CN1318427C - 氢化木霉醇类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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本发明涉及氢化木霉醇类化合物及其制备方法和用途。本发明用从海洋样品中分离得到的土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)生产出结构新颖的上述类型的化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。

Description

氢化木霉醇类化合物及其制备方法和用途
技术领域：
本发明涉及用土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)(保藏编号是：CCTCC M 204077)制备氢化木霉醇类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
与氢化木霉醇类化合物有关的化合物已有一些文献报道，主要用做自由基清除剂，如Masanori Kontani，Youji Sakagami，and Shingo Marumo.Abe N，Murata t，Yamamoto K，et al.Bisorbibetanone，a novel oxidized sorbicillin dimmer，with 1，1-diphenylhydrazyl radicalscavenging activity from a fungus.Tetra lett，1999，40：5203～5206；Romano Andrade，William AAyer and Trifonov，L S.The metabolites of Trichoderma longibrachiatum.Part II.The structuresof trichodermolide and sorbiquinol.Can JChem，1996，74：371～379；Romano Andrade，WilliamA Ayer and Paul P Mebe.The metabolites of Trichoderma longibrachiatum.Part I.Isolation ofthe metabolites and the structure of trichodierol.Can J Chem，1992，70：2526～2535；RomanoAndrade，William A Ayer and Trifonov，L S.The metabolites of Trichoderma longibrachiatum.III.Two new tetronic acids：5-hydroxyvertinolide.Aust J Chem，1997，50：255～257；Abe N，Yamamoto K and Hirota A.The biosynthesis of bisorbicillinoides：evidence for a bio syntheticroute from bisorbicillinol to bisorbibutenolide and bisorbicillinolide.Chem Commun，2001，23～24；Abe N and Hirota A.Chemical studies of the radical scavenging mechanism ofbisorbicillinol using the 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical.Chem Commun，2002，(3)：662～663；Abe N，Arakawa T and Hirota A.The biosynthesis of bisvertinolone：evidence foroxosorbicillinol as a direct precursor.Chem Commun，2002，(3)：204～205等曾分别报道了与氢化木霉醇类化合物相关的化合物，但尚未见该类化合物具有细胞增殖抑制抗肿瘤活性的报道。本发明人研究发现土生青霉菌LM2-02（Penicillium terrestre)(保藏编号是：CCTCC M204077)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞周期抑制活性，遂对其活性成分进行了研究，结果发现了两个新的氢化木霉醇类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见对该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容：
本发明旨在提供一种结构独特的具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的新化合物。
本发明的目的还在于提供一类新化合物的制备方法及其新化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
本发明首次从土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)发酵物中发现了结构新颖氢化木霉醇类化合物，  如式I所示：
其结构特征是：式I为骨架独特的化合物，可以看成是两个六元环在1，4位稠合而成，并在2，3位由两个半缩醛再次连接，R1和R2为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R3和R4一个为1，3-戊二烯基，另一个为3-戊烯基，或同为3-戊烯基。
并且本发明的式I化合物优选R1和R2为羟基，R3为1，3-戊二烯基，R4为3-戊烯基；或者R4和R5同为3-戊烯基。
上述发明中最优选的化合物是由海洋来源的土生青霉菌LM2-02(Penicilliumterrestre)的液体发酵物经硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱。氯仿-甲醇30∶1洗脱物，再经硅胶柱层析，进一步经HPLC，以甲醇-水80∶20洗脱得式I化合物。
本发明采用MTT法测试了式I化合物对P388和A-549细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，式I化合物对这两种肿瘤细胞均有增殖抑制作用。
因此本发明的式I化合物可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。
式I化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。
式I化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式I化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。
本发明的式I化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化而得到；也可由上述优选化合物经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。
需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为生产菌用于制备式I化合物。
具体实施方式：
在如下的实施例中所指的化合物1-2的化学结构分别是(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)：
化合物1(R3为1，3-戊二烯基，R4为3-戊烯基)
化合物2(R3和R4均为3-戊烯基)
实施例1化合物1-2的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取土生青霉菌LM2-02(Penicilliumterrestre)(保藏编号为：CCTCC M 204077)适量，接种到PDA斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)适量，接种到装有120mL培养液[培养基组成(克/升)：麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH2PO40.5，MgSO40.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL锥型瓶中，在28℃、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获得土生青霉菌LM2-02(Penicillium terrestre)的种子培养液。将该种子培养液按10％接种量分别接种于装有150毫升生产培养液[培养基组成(克/升)：麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH2PO40.5，MgSO40.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL三角烧瓶中，装载于28℃、120转/分钟摇床上，进行为期7天的生产发酵，获得菌丝体和发酵液。
2浸膏的获得
用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓缩至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。发酵液减压浓缩为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共58.0克。
3化合物的分离精制
浸膏(58.0克)用氯仿-甲醇(9∶1)混合溶剂溶解后，加70克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为30个流份。Fr-26(6克，氯仿-甲醇30∶1洗脱物)，经多次硅胶柱层析(氯仿-甲醇45∶1)，再经制备HPLC，以甲醇-水80∶20洗脱得化合物1(36mg)和2(32mg)。
化合物1，黄色粉末，[α]D 20+60.0°(c0.17，CH3OH)，分子式C28H34O8，HRESI-MSm/z：521.2122[M+Na]+，计算值：521.2151。UVλmaxnm(lgε)in MeOH：241(3.87)，308(4.18)，360(4.22).IRνmaxcm-1(KBr)：3441，2984，2940，1612，1261，1127，992.1H及13C NMR数据见表1。
                                表1化合物1的1H和13℃NMR数据(600MHz，in CD3COCD3)
position  δH(ppm，J in Hz) δC  HMBC(H→C) H-H COSY(b3)
1  3.03(1H，s) 58.6d  2，3，5，6，9，10，11，1′，2-CH3，10-CH3
2 79.6s
3 105.1s
4 58.9s
5 193.1s
6 104.7s
2-CH3  1.36(3H，s) 20.1q  1，2，3
4-CH3  1.39(3H，s) 20.1q  3，4，5，7
1′ 192.7s
2′  2.40(1H，dt，15.1 2，6.90)2.56(1H，dt，15.12，7.80) 35.2t  1′，3′，4′，6 3′
3′  2.25(2H，m) 29.0t  1′，2′，4′，5′ 2′，4′
4′  5.46(1H，m) 130.5d  3′，5′，6′ 3′，5′，6′
5′  5.49(1H，m) 126.5d  3′，4′，6′ 4′，6′
6′  1.61(3H，brd，4.38) 18.0q  4′，5′ 4′，5′
7  3.14(1H，s) 58.3d  3，4，5，8，9，11，12，1″，4-CH3，8-CH3
8 79.5s
9 105.0s
10 60.4s
11 201.9s
12 104.5s
8-CH3  1.34(3H，s) 21.9q  7，8，9
10-CH3  1.41(3H，s) 19.6q  1，9，10，11
1″ 174.5s
2″  6.46(1H，d，14.70) 120.1d  1″，3″，4″，12 3″
3″  7.26(1H，dd，15.12，10.98) 143.2d  1″2″，4″，5″ 2″，4″
4″  6.40(1H，m) 131.9d  2″，3″，5″，6″ 3″，5″，6″
5″  6.23(1H，dq，15.12，6.90) 140.1d  3″，4″，6″ 4″，6″
6″  1.85(3H，dd，6.90，1.35) 18.8q  4″，5″ 4″，5″
OH  16.60(s)
OH  16.80(s)
a)本表信号归属基于DEPT、1H-1H COSY、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。b)此栏中的数字和代号分别代表在1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。
化合物2，黄色粉末，[α]D 20+190.3°(c0.22，CH3OH)，分子式C28H36O8，HRESI-MSm/z：523.2292[M+Na]+，计算值：523.2308。UVλmax nm(lgε)in MeOH：297(4.27).IRνmax cm-1(KBr)：3428，2984，2940，1595，1451，1378，1261，1127，1011，965，874.1H及13C NMR数据见表2。
             表2化合物2的1H和13C                  MR数据(600 MHz，in CD3COCD3)
 position  δH(ppm，J in Hz)  δC  HMBC(H→C)
 1  3.02(1H，s)  58.7d  2，3，5，6，9，10，11，1″，2-CH3，10-CH3
 2  79.5s
 3  105.0s
 4  58.7s
 5  192.3s
 6  104.8s
 7  3.02(1H，s)  58.7d  3，4，5，8，9，11，12，1′，4-CH3，8-CH3
 8  79.5s
 9  105.0s
 10  58.7s
 11  192.3s
 12  104.8s
 2-CH3  1.35(3H，s)  21.9q  1，2，3
 4-CH3  1.38(3H，s)  19.9q  3，4，5，7
 8-CH3  1.35(3H，s)  21.9q  7，8，9
 10-CH3  1.38(3H，s)  19.9q  1，9，10，11
 1′  193.8q
 2′  2.41(1H，dt，15.42，7.71)；2.57(1H，dt，15.42，7.42)  35.1t  1′，3′，4′，12
 3′  2.25(2H，m)  29.0t  1′，2′，4′，5′
 4′  5.45(1H，m)  130.4d  2′，3′，5′，6′
 5′  5.49(1H，m)  126.5d  3′，4′，6′
 6′  1.61(3H，brd，4.98)  18.0q  4′，5′
 1′-OH  16.61(1H，s)  1′，2′，7，11，12
 1″  193.8q
 2″  2.41(1H，dt，15.42，7.71)；2.57(1H，dt，15.42，7.42)  35.1t  1″，3″，4″，6
 3″  2.25(2H，m)  29.0t  1″，2″，4″，5″
 4″  5.45(1H，m)  130.4d  2″，3″，5″，6″
 5″  5.49(1H，m)  126.5d  3″，4″，6″
 6″  1.61(3H，brd，4.98)  18.0q  4″，5″
 1″-OH  16.61(1H，s)  1″，2″，1，5，6
 a)本表信号归属基于DEPT、1H-1H COSY、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。
实施例2抗肿瘤活性的测试
1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物1-2。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。
细胞系及细胞的继代培养：活性测试采用P388和A-549细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在37℃通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)
本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的formazan，formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。
活性测试时，取对数生长期的P388和A-549细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5×104个细胞的细胞悬液，  按每孔200微升接种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20μL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150μL培养液后加入150μL DMSO溶解formazan，在540nm处测定其吸收度。按照IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照X100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。
2实验结果
化合物1-2的细胞增殖抑制活性：
表3.化合物对P388和A-549细胞的抑制率
化合物/浓度(μM)                          P388                       A-549
    100     10     1     0.1     0.01   100   10   1   0.1   0.01
12     100100     48.865.1     59.45.4     28.628.1     29.66.7   97.896.5   89.976.3   12.013.9   5.90   5.00
3结论
化合物1-2对包括人在内的哺乳动物来源的癌细胞具有抗肿瘤作用。因此，本发明的式I化合物可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于肿瘤的治疗，也可作为细胞增殖抑制的低分子生物探针用于探索生命现象本质的生命科学实验研究中。

Claims (6)

1.式I化合物
式I
其中R1和R2为羟基，R3为1，3-戊二烯基，R4为3-戊烯基，简称化合物1；或者R1和R2为羟基，R4和R3同为3-戊烯基，简称化合物2。
2.权利要求1所述式I化合物的制备方法，其特征是发酵培养土生青霉菌LM2-02，获取含有上述式I化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出化合物1和2。
3.权利要求2所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，氯仿-甲醇30∶1洗脱物，再经硅胶柱层析，进一步经制备HPLC分离纯化，以甲醇-水80∶20洗脱分别得到化合物1和2。
4.权利要求1所述的式I化合物在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。
5.权利要求1所述的式I化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途。
6.权利要求1所述的式I化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
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