CN105112427A - 一种延迟植物开花时间基因LcFLC及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从荔枝中分离得到的成花调节基因LcFLC及其应用，属于生物基因领域。本发明具体公开了LcFLC基因的核苷酸序列、克隆方法、含有该基因的亚细胞定位、该基因在荔枝不同组织部位的时空表达特征，该基因具有延迟植物开花时间的功能。本发明首次从分子生物学的角度来初步了解荔枝的成花诱导机理，为以后通过目的基因在荔枝中的过量表达或抑制其表达来调节开花时间打下基础，对于利用基因工程来选育荔枝新品种有着重要的意义。

Description

一种延迟植物开花时间基因LcFLC及其应用

技术领域

本发明涉及一种延迟成花基因，具体涉及一种延迟植物成花时间基因LcFLC的克隆、载体构建及其应用，属于生物基因技术领域。

背景技术

荔枝（LitchichinensisSonn.）属无患子科荔枝属常绿果树，是我国南方亚热带地区广泛栽培的特产果树，栽培历史悠久，种质资源丰富。荔枝栽培过程中出现的成花不稳定，是导致低产或不稳产的重要原因，因此，荔枝成花相关研究成为关注热点。

荔枝成花涉及复杂的环境因子和遗传因子。研究显示，温度是影响荔枝成花的最关键因子（Menzeletal.,1985；Menzeletal.,1986；Southwicketal.,1986）。Menzel的研究小组利用控温生长室，对荔枝成花所要求的低温强度、低温持续时间、昼夜温差等一些关注焦点问题进行过系列研究（Menzeletal.,1985；Menzeletal.,1986；Menzeletal.,1989），结果显示低于20℃以下的温度是诱导荔枝成花的有效温度（Battenetal.,1995；OHare,2002）。荔枝是典型的低温诱导成花植物，如无冷凉环境，荔枝将维持营养生长。

开花是植物从营养生长到生殖生长的重要转折，可通过多条途径调控得以实现。近年来，通过对拟南芥等模式植物如何响应环境条件以及内部成花的分子机理的研究，发现植物开花转变过程是由多因子、多途径共同控制下众多开花基因在时间和空间上顺序表达和相互作用的结果。这些途径既彼此独立，又相互关联，形成一个复杂的开花调控网络。目前，拟南芥开花受以下途径调控，包括光周期途径（Photoperiodpathway）、春化途径（Vernalizationpathway）、赤霉素途径（Gibberellinpathway）、自主途径（Autonomouspathway）、温敏途径（Thermosensorypathway）和年龄途径（Agingpathway）（Moonetal.,2005；Fornaraetal.,2010；Srikanthetal.,2011）。其中春化途径为植物感知外部环境的低温信号诱导植物开花的现象，依赖春化途径的植株必须经过一定时期的低温才能从营养生长向生殖生长转变的。春化作用是一个受多基因协调共同作用的过程，它以改变FLOWERINGLOCUSC（FLC）染色质修饰的方式降低其水平表达，最后直接或间接调控其下游基因的表达，促进植物开花（Michaelsetal.,1999；Sheldonetal.,2000；Gendalletal.,2001；Levyetal.,2002；Bastowetal.,2004；Sungetal.,2004）。FLC是春化途径的枢纽基因，它属于MADS-box基因家族，编码的蛋白是一个开花抑制因子（Bastowetal.,2004;Sheldonetal.,2000）。FLC表达量的降低与春化程度成正相关，与开花时间呈负相关，FLC高水平表达显著抑制植物成花，而flc突变体则表现为提早开花（Michaelsetal.,1999；Sheldonetal.,2000）。总之，在拟南芥春化过程中大多数基因最终都作用于关键基因FLC，从而解除对下游FLOWERINGLOCUST（FT）基因的抑制作用，促进开花。

目前已从多种作物中克隆得到FLC同源基因cDNA全长，如水稻的Hd3a，番茄的SFT，柑桔的CiFT等等。FLC及其同源基因在拟南芥等植物中表达可明显延迟其开花时间，但多年生植物荔枝对于外界环境的响应不同于草本植物拟南芥，有关低温诱导荔枝开花的调控机制和分子机理仍然不清楚。

发明内容

本发明目的在于提供一种从荔枝中分离得到的成花调节基因LcFLC，并提供该基因的核苷酸序列、克隆方法、含有该基因的亚细胞定位、该基因在荔枝不同组织部位的时空表达特征，该基因具有延迟植物开花时间的功能。

本发明的另一个目的在于提供上述一种成花调节基因LcFLC的应用。

本发明的技术方案如下：一种从荔枝中分离得到的成花调节基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

所述LcFLC基因编码的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示，其含有MADS家族典型的结构域。

所述LcFLC基因编码氨基酸同源性与枳中PtFLC编码的氨基酸序列同源性最高，为60.76%。

LcFLC基因亚细胞定位特征如下：所述LcFLC基因定位在细胞核中。

LcFLC基因在荔枝不同组织部位的时空表达特征如下：所述LcFLC基因在荔枝成熟叶片、幼叶、叶芽、花穗和韧皮部中均有表达，其主要在荔枝叶片中表达，而在花穗和韧皮部中的表达量较少，表达量顺序依次为：10月份幼叶>10月份成熟叶片>2月份幼叶>2月份成熟叶片>叶芽>花芽>花穗>韧皮部。

荔枝叶片中，所述LcFLC基因的表达量在低温诱导后开始迅速下降，8周时达到最低值，并一直维持在较低水平直至开花；在顶芽中，所述LcFLC基因的表达量一直维持在较低水平。

本发明所述一种从荔枝中分离得到的成花调节基因LcFLC基因应用于延迟或抑制植物的开花时间。

所述的LcFLC基因在调节拟南芥开花中的应用，具体是将LcFLC基因与pBI121载体相连后得到重组质粒，通过冻融法转化农杆菌，经花粉管通道法转化拟南芥后，抑制拟南芥平均开花时间延迟10天。

本发明首次从分子生物学的角度来初步了解荔枝的成花诱导机理，为以后通过目的基因在荔枝中的过量表达或抑制其表达来调节开花时间打下基础，本发明对于利用基因工程来选育荔枝新品种有着重要的意义。

附图说明

图1为LcFLC基因克隆过程电泳图。

图2为LcFLC的氨基酸序列与其他植物的LcFLC同源序列比对。

图3为LcFLC在‘妃子笑’荔枝不同时期组织或部位的表达。

图4为LcFLC在‘妃子笑’荔枝花芽发育阶段的表达分析。

图5为pBI121-GFP和pBI121植物表达载体的结构图，其中，A：改造后的pBI121-GFP载体，B：pBI121表达载体。

图6为LcFLC基因的亚细胞定位，其中，第一列为荧光图片，第二列为第一列相对应的明视野，第三列为第一列与第二列的merge。

图7为LcFLC基因在拟南芥中超表达后开花的表型。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此案例。

本发明所提供的FloweringLocusC同源基因，是从荔枝（LitchichinensisSonn.）中克隆，命名为LcFLC基因，其核酸序列如SEQIDNO.1，氨基酸序列如SEQIDNO.2。

实施例1LcFLC基因的克隆方法及序列分析

上述LcFLC基因的克隆方法及序列分析，包括如下步骤。

1.荔枝RNA的提取及检测以‘妃子笑’荔枝品种的叶片为材料，RNA的提取采用北京华越洋生物有限公司的RNAOUT试剂盒（具体方法参照说明书），然后用DNaseI（TaKaRa）消化去除总RNA中的DNA（具体方法参照说明书）。

荔枝总RNA质量和完整性检测：取1μLRNA溶液稀释至100μL，用紫外核酸蛋白检测仪测定260、280和320nm的光吸收值并计算A_260nm/A_280nm比值；同时取2μLRNA样品用1.2%的琼脂糖胶电泳检测总RNA的完整性。当A₂₆₀/A₂₈₀的比值介于1.8-2.0之间时，28S和18SrRNA条带清晰且亮度比值在1.5-2之间时，RNA样品合格后用于下一步实验。

2.cDNA第一链的合成取2μg提取好的总RNA样品用于合成第一链cDNA，反应体系20μL，引物采用Oligo（dT）₁₅，具体操作参照MLV-ReverseTranscriptaseKit（Invitrogen公司）说明书进行。

3.引物设计根据荔枝叶片转录组测序得到的相关基因序列，根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上其他作物同源基因的序列比对，依据引物设计的基本原则，用PrimerPremier5.0软件设计包括起始密码子和终止密码子的特异引物用于扩增LcFLC基因全长序列，扩增所用引物为如下：

正向引物LcFLC-F：5’-AGGCAGAGTCCTATTAGAG-3’，

反向引物LcFLC-R：5’-CACGTTTGGAGTACTACACTT-3’。

4.目的基因片段的扩增和回收以cDNA作为模板，采用PrimeScript?RT-PCRKit进行PCR扩增反应，反应体系50μL，扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测大小是否正确。在确定PCR产物中含有所需大小的目的片段后，采用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，方法参照试剂盒说明书。回收后，再取5μLPCR产物进行1.2％琼脂糖电泳检测回收效果。

5.载体连接、转化和阳性克隆鉴定将目的DNA片段与克隆载体pMD18-T按照3：1的摩尔比进行连接，在16℃条件下恒温孵育过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑用通用引物M13和特异引物同时进行PCR检测，挑取检测呈阳性的转化子送华大基因公司测序，测序结果证实得到的为LcFLC基因的全长。LcFLC基因的ORF框为573bp，编码191个氨基酸组成的蛋白，蛋白质分子量为47.02KDa，等电点为4.96。LcFLC基因的具体克隆过程电泳图如图1，其ORF框的核苷酸序列和氨基酸序列见图2所示。

6.cDNA片段序列的比对分析在NCBI数据库中进行BLAST比对，检索目的基因与其它物种基因的同源性，然后用MEGA4.1、ClustalX、GENEDOC和BioXM2.6软件等进行相关生物信息学分析。结果显示LcFLC属于MADS家族，含有MADS家族典型的结构域（位置为1-61），如图2方框所示。LcFLC与枳（Poncirustrifoliate）中PtFLC编码的氨基酸序列同源性最高，为60.76%。进化系统树结果也显示荔枝的FLC蛋白与枳（Poncirustrifoliate）的PtFLC蛋白同源性最高，亲缘关系最近；其他亲缘关系较近的依次为美洲葡萄（Vitislabrusca）、酿酒葡萄（Vitisvinifera）、和白桦（Betulaplatyphylla）等；而与小叶杨（Populussimonii）和大豆（Glycinemax）中的FLC蛋白遗传距离比较远（图2B）。

实施例2LcFLC基因在‘妃子笑’荔枝中的表达分析LcFLC基因在‘妃子笑’荔枝中的表达分析采用Real-TimePCR反应进行，具体实施方案如下。

1.实验材料为分析LcFLC基因在荔枝花芽分化过程中的表达情况，选取荔枝8个不同部位和不同的生长时期的样品RNA用作分析，不同部位的样品如下：成熟叶1（10月份）、成熟叶2（2月份）、幼叶1（10月份）、幼叶2（2月份）、叶芽、花芽、花穗和韧皮部。不同的生长时期的样品为自2012.10.22起每隔3周采取‘妃子笑’荔枝成花过程的末次枝梢成熟叶片和顶芽。

2.定量引物设计根据克隆的得到的基因序列，参照Real-timePCR引物的设计的一般原则，用Primer5.0设计特异引物，正向引物QLcFLC-F：5’-CTGCCTGTTGGATGTGCT-3’，反向引物QLcFLC-R：5’-TGGAATCAATAGTGACCCTC-3’。

3.Real-TimePCR反应Real-TimePCR利用ABI7500Real-TimePCR检测系统进行。反应体系按照Real-TimePCRMasterMix（TOYOBO，Japan）说明书，反应体积为20.0mL。反应结束后通过熔解曲线鉴定产物的特异性。内参基因选择表达稳定性良好的荔枝Actin基因（HQ615689）。采用2^-△△CT法进行基因相对表达量数据分析，计算出LcFLC的表达水平。以上所有实验每个样品均设3次重复，用ddH₂O为阴性对照。

4.LcFLC在‘妃子笑’荔枝中的表达分析LcFLC的相对表达量在10月份的幼叶和成熟叶片均保持了较高水平，而在2月份采的幼叶和成熟叶片中均有不同程度的下降，在叶芽和花芽中水平相对更低，在花穗和韧皮部中几乎不存在（图4）。从图4基因表达规律可以看出，在顶芽组织中，整个成花过程不同阶段LcFLC基因表达量始终维持在一个相对稳定的低水平。而在成熟叶片中，LcFLC的表达量开始维持在一个较高的水平，在低温来临后表达量开始迅速下降；在第8周左右达到最低值，比低温来临之前下降了25倍左右；之后一直维持在一个较低的水平直至成花过程完成。以上结果表明的LcFLC基因的主要在成熟叶中表达，并受到温度的影响，并与成花进程密切相关。

实施例3构建含LcFLC基因的植物表达载体，经农杆菌注射法转入本氏烟草（Nicotianabenthamiana）中，进一步分析LcFLC基因的亚细胞定位。

1.载体构建本实验使用的是经过部分改造（用GFP代替pBI121中的GUS基因）的pBI121载体，简称为pBI121-GFP载体（如图5A）。选取XbaⅠ和SmaⅠ两个酶切位点进行酶切，然后电泳检测并切胶回收相应大小的片段。再使用In-fusion?HDCloningKit连接酶（Clontech）将得到的目的基因连接到pBI121-GFP线性载体中。扩增带重组接头的目的基因引物为LcFLC-GFP-F：GGACTCTAGAGGATCCATGGGCCGGAGGAAGTTGCAG，LcFLC-GFP-R：GATCGGGGAAATTCGAGCTCCTATTTTAGCAAGGAAAGGG。连接体系为：In-Fusion改造的目的基因1μL，酶切后的载体1μL，In-Fusion酶1μL，加水至5μL。混匀后，50℃孵育15min。In-fusion连接酶的具体原理及方法详见说明书。

2.质粒转化及农杆菌转化取2μL连接产物用热激法转化至大肠杆菌，转化后活化菌株挑单克隆用pBI121-GFP通用引物进行PCR检测目的基因是否正确转入载体中。并取正确的菌液100μL送华大基因公司测序，以验证质粒中是否含有目的基因。再将测序正确、返还的质粒取5μL通过冻溶法将其转化农杆菌EHA105菌株感受态细胞。挑取单菌用目的基因引物检测，确认重组质粒是否转入到农杆菌中。

3.本氏烟草注射及观察注射使用的烟草品种为本氏烟草（Nicotianabenthamiana）。23℃、长日照培养一个月，注射前先黑暗处理2h，再光照30min，以利于注射。取50μL新鲜的农杆菌菌液，加入700μLYEP（50mg.L^-1Rif和100mg.L^-1Kan）培养基，过夜培养；4000rpm离心3min，收集菌体；用MMA重悬液重悬菌体，调整菌液浓度为OD=1.0，室温放置2h；用1mL注射器注射烟草叶片背面，做好标记。正常培养2天后，用荧光显微镜观察并拍摄照片。结果显示pBI121-GFP空载体对照产出的GFP绿色荧光分布于整个细胞中，呈组成型表达；而在整合有pBI121-LcFLC-GFP融合蛋白的细胞中，GFP绿色荧光仅分布在细胞核中，结果表明LcFLC基因仅定位于细胞核中（图6）。

实施例4构建含LcFLC基因的植物超表达载体，经花粉管通道法转入拟南芥，进一步验证AcFT基因的功能。具体构建方法如下。

1.载体构建及转化实验选择BamHⅠ和SacⅠ两个酶切位点，将目的基因连接替换GUS基因。设计上游引物带有BamHI酶切位点和下游引物带SacI酶切位点的基因特异性植物表达载体构建引物，用于扩增基因的编码区。

LcFLC-GUS-F：CACGGGGGACTCTAGAATGGGCCGGAGGAAGTTGCAG，

LcFLC-GUS-R：TCCTTTACCCATCCCGGGTTTTAGCAAGGAAAGGGTAGCC。

使用In-fusion?HDCloningKit连接酶将LcFLC基因连接到pBI121载体上，获得构建好的35S启动子驱动的LcFLC基因的植物表达载体，命名为pBI121-LcFLC。通过冻溶法将其转化农杆菌EHA105菌株感受态细胞。

2.拟南芥的转化本实验采用农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法。将正确的农杆菌菌液扩大培养至细菌OD600值大于2.0时，收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液，将处于盛花期拟南芥小心地反扣在渗透液中，让其花蕾完全浸入农杆菌悬浮液中大约30s。然后避光培养24h后将植物放置在适宜的条件下培养至种子成熟，分批采集种子后进行下一步的筛选处理。

3.转基因拟南芥种子的筛选及PCR检测在无菌条件下，将种子消毒后在含有Kan的固体培养基上筛选获得抗性的阳性植株，转移至新的基质中，放置在光照培养室，21℃、长日照（l6h：8h）条件下继续培养。待植株长出较多叶片后，每棵拟南芥植株采集1个叶片，分别对转基因植株进行PCR鉴定。根据电泳结果，除去假阳性植株，待阳性植株成熟后，收集种子，37℃烘干，即为T0代种子。然后继续筛选T0代种子，获得阳性植株后，收集到T1代种子，随后将T1代种子播种，得到T2代植株，用于观察表型。同时，播种哥伦比亚野生型作为阴性对照。从转基因拟南芥的表型可以看出（图7），该35S::LcFLC株系均呈现营养生长期延长和开花时间延迟的现象，转基因植株在长日照条件下比野生型成花时间要晚10天左右，莲座叶的数目也有所增加。这些结果说明LcFLC具有延迟开花的功能，是荔枝开花过程中的抑制基因。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国热带农业科学院南亚热带作物研究所

<120>一种延迟植物开花时间基因LcFLC及其应用

<160>2

<211>576

<212>DNA

<213>荔枝

<400>1

1atgggccggaggaagttgcagctgaagcgaatcgagaacaagagcagccgccaggtcacc

61ttctccaagcgccgtactggattgatcaagaaggctcgcgagctcgccgtcctctgcgac

121gtcgatgtagctctcgtcatcttctccagccgcggcaagctctacgagttctccagcgcc

181aacagtttgcccagcatcctggaccgctaccggagtcgctttgaagaggaagctctggct

241gtgaacagtgttaatgcagagggctctcaatctaaacattcaagtctgcattcacatgct

301cagctgttgcaaatagttcaaaggcaacttgaagggcaaaactttgagcagatgactgtg

361acctgtcttgtccaactagagaaacaacttgatgctgcgctgacacaaaccagagctaga

421aagacacaactgatgatggaatcaatagtgaccctccatgagaaggaaagggcacttaga

481gaggaaaaagcgcgtctagaaagcgagattgcagcattgaagaatggcactgacacatct

541gggggagcaatggctaccctttccttgctaaaatga

<211>191

<212>氨基酸

<213>荔枝

<400>2

MetGlyArgArgLysLeuGlnLeuLysArgIleGluAsnLysSerSerArgGlnValThr

15101520

PheSerLysArgArgThrGlyLeuIleLysLysAlaArgGluLeuAlaValLeuCysAsp

2125303540

ValAspValAlaLeuValIlePheSerSerArgGlyLysLeuTyrGluPheSerSerAla

4145503560

AsnSerLeuProSerIleLeuAspArgTyrArgSerArgPheGluGluGluAlaLeuAla

6165707580

ValAsnSerValAsnAlaGluGlySerGlnSerLysHisSerSerLeuHisSerHisAla

81859095100

GlnLeuLeuGlnIleValGlnArgGlnLeuGluGlyGlnAsnPheGluGlnMetThrVal

101105110115120

ThrCysLeuValGlnLeuGluLysGlnLeuAspAlaAlaLeuThrGlnThrArgAlaArg

121125130135140

LysThrGlnLeuMetMetGluSerIleValThrLeuHisGluLysGluArgAlaLeuArg

141145150155160

GluGluLysAlaArgLeuGluSerGluIleAlaAlaLeuLysAsnGlyThrAspThrSer

161165170175180

GlyGlyAlaMetAlaThrLeuSerLeuLeuLys

181185190

Claims (8)

1.一种从荔枝中分离得到的成花调节基因LcFLC基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的LcFLC基因，其特征在于：所述LcFLC基因编码的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示，其含有MADS家族典型的结构域。

3.根据权利要求1或2所述的LcFLC基因，其特征在于：所述LLcFLC基因编码氨基酸同源性与枳中PtFLC编码的氨基酸序列同源性为60.76%。

4.根据权利要求1所述的LcFLC基因，其特征在于：LcFLC基因定位在细胞核中。

5.根据权利要求1所述的LcFLC基因，其特征在于：所述LcFLC基因在荔枝成熟叶片、幼叶、叶芽、花穗和韧皮部中均有表达，其表达量顺序依次为：10月份幼叶>10月份成熟叶片>2月份幼叶>2月份成熟叶片>叶芽>花芽>花穗>韧皮部。

6.根据权利要求5所述的LcFLC基因，其特征在于：荔枝叶片中，所述LcFLC基因的表达量在低温诱导后开始迅速下降，8周时达到最低值，并一直维持在较低水平直至开花；在顶芽中，所述LcFLC基因的表达量一直维持在较低水平。

7.根据权利要求1或2所述的LcFLC基因，其特征在于：所述LcFLC基因在延迟或抑制植物开花时间方面的应用。

8.一种权利要求1或2中所述的LcFLC基因在调节拟南芥开花中的应用，其特征在于：所述LcFLC基因与pBI121载体相连后得到重组质粒，通过冻融法转化农杆菌，经花粉管通道法转化拟南芥后，抑制拟南芥平均开花时间延迟10天。