CN114807212A

CN114807212A - 调控或鉴定植物籽粒粒型或产量性状的基因及其应用

Info

Publication number: CN114807212A
Application number: CN202110068769.7A
Authority: CN
Inventors: 薛红卫; 张晓凡; 杨春艳
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2041-01-19

Abstract

本发明提供了一种调控或鉴定植物籽粒粒型或产量性状的基因及其应用。本发明所述的基因SPL12为一个正调控基因，其具有增加籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量的功能。同时，本发明人也发现，该SPL12基因存在一个SNP位点sf0629704374，其与籽粒粒型密切相关。本发明为植物的籽粒性状改良及产量性状改良提供了新途径。

Description

调控或鉴定植物籽粒粒型或产量性状的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物学和基因工程领域，更具体地，本发明涉及调控或鉴定植物籽粒粒型或产量性状的基因及其应用。

背景技术

禾谷类作物是重要的农作物，如何在有限的耕地上种出更多的作物一直是农业工作者的研究重心。研究调节农作物株型、优化农作物种植的手段，是非常重要的工作。

禾本科植物，尤其水稻，是重要的粮食作物，粒型的调控是育种专家的重点研究内容之一。粒型与最后水稻的外观品质密切相关，例如细长的泰国香米，短圆的东北大米。如何有效的缩短传统选育的时间，是现在分子育种学家的努力方向，通过解析粒型调控基因的功能，有助于育种学家选育符合要求的不同外观品质的大米。同时，产量的高低也是人们所密切关注的。

目前研究发现了一些调控理性调控基因，比如例如SMOS1、GS3、TGW6、PGL1、GL7、GLW7、GS2、GW2、GW5、GS5、GW8、GS6等。但是随着基因具体功能研究的拓展，人们发现这些粒型调控基因间存在复杂的调控网络。

其中有一部分基因与激素brassinolide(BR)的合成和信号相关。DWARF AND LOW-TILLERING(DLT)/GRAIN SIZE 6(GS6)/SMALL ORGAN SIZE2(SMOS2)编码GRAS蛋白，研究发现它能够负调控籽粒的大小。随后实验证明它能够与另一个粒型调控基因SMALL ORGANSIZE1(SMOS1)互作，形成复合体，增强SMOS1的转录活性。SMOS1是编码APETALA2(AP2)转录因子，后续还发现SMOS1能够与OsBZR1相互作用，增强OsBZR1的转录活性，并且水稻BIN2的同源蛋白GSK2能够磷酸化SMOS1，降低其蛋白稳定性。研究人员也发现定位在细胞质膜的GW5能够与GSK2相互作用，抑制其激酶活性，改变了OsBZR1和DLT的磷酸化状态，使OsBZR1和DLT更稳定，最终影响BR信号，改变粒型。除了BR信号的改变，BR含量的改变也会影响粒型，DWARF11(D11)参与BR的合成，d11突变体表现为籽粒变小。

此外，GW7是一类含有TON1 RECRUIT MOTIF(TRM)结构域的蛋白，通过招募TON1蛋白调控微管的排布，影响细胞分裂方向。而GW8能够结合在GW7的启动子区域，并抑制其表达，最终影响种子的粒宽。在这些粒型调控基因中，有一类特殊的转录因子家族SQUAMOSAPROMOTER BINDING PROTEUN-LIKE(SPL)发挥重要的调控作用。

作物育种领域中，尽管已经把一些基因与籽粒粒型或产量性状密切相关，但是随着人们需求水平的提高，找到具有特定特点的基因、开发表型进一步改良的植物新品种仍然是本领域所追求的目标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控或鉴定植物籽粒粒型或产量性状的基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种调控禾谷类植物的籽粒粒型或产量性状的方法，包括：在植物中调控SPL12蛋白的表达或活性。

在一个优选例中，所述的SPL12蛋白包括其同源物。

在另一优选例中，所述调控为增加籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量；所述方法包括：在植物中上调SPL12蛋白的表达或活性；较佳地，所述上调包括在植物中过表达SPL12蛋白，从而提高SPL12蛋白的表达或活性；较佳地，所述上调包括抑制SPL12蛋白编码基因被剪切；更佳地，所述抑制SPL12蛋白编码基因被剪切是将SPL12蛋白编码基因中受到miR-156干扰的位点进行突变(更佳地，在SPL12基因CDS序列第1143-1164位由碱基SEQID NO:5变为SEQ ID NO:6。

在一个优选例中，所述调控为降低籽粒的粒长、降低籽粒的长宽比；所述方法包括：在植物中下调SPL12蛋白的表达或活性；较佳地，所述下调包括：在植物中敲除或沉默SPL12蛋白的编码基因，或抑制SPL12蛋白的活性；较佳地所述下调包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除SPL12蛋白的编码基因；以同源重组的方法敲除SPL12蛋白的编码基因；以特异性干扰SPL12蛋白编码基因表达的干扰分子(如miRNA，siRNA，shRNA等；更具体如miR-156)来沉默；或将SPL12蛋白进行功能丧失性突变。

在本发明的另一方面，一种SPL12蛋白或其调节剂的用途，用于调节禾谷类植物的籽粒粒型或产量性状(或制备籽粒粒型或产量性状被调节的禾谷类植物)。

在一个优选例中，所述调节剂为上调剂，所述SPL12蛋白或其上调剂用于增加籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量；较佳地，所述的上调剂包括：过表达所述SPL12蛋白的表达盒或表达构建物(包括表达载体)，提高所述SPL12蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物，或抑制SPL12蛋白编码基因被剪切的试剂；较佳地，所述抑制SPL12蛋白编码基因被剪切的试剂是定点突变试剂，其将SPL12蛋白编码基因中受到miR-156干扰的位点进行突变(更佳地，在SPL12基因CDS序列第1143-1164位由碱基SEQ ID NO:5变为SEQ ID NO:6。

在另一优选例中，所述的调节剂为下调剂，其用于降低籽粒的粒长、降低籽粒的长宽比；较佳地，所述下调剂包括：敲除或沉默SPL12蛋白的编码基因的试剂，抑制SPL12蛋白活性的试剂；较佳地，所述下调剂包括：针对所述SPL12蛋白的编码基因的基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将SPL12蛋白进行功能丧失性突变；或，特异性干扰SPL12蛋白的编码基因表达的干扰分子(如miRNA，siRNA，shRNA等；更具体如miR-156)。

在另一优选例中，所述禾谷类作物为表达SPL12蛋白或其同源物的植物；较佳地，所述的禾谷类作物包括禾本科植物；较佳地，所述禾谷类作物包括选自(但不限于)：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草。

在另一优选例中，所述的禾谷类植物是SPL12蛋白相对低表达(如显著低于该种植物的该基因的表达水平)或不表达的植物，其通过提高SPL12蛋白的表达或活性，增加籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量。

在另一优选例中，所述的SPL12蛋白的氨基酸序列选自下组：(i)具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白；(ii)将如(i)所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(i)蛋白功能的、由(i)衍生的蛋白；(iii)氨基酸序列与(i)所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％、≥98％或≥99％)，具有所述调控性状功能的蛋白；(iv)(i)所示氨基酸序列的蛋白的活性片段；或(v)在(i)所示氨基酸序列的蛋白的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的蛋白。

在本发明的另一方面，提供SPL12蛋白或其编码基因的用途，用作分子标记物鉴定(分析)禾谷类植物籽粒粒型；所述SPL12的编码基因包含有SNP位点sf0629704374。

在本发明的另一方面，提供SPL12蛋白或其编码基因的用途，用作分子标记物鉴定(分析)水稻粳稻或籼稻种型；所述SPL12的编码基因包含有SNP位点sf0629704374。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定禾谷类植物籽粒粒型或鉴定水稻粳稻或籼稻种型的方法，包括：分析SPL12蛋白或其编码基因，其中所述SPL12的编码基因包含有SNP位点sf0629704374。

在一个优选例中，基于SPL12蛋白编码基因的SNP位点sf0629704374(相应于SEQID NO:2中第1066位)：若该位点的碱基为C，则其籽粒为粒宽增加的粒型，或该水稻为粳稻(粳稻概率大于98％；较佳地大于98.5％；更佳地大于99％)；若该位点的碱基为A，则其籽粒为粒宽降低的粒型，或该水稻为籼稻或粳稻(较佳地，籼稻概率大于70％而粳稻概率小于30％；更佳地，籼稻概率大于75％而粳稻概率小于25％；更佳地，籼稻概率大于80％而粳稻概率小于20％)。

在另一优选例中，基于SPL12蛋白序列即相应于SEQ ID NO:3中第356位：若该位点的氨基酸残基为P，则其籽粒为粒宽增加的粒型，或该水稻为粳稻；若该位点的氨基酸残基为T，则其籽粒为粒宽降低的粒型，或该水稻为籼稻或粳稻。

在另一优选例中，所述粒长或粒宽“增加”是指与野生型植物、同类或同种植物的量相比，有统计学意义的增加，如增加2％、5％、10％、15％、20％、40％或更多。

在另一优选例中，所述粒宽“降低”是指与野生型植物、同类或同种植物的量相比，有统计学意义的降低，如降低2％、5％、10％、15％、20％、40％或更低。

在本发明的另一方面，提供一种筛选增加禾谷类植物籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达SPL12蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中SPL12蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高(显著提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高)，则表明该候选物质为增加禾谷类植物籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量的物质的物质。

在一个优选例中，所述方法还包括：设置不添加所述候选物质的对照组，从而明确分辨测试组中所述SPL12蛋白表达或活性与对照组的差异。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述SPL12蛋白或其编码基因或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。

在一个优选例中，所述“增加产量”是指与野生型植物、同类或同种植物的量相比，有统计学意义的增加，如增加2％、5％、10％、15％、20％、40％或更高。

在本发明的另一方面，提供一种植物细胞、组织或器官，其中含有外源的SPL12蛋白的上调剂，所述上调剂包括选自：过表达所述SPL12蛋白的表达盒或表达构建物(包括表达载体)；或抑制SPL12蛋白编码基因被剪切的试剂；或提高所述SPL12蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物；或与所述SPL12蛋白相互作用、从而提高其表达或活性的上调剂。

在一个优选例中，所述的植物细胞、组织或器官不具有繁殖能力。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、OsSPL12基因的SNP位点的示意图。

图2A～G、pSPL12::RmSPL12材料粒型统计结果；SPL12^Ja过表达水稻粒长和长宽比较中花11变大，SPL12^Ja粒宽变大；标尺＝2cm。

图3A～G、pSPL12(I)::RmSPL12(I)材料粒型统计结果；SPL12^In过表达水稻粒长和长宽比较中花11变大，SPL12^In粒宽变小；标尺＝2cm。

图4、籼稻和粳稻中相应的SNP各自的占比。

具体实施方式

本发明人经过大规模的研究筛选，揭示了一种新型的与调控植物籽粒粒型以及产量性状的基因SPL12，其为一个正调控基因，其具有增加籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量的功能。同时，本发明人也发现，该SPL12基因存在一个自然发生的SNP位点sf0629704374，本发明为植物的籽粒性状改良或产量性状改良提供了新途径。

术语

如本文所用，所述的“植物”包括表达SPL12蛋白的植物或基因组存在SPL12基因的植物。根据本领域的知识，表达SPL12的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物，所述禾谷类作物为具有籽粒(穗粒)的作物。所述的“禾谷类作物”可以是禾本科植物。较佳地，所述的禾本科植物包括：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草等。

如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％更高的调节。

如本发明所用，所述的“籽粒”是指植物的果实或种子，在水稻、玉米、小麦、大麦等作物中也称为穗粒。

关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

如本发明所用，所述的高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。

如本发明所用，所述的低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。

SPL12基因及其所编码的蛋白

在本发明中，除非特别说明，所述SPL12蛋白包括了其同源物(同源蛋白)。所述SPL12为具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽(蛋白)。本发明还包括具有与SPL12蛋白相同功能的序列变异形式。

所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的SPL12蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有所述SPL12蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

本发明中，所述的“SPL12蛋白”也包括它们的同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的SPL12蛋白，但是获自其它物种、特别是禾本科植物的与所述SPL12蛋白高度同源(如具有70％以上，更特别80％，85％、90％、95％、甚至98％以上序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。

来源于水稻以外其它物种的与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。

本发明还提供了分离的蛋白，其是SPL12蛋白的片段或在两端添加其它蛋白或标签等形成的。

本发明还涉及编码本发明的SPL12蛋白或其序列变异形式的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的多肽，但与SEQ ID NO:1所示的基因组序列或SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体(变体)，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码核酸经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体还可选择性地加入抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，如Bar、GUS。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。

植物改造

本发明通过大量的系统性研究、大规模的研究筛选，鉴定到了SPL12基因，此基因调控植物籽粒粒型(粒长、粒宽或籽粒的长宽比)以及产量性状。

基于本发明人的新发现，提供了一种SPL12蛋白或其调节分子的用途，用于：调节禾谷类植物的籽粒粒型或产量。

同时，本发明也提供了一种调控禾谷类植物的籽粒粒型或产量的方法，包括：在植物中调控SPL12蛋白的表达或活性；其中，所述的SPL12蛋白包括其同源物。

应理解，在得知了所述SPL12蛋白在禾谷类植物的籽粒粒型或产量调控中的作用后，可以根据实际所需，采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的SPL12蛋白的表达或活性，这些方法均被包含在本发明中。

可以利用SPL12蛋白的表达或活性的上调剂来上调SPL12蛋白的活性。所述的SPL12蛋白的表达或活性的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”。任何可提高SPL12蛋白的活性、提高SPL12蛋白基因或蛋白的稳定性、上调SPL12蛋白基因的表达、增加SPL12蛋白的有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调SPL12蛋白或其编码的蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

作为一种优选的实施方式，提供一种上调植物中SPL12蛋白的表达的方法，所述的方法包括：将SPL12蛋白或其编码的蛋白的表达构建物或载体转入植物中。

优选地，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的本发明的多肽的编码核酸转入植物器官或组织，获得转化入所述多肽的编码核酸的植物组织或器官；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源的本发明的多肽的编码核酸的植物组织或器官再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明的SPL12蛋白的编码核酸；

(s2)将植物组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码核酸转入并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入所述SPL12蛋白的编码核酸的植物组织或器官；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物组织或器官再生成植物。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述多肽的编码核酸的转基因植物。

作为一种优选的方式，所述上调植物中SPL12蛋白的表达的方法可包括：将SPL12蛋白编码基因中受到miR-156干扰的位点进行突变，其能减少SPL12基因发生剪切的概率，促进其表达。

本发明中，所述的SPL12蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低SPL12蛋白的活性、降低SPL12蛋白或其编码基因的稳定性、下调SPL12蛋白的表达、减少SPL12蛋白有效作用时间、抑制SPL12基因的转录和翻译的物质、或降低蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调SPL12蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰SPL12蛋白或其它信号通路基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑SPL12基因的基因编辑试剂，等等。

作为本发明的一种优选方式，提供一种下调植物中SPL12蛋白的方法，包括对SPL12蛋白进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使SPL12蛋白转变为其突变体，从而使其不再发挥作用。作为一种更为具体的实施例方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。本发明的实施例中提供了优选的基因编辑试剂。

作为其它可选的方式，所述下调植物中SPL12蛋白的表达的方法可包括：(1)将干扰SPL12基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

作为其它可选的方式，所述下调植物中SPL12蛋白的表达的方法可包括：利用miR-156或能表达该miR-156的构建体，在植物中表达或过表达该miR-156，其能促使SPL12基因发生剪切，下调其表达。

因此，OsSPL12可以应用于水稻粒型和产量的分子育种中，根据实际应用需求特异调控所述性状。

植物定向筛选及分子标记

基于本发明人的新发现，本发明提供了适用于鉴定籽粒粒型或产量性状的植物的分子标记，即SPL12基因。本发明还涉及针对所述SPL12基因设计的特异性分子标记，以及鉴定策略。

因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定具有特定农艺性状的植物的方法，包括：鉴定测试植物体内SPL12蛋白的表达或活性，若该测试植物中SPL12蛋白的表达或活性高于该类植物(对照植物)中SPL12蛋白的表达或活性的平均值，则其为(或预期其为)籽粒粒长增加、籽粒的长宽比增加或产量增加的植物；或，若该测试植物中SPL12蛋白的表达或活性低于该类植物(对照植物)中SPL12蛋白的表达或活性的平均值，则其为(或预期其为)籽粒粒宽相对窄、籽粒粒长相对短或产量相对低的植物。

根据本发明的新发现，本领域技术人员可以采用任何本领域公知的或正在发展的多种技术来进行核酸序列的分析，这些技术均可被包含在本发明中。所述的方法例如包括但不限于：测序法，PCR扩增法，探针法，杂交法，限制性酶切分析法，等位基因多态性分析法(如溶解曲线法)进行核酸序列的鉴定，等等。

本发明的鉴定方法，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的长度，就可以准确、快速地判断待测样品的表型，成本低廉，适合于大规模鉴定，而且所需的样品量很少。如果需要，本领域技术人员能够设计出鉴定所述分子标记的引物。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

在得知了SPL12基因的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控籽粒粒型或产量性状的物质或潜在物质。

本发明提供了一种筛选增加禾谷类植物籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达SPL12蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中SPL12蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高(显著提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高)，则表明该候选物质为增加禾谷类植物籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量的物质的物质。

以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、双分子荧光互补实验、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。

经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于SPL12蛋白或其编码基因，对禾谷类植物的籽粒性状改良或产量性状改良有调控作用的物质。

基于SNP的植物性状鉴定

本发明发现，SPL12基因能够特异调控禾谷类植物的粒型，而一个自然发生的SNP导致对粒宽调控出现截然相反的表型。

因此，本发明还公开了一种鉴定禾谷类植物籽粒粒型或鉴定水稻粳稻或籼稻种型的方法，包括：分析SPL12蛋白或其编码基因，其中所述SPL12的编码基因包含有SNP位点sf0629704374；若该位点的碱基为C，则其籽粒为粒宽增加的粒型，或该水稻为粳稻；若该位点的碱基为A，则其籽粒为粒宽降低的粒型，或该水稻为籼稻或粳稻。

或者，也可在蛋白水平上进行鉴定，包括基于SPL12蛋白序列即相应于SEQ ID NO:3中第356位：若该位点的氨基酸残基为P，则其籽粒为粒宽增加的粒型，或该水稻为粳稻；若该位点的氨基酸残基为T，则其籽粒为粒宽降低的粒型，或该水稻为籼稻或粳稻。

本发明中，在进行了针对SNP位点sf0629704374的鉴定后，进一步也可通过对该位点的调控(例如定向突变)实现粒宽的双向调节。

本发明在分子设计育种及利用基因工程技术进行农作物品种改良等方面具有良好的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、OsSPL12基因的分离和点突变

本发明人致力于水稻粒型调控基因的研究筛选，经过大量研究分析，定位到OsSPL12基因，其可以调控水稻粒型。OsSPL12基因的SNP位点的示意图如图1。

同时，本发明人发现，OsSPL12基因存在一个位点sf0629704374，其与籼粳稻的分化密切相关：在籼稻中，sf0629704374为A，相应地，其编码的OsSPL12蛋白的第356位氨基酸为苏氨酸Thr)；在粳稻中，sf0629704374为C，相应地，其编码的OsSPL12蛋白的第356位氨基酸为脯氨酸Pro，对RiceVarMap(http://ricevarmap2.ncpgr.cn/v1)数据的分析结果如图4所示。

根据图4，sf0629704374为A的水稻中80.9％为籼稻，反之sf0629704374为C的水稻中99.0％为粳稻。

表1中为OsSPL12基因组、CDS、以及SNP为不同碱基时的蛋白序列。

表1*

*表中，SEQ ID NO:1为中花11的OsSPL12天然基因组序列，SEQ ID NO:1为抗剪切版本的OsSPL12 CDS序列，其第1143位-1164位(对应于基因组序列第4572-4593位)由碱基gcgtgctctctctcttctgtca(SEQ ID NO:5)变为ccgggccctgagcttgctcagc(SEQ ID NO:6)。

本发明人以中花11作为粳稻的OsSPL12(sf0629704374为C)的序列来源命名为SPL12^Ja，通过点突变的方式获得籼稻版本的点突变OsSPL12(sf0629704374为A)命名为SPL12^In。

以野生型中花11的基因组为模板扩增OsSPL12，通过应用点突变的引物来实现突变，点突变引物序列如下：

SPL12-INDICA-mutant-L：ccattcaagggaaacaccacgaagg(SEQ ID NO:7)；

SPL12-INDICA-mutant-R：cttggttgaggaccttcgtggtgtttc(SEQ ID NO:8)。

分别应用SPL12的左右引物进行Overlap-PCR，获得SPL12^In的序列，进行后续实验；所述左右引物序列如下：

SPL12-CDS-L：tcccccgggATGGCTTCTTTTGGGATGAACTG(SEQ ID NO:9)；

SPL12-CDS-R：cgcggtaccTCAGTGCAGATGGCCATAGCC(SEQ ID NO:10)。

实施例2、OsSPL12基因的自身启动子驱动过表达的转基因株系的构建与表型分析

通过构建OsSPL12过量表达载体OsSPL12-over，转入水稻中花11材料，获得OsSPL12过量表达的水稻材料。

载体构建方法如下：使用载体pCAMBIA1301，通过引物SPL12-CDS-L与SPL12-CDS-R扩增OsSPL12的cDNA基因。以野生型中花11为模板，通过SPL12-Pro-L与SPL12-Pro-R扩增OsSPL12启动子序列，CDS引物含有SmaI和KpnI的酶切位点，启动子引物含有HindIII和SalI。抗剪切版本通过SPL12-mProtein-L与SPL12-mProtein-R，用Overlap-PCR方法获得。所述抗剪切是调节OsSPL12基因的1143位-1164位由碱基gcgtgctctctctcttctgtca(SEQ IDNO:5)变为ccgggccctgagcttgctcagc(SEQ ID NO:6)，从而排除miR-156对其的干扰，避免OsSPL12基因被剪切，该种碱基的突变并不导致蛋白序列的变化。

连接策略为先将OsSPL12自身启动子构建入pCAMBIA1301载体中，再将对应的CDS构建入含有启动子的pCAMBIA1301载体中。每次连接均为用引物上对应的酶切位点进行酶切并进行去磷处理，将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收，连入到经同样酶切处理后的载体中。采用电击转化方法将载体质粒导入根癌农杆菌EHA105，并采用农杆菌介导法(参见Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T.Plant J 1994；6:271-282)，对中花11(获自上海市农业科学院)进行转化。

不同籼粳稻的转基因材料均采用上述策略，只是籼稻OsSPL12的CDS通过实施例1的序列进行构建。

从获得的T0代转基因植株中提取RNA并进行反转录，用OsSPL12基因特异的引物OsSPL12-realtime-F和OsSPL12-realtime-R对该基因的表达进行检测。

上述过程中，涉及的引物序列如表2。

表2

本发明人收获一系列的转基因植株，其中代表性的转基因株系包括：

3个独立的SPL12^In基因表达上调的转基因株系：

pSPL12(I)::RmSPL12(I)-1，

pSPL12(I)::RmSPL12(I)-2，

pSPL12(I)::RmSPL12(I)-3；

3个独立的SPL12^Ja基因表达上调的转基因株系：

pSPL12::RmSPL12-1，

pSPL12::RmSPL12-2，

pSPL12::RmSPL12-3。

进一步地，本发明人对上述T0代植株收种后进行扩繁，并将T2代的种子分别单株收种，每个单株的种子取30粒，在含潮霉素素(30mg/L)的水中进行萌发，全萌发的单株被鉴定为纯系。所得的3个转基因株系的纯系种子，用于后续的表型分析。

如图2A和C所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^Ja基因表达上调的转基因株系的粒长极其显著(**P<0.01)地增加。

如图2B和D所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^Ja基因表达上调的转基因株系的平均粒宽增加。

如图2E所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^Ja基因表达上调的转基因株系的长宽比显著(*P<0.05)或极其显著(**P<0.01)地增加。

如图2F所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^Ja基因表达上调的转基因株系的粒厚显著(*P<0.05)或极其显著(**P<0.01)地增加。

如图2G所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^Ja基因表达上调的转基因株系的百粒重极其显著(**P<0.01)地增加。

如图3A和C所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^In基因表达上调的转基因株系的粒长显著(*P<0.05)或极其显著(**P<0.01)地增加。

如图3B和D所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^In基因表达上调的转基因株系的粒宽显著(*P<0.05)或极其显著(**P<0.01)地降低。

如图3E所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^In基因表达上调的转基因株系的长宽比极其显著(**P<0.01)地增加。

如图3F所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^In基因表达上调的转基因株系的粒厚没有统计学差异或显著地降低(*P<0.05)。

如图3G所示，与野生型中花11(ZH11)相比，SPL12^In基因表达上调的转基因株系的百粒重极其显著(**P<0.01)地增加。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 调控或鉴定植物籽粒粒型或产量性状的基因及其应用

<130> 20A286

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5158

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L)

<400> 1

ccaatgatca aatcaagcaa agcaccactg ctgctgcaaa gaacaccaga tagatcaaac 60

tctctctctc tctggtgttg ctgttagttg gtagtttggt actacttggt actctgggaa 120

gaagaaagag attattatag cagaaaagca gcaccatggc atagctccag gcagcaaaac 180

caggtctgaa attatcccta tcttttcttt gcaagaacca gaatcttttt atggcatggc 240

attgtttgtg gaggagtgat tctccacatc attcaatcat ctttaggcag ggggtgaggg 300

gtgggctaca atgtgatttc caccacaaaa aggagttgtt cttctttctt agggttgctg 360

ctgctgctgc ttttgaggag tggagtagtt gaggccatag tagtagtaga agtagaagta 420

aactggtata gtcactactc actacactac cagttggtgt ttgttctgag cattattgga 480

gtgtcaggga agggcatgtg cttttgttgg ttgctgtagg aggaggcagc catccactgg 540

gcctcactct cctcttgttg ctgcctcctc ctcttgttac tgttcagtct caggctctca 600

ggctcacagg tggggttttg ggagatacta gttaggaggg aaaggttgcc atcttgtgtg 660

tgttggatct ttgtgagtca tgtcctcttt atcttggtgc ttttgctttt tcttgtgttt 720

tttcttttct ttctcctatc ttcttttgcc acaaaactta tggctattgt tttcatccag 780

gtagaataca acggggataa cgattctctc tcagctaaag gaggtgagat tcttggtttc 840

acatcaagta ttattgttct ttcttttact tccttcaaaa tagtttcttt gctttttatt 900

tcatatatgg tttggtttat ttatgctccc caacaagcaa ctggttcatg tgcggtaaca 960

aggagcaaat aatgcagctc tgattgactt ggggtagttg ttgtggtgat agattggaaa 1020

gggtttaaat agcgggtggt tgtggtgatg aatgggggcc agccttgatg gggttgatgc 1080

tgtcgtcttt taggtcgggg aaacaagtgg gataggatct ctctcaagtc gaggtgagtg 1140

agaactcagc caagaacaac aatggagtct ctgttgcttt agttctgcca gccaattggt 1200

ttcaactttc aacgctgcta cttgttattc atcacctcct cggatcggtt tgatttatgc 1260

tcaaggttgt gctatgcatg gtcatgctga ttgagggcaa gatttgcagg gagaggaagg 1320

atccactgtg tttcttttct gggagaaagg aaagttgagg taattgatcg ttttcgcctt 1380

tcttctcttg ctatgatccc cacaataaag cgcgtataat tcattttgga tggtatgttg 1440

tacttgtctt tttatctgaa agacaaaatg attttggtac ccgagatatg tttattgcct 1500

ttctcatcca agttctgcaa tttgttgtga cgtgtgttct ttctgttcct tcttgtttct 1560

tgaaatccta tcagatttgc aatatataca agtgtgagca gcagcagttg agatccttaa 1620

ttcagccatg gcttcttttg ggatgaactg gaatcagaag agccctgtgt tttgggactg 1680

ggaaaatcca gcgcctttcg gtccgaatac aatggaaaat cccaagagca tacctcaccc 1740

tgaaccaaga ggtgtagttg tcgcggccgc aaatcatgga tccaccaatt catccggtgg 1800

cacgttcact tctagctcgg agctagccaa tggttcatcg aagagctcct tgtcagcgtc 1860

gttcgattcc tcatccaagc tggggaacag cttagagttc aggtttgctt ctgtcaaagg 1920

gcatggcaag aacatgtgca aggatggcga ggccggtaga gttgaagact cgggcacttc 1980

tccagctgtg gcagttagcc atggtgagcc ggtaatagga ctcaagttag ggaagagaac 2040

ttactttgaa aatgtttgtg gagggcagaa tgtcaagagc tcctctgcag cttcaggtgt 2100

gacttgtcca tctactgtgg tcaagaagat gaaggtgtct cagcagagca cacaaagctc 2160

atactgccaa gttgaaggct gcaaagtcga tctgtcctcc gcaagagaat accatcgcaa 2220

gcacaaagtt tgtgaagctc attctaaggc accaaaggtt attgtttctg gtctggagcg 2280

ccgtttttgc caacagtgta gtcggtgaga gcataatctt atttcacttt gcatgctttc 2340

aagacttcct tttttatatg cactaccctc tttaaatcaa tagacacaac aacaatgaag 2400

aaaattgtct ctatctgtat tgcataaagc atataccagt ataaataaag tcaaagaagt 2460

agcactagtt tgcttggatt aaagtacaac gcaaggttcg aggttattga tctttactag 2520

tttgctgtct tatgtactct attgttttgt aggtttcatg gtttagctga atttgaccag 2580

aaaaagaaaa gttgccgcag gcgtctatct gatcataatg cacgaagaag gaaaccgcaa 2640

caagaggcaa tttcatttgg ttcatcaagg ctcgccacga tgttttacgg tagtactgac 2700

cccttagatg catcacaatg ctagatgcct tgttctgttt tgatgactga aagctattcc 2760

tttaacccaa tcaatactgc tgaaatagta ggatgatacc gtaagcattt taacatgtaa 2820

catatccagt tttctgcata cgcacgactg gtgggtgtta cctggtggca cacttctttt 2880

tagaagggag cttaacccat cctcttgagt cttgacagtt actattatat tgttatataa 2940

taatgcatag taatcatata tggtagcttg tgtattttca tgatgtagtt ttccacttga 3000

cgcgttttta ccaagtccta cacaaatctt tcatggtgac agtgtttgcg attttgcatt 3060

gcagatgcaa ggcagcagac agatatttac tttggccaat ctccttttgg ccaagtgaga 3120

agcaatgcaa tttcttcatg tgacaacctg ggaggcttca aatttacaga agcaaaactc 3180

ccctggatga agccaatgaa aactataggc cttgaggatc tgaatttctc taccctgcag 3240

atgccaggca atgttgtgtc gcatacggtg catcatcatg attttgatgg gctcatacca 3300

ttcaagggaa acaccccgaa ggtcctcaac caaggtacat taacatctct caattcatca 3360

ctgaacttta aagaaaagac atgcagctgt tgcagcatct tcaattttaa gtttttaacc 3420

atgtgttttt atttaatgat ctaaatggga ctacctattt tagcaattca atttcttatc 3480

agtaaatagg tccgactgat ttgacctttt gtttgattgt tatctgtact gttcacctct 3540

ctgctattcg acaacgccga gacagcattt tattctccat aattcctttt catacggcta 3600

caatcttctg aaaagtcttt gttgctaaac agtcagcatt cctgacttgg agtttggatt 3660

aaacaagcta cttagtcata agaacacatc attttgctcc ctttttttca gtaactactg 3720

attactcatt ttatccattt gcatcagctt gctttatgga caagctagaa ccacaaattg 3780

tttctcaaaa aaacaaaaac aaaaacagag aggctagatc caccaattat ctgttacaag 3840

ctttttggac ttcctgcctt ggtatgttga tctttcaatc tgaactgctc cattttttct 3900

ctgggtggag cctgggagcc tttcaccatc ccaaaaagca agaaatgtgt ttcacgcgag 3960

agatcgacaa gaaacgacta ggtcccattt actaggttta tggccccatc actgcccctg 4020

ataatgacat tcaccagaac ttttagctgg tagtccagta cccacatctg tgcctggtac 4080

taacctggga ccaacaaata cttattggat atgccagctt agtgttgcaa cttgcaagga 4140

gtgtgagtca tctcaataga tacaggcctt caattcagac cccccaaaaa agtattcctt 4200

ttctttctgt tgagctgtct aaatcatctc cagttgcagg atcatagaat acaccaggca 4260

caagcaacta aagatgatct acgattttta gacaatagat cttcattgac ccggcttttg 4320

cgagaaagac agaaacaaac acgagtacag agttcagaac agaactgaag atgataaatt 4380

cagagccccc ccaaaaagtg tcccttttaa tctgttgggc agtctaattc taaattattc 4440

tctccaaatt gcaggatcat atatatgaat acctgatatt ctgatgatgc atatgatttg 4500

tgatgatttt caggtgtgga tccagcctgt gccgtcgtgt cctccaactc gaatggagcc 4560

ccggatcttc ggcgtgctct ctctcttctg tcaagcgatt cctggggccc ggccgacgtt 4620

caggccggct cccaggtgca tcccggtgga gtgatgccgc ccctcgccgt tgccgccgcc 4680

accgtcaccg ccccgacgaa ccctgtcagt gtgatgcatg ctctgcaccc gtccaccgga 4740

ggaggaggat tctggcaaga cggcgacgac ccgcctccgc tcgatcatgc ctcgcaggct 4800

caggcgttca tgcatcctgg caatggcagc agctccggct atggccatct gcactgattc 4860

tgctgcatct atttggaacg ggttgatgac tggttactcc gttcatgatc ttaccctgtc 4920

agtgatggac tctgaataat ttgggggcga attgtcctgc aaccccagga tttattattt 4980

ctatttttga aaccaaacca ccaggatatt tgccattgga tgagaagtgt tcatgatcat 5040

gaaatgatct gttttgttcc acagaatctg acatatctac tactcgtctt gggaatgagc 5100

tgagatcgat tcgtgtgttg ttcattcagg aaactattct aaattctttt ggggataa 5158

<210> 2

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1428)

<223> 抗剪切的SPL12 CDS序列

<400> 2

atggcttctt ttgggatgaa ctggaatcag aagagccctg tgttttggga ctgggaaaat 60

ccagcgcctt tcggtccgaa tacaatggaa aatcccaaga gcatacctca ccctgaacca 120

agaggtgtag ttgtcgcggc cgcaaatcat ggatccacca attcatccgg tggcacgttc 180

acttctagct cggagctagc caatggttca tcgaagagct ccttgtcagc gtcgttcgat 240

tcctcatcca agctggggaa cagcttagag ttcaggtttg cttctgtcaa agggcatggc 300

aagaacatgt gcaaggatgg cgaggccggt agagttgaag actcgggcac ttctccagct 360

gtggcagtta gccatggtga gccggtaata ggactcaagt tagggaagag aacttacttt 420

gaaaatgttt gtggagggca gaatgtcaag agctcctctg cagcttcagg tgtgacttgt 480

ccatctactg tggtcaagaa gatgaaggtg tctcagcaga gcacacaaag ctcatactgc 540

caagttgaag gctgcaaagt cgatctgtcc tccgcaagag aataccatcg caagcacaaa 600

gtttgtgaag ctcattctaa ggcaccaaag gttattgttt ctggtctgga gcgccgtttt 660

tgccaacagt gtagtcggtt tcatggttta gctgaatttg accagaaaaa gaaaagttgc 720

cgcaggcgtc tatctgatca taatgcacga agaaggaaac cgcaacaaga ggcaatttca 780

tttggttcat caaggctcgc cacgatgttt tacgatgcaa ggcagcagac agatatttac 840

tttggccaat ctccttttgg ccaagtgaga agcaatgcaa tttcttcatg tgacaacctg 900

ggaggcttca aatttacaga agcaaaactc ccctggatga agccaatgaa aactataggc 960

cttgaggatc tgaatttctc taccctgcag atgccaggca atgttgtgtc gcatacggtg 1020

catcatcatg attttgatgg gctcatacca ttcaagggaa acaccccgaa ggtcctcaac 1080

caaggtgtgg atccagcctg tgccgtcgtg tcctccaact cgaatggagc cccggatctt 1140

cgccgggccc tgagcttgct cagcagcgat tcctggggcc cggccgacgt tcaggccggc 1200

tcccaggtgc atcccggtgg agtgatgccg cccctcgccg ttgccgccgc caccgtcacc 1260

gccccgacga accctgtcag tgtgatgcat gctctgcacc cgtccaccgg aggaggagga 1320

ttctggcaag acggcgacga cccgcctccg ctcgatcatg cctcgcaggc tcaggcgttc 1380

atgcatcctg gcaatggcag cagctccggc tatggccatc tgcactga 1428

<210> 3

<211> 475

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L)

<400> 3

Met Ala Ser Phe Gly Met Asn Trp Asn Gln Lys Ser Pro Val Phe Trp

1 5 10 15

Asp Trp Glu Asn Pro Ala Pro Phe Gly Pro Asn Thr Met Glu Asn Pro

20 25 30

Lys Ser Ile Pro His Pro Glu Pro Arg Gly Val Val Val Ala Ala Ala

35 40 45

Asn His Gly Ser Thr Asn Ser Ser Gly Gly Thr Phe Thr Ser Ser Ser

50 55 60

Glu Leu Ala Asn Gly Ser Ser Lys Ser Ser Leu Ser Ala Ser Phe Asp

65 70 75 80

Ser Ser Ser Lys Leu Gly Asn Ser Leu Glu Phe Arg Phe Ala Ser Val

85 90 95

Lys Gly His Gly Lys Asn Met Cys Lys Asp Gly Glu Ala Gly Arg Val

100 105 110

Glu Asp Ser Gly Thr Ser Pro Ala Val Ala Val Ser His Gly Glu Pro

115 120 125

Val Ile Gly Leu Lys Leu Gly Lys Arg Thr Tyr Phe Glu Asn Val Cys

130 135 140

Gly Gly Gln Asn Val Lys Ser Ser Ser Ala Ala Ser Gly Val Thr Cys

145 150 155 160

Pro Ser Thr Val Val Lys Lys Met Lys Val Ser Gln Gln Ser Thr Gln

165 170 175

Ser Ser Tyr Cys Gln Val Glu Gly Cys Lys Val Asp Leu Ser Ser Ala

180 185 190

Arg Glu Tyr His Arg Lys His Lys Val Cys Glu Ala His Ser Lys Ala

195 200 205

Pro Lys Val Ile Val Ser Gly Leu Glu Arg Arg Phe Cys Gln Gln Cys

210 215 220

Ser Arg Phe His Gly Leu Ala Glu Phe Asp Gln Lys Lys Lys Ser Cys

225 230 235 240

Arg Arg Arg Leu Ser Asp His Asn Ala Arg Arg Arg Lys Pro Gln Gln

245 250 255

Glu Ala Ile Ser Phe Gly Ser Ser Arg Leu Ala Thr Met Phe Tyr Asp

260 265 270

Ala Arg Gln Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Gly Gln Ser Pro Phe Gly Gln

275 280 285

Val Arg Ser Asn Ala Ile Ser Ser Cys Asp Asn Leu Gly Gly Phe Lys

290 295 300

Phe Thr Glu Ala Lys Leu Pro Trp Met Lys Pro Met Lys Thr Ile Gly

305 310 315 320

Leu Glu Asp Leu Asn Phe Ser Thr Leu Gln Met Pro Gly Asn Val Val

325 330 335

Ser His Thr Val His His His Asp Phe Asp Gly Leu Ile Pro Phe Lys

340 345 350

Gly Asn Thr Pro Lys Val Leu Asn Gln Gly Val Asp Pro Ala Cys Ala

355 360 365

Val Val Ser Ser Asn Ser Asn Gly Ala Pro Asp Leu Arg Arg Ala Leu

370 375 380

Ser Leu Leu Ser Ser Asp Ser Trp Gly Pro Ala Asp Val Gln Ala Gly

385 390 395 400

Ser Gln Val His Pro Gly Gly Val Met Pro Pro Leu Ala Val Ala Ala

405 410 415

Ala Thr Val Thr Ala Pro Thr Asn Pro Val Ser Val Met His Ala Leu

420 425 430

His Pro Ser Thr Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gln Asp Gly Asp Asp Pro

435 440 445

Pro Pro Leu Asp His Ala Ser Gln Ala Gln Ala Phe Met His Pro Gly

450 455 460

Asn Gly Ser Ser Ser Gly Tyr Gly His Leu His

465 470 475

<210> 4

<211> 475

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L)

<400> 4

Met Ala Ser Phe Gly Met Asn Trp Asn Gln Lys Ser Pro Val Phe Trp

1 5 10 15

Asp Trp Glu Asn Pro Ala Pro Phe Gly Pro Asn Thr Met Glu Asn Pro

20 25 30

Lys Ser Ile Pro His Pro Glu Pro Arg Gly Val Val Val Ala Ala Ala

35 40 45

Asn His Gly Ser Thr Asn Ser Ser Gly Gly Thr Phe Thr Ser Ser Ser

50 55 60

Glu Leu Ala Asn Gly Ser Ser Lys Ser Ser Leu Ser Ala Ser Phe Asp

65 70 75 80

Ser Ser Ser Lys Leu Gly Asn Ser Leu Glu Phe Arg Phe Ala Ser Val

85 90 95

Lys Gly His Gly Lys Asn Met Cys Lys Asp Gly Glu Ala Gly Arg Val

100 105 110

Glu Asp Ser Gly Thr Ser Pro Ala Val Ala Val Ser His Gly Glu Pro

115 120 125

Val Ile Gly Leu Lys Leu Gly Lys Arg Thr Tyr Phe Glu Asn Val Cys

130 135 140

Gly Gly Gln Asn Val Lys Ser Ser Ser Ala Ala Ser Gly Val Thr Cys

145 150 155 160

Pro Ser Thr Val Val Lys Lys Met Lys Val Ser Gln Gln Ser Thr Gln

165 170 175

Ser Ser Tyr Cys Gln Val Glu Gly Cys Lys Val Asp Leu Ser Ser Ala

180 185 190

Arg Glu Tyr His Arg Lys His Lys Val Cys Glu Ala His Ser Lys Ala

195 200 205

Pro Lys Val Ile Val Ser Gly Leu Glu Arg Arg Phe Cys Gln Gln Cys

210 215 220

Ser Arg Phe His Gly Leu Ala Glu Phe Asp Gln Lys Lys Lys Ser Cys

225 230 235 240

Arg Arg Arg Leu Ser Asp His Asn Ala Arg Arg Arg Lys Pro Gln Gln

245 250 255

Glu Ala Ile Ser Phe Gly Ser Ser Arg Leu Ala Thr Met Phe Tyr Asp

260 265 270

Ala Arg Gln Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Gly Gln Ser Pro Phe Gly Gln

275 280 285

Val Arg Ser Asn Ala Ile Ser Ser Cys Asp Asn Leu Gly Gly Phe Lys

290 295 300

Phe Thr Glu Ala Lys Leu Pro Trp Met Lys Pro Met Lys Thr Ile Gly

305 310 315 320

Leu Glu Asp Leu Asn Phe Ser Thr Leu Gln Met Pro Gly Asn Val Val

325 330 335

Ser His Thr Val His His His Asp Phe Asp Gly Leu Ile Pro Phe Lys

340 345 350

Gly Asn Thr Thr Lys Val Leu Asn Gln Gly Val Asp Pro Ala Cys Ala

355 360 365

Val Val Ser Ser Asn Ser Asn Gly Ala Pro Asp Leu Arg Arg Ala Leu

370 375 380

Ser Leu Leu Ser Ser Asp Ser Trp Gly Pro Ala Asp Val Gln Ala Gly

385 390 395 400

Ser Gln Val His Pro Gly Gly Val Met Pro Pro Leu Ala Val Ala Ala

405 410 415

Ala Thr Val Thr Ala Pro Thr Asn Pro Val Ser Val Met His Ala Leu

420 425 430

His Pro Ser Thr Gly Gly Gly Gly Phe Trp Gln Asp Gly Asp Asp Pro

435 440 445

Pro Pro Leu Asp His Ala Ser Gln Ala Gln Ala Phe Met His Pro Gly

450 455 460

Asn Gly Ser Ser Ser Gly Tyr Gly His Leu His

465 470 475

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 5

gcgtgctctc tctcttctgt ca 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 6

ccgggccctg agcttgctca gc 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 7

ccattcaagg gaaacaccac gaagg 25

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 8

cttggttgag gaccttcgtg gtgtttc 27

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 9

tcccccggga tggcttcttt tgggatgaac tg 32

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 10

cgcggtacct cagtgcagat ggccatagcc 30

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 11

tcccccggga tggcttcttt tgggatgaac tg 32

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 12

cgcggtacct cagtgcagat ggccatagcc 30

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 13

caccaagctt tctcatgggt tatttgcttc atg 33

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 14

cgcgtcgacg gctgaattaa ggatctcaac tg 32

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 15

ccgggccctg agcttgctca gcagcgattc ctggggc 37

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 16

gctgagcaag ctcagggccc ggcgaagatc cggggct 37

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 17

taccatcgca agcacaaagt tt 22

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 多核苷酸(polynucleotide )

<400> 18

ggcgctccag accagaaa 18

Claims

1.一种调控禾谷类植物的籽粒粒型或产量性状的方法，包括：在植物中调控SPL12蛋白的表达或活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调控为增加籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量；所述方法包括：在植物中上调SPL12蛋白的表达或活性；较佳地，所述上调包括在植物中过表达SPL12蛋白，从而提高SPL12蛋白的表达或活性；较佳地，所述上调包括抑制SPL12蛋白编码基因被剪切；更佳地，所述抑制SPL12蛋白编码基因被剪切是将SPL12蛋白编码基因中受到miR-156干扰的位点进行突变(更佳地，在SPL12基因CDS序列第1143-1164位由碱基SEQ ID NO:5变为SEQ ID NO:6；或

所述调控为降低籽粒的粒长、降低籽粒的长宽比；所述方法包括：在植物中下调SPL12蛋白的表达或活性；较佳地，所述下调包括：在植物中敲除或沉默SPL12蛋白的编码基因，或抑制SPL12蛋白的活性；较佳地所述下调包括：以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除SPL12蛋白的编码基因；以同源重组的方法敲除SPL12蛋白的编码基因；以特异性干扰SPL12蛋白编码基因表达的干扰分子来沉默；或将SPL12蛋白进行功能丧失性突变。

3.一种SPL12蛋白或其调节剂的用途，用于调节禾谷类植物的籽粒粒型或产量性状。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述调节剂为上调剂，所述SPL12蛋白或其上调剂用于增加籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量；较佳地，所述的上调剂包括：过表达所述SPL12蛋白的表达盒或表达构建物，提高所述SPL12蛋白翻译效率的表达盒或表达构建物，或抑制SPL12蛋白编码基因被剪切的试剂；较佳地，所述抑制SPL12蛋白编码基因被剪切的试剂是定点突变试剂，其将SPL12蛋白编码基因中受到miR-156干扰的位点进行突变(更佳地，在SPL12基因CDS序列第1143-1164位由碱基SEQ ID NO:5变为SEQ ID NO:6；或

所述的调节剂为下调剂，其用于降低籽粒的粒长、降低籽粒的长宽比；较佳地，所述下调剂包括：敲除或沉默SPL12蛋白的编码基因的试剂，抑制SPL12蛋白活性的试剂；较佳地，所述下调剂包括：针对所述SPL12蛋白的编码基因的基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将SPL12蛋白进行功能丧失性突变；或，特异性干扰SPL12蛋白的编码基因表达的干扰分子。

5.如权利要求1～4任一所述，其特征在于，所述禾谷类作物为表达SPL12蛋白或其同源物的植物；较佳地，所述的禾谷类作物包括禾本科植物；较佳地，所述禾谷类作物包括选自：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱、二穗短柄草。

6.如权利要求1～4任一所述，其特征在于，所述的SPL12蛋白的氨基酸序列选自下组：(i)具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的蛋白；(ii)将如(i)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(i)蛋白功能的、由(i)衍生的蛋白；(iii)氨基酸序列与(i)所示氨基酸序列的同源性≥85％，具有所述调控性状功能的蛋白；(iv)(i)所示氨基酸序列的蛋白的活性片段；或(v)在(i)所示氨基酸序列的蛋白的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的蛋白。

7.SPL12蛋白或其编码基因的用途，用作分子标记物：

鉴定禾谷类植物籽粒粒型；或

鉴定水稻粳稻或籼稻种型；

所述SPL12的编码基因包含有SNP位点sf0629704374。

8.一种鉴定禾谷类植物籽粒粒型或鉴定水稻粳稻或籼稻种型的方法，包括：分析SPL12蛋白或其编码基因，其中所述SPL12的编码基因包含有SNP位点sf0629704374。

9.如权利要求7或8所述，其特征在于，基于SPL12蛋白编码基因的SNP位点sf0629704374：若该位点的碱基为C，则其籽粒为粒宽增加的粒型，或该水稻为粳稻；若该位点的碱基为A，则其籽粒为粒宽降低的粒型，或该水稻为籼稻或粳稻；或

基于SPL12蛋白序列即相应于SEQ ID NO:3中第356位：若该位点的氨基酸残基为P，则其籽粒为粒宽增加的粒型，或该水稻为粳稻；若该位点的氨基酸残基为T，则其籽粒为粒宽降低的粒型，或该水稻为籼稻或粳稻。

10.一种筛选增加禾谷类植物籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量的物质的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达SPL12蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中SPL12蛋白的表达或活性，若其表达或活性提高，则表明该候选物质为增加禾谷类植物籽粒的粒长、增加籽粒的长宽比或增加产量的物质的物质。