CN102618540A

CN102618540A - 调控十字花科植物开花时间的物质和方法

Info

Publication number: CN102618540A
Application number: CN2011100334884A
Authority: CN
Inventors: 何玉科; 张绍峰; 孙传宝
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2012-08-01

Abstract

本发明涉及调控十字花科植物开花时间的物质和方法。具体而言，本发明涉及含有SEQ ID NO：13所示序列的多核苷酸序列、含有该序列的多核苷酸构建物、转化体，调控十字花科植物开花时间的方法，以及所述序列或构建物的用途。

Description

调控十字花科植物开花时间的物质和方法

技术领域

本发明属于调控十字花科植物开花时间领域，具体涉及调控十字花科植物开花时间的物质和方法。

背景技术

大白菜(Brassica rapa.pekinensis)是一种重要的蔬菜作物，其营养生长阶段分为四个发育时期：幼苗期、莲座期、包心期和结球期。这种二年生草本植物需要经历一个冬天才能开花，植物经过低温处理后，到第二年春天开花，这个过程叫春化。

在大白菜营养生长的任一时期，只要有20-50天的低温环境(10℃以下)，植株就能通过春化作用进入生殖生长阶段。在生产上，“未熟抽薹”是造成大白菜产量和品质损失的一大难题，其原因是植株在结球期和结球期之前就通过春化作用而抽薹，导致植株无法结球和形成散球。为了保证产品器官-叶球的充分发育和产量形成，育种家往往将晚抽薹作为一个重要育种目标，而栽培者则通过播种期的安排避免大白菜生殖生长阶段的到来。

在拟南芥中，FLOWER LOCUS C(FLC)作为一种重要的开花抑制蛋白负调控春化作用，参与植株从营养生长向生殖生长的转化过程。拟南芥生态型Col自身FLC表达较弱，所以不经过春化也可以开花。但在一些突变体中发现FLC表达会上调。通过对突变体的鉴定发现对FLC表达起促进作用的FRI，和对FLC表达抑制的FCA，FLD，LD，FVE。其中FRI(FRIGIDA)可协调mRNA的5’帽子结构与Paf(PolII-associated factor complex)的相互作用而起到修饰染色质的作用；FCA是个有RNA结合结构域的蛋白，它对mRNA的poly(A)尾巴形成起作用；FLD(FLOWERING LOCUS D，a homolog of the humanlysine-specific demethylase 1(LSD1))是催化组蛋白H3K4位点上去甲基化的酶。除了这些调控FLC表达的蛋白外，对FLC表达起明显调控效果的环境因素是低温处理，即春化。春化中FLC表达受抑制主要通过诱导表达FLC基因区域的非编码RNA的表达，然后由非编码RNA介导组蛋白甲基化，从而在表观遗传上抑制FLC的表达。FLC在春化中受到表观遗传学上的抑制，主要是激活型组蛋白修饰(乙酰化，H3K4me3)的消失，和抑制型组蛋白修饰(H3K9me3，H3K27me3)的增加。VIN3只在拟南芥春化过程中表达，它结合FLC的启动子和第一个内含子区域，导致在春化中，该区域的组蛋白去乙酰化(Wood et al.，2006)。组蛋白的H3K4me3去甲基化由FLD(FLOWERING LOCUS D，a homologof the human lysine-specific demethylase 1(LSD 1))催化的(Liu et al.，2007)。VRN2(Gendall et al.，2001)和LHP1(Sung et al.，2006)分别通过调节H3K27me3和H3K9me3甲基化来维持FLC的抑制状态。非编码的RNA同样会参与到FLC在春化中的表观遗传学抑制，其中就包括FLC的反向转录本和反向转录本启动子区域的短RNA。

研究发现，拟南芥植株体内存在一种非编码的FLC反义转录本(Naturalantisence transcripts，NATS)，它与FLC正义转录本的表达水平有关。拟南芥的天然反向转录本最早在2003年通过Tilling发现的。2007年通过Northern blot在FLC3’端杂交得到两条小RNA，大小分别为24nt和30nt，方向相反。2009年Nature报道了拟南芥FLC两个反向转录本的序列，该小RNA的产生位置不在反向转录本的第一个外显子内，位于反向转录本的启动子区域，同样小RNA位于FLC正向转录本Poly(A)尾巴后面，所以可以排除是Nat-siRNA(Swiezewskiet al.，2007)。由于它位于反向转录本启动子附近，它有可能属于动物中报道的启动子区域的短RNA(PASRs)，FLC3’端的短RNA是否会介导组蛋白甲基化，有待于进一步的研究。

大白菜和拟南芥同属于十字花科植物，亲缘关系较近。大白菜(Brassicarapa)是严格需要春化才能开花的，和拟南芥相比，大白菜中FLC的表达量要高。2007年(Kim et al.，2007)报道大白菜基因组中共有3个FLC，即BrpFLC1、BrpFLC2、BrpFLC3。其中BrpFLC2位于2号染色体上，BrpFLC1位于10号染色体上，BrpFLC3位于3号染色体上。它们在春化中都会受到表观遗传上的抑制，从而起始开花基因的表达。

2007年NCBI上公布了大白菜FLC，BrpFLC2的反向转录本的EST序列(EX096192)。但cDNA文库的材料来源不是春化中的大白菜，而是软腐菌侵染24小时内的大白菜叶片。

发明内容

为了深入了解大白菜春化作用的分子机制，我们启动了大白菜FLC正向和反向转录本的分离和功能研究。从大白菜早抽薹(早薹zaotai)和晚抽薹(晚薹wantai)基因型中，我们分别克隆了4个FLC同源基因和一个天然反向转录本。FLC同源基因分别被命名为BrpFLC1(Genbank登陆号AY115678)、BrpFLC2(Genbank登陆号AY205317)、BrpFLC3(Genbank登陆号AY115677)和BrpFLC5(Genbank登陆号AY115675)，而一个反向转录本被命名为BrpFLC2as(Genbank登陆号EX096192)。有趣的是，早抽薹基因型和晚抽薹基因型所有FLC同源基因和反向转录本的基因组序列完全一致，表明大白菜早抽薹和晚抽薹的性状不是由于两个基因型FLC基因的序列差别造成的。

对早抽薹基因型zaotai和晚抽薹基因型wantai的幼苗分别进行低温春化处理。Northern blotting的检测结果表明，在BrpFLC基因3’端下游有150nt的短片段RNA，它在春化末期的叶片，及花和果荚中表达较高。由于它产生的位置位于反向转录本的启动子区域，所以推测其可能是类似动物中报道的promoter-associated short RNA作用于BrpFLC2as的启动子区域。这样，BrpFLC基因的3’端的短非编码RNA参与了春化中BrpFLC的表观遗传抑制。Northern杂交显示，在早抽薹和晚抽薹基因型的3’UTR下游存在150nt短片段RNA与BrpFLC基因方向转录本有重叠区域。在花和果荚中表达较高，在未春化的叶中表达较低。随着春化的进行，表达量逐渐升高。预测该短片段RNA会像动物中promoter-associated short RNAs那样结合SUZ12，从而介导组蛋白H3K27me3的甲基化。免疫共沉淀的结果证明，低温诱导BrpFLC2的基因中间部分H3K27me3的甲基化。

根据大白菜早抽薹和晚抽薹基因型春化作用的特点、BrpFLC基因3’端下游非编码的短片段RNA的表达方式及其在拟南芥转基因植株中的功能，我们提出了BrpFLC2的3’端非编码RNA通过介导大白菜春化作用来调节大白菜开花时间。我们的研究结果对于遗传上改良大白菜开花时间和产品器官的形成提供可靠地理论依据。

因此，本发明第一方面提供一种分离的多核苷酸序列，选自：

(a)含SEQ ID NO：13所示序列的多核苷酸序列；

(b)对(a)所述的序列进行一个或几个碱基的取代、缺失、插入修饰所获得的多核苷酸序列，该多核苷酸序列能够调节十字花科植物春化作用；

(c)与(a)或(b)所述多核苷酸序列互补的序列；和

(d)在严格条件下与(a)、(b)或(c)所述序列杂交的核苷酸序列。

在一具体实施方式中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

本发明第二方面提供一种多核苷酸构建物，所述多核苷酸构建物含有本发明所述的多核苷酸序列。

本发明第三方面提供一种转化体，所述转化体转化了本发明所述的多核苷酸构建物。

在一具体实施方式中，所述转化体选自十字花科植物的细胞、组织和器官。

本发明第四方面提供一种调控十字花科植物开花时间的方法，所述方法包括调控所述十字花科植物中SEQ ID NO：13所示的序列或其同源序列的表达，从而调控该十字花科植物的开花时间。

在一具体实施方式中，所述方法包括抑制所述十字花科植物中SEQ IDNO：13所示的序列或其同源序列的表达，从而推迟该十字花科植物的开花时间。

在一具体实施方式中，所述方法包括提高所述十字花科植物中SEQ IDNO：13所示的序列或其同源序列的表达，从而促进该十字花科植物的开花时间。

在一具体实施方式中，所述十字花科植物选自：自大白菜、青菜、甘蓝、油菜和萝卜。

本发明第五方面提供本发明所述的多核苷酸序列或多核苷酸构建物在调控大白菜FLC2基因或其同源基因的基因中间部分H3K27me3的甲基化中的应用。

本发明第六方面提供一种制备转基因十字花科植物的方法，所述方法包括：

(1)构建能过表达SEQ ID NO：13所示的序列或其同源序列的多核苷酸构建物，或能敲除或突变SEQ ID NO：13所示的序列或其同源序列的多核苷酸构建物；

(2)将步骤(1)所获得的多核苷酸构建物转入植物细胞、组织、器官或种子，获得SEQ ID NO：13所示的序列或其同源序列过表达、弱表达或不表达的植物细胞、组织、器官或种子；和

(3)将步骤(2)获得的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

“弱表达”指与野生型的表达相比，SEQ ID NO：13或其同源序列的表达弱。

附图说明

图1显示Northern Blot杂交结果。结果显示，FLC基因3’-UTR下游存在与BrpFLCas同源的短片段RNA。

图2显示probe a对应区域的5’和3’各设计探针做Northern Blot。

图3显示Northern杂交结果，结果显示BrpFLC2基因3’UTRecht下游短片段RNA的表达模式，探针为probe a。

图4显示Chip结果，结果显示在白菜植株春化13天时，BrpFLC基因内部存在H3K27me3甲基化。

图5显示BrpFLC基因可能存在甲基化的区域，分别对应PCR的引物为，1和2；3和4；5和6。其中，1：bfgd5；2：BrpFLC-22a；3：BrpFLC-1993s；4：BrpFLC3；5：probes；6：bfgd3；其中1和2引物扩启动子区域的352bp，3和4引物扩基因内部的192bp，5和6引物扩基因3’端的147bp。

图6显示十字花科中大蒜芥属的水蒜芥(Sisymbrium irio，Si)和芸薹属的甘蓝(Brassica oleracea，Bo)中的同源序列与大白菜(Br)的序列对比结果。

具体实施方式

本发明中，术语“调控”指采用生物学手段人为地控制十字花科植物春化作用或开花时间。

本发明中，调控的方法可包括采用基因工程技术过表达SEQ ID NO：13所示的序列或其同源序列，或通过转入能敲除或突变SEQ ID NO：13所示的序列或其同源序列的多核苷酸构建物，从而抑制其表达，控制开花时间。过表达和转入各种多核苷酸构建物以敲除或突变基因的方法是本领域周知的。

本发明中，十字花科植物包括但不限于大白菜、青菜、甘蓝、萝卜等。

本发明包括在其它十字花科植物中发现的SEQ ID NO：13的同源序列。同源序列在本文中指表明两个或多个蛋白质或核苷酸序列可能具有相同的祖先，且有相似的功能。蛋白质和DNA的同源性常常通过它们序列的相似性来判定。例如，如果两个基因有着几乎一样的DNA序列，那么它们很可能同源。

可以序列同一性来定义本文的同源序列。换言之，本发明包括表现出SEQ IDNO：13具有相当大百分比序列同一性的多核苷酸分子。尤其感兴趣的是这样的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子在十字花科植物中发挥功能以介导十字花科植物的春化作用，并且与SEQ ID NO：13具有至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约90％序列同一性或甚至更高(例如94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性。

“百分比序列同一性”指当两个序列得到最佳比对时(具有适当的核苷酸插入、缺失或在比较窗口中总计低于参照序列20％的缺口)，与测试多核苷酸分子(或其互补链)相比，参照多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分数。最佳序列比对为本领域技术人员所熟知，并且可以通过工具(例如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的搜索相似性方法)实施，并优选通过计算机化执行这类算法(例如作为GCG Wisconsin Package(Accelrys Inc.，SanDiego，CA)的部分提供的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)而实施。测试序列和参照序列比对片段的“同一性分数”是两个比对序列共有的相同组分的数目除以参照序列片段(即整个参照序列或参照序列中详细说明的较小部分)中的组分总数目。将百分比序列同一性表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列可以与全长多核苷酸序列或其部分、或与更长的多核苷酸序列比较。

当多核苷酸分子在特定条件下特异性地杂交以形成双链体分子时，它们是同源的。在这些条件下(称为严格条件)，一个多核苷酸分子可以用作鉴定共有同源性的另一个多核苷酸分子的探针或引物。短语“严格条件”是关于核酸探针与靶核酸(即与特定的目的核酸序列)通过特定杂交程序杂交而功能性定义的，所述杂交程序在Sambrook等人(2000)中进行讨论。因此，本发明的核苷酸序列可以因其与多核苷酸分子片段的一段互补序列选择性地形成双链体分子的能力而得到利用。

根据设想的应用，人们需要采用不同的杂交条件以获得探针对靶序列的不同程度的选择性。对于要求高选择性的应用，人们一般需要采用相对的高严格条件以形成杂交体，例如，人们将选择相对低盐和/或高温条件，例如在约50℃至约70℃温度、约0.02M至约0.15M NaCl所提供的条件。例如，高严格条件是以高严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC，0.1％SDS，65℃)将杂交过滤器(filter)洗涤至少两次。促进DNA杂交的合适的中等严格性条件为本领域技术人员所公知，例如约45℃、6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后为50℃的2.0xSSC洗涤。另外，可以从50℃、约2.0xSSC的低严格性至50℃、约0.2xSSC的高严格性选择洗涤步骤中的盐浓度。另外，可以从室温(约22℃)的低严格性条件至约65℃的高严格性条件增加洗涤步骤中的温度。温度和盐均可以变化，或者可以保持温度或盐浓度恒定而改变另一个变量。这样的选择性条件允许探针和模板或靶链之间的很少的错配。通过杂交检测多核苷酸分子为本领域技术人员所熟知，且美国专利4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法的示例。

也可以通过计算机程序确定同源性，所述计算机程序比对多核苷酸序列并评价多核苷酸分子在确定的严格性条件下形成双链体分子的能力。将共有高同源性程度的不同来源的多核苷酸分子称为“同源的”。

在另一个实施方案中，可以修饰或改变如SEQ ID NO：13所示的多核苷酸序列。改变多核苷酸序列的一个优选方法是使用PCR以修饰序列中所选核苷酸或区域。这些方法为本领域技术人员所熟知。可以在基于PCR的DNA修饰方法中通过例如模板序列的插入、缺失或置换而修饰序列。在本发明的上下文中，“变体”是含有变化的多核苷酸序列，在所述多核苷酸序列中，优选在基本保持该多核苷酸序列功能的同时缺失、添加和/或替代原始启动子的一个或几个核苷酸。例如，可以从启动子5’或3’末端缺失一个或几个碱基以产生“截短的”启动子。可以在启动子内部插入、缺失或替代一个或几个碱基。

本文所用的“构建物”指来自任何来源的任何重组多核苷酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环形单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，其能够进行基因组整合或自主复制，包含其中一个或多个多核苷酸分子以功能上可操作的方式连接的多核苷酸分子。在某些具体实施例中，本发明的构建物是一种载体，优选为表达载体。

本文所用的“可操作地连接”指第一个多核苷酸分子(例如启动子)与第二个可转录的多核苷酸分子(例如目的基因)连接，其中多核苷酸分子如此排列，从而第一个多核苷酸分子影响第二个多核苷酸分子的功能。优选地，两个多核苷酸分子是单个连续多核苷酸分子的部分，且更优选是临近的。例如，如果启动子在细胞内调节或介导目的基因的转录，则该启动子与目的基因可操作地连接。

本文所用的“可转录的多核苷酸分子”指能够被转录为RNA分子的任何多核苷酸分子。已知以使可转录的多核苷酸分子被转录为功能mRNA分子的方式将构建体引入细胞的方法，所述功能mRNA分子得到翻译并从而表达为蛋白质产物。为了抑制特定的目的RNA分子的翻译，也可以构建能够表达反义RNA分子的构建体。为了实施本发明，制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法为本领域技术人员所熟知，见例如Sambrook等人。

本发明的构建物一般可以含有与可转录的多核苷酸分子可操作地连接的启动子，该可转录的多核苷酸分子与3’转录终止多核苷酸分子可操作地连接。另外，构建物可以包括但不限于来自植物基因3’-非翻译区(3’UTR)的额外的调节多核苷酸分子(例如，增加mRNA的mRNA稳定性的3’UTR)。构建体可以包含但不限于mRNA多核苷酸分子的5’非翻译区(5’UTR)，所述5’非翻译区在翻译起始中具有重要作用，并且也可以是植物表达构建体中的基因组分。

术语“转化的”指已引入了外来多核苷酸分子例如构建物的细胞、组织、器官或生物。优选将引入的多核苷酸分子整合到受体细胞、组织、器官或生物的基因组DNA中，从而使引入的多核苷酸分子由后代遗传。因此，本文中，“转化体”包括引入或转化了本发明的启动子序列或构建物的各种细胞、组织和器官。所述细胞、组织和器官可无法独自繁育成单个植株。“转基因的”或“转化的”细胞或生物也包括细胞或生物的后代，以及在杂交中采用这样的转基因植物作为亲本、并表现出由于存在外来多核苷酸分子而产生的改变的表型的育种程序产生的后代。可以通过任何植物转化方法将含有本发明启动子的植物转化构建体引入植物。在本发明的实践中通过将植物表达构建体引入植物基因组而转化植物的方法和材料可以包含任何公知的和经过证明的方法，包括美国专利5384253中说明的电穿孔；美国专利5015580、5550318、5538880、6160208、6399861和6403865中说明的微粒轰击；美国专利5635055、5824877、5591616和5981840说明的土壤杆菌介导的转化；以及美国专利5508184中说明的原生质体转化，所有这些专利都在此引用作为参考。

因此，本发明包括采用基因工程方法调控十字花科植物春化作用，例如，采用上文所述的转化方法转入所需的多核苷酸构建物至植物的任何一部分中，包括细胞、组织、器官或生物的基因组DNA中，使其所述多核苷酸构建物在该部分中表达所需的基因，如本文所述的SEQ ID NO：13或其同源序列，由此控制春化作用，促进早抽薹或晚抽薹。转化的时间可由本领域技术人员根据本领域常规技术进行选择。

1.材料与方法

1.1材料

大白菜早薹zaotai和晚苔wantai两个大白菜品种(种子来自上海孙桥农业科技有限公司)抽薹特性不同。早薹zaotai在低温下处理15-20天即可通过春化作用而抽薹，晚苔wantai则需要75天以上的持续低温处理才能通过春化作用而抽薹。用于转基因和性状观察的拟南芥生态型为Columbia和C24。

1.2植株培养

将大白菜早薹zaotai和晚苔wantai自交系的幼苗置于3-5C℃的低温下春化30天，晚苔wantai自交系在同样的低温下处理75天，其间分别取叶片组织检测BrpFLC2基因和反向转录本BrpFLas-1在春化过程中的表达。在低温处理前、处理12天时、处理29天、处理50天和90天分别测定植株生长状况和提取RNA样品。

1.3RNA提取

Trizol提取RNA步骤：

1)液氮中将材料研磨充分。

2)研磨好的材料转到EP管中，加1ml Trizol。

3)震荡，室温放置10分钟。

4)加入0.2ml氯仿，震荡，室温放置10分钟。

5)4℃，12000rpm，离心10分钟。

6)取上清，加入1倍体积异丙醇，混匀，冰上放置15分钟。

7)4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清。

8)70％乙醇洗一次，离心(4℃，12000rpm，5分钟)，弃上清。超净台吹干。

9)用30μl DEPC处理过的水溶解，-70℃存放。

冷酚法(适用于糖分含量多的材料，如花和果荚)提取RNA步骤：

1)在液氮中研磨材料至粉状，转入离心管中，冰上加抽提液500μl。加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，冰浴1小时，每隔10分钟振荡一次。

2)14000rpm，4℃离心15分钟，取上清，加等体积酚∶氯仿∶异戊醇，冰浴5分钟。

3)重复步骤2，直至有机相和水相无蛋白质为止。

4)加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，14000rpm 4℃离心15分钟。

5)取上清，加0.5倍体积的高盐溶液和0.5倍体积的异丙醇，混匀后-70℃1小时。

6)14000rpm 4℃离心20分钟，去上清，沉淀溶于150ul H₂O中。

7)14000rpm 4℃离心10分钟，取上清转至一新管中。

8)加入1/3体积的8M LiCl，-20℃过夜沉淀RNA。

9)14000rpm 4℃离心15分钟。

10)沉淀用70％乙醇洗两次。

11)50μl H₂O溶解RNA。

试剂：

抽提液：1M Tris-HCl，50mM EDTA，pH 8.0

高盐溶液：0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl

eDNA合成步骤：

反转录体系：(20μl)

5X AMV缓冲液 4μl

2mM dNTP 10μl

20μM oligo dT₁₈ 1μl

RNA 2μl

RNase抑制剂 0.5μl

AMV 1μl

DEPC水 1.5μl

25℃10分钟，42℃反应1小时，94℃5分钟。

1.4Northern杂交

7.5％聚丙烯酰胺胶的配置

7.5％聚丙烯酰胺胶工作液(75ml)

Urea 31.5g

40％丙烯酰胺化合物 14ml

(38g/100ml丙烯酰胺，2g/100ml N，N’-亚甲基二丙烯酰胺)

5×TBE 15ml

H₂O 23.5ml

配胶

工作液：10ml

10％AP：50μl

TEMED：10μl

加样缓冲液用尿素饱和，尽量保证RNA的上样量在10μg以上。

电泳

1×TBE，80V，2小时

转膜

0.5×TBE，28mA，过夜

紫外交联2分钟，80℃烘膜2小时

杂交液100ml(2张膜)

SDS 7g

Na₂HPO₄.12H₂O 12.24g

NaH₂PO₄.2H₂O 2.46g

0.5M EDTA 200μl

BSA 1g

γ-P32ATP末端标记探针

H₂O 21μl

PNK 1.5μl

10×buffer 3μl

Probe 2μl

γ-P32ATP 3.5μl

洗膜：

1×SSC和1％SDS洗膜3次，压磷屏。

探针序列：

bfas5：ggtagttcttctgtcttcacc(S EQ ID NO：1)

probe a：atggccacgtctctctctactgcaa(SEQ ID NO：2)

probe b：gatacaaagttaattggcgtaaacacac(SEQ ID NO：3)

probe c：cccatgacaatgcgcgctttagata(SEQ ID NO：4)

1.5染色质免疫共沉淀

甲醛交联

将新鲜叶片放到50ml 1％的甲醛(1.35ml 37％甲醛，48.65ml H₂O)中，在真空泵中抽真空10分钟，然后加入0.375g甘氨酸(终浓度0.1M)室温5分钟解交联。样品用蒸馏水洗3遍后，液氮冻存。

提染色质

将叶片在液氮中磨碎，加入3ml缓冲液(0.4M suc，10mM Tris-HClpH8.0，10mM MgCl₂，5mM B-巯基乙醇)，用4层纱布滤去细胞壁等杂质，渗出的液体转到新的离心管中，4C，12000rpm，离心10分钟。去上清，沉淀用缓冲液(0.25M suc，10mM Tris-HCl pH8.0，10mM MgCl₂，1％Triton100，5mM B-巯基乙醇)洗一遍，4C，12000rpm，离心10分钟。沉淀再在buffer(1.7M suc，10mMTris-HCl pH8.0，0.15％Triton 100，2mM MgCl₂)中重悬，4C，16000g，离心1小时。

超声波打碎染色体

将沉淀融入200微升核裂解buffer(50mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA，1％SDS)中，冰上放置10分钟。然后超声波破碎(15秒工作/60秒间隙，重复5次)。4C，12000rpm，离心30分钟，取上清。

免疫沉淀

将上清转到新的离心管中，加800微升的缓冲液(1.1％Triton100，1.2mMEDTA，16.7mM Tris-HCl pH8.0，167mM NaCl)，再加入40微升protein-A agarosebeads，4℃放置1小时。2300g，离心1分钟。上清分成两份，每份500微升，其中一份加入5微升H3K27me3的抗体，另一份不加，4℃放置过夜。第二天，每管加入30微升50％proteinA-agorose beads，4℃放置1小时。

清洗

分别用低盐缓冲液、高盐缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和TE缓冲液清洗珠。

溶解DNA

加入250微升chip elution buffer(1％w/v SDS，0.1M Na-HCO3)，65℃，15分钟。重复一次，合并上清。

解交联

500微升的上清中加入20微升5M NaCl，在65℃水浴锅中放置6-8小时。然后加入蛋白酶K，55℃处理2小时。

DNA纯化

DNA通过酚，氯仿抽提，和酒精沉淀来纯化。纯化好的DNA加入50微升水。

引物的序列及在BrpFLC基因组DNA上的位置

bfgd5：ggtaccccatagtatttgagatctaaccat(SEQ ID NO：5)

BrpFLC-22a：cttctgtctccgagaagcct(SEQ ID NO：6)

BrpFLC-1993s：ggacaggatcttcagtcaaa(SEQ ID NO：7)

BrpFLC3：gagtcgacgcttacatcaga(SEQ ID NO：8)

probes：ttgcagtagagagagacgtggccat(SEQ ID NO：9)

bfgd3：ggtaccgaatattaagaactcggcctactg(SEQ ID NO：10)

PCR程序

94℃ 3min

94℃ 30sec

58℃ 30sec

72℃ 30sec

35轮

72C 10min

2结果与分析

2.1BrpFLC基因3’UTR下游短片段RNA

2007年通过Northern blot在拟南芥FLC基因3’-UTR下游杂到一个24ntsRNA。它的方向与FLC转录的方向相反，与之互补的探针的序列为：agggacgtggctctctctctctctc(SEQ ID NO：11)。sRNA在花和果荚中表达较高，sRNA产生区域的染色体是H3K9me2甲基化的，但文中并没有提及该sRNA与春化的关系。2009年底公布了拟南芥FLC两个反向转录本的全长序列，把反向转录本的5’端贴到基因组DNA上，可看到sRNA产生的位置不在反向转录本上，而位于反向转录本的启动子区域。进一步验证24nt sRNA是通过RNA聚合酶IVa，RNA-依赖性RNA聚合酶2，和DICER-LIKE3途径产生的，但产生该sRNA的模板来源仍是个问题。2007年的文章中还提到在FLC3’区域存在一个30nt的sRNA。它是通过用FLC基因3’-UTR下游区域300bp的DNA片段制作的随机探针杂到的，文章报道了30nt sRNA的产生机制与24nt的不同，30nt sRNA的具体产生机制仍不清楚。2010年在动物Polycomb target gene的5’端发现存在50-200nt的短RNA(promoter-associated short RNA)，这些短RNA的二级结构可以结合SUZ12，从而招募polycomb complexes来修饰基因启动子区域的组蛋白H3K27me3甲基化。拟南芥3’端存在一些小RNA，其中部分小RNA的来源机制并不清楚，它们的位置正好是反向转录本的启动子区域，那么这些RNA是否属于promoter-associated short RNA一类，并介导了春化中FLC染色体上组蛋白H3K27me3的甲基化，如果该机制存在，它也适用于大白菜BrpFLC的3’端。

通过搜索大白菜BrpFLC3’区域的序列，我们找到与拟南芥24ntsRNA探针的同源序列：atggccacgtctctctctactgcaa(SEQ ID NO：12)，它对应于反义链，如果用它作探针杂到的RNA应该是正向的。我们以此序列制作探针，通过Northern blot在大白菜花，果荚，和春化中叶片中检测到150nt左右的短RNA。为了证明该短RNA参与了春化过程中BrpFLC组蛋白H3K27me3的甲基化，我们通过染色质共沉淀检测春化中BrpFLC组蛋白H3K27me3的甲基化情况，看甲基化程度是否与短RNA表达量吻合。

2.2Northern Blot检测BrpFLC 3’-UTR下游短片段RNA

07年的研究报道拟南芥FLC基因3’-UTR下游存在一个非编码小RNA片段，我们利用该小RNA片段互补的序列作为探针Probe a(图1)，做Northernblot在大白菜BrpFLC基因的3’端序列上杂到大小在150nt的RNA片段，序列分析发现，我们找到了与拟南芥FLC基因3’-UTR下游非编码小RNA片段同源的大白菜中的小RNA同源片段，与拟南芥不同的是它位于反义链上，并且它对应于BrpFLC反向转录本的第一个外显子。以此探针做Northern blot在比热和大散叶的花中都能杂到150nt大小的短RNA，在比热中有两条带，在大散叶中有一条带。把该探针和U6探针放在一起作Northern blot，发现该短RNA的长度略大于U6，U6是102nt。

为了进一步确认该短RNA的精确序列，我们在探针probe a的左右两侧分别设计探针作Northern blot(探针的位置如图2所示)。数字表示核苷酸相对于克隆的BrpFLC基因组DNA片段4093bp中所在的位置。结果表明，probe a 5’端的探针杂bfas5没有信号，而3’端的探针probe b能够杂到相同位置的条带。说明probe a所对应的序列已经位于短RNA的5’端。进一步用探针probe b对应片段位置3’端的探针probe c做Northern blot，能够杂到相同位置的条带，但明显信号非常弱，说明探针probe c部分对应于该小RNA片段3’端位置。这样我们基本上把该小RNA片段序列范围确定下来。

在早薹zaotai中检测短RNA的表达模式，用的材料包括6叶期没有春化的成熟叶，春化12天和30天的叶，花和果荚。发现短RNA在花和果荚中表达较高，在未春化的叶中表达较低(图3)。随着春化的进行，表达量逐渐升高。

2.3BrpFLC染色体上组蛋白H3K27me3甲基化

为了解BrpFLC甲基化的情况，我们采用染色质免疫共沉淀的方法检测春化中早薹zaotai的BrpFLC2染色体上组蛋白H3K27me3甲基化。在低温处理前，BrpFLC2的基因中间的部分(图4中引物P3和P4之间的序列)不存在H3K27me3甲基化。在春化13天的早薹zaotai成熟叶中，BrpFLC2的基因中间的部分(引物3和4之间的序列)存在H3K27me3甲基化，而在BrpFLC2的5’和3’区域未发现H3K27me3甲基化。这个结果说明，低温诱导BrpFLC2的基因中间部分(图4中引物P3和P4之间的序列)H3K27me3的甲基化。

低温春化过程中，BrpFLC 3’-UTR下游短片段RNA表达与BrpFLC2的基因中间部分H3K27me3的甲基化表现一致，根据已有文献报道，动物中发现的promoter-associated short RNA可以结合SUZ12，从而招募PRC2，导致产生短RNA片段的基因的染色体上H3K27me3甲基化，进而对该基因表观遗传上调控表达(Yap，K.L.，S.Li，etal.(2010).″Molecular interplay of the noncoding RNAANRIL and methylated histone H3lysine 27by polycomb CBX7in transcriptionalsilencing ofINK4a.″Mol Cell 38(5)：662-74.)。随着春化的进行，BrpFLC3’端的短RNA表达量升高，这提示了它参与春化过程中BrpFLC染色体上组蛋白H3K27me的甲基化，从而调节大白菜开花时间。

2.4BrpFLC 3’-UTR下游短片段RNA同源序列对比

我们将十字花科中大蒜芥属的水蒜芥(Sisymbrium irio，Si)和芸薹属的甘蓝(Brassica oleracea，Bo)中的同源序列与大白菜(Br)的序列进行对比，结果如图6。如图所示，同科不同属之间的植物中，该短RNA片段序列保守性很强。

3结论

BrpFLC基因3’-UTR下游短片段RNA与VRN2有相互作用，调控大白菜开花时间。

短RNA的序列延伸到BrpFLC反向转录本的5′末端外，所以可以排除短RNA是通过RNA-依赖性RNA聚合酶途径产生的。由于它产生的位置在BrpFLC反向转录本的启动子附近，所以我们推测它是类似动物中发现的promoter-associated short RNA。而且promoter-associated short RNA可以结合SUZ12，从而招募PRC2，导致产生短RNA基因的染色体上H3K27me3甲基化。随着春化的进行，BrpFLC3’端的短RNA表达量升高，这提示了它参与春化过程中BrpFLC染色体上组蛋白H3K27me的甲基化，从而调节大白菜开花时间。