基因的植物细胞；

由该植物细胞再生成转基因植物，所述转基因植物的叶数比相同基因背景的非转基因植株少或多10％，所述的叶数是转基因植株与非转基因植株培养于相同条件下测定的。

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