WO2001032881A1 - GENE Hd1 LIE A LA PHOTOSENSIBILITE D'UNE PLANTE ET SON UTILISATION - Google Patents

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WO2001032881A1
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photosensitivity
protein
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Masahiro Yano
Yuichi Katayose
Takuji Sasaki
Risa Ishimaru
Takuichi Fuse
Motoyuki Ashikari
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National Institute Of Agrobiological Sciences
Bio-Oriented Technology Research Advancement Institution
Society For Techno-Innovation Of Agriculture, Forestry And Fisheries
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Definitions

  • the present invention relates to a gene involved in plant photosensitivity and a modification of plant photosensitivity using the gene. Modification of plant photosensitivity is useful in fields such as plant breeding. Background art
  • photosensitive genes genes that enhance rice photosensitivity are collectively referred to as “photosensitive genes”. So far, the existence of several photosensitive genes has been found as mutations or mutations inherent in cultivars, such as the Sel locus (chromosome 6; Yokoo and Fujimaki (1971) Japan. J. Breed. 21). : 35-39), El locus (chromosome 7; Tsai, KH (1976) Jpn. J. Genet. 51: 115-128, Okumoto, (1992) Jpn. J. Breed. 42: 415-429), E2 locus (unknown), E3 locus (chromosome 3 ?; Okumoto et al., The 9th Lecture Meeting of Japanese Society of Breeding. 47 (Alternative 1): 31), etc., suggest the existence of a photosensitive gene (Yamagata et al. (1986) In Rice Genetics, International Rice Research Institute, Manila, pp 351-359).
  • the rice photosensitivity gene Once the rice photosensitivity gene is isolated, it can be introduced into any cultivar by the transformation method to modify the photosensitivity of those lines and thereby regulate the heading time of rice. It is believed that there is. Therefore, it can be said that breed improvement using the gene is extremely advantageous in comparison with the conventional method in terms of simplicity and reliability. However, it is said that the gene involved in the photosensitivity was isolated in rice. No reports have been made yet. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide a novel plant photosensitive gene, particularly a rice-derived photosensitive gene. Another object of the present invention is to modify the photosensitivity of a plant by using the gene, thereby modifying the flowering time of the plant. Still another object of the present invention is to provide a method for evaluating photosensitivity of plants.
  • the present inventors have focused on rice, among which it is desired to develop a simple method for modifying the heading time, among plants, and have conducted intensive research to isolate genes involved in the photosensitivity.
  • Hdl one of the quantitative morphological loci (QTL) detected using the cross progeny of Nipponbare and Kasalath, is known to be located on chromosome 6.
  • QTL quantitative morphological loci
  • analysis using the near isogenic line of the Hdl region (allele of Kasalath) with the genetic background of Nipponbare indicates that the Hdl locus is a photosensitive locus.
  • chromosomal locations suggest that Hdl may be the same locus as the previously reported photosensitivity locus Sel, but there was no direct evidence.
  • the present inventors In order to isolate the photosensitive gene Hdl, whose presence is known but not yet identified, the present inventors first performed linkage analysis and a yeast artificial chromosome (YAC) clone. The Hdl gene region was aligned.
  • YAC yeast artificial chromosome
  • the present inventors aligned the Hdl gene region using a P1-derived artificial chromosome (PAC) clone. Specifically, by using DNA clones located in the vicinity of the region where the Hdl gene was found by the above analysis, two PAC clones thought to contain those nucleotide sequences were selected from the Nipponbare genomic library. Furthermore, when those clones were examined by PCR, it was found that one of the selected PAC clones, P0038C5, had the nucleotide sequences corresponding to S20418 and Y4836R and completely contained the Hdl locus (Fig. 1).
  • PAC P1-derived artificial chromosome
  • the present inventors have analyzed the nucleotide sequence of the PAC clone P0038C5, and as a result, have succeeded in narrowing the region where the Hdl candidate gene is considered to be about 12 kb.
  • Gene prediction and similarity search were performed on the nucleotide sequence of this candidate region, and the oxidase S2539 captured as a rice EST and the Arabidopsis CO (zinc finger domain), which functions to promote flowering under long-day conditions, were With It is thought to be a region that shows extremely high similarity to that of a transcription regulatory gene.
  • this Hdl candidate gene has the function of imparting photosensitivity to rice
  • the genomic region containing the gene was replaced with the Kasal ath type of the photogenic gene region possessed by Nipponbare to lose photosensitivity.
  • the strain was introduced into the strain and expressed.
  • heading was promoted under short-day conditions in individuals incorporating the candidate gene.
  • the photosensitivity was strong
  • heading was promoted under short-day conditions, and it was revealed that the Hdl candidate gene has a function to enhance photosensitivity.
  • the present inventors have succeeded in isolating a gene involved in plant photosensitivity, and have been able to modify plant photosensitivity using the gene.
  • the present inventors have found that it is possible to evaluate the photosensitivity of a plant using a gene, thereby completing the present invention.
  • the present invention more specifically relates to
  • MA which encodes a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3,
  • a transformed plant which is a progeny or clone of the transformed plant according to (10) or (11),
  • a method for increasing photosensitivity of a plant comprising expressing the DNA according to (1) or (2) in cells of a plant,
  • a method for reducing photosensitivity of a plant which comprises suppressing expression of the endogenous DNA according to any one of (1) and (2) in cells of a plant,
  • the present invention provides a DNA encoding a rice-derived Hdl protein.
  • the nucleotide sequence of Hdl genomic DNA from Nipponbare is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of the protein encoded by the DNA is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of Hdl genomic DNA of Ginbozu is shown in SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence of the protein encoded by the DNA is shown in SEQ ID NO: 3.
  • Hdl is one of the quantitative trait loci (QTL) detected using the progeny of the cross between Nipponbare and Kasalath, and was found to be located on chromosome 6.
  • QTL quantitative trait loci
  • the Hdl locus is a photosensitive locus.
  • the Hdl gene has the effect of reducing the number of days required from sowing to heading (heading time) under short-day conditions, and has the effect of increasing it under long-day conditions.
  • the Hdl gene of Nipponbare enhances photosensitivity and has the effect of growing late in field cultivation (close to long-day conditions).
  • the Hdl gene has been used as a gene involved in plant photosensitivity.
  • the present inventors have finally succeeded in elucidating the existing region through complicated steps and isolating the gene as a single gene.
  • heading control is an important breeding goal in Japanese rice breeding.
  • cold regions especially in cold regions, the low temperature of autumn comes early, so it is important to control the heading time to avoid cold damage.
  • southwest warm regions avoid concentration of harvesting work in large-scale rice cultivation areas. For this reason, early or late growth is expected.
  • the Hdl protein Since the Hdl protein has the effect of enhancing the photosensitivity of the plant, the late growth of the plant (delay in flowering time) can be achieved by transforming the plant with MA encoding the protein. It is possible to cause.
  • the expression of the DNA using an antisense method or a ribozyme method, it is possible to reduce photosensitivity and to accelerate the flowering time of a plant. Therefore, varieties that do not have the DNA encoding the Hdl protein are transfected with the DNA by genetic recombination, and varieties that do have the DNA are expressed using antisense ribozyme or the like. By controlling, it is possible to diversify the flowering time of the plant and to cultivate new varieties of the plant.
  • DNAs encoding the Hdl proteins of the present invention include genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA. Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by a person skilled in the art using conventional methods. Genomic DNA is extracted, for example, from rice varieties (eg, Nipponbare, Ginbozu) that have photosensitivity genes, and genomic libraries (plasmid, phage, cosmid, BAPAC, etc. are used as vectors) Can be developed and developed, and colony hybridization or plaque hybridization can be performed using a probe prepared based on DNA encoding the protein of the present invention (for example, SEQ ID NOs: 2, 4). It can be prepared by carrying out a dilution.
  • DNA encoding the protein of the present invention can also be prepared by preparing a primer specific to (for example, SEQ ID NOs: 2, 4) and performing PCR using this primer.
  • a primer specific to for example, SEQ ID NOs: 2, 4
  • cDNA for example, cDNA is synthesized based on mA extracted from rice varieties having a photosensitive gene (eg, Nipponbare, Ginbozu) and inserted into a vector such as ZAP to obtain a cDNA library. It can be prepared by developing, developing, and performing colony hybridization or plaque hybridization in the same manner as described above, or by performing PCR. .
  • the present invention includes a DNA encoding a protein functionally equivalent to the Hdl protein (Nipponbare, Ginbozu) described in SEQ ID NO: 1 or 3.
  • Hdl protein “Nipponbare, Ginbozu) described in SEQ ID NO: 1 or 3.
  • “has a function equivalent to that of the Hdl protein” means that the target protein has a function of increasing the photosensitivity of a plant.
  • Such DNA is preferably derived from monocotyledonous plants, more preferably from grasses, and most preferably from rice.
  • Such DNA encodes, for example, a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. Includes variants, derivatives, alleles, normals and homologs.
  • Methods well known to those skilled in the art for preparing DNA encoding amino acid sequence-modified proteins include, for example, the site-directed mutagenesis method (Kramer, W. & Fritz, H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA. Methods in Enzymology, 154: 350-367).
  • mutation of the amino acid sequence of the encoded protein due to mutation of the nucleotide sequence can occur in nature.
  • the DNA encodes a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted or added in the amino acid sequence encoding the native Hdl protein
  • the native Hdl Functions equivalent to protein (SEQ ID NO: 1 or 3) It is included in the DNA of the present invention as long as it encodes a protein having the same. Further, even when the nucleotide sequence is mutated, it may not be accompanied by mutation of an amino acid in the protein (degenerate mutation). Such a degenerate mutant is also included in the DNA of the present invention.
  • Whether or not encodes a protein that increases plant photosensitivity can be evaluated as follows.
  • the most common method is a method in which a plant into which the DNA has been introduced is cultivated and examined in a growth chamber in which day length can be changed. In other words, cultivate under conditions of short days (generally 9 to 10 hours) and long days (14 to 16 hours), and determine the number of days required from sowing to flowering (from sowing to sprouting if it is rice). This is a comparison method. If the number of days does not change between long days and short days or is almost the same, it is determined that there is no photosensitivity. When there is photosensitivity, the number of days until flowering on a long day is longer than that on a short day, and the magnitude of the difference can be regarded as the degree of photosensitivity.
  • the growth chamber is not available, it can be tested in a cultivation test in a field or greenhouse with a natural photoperiod.
  • the plants are sown every 20 days in a greenhouse, cultivated under natural daylength while maintaining the temperature, and the flowering date of each is measured.
  • the plants are sown every 20 days in a greenhouse, cultivated under natural daylength while maintaining the temperature, and the flowering date of each is measured.
  • heading of cultivars with high photosensitivity is generally promoted, and conversely from April to July it is delayed.
  • varieties with low photosensitivity the number of heading days changes little without being affected by migration during the sowing period.
  • the DNA of the present invention also includes a DNA encoding a protein having a function equivalent to that of the Hdl protein that can be isolated by the hybridization technique or the PCR technique.
  • a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions.
  • the stringent hybridization conditions refer to the conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 ⁇ SSC, or the equivalent hybridization condition of stringency.
  • 6M urea, 0.4 SDS, and O.lxSSC under conditions of higher stringency, for example, 6M urea, 0.4 SDS, and O.lxSSC, isolation of DNA with higher homology can be expected.
  • High homology refers to sequence identity of at least 50% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 90% or more (eg, 95% or more) in the entire amino acid sequence.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, for the preparation of recombinant proteins and for the production of transformed plants with altered photosensitivity.
  • DNA encoding the protein of the present invention is inserted into an appropriate expression vector, the vector is introduced into appropriate cells, and the transformed cells are cultured and expressed. Purify the protein.
  • Recombinant proteins can be expressed as fusion proteins with other proteins, for example, to facilitate purification. For example, a method of preparing a fusion protein with maltose binding protein using E.
  • coli as a host (Vector-pMAL series released by New England BioLabs, USA), a method of preparing a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) It is possible to use a method (Vector-pGEX series released by Amersham Pharmacia Biotech), a method of adding a histidine tag and preparing (Novagen PET series), and the like.
  • the host cell is not particularly limited as long as it is a cell suitable for expression of the recombinant protein.
  • Escherichia coli yeast, various animal and plant cells, insect cells, and the like can be used.
  • a vector into a host cell for introduction into Escherichia coli, a method using calcium ions (Mandel, M. & Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162, Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580) can be used.
  • the recombinant protein expressed in the host cell can be purified and recovered from the host cell or a culture supernatant thereof by a method known to those skilled in the art.
  • affinity purification can be easily performed.
  • an antibody that binds to the protein can be prepared.
  • a polyclonal antibody is prepared by immunizing an immunized animal such as a heron with a purified protein of the present invention or a partial peptide thereof, collecting blood after a certain period of time, and removing the blood clot. It is possible. Monoclonal antibodies are used for antibody production in animals immunized with the above proteins or peptides. It can be prepared by fusing vesicles with bone tumor cells, isolating a single clone cell (hybridoma) producing the desired antibody, and obtaining the antibody from the cell. The antibody thus obtained can be used for purification and detection of the protein of the present invention.
  • the present invention includes an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • MA encoding the protein of the present invention is introduced into an appropriate vector, and this is introduced into a plant cell.
  • the transformed plant cells thus obtained are regenerated.
  • the photosensitivity gene Hdl isolated by the present inventors has the effect of enhancing the photosensitivity of rice and, as a result, has the effect of delaying the heading time, but this gene is introduced into any variety and expressed. By doing so, it is possible to control the heading time of those lines.
  • the time required for this transformation is extremely short as compared with conventional gene transfer by crossing, and is advantageous in that it does not involve changes in other traits.
  • genes regulating the heading stage have not been isolated or identified so far, and such a method has been made possible by the present invention for the first time.
  • DNA for suppressing the expression of MA encoding the protein of the present invention is inserted into an appropriate vector, and this is inserted into plant cells. And the resulting transformed plant cells are regenerated. “Suppression of expression of DNA encoding the protein of the present invention” includes suppression of gene transcription and suppression of translation into protein. It also includes a reduction in expression as well as a complete cessation of DNA expression.
  • the action of the antisense nucleic acid to suppress the expression of the target gene has several factors as follows. In other words, inhibition of transcription initiation by triplex formation, suppression of transcription by formation of a hybrid with a site where a local open loop structure was formed by A polymerase, inhibition of transcription by formation of a hybrid with RNA that is undergoing synthesis, intron, Of splicing by hybridization at the junction with exo-exon, suppression of splicing by hybridization to spliceosome-forming sites, suppression of translocation from the nucleus to cytoplasm by hybridization with mRNA, addition of the binding site and poly (A) Inhibition of splicing by hybridization with the translation initiation factor binding site, suppression of translation initiation by hybridization with the translation initiation factor binding site, translation suppression by hybridization with the ribosome binding site near the initiation codon, translational translation of fflRNA and polysome binding site Hybrid Formation inhibition of the peptide chain, and suppression of gene expression by forming a hybrid between the
  • the antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the above actions.
  • designing an antisense sequence that is complementary to the untranslated region near the 5 'end of the gene mRNA would be effective in inhibiting translation of the gene.
  • sequences complementary to the coding region or the 3 'untranslated region may also be used.
  • the DNA containing the antisense sequence of the sequence of the untranslated region as well as the translated region of the gene is also included in the antisense DNA used in the present invention.
  • the antisense DNA used is ligated downstream of the appropriate promoter and is preferably Alternatively, a sequence containing a transcription termination signal is linked to the 3 'end.
  • the DNA thus prepared can be transformed into a desired plant by a known method.
  • the sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous gene of the transformed plant or a part thereof, but may not be completely complementary as long as gene expression can be effectively inhibited. Good.
  • the transcribed MA has preferably at least 90%, most preferably at least 95% complementarity to the transcript of the target gene.
  • the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, and more preferably 500 bases. That is all.
  • the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
  • Ribozyme is an RNA molecule having catalytic activity. Ribozymes have various activities. Among them, research on ribozymes as enzymes that cleave MA has made it possible to design ribozymes for site-specific cleavage of RNA. Ribozymes include those with a size of 400 nucleotides or more, such as the group I intron type and M1RNA contained in RNaseP, but have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type and hairpin type. There are also others (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, (1990) Protein nucleic acid enzyme, 35: 2191).
  • the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves the 3 'side of C13 of G13U14C15, but it is important for activity that U14 forms a base pair with A at position 9; Bases have been shown to be cleaved at A or U in addition to C (M. Koizumi et al., (1988) FEBS Lett. 228: 225). If the ribozyme substrate-binding site is designed to be complementary to the RNA sequence near the target site, a restriction-enzymatic RNA-cleaving ribozyme that recognizes the UC, UU, or UA sequence in the target RNA can be created. (M.
  • Hairpin ribozymes are also useful for the purpose of the present invention. Hairbin type ribozymes are found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (J. M. Buzayan Nature 323: 349, 1986). It has been shown that this ribozyme can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Y. Kikuchi and N. Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751, Kikuchi Hiroshi, (1992) Chemistry and biology) 30: 112).
  • a ribozyme designed to cleave the target is ligated to a promoter, such as the force reflower mosaic virus 35S promoter, and a transcription termination sequence to be transcribed in plant cells.
  • a promoter such as the force reflower mosaic virus 35S promoter
  • a transcription termination sequence to be transcribed in plant cells.
  • ribozyme activity may be lost.
  • another trimming ribozyme that acts as a cis for trimming is placed on the 5 'or 3' side of the ribozyme portion.
  • Co-suppression is a phenomenon in which when a gene having the same or similar sequence as a target endogenous gene is introduced into a plant by transformation, the expression of both the foreign gene to be introduced and the target endogenous gene is suppressed. Say. The details of the mechanism of co-suppression are not clear, but are often observed in plants (Curr. Biol. 7: R793, 1997, Curr. Biol. 6: 810, 1996).
  • vector DNA prepared to express the Hdl gene or a DNA having a sequence similar thereto can be transformed into a target plant.
  • a plant having the trait of the Hdl mutant, that is, a plant with reduced photosensitivity may be selected from the obtained plants.
  • the gene used for co-suppression does not need to be completely identical to the target gene, but has at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (eg, 95% or more) sequence identity. Has the property.
  • the identity of the sequence can be determined by the above-described method.
  • the suppression of the expression of the endogenous gene in the present invention can also be achieved by transforming a gene having a dominant-negative trait of a target gene into a plant.
  • a gene having a dominant negative trait refers to a gene having a function of eliminating or decreasing the activity of an endogenous wild-type gene inherent in a plant by expressing the gene.
  • the vector used for the transformation of a plant cell is not particularly limited as long as it can express the inserted gene in the cell.
  • a vector containing a promoter eg, 35S promoter of cauliflower mosaic virus
  • a promoter for constitutive gene expression in plant cells
  • a promoter that is inducibly activated by an external stimulus It is also possible to use a vector.
  • plant cell includes various forms of plant cells, for example, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and calli.
  • Vectors can be introduced into plant cells by the polyethylene glycol method, the electroporation method (selection port por- tion), the method via agglom- Various methods known to those skilled in the art, such as an incorporation method, can be used. Regeneration of a plant from a transformed plant cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of the plant cell (see Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100: 1503-1507).
  • a technique for producing a transformed plant is to introduce a gene into protoplasts by polyethylene glycol to regenerate the plant (Indian rice varieties are suitable) (Datta, SK ( 1995) In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) Pp66-74), Gene transfer to protoplasts by electric pulse to regenerate plants (Japanese rice varieties are suitable)
  • progeny can be obtained from the plant by sexual or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tubers, roots, strains, calli, protoplasts, etc.) from the plant, its progeny or clone, and mass-produce the plant based on them. Is also possible.
  • the present invention includes plant cells into which the DNA of the present invention has been introduced, plants containing the cells, progeny and clones of the plants, and propagation materials of the plants, progeny thereof, and clones.
  • the plant of which photosensitivity has been modified in this manner has a different flowering time as compared to a wild-type plant.
  • the flowering time is delayed under field conditions due to the increased photosensitivity, while the Hdl protein is encoded by introducing antisense DNA or the like.
  • the flowering time is advanced due to the reduced photosensitivity.
  • the present invention also provides a method for evaluating the photosensitivity of a plant.
  • the present inventors examined the relationship between the transcript of the Hdl gene and the number of days of heading in the field, and found that when normal (Nipponbare and Ginbozu) transcripts were recognized, the number of days of heading increased, When abnormal transcripts were observed, the number decreased (Example 5). This indicates that the degree of photosensitivity in plants is determined in part by whether or not a functional Hdl protein is expressed.
  • the method for evaluating the photosensitivity of a plant of the present invention is based on this finding, and is characterized by detecting whether or not the plant has a DNA encoding a functional Hdl protein.
  • Whether a plant has DNA encoding a functional Hdl protein or not should be evaluated, for example, by detecting structural differences in the region corresponding to Hd1 in genomic DNA as polymorphisms. Is possible.
  • the evaluation of photosensitivity of a plant by the method of the present invention has an advantage, for example, in the case of performing breeding improvement by crossing plants. For example, when it is not desired to introduce a photosensitive trait, it is possible to avoid crossing with a photosensitive variety, and conversely, when it is desired to introduce a photosensitive trait, crossing with a photosensitive variety Can be performed. It is also effective when selecting desirable individuals from hybrid progeny individuals. Compared to judging the presence or absence of photosensitivity of a plant based on its phenotype, it is simpler and more reliable to judge at the genetic level. It can be said that it can greatly contribute.
  • the present invention provides a DNA comprising at least 15 nucleotides complementary to the DNA of the present invention comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, or a complementary strand thereof.
  • the “complementary strand” refers to one strand of the double-stranded DNA composed of A: T, G: C base pairs and the other strand.
  • the term "complementary” is not limited to a completely complementary sequence in at least 15 contiguous nucleotide regions, but is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably 95%. It is sufficient that at least the base sequence is a complementary sequence.
  • Such DNA is useful as a probe for detecting and isolating the DNA of the present invention, and as a primer for performing amplification. Brief description of the drawings
  • Figure 1 shows a detailed linkage map of the Hdl gene region, and an alignment map of YAC and genomic clones.
  • A shows a linkage map created using a segregated population of 1505 individuals
  • B shows an alignment map of yeast artificial chromosome (YAC) clones.
  • C shows an alignment map of P1-derived artificial chromosome (PAC) clones.
  • D shows genes predicted as candidate regions of the Hdl gene and their similarity search results.
  • FIG. 2 is a diagram showing a comparison of nucleotide sequences of Hdl candidate gene regions.
  • Nipponbare and Ginbozu have a functional Hdl gene, and Kasalath has a reduced or lost gene.
  • HS66 and HSU0 are mutant lines that have lost photosensitivity at the Sel locus induced by gamma-ray irradiation.
  • the region enclosed by a square indicates the region estimated to be exon as a result of gene prediction.
  • the number above the detected mutation site indicates the number of inserted or deleted bases.
  • FIG. 3 is a view showing a vector used for a complementation test by transformation.
  • FIG. 4 is a diagram showing changes in the number of days required for heading in a transformed population into which a 7.1 kb genomic DNA fragment containing the Hd1 candidate gene region has been introduced.
  • FIG. 5 is a diagram showing the number of days required for heading in a self-bred progeny (T1) of a transformed individual into which a 7.lk genomic DNA fragment containing the Hd1 candidate gene region has been introduced.
  • the leaves of the selected individuals were pooled into five individuals, DNA was extracted, and individuals having recombinant chromosomes generated in the Hdl region were selected.
  • the RFLP markers used to select transgenic individuals are R1679 and P130. As a result, 9 and 2 recombinant individuals were selected between Hdl and R1679 and P130, respectively (Fig. 1).
  • Hdl locus was located between the RFLP markers S20481 and P130, and no recombinant individuals were found between SLP and S2539. It was not issued ( Figure 1).
  • One transgenic individual useful for narrowing down the Hdl gene genome candidate region was found between S20481 and two individuals between P130 and P130.
  • YAC clones having the nucleotide sequences of DNA markers C235, S20481 and S2539 existing near the Hdl locus were identified. More specified YAC clone Y4836 was isolated by the cassette method and analyzed as an RFLP marker. As a result, terminal clone Y4836R was co-separated with RFLP marker-P130. Therefore, it was revealed that YAC clone Y4836 contains the Hdl gene region (FIG. 1).
  • the Nipponbare Genome which was created in a rice genome analysis study, using an STS481 primer set of RFLP markers S20481 (amplified genomic fragment 0.74 kb) and S2539 (amplified genomic fragment 1.9 kb) near the Hdl locus PAC clone library
  • the insert DNA (including vector 1) of P0038C5 was fragmented with ultrasonic waves to prepare sublibraries with an average insert length of 2 kb and 5 kb.
  • the base sequences of 2000 clones arbitrarily selected from this sublibrary were analyzed and assembled by computer software Phred / Phrap.
  • CAP S Cross-linked Amplified Polymorphic Sequence
  • the Hdl gene was used as a primer as a CAPS marker lb (restriction enzyme Sspl) “SEQ ID NO: 9 / 5′-AAG C GCA GAA AGT AAA GAG-3,” and “SEQ ID NO: 10 / 5′-GAA ACA ATA GTA GTA GAC CGA GCA-3, ", lc (restriction enzyme Hindi 11)” SEQ ID NO: 11/5, -GAC CCA TCC GCC GCC TAC TCT-3'j and "SEQ ID NO: 12 / 5'-GCA GGT CGT GAA ACA ATC GGT-3, ", Id (restriction enzyme Haelll)” SEQ ID NO: 13/5, -ATT GAG ATG GTA TTG CGG AAG A-3, "and” SEQ ID NO: 14/5,-CAC ATC GTG CCT TCA AGC TG-3, "and le (restriction enzyme Sau3AI)” SEQ ID NO: 15/5, -ACA A
  • a gene prediction and a similarity search were performed on rice, and a region showing extremely high similarity to baroxidase S2539 and CO of arabidopsis, which were captured as rice ESTs, was found. Is a gene having the function of promoting flowering under long-day conditions, and is considered to be a transcriptional regulatory gene having a zinc finger domain.
  • the transcript level of rice EST S2539 was not changed by RT-PCR in Nipponbare and Hdl near isogenic lines. Therefore, the predicted gene with zinc finger domain was selected as a candidate for the Hdl gene, and further analysis was proceeded.
  • a clone no.47 containing the candidate gene was selected from a cosmid library created from Kasalath genomic DNA. Using the selected cosmid clones, the nucleotide sequence of the Kasalath Hdl candidate gene region of 12 kb was determined.
  • Mutant HS66 (SEQ ID NO: 20) showed a 43 bp deletion in the predicted exon, and HS110 (SEQ ID NO: 21) showed a 433 bp insertion in the intron, compared to Ginbozu. ( Figure 2 ) .
  • the candidate gene having the zinc finger domain was determined to be a more promising candidate for the Hdl gene. It was also suggested that the Se 1 locus may be the same as the Hdl locus.
  • RT-PCR of candidate genes was performed for Nipponbare and a near-isogenic line (NIL (Hdl)) in which the Hdl gene region was replaced with a chromosomal fragment of Kasalath. That is, after extracting all MA from the collected leaves, synthesizing cDNA using reverse transcriptase, a primer containing intron designed in the Hdl gene (SEQ ID NO: 22 / 5'-TTC TCC TCT CCT CCA AAG ATT CC-3 , (Sense strand), SEQ ID NO: 23/5, -CAT ACG CCT TTC TTG TTT Ck-3, (antisense strand)).
  • NIL near-isogenic line
  • RNA used in the gun type was performed using primers capable of amplifying a fragment of actin gene (SEQ ID NO: 24 / 5'-TCC ATC TTG GCA TCT CTC AG-3, (sense strand), and SEQ ID NO: 25/5 '-GTA CCC GCA TCA GGC ATC TG-3' (antisense strand)).
  • SEQ ID NO: 24 / 5'-TCC ATC TTG GCA TCT CTC AG-3, (sense strand), and SEQ ID NO: 25/5 '-GTA CCC GCA TCA GGC ATC TG-3' (antisense strand) candidate inheritance of a Nipponbare near isogenic line with the Kasalath gene at the Hdl locus
  • the transcript abundance of the offspring was significantly reduced compared to Nipponbare, and their size was also slightly smaller (Table 1).
  • the size of the transcript was based on the size of the product spread in Nipponbare. This difference in size corresponded to the deletion observed in the genome sequence. Furthermore, the same RT-PCR expression analysis was performed on the mutant lines HS66 and HS110 related to Sel and their original cultivar “Ginbozu”. In Ginbozu, transcripts were detected as in Nipponbare. In HS66, the amount of transcripts was the same as in Ginbozu, but a slightly smaller transcript was amplified. The extent of size reduction was consistent with the 43 bp deletion observed in genomic base sequence analysis.
  • the lkbApal fragment and the 3.5 kb HindIII fragment (Fig. 1) were incorporated into a vector pPZP2H-lac (Fig. 3) that can be transformed via an agrobacterium.
  • transformation was carried out according to the method of Toki et al. ((1997) Plant Mol. Biol. Rep. 15: 16-21).
  • the strain NIL (Hdl / Hd2) which has a genetic background of Nipponbare and replaces the photosensitive gene Hdl and Hd2 regions of Kazunato with Kasalath type, has a genetic background of Nipponbare. .
  • 52 hygromycin-resistant individuals were obtained with the vector incorporating the 7.1 kb fragment, 44 individuals with the vector incorporating the 3.5 kb fragment, and 19 individuals with the vector alone.
  • the present invention provides a rice photosensitivity gene. Since the gene of the present invention imparts photosensitivity to rice and thereby has the function of regulating the heading time, it can greatly contribute to rice breeding. In particular, the use of the gene of the present invention can change the heading time of rice, and is useful for breeding rice varieties adapted to the cultivation area and cultivation time. In addition, cultivation of rice varieties using the gene of the present invention is more advantageous than conventional methods in that a target plant can be obtained with high certainty in a short period of time.
  • the present invention also provides a method for evaluating photosensitivity of a plant.
  • the conventional evaluation method is to cross the target cultivar with a test line for examining the presence of a specific gene, and to estimate the presence or absence of the gene from the separation of the heading time of their progeny. It took two to three years to put it out.
  • the determination can be made by extracting a part of the seedling which has passed about 2 weeks after sowing, extracting DNA, and analyzing the extracted DNA. If it can be determined whether or not it has a photosensitive gene, the progeny of the breed Can be estimated before crossing, and it is useful information for selection and selection of mating mothers.
  • This marker can also be used as a selection marker because the presence or absence of a photosensitive gene in each individual of the selected population can be easily determined by the above method.

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Description

明細書 植物の感光性遺伝子 Hdlおよびその利用 技術分野
本発明は、 植物の感光性に関与する遺伝子および該遺伝子を利用した植物の感 光性の改変に関する。 植物の感光性の改変は、 植物の品種改良などの分野におい て有用である。 背景技術
イネは一般に短日で出穂が促進され、 逆に長日では出穂が遅延する。 従来の品 種では、 一般に九州や本州南部の品種は強い感光性をもち、 東北や北海道の品種 は感光性がないか極めて弱い。 イネは感光性を失うと日長の変化によって出穗時 期が変化せず、 一定の生育期間を経ると、 出穂する特徴を示す。 このようにイネ は感光性の有無により、 栽培地域や栽培時期などに関する適応性が大きく変化す るため、 イネの感光性の改変は、 イネの品種改良において重要な課題となってい 従来、 イネの品種改良における出穂期の改変は、 （1) 交雑による早生 '晚生 系統の選抜や （2) 放射線や化学物質による突然変異誘起などによって行われて きた。 しかしながら、 これらの作業には長期間を要し、 また変異の程度や方向性 を予測できないなど多くの問題が存在していた。
ところで、 イネの遺伝学の分野においては、 イネの感光性を強くする遺伝子を 総称して 「感光性遺伝子」 と呼んでいる。 これまでいくつかの感光性遺伝子の存 在が、 突然変異や品種に内在する変異として見出されており、 例えば、 Sel座 （ 第 6染色体； Yokoo and Fujimaki ( 1971 ) Japan. J. Breed. 21 : 35-39) 、 El 座 （第 7染色体； Tsai , K.H. ( 1976 ) Jpn. J. Genet. 51 : 115-128、 Okumoto, Y. et al . ( 1992) Jpn. J. Breed. 42 : 415-429) 、 E2座 (不明) 、 E3座 （第 3染色体？ ；奥本ら、 日本育種学会第 9 1回講演会 育雑 47 (別 1 ) : 31) 等において感光性遺伝子の存在が示唆されている （Yamagata et al . ( 1986 ) I n Rice Genetics, International Rice Research Institute, Mani l la, pp351 -359) 。
ィネ感光性遺伝子が単離されれば、 これを形質転換法により任意の品種に導入 することによって、 それらの系統の感光性を改変させ、 これによりイネの出穂期 を調節することが可能であると考えられる。 このため、 該遺伝子を利用した品種 改良は、 簡便性や確実性の面で、 従来の方法と比して極めて有利であると言える しかしながら、 イネにおいてその感光性に関与する遺伝子を単離したという報 告は、 いまだなされていない。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 新規な 植物の感光性遺伝子、 特にイネ由来の感光性遺伝子を提供することにある。 また 、 本発明は、 該遺伝子を利用して植物の感光性を改変し、 これにより植物の開花 時期を改変することを目的とする。 さらに、 本発明は、 植物の感光性の評価方法 を提供することをも目的とする。
本発明者等は、 植物の中でも、 特に出穂時期を改変する簡便な方法の開発が望 まれているイネに着目し、 その感光性に関与する遺伝子を単離すベく鋭意研究を 行なった。
イネにおいては、 日本晴と Kasalathの交雑後代を利用して検出された量的形 質遺伝子座 （QTL) の一つである Hdlが、 第 6染色体上に座乗することが知られ ている。 また日本晴の遺伝的背景をもつ Hdl領域 （Kasalathの対立遺伝子） の 準同質遺伝子系統を利用した解析から、 Hdl遺伝子座が感光性遺伝子座であるこ とが明らかとなっている (Lin et al . ( 1999) Abstract for Plant Genome VI I . pl60、 矢野 他、 育種学雑誌 第 47卷 （別 2 ) p224) 。 さらに染色体上の位 置から、 Hdlは既報の感光性遺伝子座 Sel と同じ遺伝子座である可能性が示唆さ れているが、 直接的な証拠はなかった。
本発明者らは、 このようにその存在自体は知られているが、 いまだ同定されて いない感光性遺伝子 Hdlを単離するために、 まず、 連鎖解析および酵母人工染 色体 （YAC) クローンによる Hdl遺伝子領域の整列化を行なった。
具体的には、 Hdl遺伝子単離に不可欠である、 大規模分離集団の連鎖解析を行 つた。 連鎖解析にはプールサンプリング法を用いた。 また、 イネゲノム解析研究 において作出された YACクローンの整列化地図を利用して、 Hdl遺伝子座近傍に 存在する YACクローンを特定した。 さらに特定された YACクローン Y4836の末 端断片を単離し、 RFLPマーカ一として解析することにより、 YACクローン Y4836 が Hdl遺伝子領域を含むことを明らかにした （図 1 ) 。
さらに Hdl遺伝子の候補領域を絞り込むために、 本発明者等は、 P1由来人工 染色体 （PAC) クローンによる Hdl遺伝子領域の整列化を行なった。 具体的には 、 上記解析により見出された Hdl遺伝子の存在領域に近接する DNAクローンを 利用して、 それらの塩基配列を含むと考えられる PACクローンを日本晴のゲノ ムライブラリーから 2個選抜した。 さらに、 それらのクローンを PCRにより調 査したところ、 選抜した PACクローンの 1つ P0038C5が、 S20418および Y4836R に対応する塩基配列を有し、 Hdl遺伝子座を完全に含むことが明らかとなった （ 図 1 ) 。
本発明者等は、 PACクローン P0038C5の塩基配列解析を行なった結果、 Hdl候 補遺伝子が存在すると考えられる領域を約 12kbにまで絞り込むことに成功した 。 この候補領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行い、 イネ の ESTとして捕足されているパ一ォキシダーゼ S2539ならびに長日条件で開花 を促進する機能を有するァラビドプシスの CO (ジンクフィンガードメインを有 する転写調節遺伝子であると考えられている） と非常に高い類似性を示す領域を 見出した。
ジンクフィンガードメインをもつ予測遺伝子を Hdl遺伝子の候補とし、 さら に解析を進めたところ、 Kasalathの候補遺伝子領域 （0RF) 内には 11箇所 （挿 入、 欠失および塩基置換） の変異が認められた （図 2 ) 。 また、 Hdl と同じ遺伝 子座であると推定されている Selに関する突然変異系統 HS66および HS110なら びにそれらの原品種銀坊主の候補遺伝子領域について解析を行ったところ、 Sel 遺伝子をもつ銀坊主の塩基配列は日本晴と比べて新たな 36bpの塩基配列および 1塩基置換が見い出されたが、 その他は完全に一致していた。 突然変異系統 HS6 6および HS110では銀坊主の配列と比較して変異が認められた （図 2 ) 。 これら の結果から、 ジンクフィンガードメインをもつ候補遺伝子が Hdl遺伝子の有力 な候補であると判断した。
また、 Hdl候補遺伝子の発現解析を行なったところ、 Hdl遺伝子領域を Kasala thの染色体断片に置換した準同質遺伝子系統 （NIL(Hdl )) では、 日本晴に比べ て発現量が著しく減少していた。 銀坊主では、 日本晴と同様に転写産物が検出さ れたが、 突然変異系統である HS66および HS110では、 銀坊主と異なるサイズの 転写産物が検出された。 候補遺伝子の転写産物と圃場での到穂日数との関係をみ たところ、 正常 （日本晴および銀坊主） な転写産物が認められた場合は、 到穂日 数は増加し、 異常な転写産物が認められた場合は減少した （表 1 ) 。 以上の結果 から、 候補遺伝子領域が Hdl遺伝子であり、 Sel遺伝子座が Hdl候補遺伝子座と 同じであると考えられた。
この Hdl候補遺伝子がィネに感光性を付与する機能を有することを確認する ために、 該遺伝子を含むゲノム領域を、 日本晴のもつ感光性遺伝子領域を Kasal ath型に置換して感光性を消失させた系統に導入して、 発現させた。 その結果、 候補遺伝子が組みこまれている個体では、 短日条件で出穂が促進された。 一般に 、 感光性が強い場合、 短日条件では出穂が促進されることから、 Hdl候補遺伝子 が感光性を強める機能をもつことが判明した。
即ち、 本発明者らは、 植物の感光性に関与する遺伝子を単離することに成功す ると共に、 該遺伝子を利用して植物の感光性を改変させることが可能であること 、 さらには該遺伝子を利用して植物の感光性を評価することが可能であることを 見出し、 これにより本発明を完成するに至った。
本発明は、 より具体的には、
( 1) 植物の感光性を増加させる機能を有する植物由来のタンパク質をコード する、 下記 （a) から （c) のいずれかに記載の DNA、
(a) 配列番号： 1または 3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコー ドする醒ヽ
(b) 配列番号： 1または 3に記載のアミノ酸配列において 1または複数のァ ミノ酸が置換、 欠失、 付加、 および/または挿入されたアミノ酸配列からなる夕 ンパク質をコードする MA、
( c ) 配列番号： 2または 4に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジヱ ントな条件下でハイブリダイズする DNA、
(2) イネ由来である、 （ 1) に記載の DNA、
(3) ( 1) または （2) に記載の DNAの転写産物と相補的なアンチセンス R NAをコードする DNA、
(4) ( 1) または （2) に DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム 活性を有する RNAをコードする DNA、
(5) 植物細胞における発現時に、 共抑制効果により、 （ 1) または （2) に 記載の DNAの発現を抑制させる RNAをコードする DNA、
(6) 植物の感光性を増加させるために用いる、 （ 1) または （2) に記載の DNAヽ (7) 植物の感光性を低下させるために用いる、 （3) から （5) のいずれか に記載の DNA、
(8) ( 1) から （5) のいずれかに記載の DNAを含むベクタ一、
(9) (8) に記載のベクターが導入された植物細胞、
( 10) (9) に記載の植物細胞を含む形質転換植物体、
( 1 1) イネである、 （ 10) に記載の形質転換植物体、
( 12) ( 10) または （ 1 1) に記載の形質転換植物体の子孫またはクロ一 ンである、 形質転換植物体、
( 13) ( 10) から （ 12) のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料
( 14) ( 10) または （ 1 1) に記載の形質転換植物体の製造方法であって 、 （ 1) または （2) に記載の DNAを植物細胞に導入し、 該植物細胞から植物 体を再生させる工程を含む方法、
( 15) ( 1) または （2) に記載の DNAを植物体の細胞内で発現させるこ とを特徴とする、 植物の感光性を増加させる方法、
( 16) 植物の感光性を増加させることにより日長に依存した植物の開花時期 を遅延させる、 （ 15) に記載の方法、
( 17) 植物体の細胞内における、 内因性の （ 1) または （2) のいずれかに 記載の DNAの発現を抑制することを特徴とする、 植物の感光性を低下させる方 法、
( 18) (3) から （5) のいずれかに記載の DNAを植物体の細胞内で発現 させる、 （ 17) に記載の方法、
( 19) 植物の感光性を低下させることにより、 日長に依存した植物の開花時 期を早める、 （ 17) または （ 18) に記載の方法、
(20) 植物がイネである、 （ 15 ) から （ 19 ) のいずれかに記載の方法、 (2 1) 植物の感光性を評価する方法であって、 該植物における （ 1) に記載 の DNAの存在の有無を検出することを特徴とする方法、
(22) 植物がイネである、 （2 1) に記載の方法、
(23) ( 1) または （2) に記載の DNAを含むベクターが導入された宿主 細胞、
(24) ( 1) または （2) に記載の DNAによりコードされるタンパク質、 ( 25 ) ( 23 ) に記載の宿主細胞を培養し、 該細胞またはその培養上清から 組換えタンパク質を回収する工程を含む、 （24) に記載のタンパク質の製造方 法、
( 26) ( 24) に記載のタンパク質に結合する抗体、
(27) 配列番号： 2または 4に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相 補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドからなる DNA、 を提供するものであ る。
本発明は、 イネ由来の Hdlタンパク質をコードする DNAを提供する。 日本晴 の Hdlゲノム DNAの塩基配列を配列番号： 2に、 該 DNAがコードするタンパク質 のアミノ酸配列を配列番号： 1に示す。 また、 銀坊主の Hdlゲノム DNAの塩基配 列を配列番号： 4に、 該 DNAがコードするタンパク質のァミノ酸配列を配列番号 ： 3に示す。
Hdlは日本晴と Kasalathの交雑後代を利用して検出された量的形質遺伝子座 (QTL) の一つであり、 第 6染色体上に座乗することが明らかとなっていた。 ま た日本晴の遺伝的背景をもつ Hdl領域の準同質遺伝子系統を利用した実験から 、 Hdl遺伝子座は感光性遺伝子座であることが知られていた。 Hdl遺伝子は、 短 日条件において播種から出穂までに必要な日数 （到穂日数） を減少させる作用を もち、 長日条件では増加させる作用をもつ。 すなわち日本晴の Hdl遺伝子は感 光性を強めて、 圃場における栽培 （長日条件に近い） では晩生化させる作用をも つ。 このように Hdl遺伝子は、 植物の感光性に関与する遺伝子として、 これま でイネ第 6染色体という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知ら れていたが、 その同定および単離には至っていなかった。 本発明者らは、 複雑な ステップを経て遂にその存在領域を解明し、 単一の遺伝子として該遺伝子を単離 することに初めて成功した。
現在、 日本のイネの品種改良においては、 出穂期の調節は重要な育種目標であ る。 特に寒冷地では秋の低温が早く到来することから、 出穂期の調節は冷害の回 避のために重要であり、 一方、 西南暖地においては、 大規模稲作地帯における収 穫作業の集中を回避するためにも早生化あるいは晩生化が期待されている。
Hdlタンパク質は、 植物の感光性を強める作用を有していることから、 該夕ン パク質をコードする MAで植物を形質転換することにより、 植物の晩生化 （開 花時期の遅延化） を引き起こすことが可能である。 一方、 アンチセンス法ゃリボ ザィム法などを利用して該 DNAの発現制御を行うことにより、 感光性を低下さ せ、 植物の開花時期を早めることが可能である。 従って、 Hdlタンパク質をコー ドする DNAを有していない品種には、 遺伝子組換えにより該 DNAを導入し、 有 している品種にはアンチセンスゃリボザィムなどを利用して該 DN Aの発現を制 御することにより、 植物の開花時期の多様化を図り、 植物の新品種育成を行なう ことができる。
本発明の Hdlタンパク質をコードする DNAには、 ゲノム DNA、 cDNA、 および化 学合成 DNAが含まれる。 ゲノム DNAおよび cDNAの調製は、 当業者にとって常套 手段を利用して行うことが可能である。 ゲノム DNAは、 例えば、 感光性遺伝子 を有するイネ品種 （例えば、 日本晴、 銀坊主） からゲノム DNAを抽出し、 ゲノ ミックライブラリ一 （ベクターとしては、 プラスミ ド、 ファージ、 コスミ ド、 B A PACなどが利用できる） を作成し、 これを展開して、 本発明タンパク質をコ ードする DNA (例えば、 配列番号： 2、 4) を基に調製したプローブを用いてコロ ニーハイプリダイゼ一シヨンあるいはプラークハイブリダイゼーシヨンを行うこ とにより調製することが可能である。 また、 本発明タンパク質をコードする DNA (例えば、 配列番号： 2、 4) に特異的なプライマーを作成し、 これを利用した P CRをおこなうことによって調製することも可能である。 また、 cDNAは、 例えば 、 感光性遺伝子を有するイネ品種 （例えば、 日本晴、 銀坊主） から抽出した m Aを基に cDNAを合成し、 これをえ ZAP等のベクターに挿入して cDNAライブラリ 一を作成し、 これを展開して、 上記と同様にコロニーハイブリダィゼ一シヨンあ るいはプラークハイブリダィゼ一シヨンを行うことにより、 また、 PCRを行うこ とにより調製することが可能である。
本発明は、 配列番号： 1または 3に記載の Hdlタンパク質 （日本晴、 銀坊主） と機能的に同等なタンパク質をコードする DNAを包含する。 ここで 「Hdlタンパ ク質と同等の機能を有する」 とは、 対象となるタンパク質が植物の感光性を増加 させる機能を有することを指す。 このような DNAは、 好ましくは単子葉植物由 来であり、 より好ましくはイネ科植物由来であり、 最も好ましくはイネ由来であ る。
このような DNAには、 例えば、 配列番号： 1または 3に記載のァミノ酸配列に おいて 1若しくは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 付加および/または挿入された アミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、 誘導体、 アレル、 ノ リア ントおよびホモログが含まれる。
アミノ酸配列が改変された夕ンパク質をコードする DNAを調製するための当 業者によく知られた方法としては、 例えば、 site- directed mutagenesis法 （Kr amer, W. & Fritz，H. - J. ( 1987) Oligonucleotide - directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA. Methods in Enzymology, 154: 350-367 ) が挙げられる。 また、 塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸 配列が変異することは、 自然界においても生じ得る。 このように天然型の Hdl タンパク質をコ一ドするアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が置 換、 欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコ一ドする DNA であっても、 天然型の Hdlタンパク質 （配列番号： 1または 3) と同等の機能を 有するタンパク質をコードする限り、 本発明の DNAに含まれる。 また、 たとえ 、 塩基配列が変異した場合でも、 それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わな い場合 （縮重変異） もあり、 このような縮重変異体も本発明の DNAに含まれる ある DNAが植物の感光性を増加させるタンパク質をコードするか否かは以下 のようにして評価することができる。 最も一般的な方法としては、 該 DNAが導 入された植物を、 日長が変更できるグロースチャンバ一で栽培して調べる手法で ある。 すなわち短日 （一般的には 9〜10時間） 条件と長日 （14〜16時間） 条件 で栽培し、 播種から開花するまで （イネであれば播種から穂が出るまで） に必要 な日数を比較する方法である。 該日数が長日と短日で変わらないかほとんど同じ 場合は感光性がないと判断する。 感光性がある場合は、 長日での開花までの日数 は短日より大きくなり、 その差の大きさを感光性の程度とみなすことができる。 グロ一スチャンバ一が利用できない場合には、 自然日長の圃場あるいは温室にお ける栽培試験で検定可能である。 すなわち温室に 20日おきに播種し、 温度を保 つて自然日長下で栽培し、 それそれの開花日を測定する。 イネにおいては、 一般 に 8月〜 2月に播種した場合は、 感光性の大きな品種の出穂は促進され、 逆に 4 月から 7月では遅延する。 一方、 感光性の小さな品種では到穂日数は播種期の 移動に影響されずに変化が小さい。
配列番号： 1または 3に記載の Hdlタンパク質と機能的に同等なタンパク質を コードする DNAを調製するために、 当業者によく知られた他の方法としては、 ハイブリダィゼ一シヨン技術 （Southern, E.M. ( 1975 ) Journal of Molecular Biology, 98， 503) やポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) 技術 （Saiki， R. K. et al . ( 1985 ) Science, 230, 1350-1354、 Saiki, R. K. et al . ( 1988) Science, 239， 487-491 ) を利用する方法が挙げられる。 即ち、 当業者にとっては、 Hdl遺 伝子の塩基配列 （配列番号： 2または 4) もしくはその一部をプローブとして、 また Hdl遺伝子 （配列番号： 2または 4) に特異的にハイブリダィズするオリゴ ヌクレオチドをプライマーとして、 イネや他の植物から Hdl遺伝子と高い相同 性を有する DNAを単離することは通常行いうることである。 このようにハイブ リダィズ技術や PCR技術により単離しうる Hdlタンパク質と同等の機能を有す るタンパク質をコードする DNAもまた本発明の DNAに含まれる。
このような DNAを単離するためには、 好ましくはストリンジェントな条件下 でハイプリダイゼーシヨン反応を行なう。 本発明においてストリンジェントなハ イブリダィゼ一シヨン条件とは、 6M尿素、 0.4%SDS、 0.5xSSCの条件またはこれ と同等のストリンジエンシーのハイプリダイゼーシヨン条件を指す。 よりストリ ンジエンシーの高い条件、 例えば、 6M尿素、 0.4 SDS、 O. lxSSCの条件を用れば 、 より相同性の高い DNAの単離を期待することができる。 これにより単離され た DNAは、 アミノ酸レベルにおいて、 Hdlタンパク質のアミノ酸配列 （配列番号
: 1または 3) と高い相同性を有すると考えられる。 高い相同性とは、 アミノ酸 配列全体で、 少なくとも 50%以上、 さらに好ましくは 70%以上、 さらに好まし くは 90%以上 （例えば、 95%以上） の配列の同一性を指す。 アミノ酸配列や塩基 配列の同一性は、 Karl in and Altschul によるアルゴリズム BLAST (Proc . Nat 1. Acad. Sei . USA 90 : 5873-5877, 1993 )によって決定することができる。 この ァルゴリズムに基づいて、 BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されて いる（Altschul et al . J. Mol . Biol .215 :403- 410， 1990 )。 BLASTに基づいて B LASTNによって塩基配列を解析する場合には、 パラメ一夕一はたとえば score =
100、 ordlength = 12とする。 また、 BLASTに基づいて BLASTXによってアミ ノ酸配列を解析する場合には、 パラメ一夕一はたとえば score = 50、 wordleng th = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログ ラムのデフォルトパラメーターを用いる。 これらの解析方法の具体的な手法は公 知である (http://www.iicbLnlm. nin.gov· )0
本発明の DNAは、 例えば、 組み換えタンパク質の調製や感光性が改変された 形質転換植物体の作出などに利用することが可能である。 組み換えタンパク質を調製する場合には、 通常、 本発明のタンパク質をコード する DNAを適当な発現べクタ一に挿入し、 該ベクターを適当な細胞に導入し、 形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。 組み換えタンパク質 は、 精製を容易にするなどの目的で、 他のタンパク質との融合タンパク質として 発現させることも可能である。 例えば、 大腸菌を宿主としてマルトース結合タン パク質との融合タンパク質として調製する方法 （米国 New England BioLabs社 発売のベクタ一 pMALシリーズ） 、 グル夕チオン- S-トランスフェラーゼ（GST)と の融合タンパク質として調製する方法 （Amersham Pharmacia Biotech社発売の ベクタ一 pGEXシリーズ） 、 ヒスチジンタグを付加して調製する方法 （Novagen 社の PETシリーズ） などを利用することが可能である。 宿主細胞としては、 組 み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、 上記の大腸菌の 他、 例えば、 酵母、 種々の動植物細胞、 昆虫細胞などを用いることが可能である 。 宿主細胞へのベクターの導入には、 当業者に公知の種々の方法を用いることが 可能である。 例えば、 大腸菌への導入には、 カルシウムイオンを利用した導入方 法 (Mandel , M. & Higa, A. ( 1970) Journal of Molecular Biology, 53， 158 -162、 Hanahan, D. ( 1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580) を用いることができる。 宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、 該宿主 細胞またはその培養上清から、 当業者に公知の方法により精製し、 回収すること が可能である。 組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などと の融合夕ンパク質として発現させた場合には、 容易にァフィニティ一精製を行う ことが可能である。
得られた組換えタンパク質を用いれば、 これに結合する抗体を調製することが できる。 例えば、 ポリクローナル抗体は、 精製した本発明のタンパク質若しくは その一部のぺプチドをゥサギなどの免疫動物に免疫し、 一定期間のにちに血液を 採取し、 血べいを除去することにより調製することが可能である。 また、 モノク ローナル抗体は、 上記タンパク質若しくはべプチドで免疫した動物の抗体産生細 胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、 目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞 （ ハイプリ ドーマ） を単離し、 該細胞から抗体を得ることにより調製することがで きる。 これにより得られた抗体は、 本発明のタンパク質の精製や検出などに利用 することが可能である。 本発明には、 本発明のタンパク質に結合する抗体が含ま れる。
本発明の DNAを利用して感光性が増加した形質転換植物体を作製する場合に は、 本発明のタンパク質をコードする MAを適当なベクターに揷入して、 これ を植物細胞に導入し、 これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。 本発 明者等により単離された感光性遺伝子 Hdlは、 イネの感光性を強める作用を有 し、 その結果、 出穂期を遅らせる効果を有するが、 この遺伝子を任意の品種に導 入し発現させることによりそれらの系統の出穂期を調節することが可能である。 この形質転換に要する期間は、 従来のような交配による遺伝子移入に比較して極 めて短期間であり、 また、 他の形質の変化を伴わない点で有利である。 イネにお いて、 出穂期を調節する遺伝子はこれまで単離，同定の報告はなされておらず、 このような手法は本発明により初めて可能となった。
一方、 感光性が低下した形質転換植物体を作製する場合には、 本発明のタンパ ク質をコードする MAの発現を抑制するための DNAを適当なベクターに挿入し て、 これを植物細胞に導入し、 これにより得られた形質転換植物細胞を再生させ る。 「本発明のタンパク質をコードする DNAの発現の抑制」 には、 遺伝子の転 写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。 また、 DNAの ¾現の完全 な停止のみならず発現の減少も含まれる。
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、 アンチセン ス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。 植物細胞におけるァ ンチセンス効果は、 エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、 電気穿孔法で導 入したアンチセンス RNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初 めて実証した（J. R. Eckerおよび R. W. Davis, ( 1986 ) Proc . Natl . Acad. USA.83 : 53 72 )。 その後、 タバコやペチュニアにおいても、 アンチセンス RNAの発現によつ て標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており（A. iL van der Krolら ( 19 88 ) Nature 333 : 866 )、 現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段とし て確立している。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、 以下のような 複数の要因が存在する。 すなわち、 三重鎖形成による転写開始阻害、 Aポリメ ラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイプリッド形成 による転写抑制、 合成の進みつつある RNAとのハイプリッド形成による転写阻 害、 イントロンとェキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシン グ抑制、 スプライソソーム形成部位とのハイプリヅド形成によるスプライシング 抑制、 mRNAとのハイブリツド形成による核から細胞質への移行抑制、 キヤツビ ング部位やポリ（ A )付加部位とのハイブリヅド形成によるスプライシング抑制 、 翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳關始抑制、 閧始コドン 近傍のリボソーム結合部位とのハイブリツ ド形成による翻訳抑制、 fflRNAの翻訳 領域やポリソーム結合部位とのハイプリッ ド形成によるべプチド鎖の伸長阻止、 および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイプリッド形成による遺伝子発 現抑制などである。 これらは、 転写、 スプライシング、 または翻訳の過程を阻害 して、 標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上 「新生化学実験講座 2 核酸 IV 遺伝子の複製と発現」 ，日本生化学会編,東京化学同人 , PP. 319- 347, 1993 )。 本発明で用いられるアンチセンス配列は、 上記のいずれの作用で標的遺伝子の 発現を抑制してもよい。 一つの態様としては、 遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻 訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻訳阻害に効果的で あろう。 しかし、 コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用 し得る。 このように、 遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセ ンス配列を含む DNAも、 本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。 使 用されるアンチセンス DNAは、 適当なプロモー夕一の下流に連結され、 好まし くは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 このようにして調製さ れた DNAは、 公知の方法で、 所望の植物へ形質転換できる。 アンチセンス DNA の配列は、 形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列 であることが好ましいが、 遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、 完全に相補的 でなくてもよい。 転写された MAは、 標的とする遺伝子の転写産物に対して好 ましくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。 アンチセンス 配列を用いて、 効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、 アンチセンス DNA の長さは、 少なくとも 15塩基以上であり、 好ましくは 100塩基以上であり、 さ らに好ましくは 500塩基以上である。 通常、 用いられるアンチセンス DNAの長 さは 5kbよりも短く、 好ましくは 2.5kbよりも短い。
内在性遺伝子の発現の抑制は、 また、 リボザィムをコ一ドする DNAを利用し て行うことも可能である。 リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことを いう。 リボザィムには種々の活性を有するものがあるが、 中でも MAを切断す る酵素としてのリボザィムの研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とする リボザィムの設計が可能となった。 リボザィムには、 グループ Iイントロン型や 、 RNasePに含まれる M1RNAのように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもあ るが、 ハンマーへッド型ゃヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ド メインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子， （1990) 蛋白質核酸酵素， 35 :2191 )。
例えば、 ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C 15の 3'側を切断するが、 活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重 要とされ、 15位の塩基は Cの他に Aまたは Uでも切断されることが示されてい る（M. Koizumi ら，（1988) FEBS Lett.228: 225)。 リボザィムの基質結合部を標的 部位近傍の RNA 配列と相補的になるように設計すれば、 標的 RNA中の UC、 UUま たは UAという配列を認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出すること が可能である（M. Koizumi ら，（1988) FEBS Lett. 239 : 285、 小泉誠および大塚栄 子，（1990) 蛋白質核酸酵素， 35:2191、 M.Koizumiら， (1989) Nucleic Acids R es. 17:7059)。 例えば、 Hdl遺伝子のコード領域 （配列番号： 2または 4) 中に は標的となりうる部位が複数存在する。
また、 ヘアピン型リボザィムも、 本発明の目的のために有用である。 ヘアビン 型リボザィムは、 例えばタバコリングスポットウイルスのサテラィ ト RNAのマ ィナス鎖に見出される（J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。 このリボザィムも 、 標的特異的な RNA切断を起こすように設計できることが示されている（Y.Kiku chi および N.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、 菊池洋， (1992) 化学と生物 30:112)。
標的を切断できるよう設計されたリボザィムは、 植物細胞中で転写されるよう に力リフラワーモザィクウィルスの 35Sプロモーターなどのプロモーターおよ び転写終結配列に連結される。 しかし、 その際、 転写された RNAの 5'末端や 3' 末端に余分な配列が付加されていると、 リボザィムの活性が失われてしまうこと がある。 このようなとき、 転写されたリボザィムを含む RNAからリボザィム部 分だけを正確に切り出すために、 リボザィム部分の 5'側や 3'側に、 . トリミング を行うためのシスに働く別のトリミングリボザィムを配置させることも可能であ る（K.Tairaら， (1990) Protein Eng. 3:733、 A.M.Dzianottおよび J. J.Bujars ki (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:4823、 C.A.Grosshansおよび R.T.Ce ch (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Tairaら （1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。 また、 このような構成単位をタンデムに並べ、 標的遺伝子内の 複数の部位を切断できるようにして、 より効果を高めることもできる（N.Yuyam a ら Biochem.Biophys. Res. Co皿 un.186:1271, 1992)。 このようなリボザィムを用 いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、 該遺伝子の発現を 抑制することができる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、 さらに、 標的遺伝子配列と同一もしくは類似し た配列を有する DNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成さ れうる。 「共抑制」 とは、 植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列 を有する遺伝子を形質転換により導入すると、 導入する外来遺伝子および標的内 在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。 共抑制の機構の詳細は 明らかではないが、 植物においてはしばしば観察される（Curr. Biol .7:R793, 199 7, Curr. Biol .6 : 810, 1996 )。 例えば、 Hdl遺伝子が共抑制された植物体を得るた めには、 Hdl遺伝子若しくはこれと類似した配列を有する DNAを発現できるよう に作製したべクタ一 DNAを目的の植物へ形質転換し、 得られた植物体から Hdl変 異体の形質を有する植物、 即ち感光性が低下した植物を選択すればよい。 共抑制 に用いる遺伝子は、 標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、 少なくとも 7 0%以上、 好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上 （例えば、 95%以 上） の配列の同一性を有する。 配列の同一性は、 上記した手法により決定できる さらに、 本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、 標的遺伝子のドミナン トネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによつても達成す ることができる。 ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、 該遺伝子を 発現させることによって、 植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失 もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、 該細胞内で挿入遺伝子を 発現させることが可能なものであれば特に制限はない。 例えば、 植物細胞内での 恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモー夕一 （例えば、 カリフラワーモザイク ウィルスの 35Sプロモーター） を有するベクターや外的な刺激により誘導的に 活性化されるプロモー夕一を有するベクタ一を用いることも可能である。 ここで いう 「植物細胞」 には、 種々の形態の植物細胞、 例えば、 懸濁培養細胞、 プロト プラスト、 葉の切片、 カルスなどが含まれる。
植物細胞へのベクターの導入は、 ポリエチレングリコール法、 電気穿孔法 （ェ レクト口ポーレーシヨン） 、 ァグロパクテリゥムを介する方法、 パ一テイクルガ ン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。 形質転換植物細胞か らの植物体の再生は、 植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが 可能である (Toki ら （1995 ) Plant Physiol . 100 : 1503- 1507参照） 。 例えば、 イネにおいては、 形質転換植物体を作出する手法については、 ポリエチレングリ コールによりプロトプラス卜へ遺伝子導入し、 植物体 （インド型イネ品種が適し ている） を再生させる方法 （Datta, S. K. ( 1995 ) In Gene Transfer To Plants( Potrykus I and Spangenberg Eds. ) pp66-74) 、 電気パルスによりプロトプラ ストへ遺伝子導入し、 植物体 （日本型イネ品種が適している） を再生させる方法
(Toki et al ( 1992 ) Plant Physiol . 100， 1503-1507) 、 パーティクルガン法 により細胞へ遺伝子を直接導入し、 植物体を再生させる方法 （Christou et al .
( 1991 ) Bio/technology, 9 : 957-962. ) およびァグロパクテリゥムを介して遺 伝子を導入し、 植物体を再生させる方法 （Hiei et al . ( 1994) Plant J. 6 : 27 1-282. ) など、 いくつかの技術が既に確立し、 本願発明の技術分野において広 く用いられている。 本発明においては、 これらの方法を好適に用いることができ る。
一旦、 ゲノム内に本発明の DNAが導入された形質転換植物体が得られれば、 該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。 また 、 該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料 （例えば、 種子、 果実、 切 穂、 塊茎、 塊根、 株、 カルス、 プロ トプラスト等） を得て、 それらを基に該植物 体を量産することも可能である。 本発明には、 本究明の DNAが導入された植物 細胞、 該細胞を含む植物体、 該植物体の子孫およびクローン、 並びに該植物体、 その子孫、 およびクローンの繁殖材料が含まれる。
このようにして作出された感光性が改変された植物体は、 野生型植物体と比較 して、 その開花時期が変化している。 例えば、 Hdlタンパク質をコードする DNA が導入された植物体は、 その感光性の増加により、 圃場条件下において開花時期 が遅延し、 一方、 アンチセンス DNAなどの導入により Hdlタンパク質をコード する DNAの発現が抑制された植物体は、 その感光性の低下により、 開花時期が 早まる。 このように Hdl遺伝子の発現を制御することにより、 植物の開花時期 を調節することができる。 本発明の手法を用いれば、 有用農作物であるイネにお いては、 その出穂時期を調節することができ、 生育環境に適応したイネ品種の育 成の上で非常に有益である。
本発明は、 また、 植物の感光性を評価する方法を提供する。 本発明者等は、 H dl遺伝子の転写産物と圃場での到穂日数との関係をみたところ、 正常 （日本晴 および銀坊主） な転写産物が認められた場合は、 到穂日数は増加し、 異常な転写 産物が認められた場合は減少した （実施例 5 ) 。 このことは、 植物における感光 性の程度が、 機能的な Hdlタンパク質を発現するか否かが一つの要因となって 決定されていることを示すものである。 本発明の植物の感光性を評価する方法は 、 この知見に基づくものであり、 植物が機能的な Hdlタンパク質をコードする D NAを保持しているか否かを検出することを特徴とする。
植物が機能的な Hdlタンパク質をコ一ドする DNAを保持しているか否かは、 例えば、 ゲノム DNAの Hd 1に相当する領域の構造上の違いを多型として検出す ることにより評価することが可能である。
本発明の方法による植物の感光性の評価は、 例えば、 植物の交配による品種改 良を行なう場合において利点を有する。 例えば、 感光性の形質の導入を望まない 場合に、 感光性を有する品種との交配を避けることができ、 逆に、 感光性の形質 の導入を望む場合に、 感光性を有する品種との交配を行なうことができる。 また 交雑後代個体から望ましい個体を選抜する際にも有効である。 植物の感光性の有 無を、 その表現型により判断することに比して、 遺伝子レベルで判断することは 簡便で確実であるため、 本発明の感光性の評価方法は、 植物の品種改良において 大きく貢献し得ると言える。
また、 本発明は、 配列番号： 2または 4に記載の塩基配列からなる本発明の D NAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドからなる DNAを提供 する。 ここで 「相補鎖」 とは、 A: T、 G : Cの塩基対からなる 2本鎖 DNAの一方の 鎖に対する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 少なくとも 15個の連続し たヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、 少なくとも 70%、 好ましくは少なくとも 80%、 より好ましくは 90%、 さらに好ましくは 95% 以上の 塩基配列が相補配列であればよい。 このような DNAは、 本発明の DNAの検出や 単離を行なうためのプローブとして、 また、 増幅を行うためのプライマーとして 有用である。 . 図面の簡単な説明
図 1は、 Hdl遺伝子領域の詳細な連鎖地図、 YACならびにゲノミッククローン の整列化地図を示したものである。
Aは、 1505個体の分離集団を利用して作成した連鎖地図を示したものである
Bは、 酵母人工染色体 （YAC) クローンの整列化地図を示したものである。 Cは、 P1由来人工染色体 （PAC) クローンの整列化地図を示したものである。 Dは、 Hdl遺伝子の候補領域と予測される遺伝子ならびにそれらの類似性検索 結果を示したものである。
図 2は、 Hdl候補遺伝子領域の塩基配列の比較を示す図である。 日本晴および 銀坊主は機能を有する Hdl遺伝子を、 Kasalathは機能が低下したか消失した遺 伝子をもつ。 HS66および HSU0は銀坊主のァ線照射により誘発された Sel遺伝 子座の感光性を失っている突然変異系統である。 四角で囲んだ領域は遺伝子予測 の結果、 ェクソンと推定された領域を示す。 検出された変異部位の上部の数字は 、 挿入あるいは欠失した塩基数を示す。
図 3は、 形質転換による相補性検定に用いたベクターを示す図である。
図 4は、 Hd 1候補遺伝子領域を含む 7. 1kbのゲノム DNA断片を導入した形質 転換個体群における出穂までに要する日数の変化を示す図である。 図 5は、 Hd 1候補遺伝子領域を含む 7. lk のゲノム DNA断片を導入した形質 転換個体の自殖後代 （T1 ) における出穂までに要する日数を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。
[実施例 1 ] 高精度連鎖解析および酵母人工染色体 （YAC) クローンによる Hd 1遺伝子領域の整列化
マップベースクローニングに不可欠な大規模分離集団による Hdl領域の詳細 な連鎖解析を行った。 連鎖解析用の集団は Hdl領域が分離する日本晴と Kasalat hの戻し交雑後代 BC3F3世代を用いた。 連鎖解析にはプールサンプリング法を用 いた。 すなわち Hdl領域が分離する BC3F3約 8000個体を圃場に栽培して、 出穂 期を調査し、 分離個体の中から Hdl遺伝子座の Kasalathホモ個体と推定される 早生個体 1505個体を選抜した。 選抜した個体の葉を 5個体で一つのプールとし 、 DNAを抽出して、 Hdl領域に生じた組み換え染色体を有する個体を選定した。 組み換え個体の選抜に用いた RFLPマーカーは R1679および P130である。 その 結果、 Hdlと R1679および P130の間にそれそれ 9個および 2個の組み換え個体 を選抜した （図 1 ) 。
Hdl近傍に存在すると考えられる DNAマーカーを用いてさらに詳細な連鎖解析 を行ったところ、 Hdl遺伝子座は RFLPマーカー S20481および P130との間に位 置づけられ、 S2539との間には組み換え個体は見出されなかった （図 1 ) 。 Hdl 遺伝子のゲノム候補領域を絞り込むために有用な組み換え個体を、 S20481との 間に 1個体、 P130との間に 2個体見出した。
イネゲノム研究において作出された YACクローンの整列化地図の情報をもと に Hdl遺伝子座近傍に存在する DNAマーカー C235、 S20481および S2539の塩基 配列を有する YACクローンを特定した。 さらに特定された YACクローン Y4836 の末端断片をカセット法により単離し、 RFLPマーカーとして解析したところ、 末端クローン Y4836Rは RFLPマーカ一 P130と共分離した。 したがって、 YACク ローン Y4836は Hdl遺伝子領域を含むことが明らかとなった （図 1 ) 。
[実施例 2 ] P1由来人工染色体 （PAC) クローンによる Hdl遺伝子領域の整列 化
Hdl遺伝子座近傍の RFLPマ一カー S20481 (増幅ゲノム断片 0· 74kb) 、 および S2539 (増幅ゲノム断片 1.9kb) を STS化したプライマ一セッ トを用いて、 イネ ゲノム解析研究において作成された日本晴ゲノムの PACクローンライブラリー
(平均インサート長 112kb， 18432クローン；イネゲノムの約 4.5倍に相当） のスクリーニングを行った。 STS化に用いたプライマーは、 S20481については
「配列番号： 5/ 5， -GGA CTG GGT GAA GAA GAT-3'」 と 「配列番号： 6/ 5， -CCT T GT CCT CTC CTC TTG-3' j 、 S2539については 「配列番号： 7/ 5， - GTA GAG TGA TGA CM AAT GAC AA-3'」 と 「配列番号： 8/ 5， -GGA CTG AGA TGG AAT GTG CT-3 ' j を用いた。 その結果、 P0676F10および P0038C5の 2つのクローンが選抜され た。 さらにこれらの PACクローンが RFLPマーカー Y4836Rおよび P130に対応す る塩基配列を有するか否かを PCRにより調査した。 その結果、 PACクローン P00 38C5は Y4836Rに対応する塩基配列を有することが明らかとなり、 Hdl遺伝子座 を完全に含むことが明らかとなった （図 1 ) 。
[実施例 3 ] 塩基配列解析による候補遺伝子領域の特定
Hdl遺伝子を含むと考えられる PACクローン P0038C5の塩基配列解析を行なつ た。 塩基配列の解析は P0038C5のインサート DNA (ベクタ一を含む） を超音波で 断片化し、 2kbおよび 5kbの平均ィンサート長のサブライブラリーを作成した。 このサブライブラリーから任意に選んだ 2000個のクローンの塩基配列を解析し 、 コンピューターソフ ト Phred/Phrapによりアセンブルを行った。 連鎖解析に より特定された候補遺伝子領域内の塩基配列情報を利用して、 さらに新たな CAP S (Cleaved Ampl ified Polymorphic Sequence )マーカ一を作成し、 候補領域の 絞り込みを行った。 Hdl遺伝子はプライマーとして、 CAPSマーカー lb (制限酵 素 Sspl ) 「配列番号： 9/ 5' -AAG C GCA GAA AGT AAA GAG- 3，」 および 「配列 番号： 10/ 5' -GAA ACA ATA GTA GAC CGA GCA- 3，」、 lc (制限酵素 Hindi 11 ) 「 配列番号： 11/ 5， -GAC CCA TCC GCC GCC TAC TCT-3' j および 「配列番号： 12/ 5' -GCA GGT CGT GAA ACA ATC GGT- 3，」、 Id (制限酵素 Hael l l ) 「配列番号： 1 3/ 5，- ATT GAG ATG GTA TTG CGG AAG A -3，」 および 「配列番号： 14/ 5， - CAC ATC GTG CCT TCA AGC TG-3，」 、 および le (制限酵素 Sau3AI) 「配列番号： 15/ 5， -ACA AGG ACG AGG AGG TGG AC- 3，」 および 「配列番号： 16/ 5， -GCT GCT GCT CTT GCT GTT CA-3'」 、 と共分離し、 la (制限酵素 Sau3AI) 「配列番号： 7」 お よび 「配列番号： 8」 、 および If (制限酵素 Ncol ) 「配列番号： 17/ 5' -CCA GG A AGT TTG AGA AGA CA-3' j および 「配列番号： 18/ 5， -TGC ATT CTG ATG CTT G AT TA-3' j との間にそれそれ 1個体の組み換え個体を検出した （図 1 ) 。 従つ て、 候補ゲノム領域を約 12kbまで絞り込むことができた。 この候補領域の塩基 配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行ったところ、 イネの ESTとし て捕足されているバーオキシダ一ゼ S2539ならびにァラビドプシスの COと非常 に高い類似性を示す領域が見い出された。 ァラビドプシスの CO遺伝子は長日条 件で開花を促進する機能を有する遺伝子であり、 ジンクフィンガードメインを有 する転写調節遺伝子であると考えられている。
[実施例 4 ] Hdl候補遺伝子の塩基配列解析
ィネの EST S2539は、 日本晴および Hdlの準同質遺伝子系統における RT- PCR によって、 転写産物量が変化していなかった。 したがってジンクフィンガードメ インをもつ予測遺伝子を Hdl遺伝子の候補とし、 さらなる解析を進めた。 Kasal athの Hdl候補遺伝子の塩基配列を決定するために、 Kasalathのゲノム DNAか ら作成したコスミ ドライブラリーから候補遺伝子を含むクローン no.47を選抜 した。 選抜したコスミ ドクローンを利用して、 Kasalathの Hdl候補遺伝子領域 12kbの塩基配列を決定した。 Kasalathの候補遺伝子領域 （配列番号： 19) の OR F内には 11箇所 （挿入、 欠失および塩基置換） の変異が認められたが、 そのう ち最も大きな変異は予測されるェクソン内の 36bpの挿入および 33bpの欠失で あった （図 2 ) 。
一方、 Hdlと同じ遺伝子座であると推定されている Selに関する突然変異系統 HS66および HS110ならびにそれらの原品種銀坊主の候補遺伝子領域の塩基配列 の解析を行った。 日本晴の塩基配列をもとに Hdl遺伝子領域を増幅できるブラ イマ一を作成し、 該当領域をクローン化して塩基配列を解析した。 その結果、 S el遺伝子をもつ銀坊主の塩基配列には、 Kasalathの配列に見い出された 36bp の挿入配列および 1塩基置換が認められたが、 その他は一致していた。 突然変 異系統 HS66 (配列番号： 20) では、 銀坊主と比較して、 予測されるェクソン内 に 43bpの欠失、 HS110 (配列番号： 21 ) ではィントロン内に 433bpの挿入が認 められた （図 2 ) 。
以上の結果によりジンクフィンガードメインをもつ候補遺伝子が Hdl遺伝子 のより有力な候補であると判断した。 また Se 1遺伝子座は Hdl遺伝子座と同じ である可能性が示唆された。
[実施例 5 ] Hdl候補遺伝子の発現解析
日本晴および Hdl遺伝子領域を Kasalathの染色体断片に置換した準同質遺伝 子系統 （NIL ( Hdl ) ) に対して、 候補遺伝子の RT- PCRを行った。 すなわち採取し た葉から全 MAを抽出し、 逆転写酵素により cDNAを合成した後、 Hdl遺伝子内 に設計したィントロンを含むプライマー （配列番号： 22/ 5' -TTC TCC TCT CCA AAG ATT CC- 3， （センス鎖） 、 配列番号： 23/ 5， -CAT ACG CCT TTC TTG TTT Ck- 3， （アンチセンス鎖） ） によって PCRを行った。 銃型に用いた RNA量の評価は ァクチンの遺伝子内断片を増幅できるプライマー （配列番号： 24/ 5' - TCC ATC TTG GCA TCT CTC AG- 3， （センス鎖） 、 および配列番号： 25/ 5' - GTA CCC GCA TCA GGC ATC TG -3' (アンチセンス鎖） ） を用いた PCRによって行った。 その 結果、 Hdl座に Kasalathの遺伝子をもつ日本晴の準同質遺伝子系統の候補遺伝 子の転写産物量は日本晴に比べて著しく減少し、 かつその大きさもわずかに小さ くなつていた （表 1 ) 。
表 1
系統 到穂曰数2 発現量3 転写産物の大きさ
日本晴 111 .4±0.55 +++ 期待されるサイズ （日本晴）
m i( Hdi)] 96.2±0.84 + やや小さい
銀坊主 118.8±0.84 +++ 期待されるサイズ
HS66 95.2±0.84 +++ やや小さい
HS110 99.0± 1 .00 + 期待されるものと大きいものの混合
2 :圃場栽培 （4月 22曰播種） におけるデータ
3： 候補遺伝子の発現量および転写産物の大きさは RT-PCRによる評価
転写産物の大きさは日本晴において增幅される産物の大きさを基準とした この大きさの違いはゲノム塩基配列において認めれた欠失に対応するものであ つた。 さらに Selに関する突然変異系統 HS66および HS110ならびにそれらの原 品種 「銀坊主」 に対して、 同様な RT- PCRによる発現解析を行った。 銀坊主では 日本晴と同様に転写産物が検出されたが、 HS66では転写産物量は銀坊主と変わ らないが、 やや小さな転写産物が増幅された。 サイズの減少の程度は、 ゲノム塩 基配列の解析において観察された 43bpの欠失と一致していた。 一方、 HSU0で は、 RT- PCRによる増幅産物が単一でなく、 銀坊主と同じ大きさや著しく大きな 転写産物が増幅されていた （表 1 ) 。 これらの増幅産物をクローン化し、 塩基配 列を調べたところ、 日本晴と同じ増幅産物の他に、 433bpの挿入配列の一部を含 む産物が見出された。 従って HS110では、 433bpのイントロンへの挿入により、 スプライシングが正常に行われていない可能性が示唆された。
候補遺伝子の転写産物と圃場での到穂日数との関係をみたところ、 正常 （日本 晴および銀坊主） な転写産物が認められた場合は、 到穂日数は増加し、 異常な転 写産物が認められた場合は減少した。 また HS110では、 正常な転写産物がわず かに認められたが、 到穂日数も銀坊主に比較して減少するものの、 HS66と比較 した場合、 わずかに増加していた （表 1 ) 。 この結果から、 HS110は Sel座の機 能を完全に失ってはいないことが示唆される。 塩基配列の解析結果ならびに発現解析の結果を総合して考えると、 候補遺伝子 領域が Hdl遺伝子であることならびに Sel遺伝子座は Hdl候補遺伝子座と同じ であることが強く示唆された。
[実施例 6 ] 形質転換による候補遺伝子の機能の同定
Hdlの候補領域として特定されたゲノム領域 7. lkbApal断片および 3.5kbHind I I I断片 （図 1 ) を、 ァグロパクテリゥムを介して形質転換可能なベクター pPZP 2H-lac (図 3 ) に組み込んだ。 これらの断片を含むベクターならびにベクタ一 のみを用い、 土岐らの方法 （（1997) Plant Mol . Biol . Rep. 15 : 16-21) により 形質転換を行なった。 形質転換する系統として、 日本晴の遺伝的背景をもち、 日 本晴のもつ感光性遺伝子 Hdlおよび Hd2領域を Kasalath型に置換して、 感光性 を消失させた系統 NIL(Hdl/Hd2 )を用いた。 形質転換の結果、 7. 1kb断片を組み 込んだベクターでは 52個体、 3.5kb断片を組み込んだベクターでは 44個体、 ベ クタ一のみでは 19個体のハイグロマイシン耐性個体を得た。
候補遺伝子に特異的なプライマー （配列番号： 14 (センス鎖） ， 配列番号： 1 5 (アンチセンス鎖） ） を用いて、 導入を試みた領域が組み込まれたか否かを PC R法により調査した。 その結果、 7. 1kb断片および 3.5kb断片の導入を試みたす ベての形質転換体について候補遺伝子が組み込まれれていることが示唆された。 これらの個体を、 自然日長条件の隔離温室 （7月中旬に培養室から隔離温室に 移す。 つくば巿） ならびに短日条件 （10時間照明） のグロースチャンバ一に移 し、 出穂までの所要日数を調査したところ、 自然日長条件では、 7. 1kb断片を導 入した個体群のなかに、 出穂が著しく促進された個体が出現した （図 4 ) 。 また 短日条件のグロースチャンバ一では 7. Ikb断片とベクターのみの個体の出穂曰 に明瞭な差が認められ、 7. Ikb断片を導入した個体の出穂がべク夕一のみを導入 した個体と比較して 7〜； 14日早くなつた。 一方、 3.5kbのゲノム断片を導入した 系統はべク夕一のみの個体と同様な出穂日となった。 これらの結果から、 候補遺伝子領域 （7. 1kb) には、 短日条件で出穂を促進す る作用を有することが確認された。 一般に、 感光性が強い場合、 短日条件では出 穂が促進されることから判断して、 導入したゲノム断片は感光性を強める機能を もつことが判明した。
さらに、 短日条件で出穂が促進された個体から 1コピーの導入遺伝子をもつ と推定される 1個体を選抜し、 その自殖後代を同じく短日条件 （10時間の明条 件、 14時間の暗条件） で栽培した。 その結果、 自殖後代の到穂日数には大きな 変異が認められ、 晩生 3個体は導入遺伝子を保有せず、 それら以外の早生個体 は導入遺伝子を保有していた （図 5 ) 。 最も早生となった 4個体は、 PCRによる 調査から、 導入遺伝子ホモ型であると考えられた。 以上の結果から、 導入した候 補遺伝子が短日条件で出穂を促進する Hdl遺伝子の機能を有することが立証さ れた。 産業上の利用の可能性
本発明によりィネの感光性遺伝子が提供された。 本発明の遺伝子はィネに感光 性を付与し、 これにより出穂期を調節する機能を有するため、 イネの品種育成に 大きく貢献し得る。 特に、 本発明の遺伝子を用いればイネの出穂期を変化させる ことができ、 栽培地域や栽培時期に適応したイネ品種育成に有用である。 また、 本発明の遺伝子を用いるイネの品種育成は、 短期間で高い確実性をもって目的の 植物体を得ることができる点で、 従来の方法より有利である。
また、 本発明により植物の感光性の評価方法が提供された。 従来の評価方法は 、 特定の遺伝子の存在を調べるための検定系統に対象品種を交配して、 それらの 後代の出穂期の分離から、 遺伝子の有無を推定するものであり、 1品種について 結論を出すために、 2〜3年と多大な労力を要した。 本発明の方法では、 播種後 2週間程度経過した苗の一部を採種して、 DNAを抽出し、 これを解析することに より判定できる。 感光性遺伝子をもっかどうかが判定できれば、 その品種の後代 における感光性の程度を交配の前に推定でき、 交配母本の選定や選抜のための有 用な情報となる。 また、 このマーカーは選抜集団の各個体の感光性遺伝子の有無 を上記の方法で容易に判定できることから選抜マーカーとしても利用できる。

Claims

請求の範囲
I . 植物の感光性を増加させる機能を有する植物由来のタンパク質をコードす る、 下記 （a ) から （c ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 1または 3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコー ドする DNAo
( b ) 配列番号： 1または 3に記載のアミノ酸配列において 1または複数のァ ミノ酸が置換、 欠失、 付加、 および/または挿入されたアミノ酸配列からなる夕 ンパク質をコ一ドする DNA。
( c ) 配列番号： 2または 4に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェ ントな条件下でハイブリダイズする DNA。
2 . イネ由来である、 請求項 1に記載の DNA。
3 . 請求項 1または 2に記載の DNAの転写産物と相補的なアンチセンス A をコードする DNA。
4 . 請求項 1または 2に DNAの転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性 を有する RNAをコードする DNA。
5 . 植物細胞における発現時に、 共抑制効果により、 請求項 1または 2に記載 の DNAの発現を抑制させる RNAをコードする DNA。
6 . 植物の感光性を増加させるために用いる、 請求項 1または 2に記載の DNA
7 . 植物の感光性を低下させるために用いる、 請求項 3から 5のいずれかに記 載の DNAo
8 . 請求項 1から 5のいずれかに記載の DNAを含むベクター。
9 . 請求項 8に記載のベクターが導入された植物細胞。
1 0 . 請求項 9に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。
I I . ィネである、 請求項 1 0に記載の形質転換植物体。
1 2 . 請求項 1 0または 1 1に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンで ある、 形質転換植物体。
1 3 . 請求項 1 0から 1 2のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
1 4 . 請求項 1 0または 1 1に記載の形質転換植物体の製造方法であって、 請 求項 1または 2に記載の DNAを植物細胞に導入し、 該植物細胞から植物体を再 生させる工程を含む方法。
1 5 . 請求項 1または 2に記載の DNAを植物体の細胞内で発現させることを 特徴とする、 植物の感光性を増加させる方法。
1 6 . 植物の感光性を増加させることにより日長に依存した植物の開花時期を 遅延させる、 請求項 1 5に記載の方法。
1 7 . 植物体の細胞内における、 内因性の請求項 1または 2のいずれかに記載 の DNAの発現を抑制することを特徴とする、 植物の感光性を低下させる方法。
1 8 . 請求項 3から 5のいずれかに記載の DNAを植物体の細胞内で発現させ る、 請求項 1 7に記載の方法。
1 9 . 植物の感光性を低下させることにより、 日長に依存した植物の開花時期 を早める、 請求項 1 7または 1 8に記載の方法。
2 0 . 植物がイネである、 請求項 1 5から 1 9のいずれかに記載の方法。
2 1 . 植物の感光性を評価する方法であって、 該植物における請求項 1に記載 の DNAの存在の有無を検出することを特徴とする方法。
2 2 . 植物がイネである、 請求項 2 1に記載の方法。
2 3 . 請求項 1または 2に記載の DNAを含むベクターが導入された宿主細胞
2 4 . 請求項 1または 2に記載の DNAによりコードされるタンパク質。
2 5 . 請求項 2 3に記載の宿主細胞を培養し、 該細胞またはその培養上清から 組換え夕ンパク質を回収する工程を含む、 請求項 2 4に記載の夕ンパク質の製造 方法。
2 6 . 請求項 2 4に記載のタンパク質に結合する抗体。
2 7 . 配列番号： 2または 4に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補 鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドからなる DNA。
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