CN102311971A

CN102311971A - 一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体及其构建方法

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Publication number: CN102311971A
Application number: CN2010102115054A
Authority: CN
Inventors: 林忠平; 麻洪; 胡鸢雷
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-06-29
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2012-01-11

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体，所述表达载体含有Cre基因表达盒、选择标记基因表达盒以及驱动目的基因的启动子、目的基因的终止子和供目的基因插入的多克隆位点；所述Cre基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；所述Cre基因表达盒和选择标记基因表达盒位于两个同向的loxP位点之间。本发明在Cre基因中插入了来自蓖麻的过氧化氢酶基因的内含子，可以防止Cre基因在微生物中表达，克服表达载体构建的困难，还可以提高农杆菌转化植物的效率，大大提高转基因植物培育效率。

Description

一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体及其构建方法。

背景技术

随着生物技术的进步，人们利用基因工程手段来改造植物以提高其品质、产量和抗性水平等已经成为现实。尤其近年来，转基因技术突飞猛进，转基因作物越来越多。基因修饰食品的安全性问题便成为公众关注的热点之一。由于某些原因，人们往往不希望在某种植物器官中含有外源的基因。特别是在一些可食用部分，例如，果实、种子，若含有某种外来基因，该基因产物可能不利于食用器官的品质改良，或可能不利于产品在市场上销售，就有必要将这些外源基因在食用器官删除。因此，如何控制转基因植物中外源基因的行为对转基因作物的产业化和商业化具有非常重要的意义。

随着分子生物学的不断发展，人们已经开始利用基因工程手段来控制转基因的行为。例如，Park&Willmizter等使用马铃薯块茎专一性启动子与uidA基因融合，所获转基因马铃薯只在块茎组织中检测到uidA基因的活性，而根、茎、叶中检测不到uidA基因的活性。

专利号为CN00122803.X的中国发明专利公开了一种利用定位重组系统从特定器官中删除外源基因的方法，该方法包括以下步骤：分别构建含重组酶基因的植物表达载体与含外源目的基因的载体，重组酶基因受器官或组织特异性启动子驱动，外源目的基因受组成型启动子驱动，外源目的基因两侧为同向的可被重组酶识别的DNA位点，将这两种载体通过转基因的方法分别导入两个植株，这两个转基因植物杂交后，重组酶识别外源目的基因两侧的DNA位点，将外源目的基因从植物基因组中删除。虽然该发明所述方法从理论上讲，重组酶在植物的特异器官或组织中表达，并在表达的器官或组织中切出识别位点间的外源核苷酸序列，而在其它器官或组织中不能删除外源靶核苷酸序列并保证了该外源基因的性状；但在实际操作过程中，需要将含重组酶基因的植物表达载体与含外源目的基因的载体分别导入植物细胞中，待转基因植物成活并发育良好再将二者杂交，缺点是操作复杂，转化及筛选工作量大，所需时间长，并且这种方法容易引起细胞变异，而且导入的基因又不是紧密连锁的，在后代中基因间会出现难以解决的孟德尔分离。

另外，在表达载体构建完成之后，将其导入农杆菌，在农杆菌培养过程中也会有Cre蛋白的表达而造成许多农杆菌中失去完整的Cre-LoxP系统，不仅载体构建过程中存在困难，也会降低农杆菌转化植物效率。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体。

本发明的第二个目的在于提供一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体的构建方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体，所述表达载体含有Cre基因表达盒、选择标记基因表达盒以及驱动目的基因的启动子、目的基因的终止子和供目的基因插入的多克隆位点；所述Cre基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；所述Cre基因表达盒和选择标记基因表达盒位于两个同向的loxP位点之间。

在Cre基因的第302位碱基G和第303位碱基G之间插入有碱基序列如SEQ IDNO：2所示的蓖麻过氧化氢酶基因的内含子序列。

SEQ ID NO：2：

1 GTAAATTTCT AGTTTTTCTC CTTCATTTTC TTGGTTAGGA CCCTTTTCTC TTTTTATTTT

61 TTTGAGCTTT GATCTTTCTT TAAACTGATC TATTTTTTAA TTGATTGGTT ATGGTGTAAA

121 TATTACATAG CTTTAACTGA TAATCTGATT ACTTTATTTC GTGTGTCTAT GATGATGATG

181 ATGTTACAG

Cre基因经突变改造不存在的BamHI位点位于Cre基因的356位(将357位的G突变为A后，GGATCC变为GAATCC)改造后的Cre基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，其中斜体且加粗部分为插入的蓖麻过氧化氢酶基因内含子，下划线位置为点突变碱基：

1 ATGTCCAATT TACTGACCGT ACACCAAAAT TTGCCTGCAT TACCGGTCGATGCAACGAGT

61 GATGAGGTTC GCAAGAACCT GATGGACATG TTCAGGGATC GCCAGGCGTTTTCTGAGCAT

121 ACCTGGAAAA TGCTTCTGTC CGTTTGCCGG TCGTGGGCGG CATGGTGCAAGTTGAATAAC

181 CGGAAATGGT TTCCCGCAGA ACCTGAAGAT GTTCGCGATT ATCTTCTATATCTTCAGGCG

241 CGCGGTCTGG CAGTAAAAAC TATCCAGCAA CATTTGGGCC AGCTAAACATGCTTCATCGG

301 AG

361

421

481

GTCCGGGCT GCCACGACCA AGTGACAGCA ATGCTGTTTCACTGGTTATG

541 CGGCGGATCC GAAAAGAAAA CGTTGATGCC GGTGAACGTG CAAAACAGGCTCTAGCGTTC

601 GAACGCACTG ATTTCGACCA GGTTCGTTCA CTCATGGAAA ATAGCGATCGCTGCCAGGAT

661 ATACGTAATC TGGCATTTCT GGGGATTGCT TATAACACCC TGTTACGTATAGCCGAAATT

721 GCCAGGATCA GGGTTAAAGA TATCTCACGT ACTGACGGTG GGAGAATGTTAATCCATATT

781 GGCAGAACGA AAACGCTGGT TAGCACCACA GGTGTAGAGA AAGCACTTAGCCTGGGGGTA

841 ACTAAACTGG TCGAGCGATG GATTTCCGTC TCTGGTGTAG CTGATGATCCGAATAACTAC

901 CTGTTTTGCC GGGTCAGAAA AAATGGTGTT GCCGCGCCAT CTGCCACCAGCCAGCTATCA

961 ACTCGCGCCC TGGAAGGGAT TTTTGAAGCA ACTCATCGAT TGATTTACGGCGCTAAGGAT

1021 GACTCTGGTC AGAGATACCT GGCCTGGTCT GGACACAGTG CCCGTGTCGGAGCCGCGCGA

1081 GATATGGCCC GCGCTGGAGT TTCAATACCG GAGATCATGC AAGCTGGTGGCTGGACCAAT

1141 GTAAATATTG TCATGAACTA TATCCGTACC CTGGATAGTG AAACAGGGGCAATGGTGCGC

1201 CTGCTGGAAG ATGGCGATTA G

所述Cre基因表达盒由来自大豆的热激启动子hsp、Cre基因和终止子组成。

所述驱动目的基因的启动子为Super启动子、35S启动子、e35S启动子或ubiquitin启动子。

所述选择标记基因为hptII基因、nptII基因或bar基因。

本发明包括，但不限于表1所示的植物表达载体：

表1本发明所述植物表达载体列表

载体名称	启动子	选择标记基因	多克隆位点(按从启动子到终止子的方向排列)
				pHIMES-SuB	Super	bar	XbaI，SmaI，KpnI*，SacI
pHIMES-SuK	Super	nptII	XbaI，SmaI，KpnI，SacI
				pHIMES-SuH	Super	hptII	XbaI，SmaI，KpnI，SacI
pHIMES-35B	35S	bar	XbaI，BamHI，SmaI，KpnI*，SacI
				pHIMES-35K	35S	nptII	XbaI，BamHI，SmaI，KpnI，SacI
pHIMES-35H	35S	hptII	XbaI，BamHI，SmaI，KpnI，SacI
				pHIMES-e35B	e35S	bar	BamHI，SmaI，KpnI*，SacI
pHIMES-e35K	e35S	nptII	BamHI，SmaI，KpnI，SacI
				pHIMES-e35H	e35S	hptII	BamHI，SmaI，KpnI，SacI
pHIMES-UbB	Ubiquitin	bar	BamHI，SmaI，KpnI*，SacI
				pHIMES-UbK	Ubiquitin	nptII	BamHI，SmaI，KpnI，SacI
pHIMES-UbH	Ubiquitin	hptII	BamHI，SmaI，KpnI，SacI

注：带*号标志的KpnI酶切位点无法使用，因为bar选择标记基因中含有一个KpnI位点。

一种可高效删除转基因植物选择标记基因表达载体在构建方法，包括以下步骤：

1)对Cre基因进行改造，在Cre基因的第302位碱基G和第303位碱基G之间插入有碱基序列如SEQ ID NO：2所示的蓖麻过氧化氢酶基因的内含子序列；

2)构建Cre基因表达盒；

3)将Cre基因表达盒、选择标记基因表达盒以及驱动目的基因的启动子、目的基因的终止子和供目的基因插入的多克隆位点克隆至同一载体，使Cre基因表达盒和选择标记基因表达盒位于两个同向的loxP位点之间，得到一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体。

利用本发明所述植物表达载体的农杆菌对植物进行转化后，得到转基因植株。对转基因植物进行热激处理，在热激启动子hsp的驱动下，Cre基因表达，Cre重组酶将两个loxP位点之间的DNA序列，包括选择抗性基因的表达盒和Cre基因本身的表达盒，删除掉，得到的植株就是只有目的基因，而不含选择标记基因的转基因植株。与现有技术相比，具有操作简单，转化及筛选工作量小，所需时间短；且不易引起细胞变异，导入的Cre基因和选择抗性基因紧密连锁，在后代中基因间不易出现分离。

另外更大的优点在于，本发明对Cre基因进行了改造：首先，在Cre基因中插入了来自蓖麻的过氧化氢酶基因的内含子，可以防止Cre基因在微生物中表达，克服表达载体构建的困难，还可以提高农杆菌转化植物的效率，大大提高转基因植物培育效率；其次，利用定点突变去除了Cre基因中的一个BamHI位点，这样表达载体的多克隆位点中就可以利用BamHI位点插入外源目的基因，方便了植物表达载体构建。

附图说明

图1是利用热激诱导删除转基因植物选择标记基因的原理图；

图2A-2K是植物表达载体pHIMES-SuH的构建流程图；

图3是植物表达载体pHIMES-SuB的构建流程图；

图4是植物表达载体pHIMES-SuK的构建流程图；

图5是植物表达载体pHIMES-35B的构建流程图；

图6是植物表达载体pHIMES-35K的构建流程图；

图7是植物表达载体pHIMES-35H的构建流程图；

图8是植物表达载体pHIMES-e35B的构建流程图；

图9是植物表达载体pHIMES-e35K的构建流程图；

图10是植物表达载体pHIMES-e35H的构建流程图；

图11是植物表达载体pHIMES-UbB的构建流程图；

图12是植物表达载体pHIMES-UbK的构建流程图；

图13是植物表达载体pHIMES-UbH的构建流程图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明所述的技术方案做进一步详细解释。

本发明所涉及质粒来源介绍：

1、通过购买途径获得：pCAMBIA3300、pCAMBIA2300、pCAMBIA1300和pCAMBIA-3301购自CAMBIA公司，pBI221购自Clontech公司，pBluescriptKSII购自Strategene公司，pUC19购自TAKARA公司，pGEM5Z购自Promega公司。

本发明所采用的分子生物学方法，如下一并介绍，不在具体实施例中赘述：

1、PCR扩增反应

根据模板的差异和扩增片段的不同，PCR扩增反应的体系和反应条件要做相应改变。在进行PCR反应时主要应考虑引物的退火温度，反应体系中镁离子有效浓度，模板的来源等因素。按25μl体系以质粒为模板扩增Cre基因为例：

反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环；72℃延伸7分钟。

2、碱裂解法小量制备质粒DNA

①挑取单菌落(或取适量菌液)接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

②取1.5ml菌液于离心管中；9,000rpm离心30秒；

③菌体沉淀重悬于200μl溶液I中，振荡混匀；

④加入新鲜配置的200μl溶液II，轻弹混匀，冰上放置3min，至溶液较清；

⑤加入300μl溶液III，轻弹混匀，冰上放置5min；12,000rpm离心5min；

⑥取上清液，加入等体积氯仿，混匀后12,000rpm离心5min；

⑦取上清，加入等体积异丙醇并混匀，室温下放置10min后，12,000rpm离心10min；

⑧弃上清，沉淀用200μl ddH₂O溶解，加入100μl 7.5M NH₄Ac并混匀，在冰上放置5min；12,000rpm离心5min；

⑨取上清，加入等体积异丙戊醇，混匀后在冰上放置10min；12,000rpm离心5min；

⑩弃上清，沉淀用70％乙醇清洗，抽干后溶于适量双蒸水中。

3、在质粒载体中进行克隆

1)酶切反应

在30μl反应体系中，加入10×酶切缓冲液3μl，DNA 1-5ug，限制性内切酶1μl(10U)，加无菌双蒸水补至30μl，37℃反应2小时；加入RNase 0.2μl，37℃反应10min后，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

2)DNA片段的回收与纯化——琼脂糖凝胶DNA回收柱回收法

①在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量不切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。

②将切下的含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。

③加3倍体积的溶胶/结合液DB。

④56C水浴放置10min(至完全溶解)，每2-3min震荡一次加速溶解。

⑤将所得溶液加入吸附柱AC(吸附柱放入收集管中)，室温放置1min，12000rpm离心30-60s，倒掉废液。

⑥加入700uL漂洗液WB(事先加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液。

⑦加入500uL漂洗液WB，12000rpm离心30s，丢弃废液。

⑧将吸附柱AC放回空收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。

⑨取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30uL洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm离心1min。如果需要较多量DNA，可以将得到的溶液重新加入吸附柱中，离心1min。

3)连接反应

非同尾酶的不同限制性内切酶切出的粘端或一平端一粘端DNA，可以回收片段后直接进行连接反应，10μl反应体系中加入3∶1比例的插入片段和载体片段，1单位T4DNA连接酶，一般16℃反应10小时左右；

4)大肠杆菌感受态细胞的制备-CaCl₂法

①挑取新鲜的E.coli DH5α单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜；

②按1∶50的比例把菌液接种到新鲜的LB液体培养基内，37℃培养1-2h，至OD₆₀₀约为0.4

③菌液冰浴15min，分装于小离心管中；5,000rpm 4℃离心3min收集细胞；

④细胞重悬于1ml预冷的0.1M CaCl₂中，冰浴30min；5,000rpm 4℃离心3min收集细胞；

⑤用100μl预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞沉淀，12-24小时内使用转化效率最高；如需保存，加入甘油至终浓度20％或7％DMSO放于-70℃冰箱保存。

5)细菌的转化

①取100μl感受态细胞加5μl连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min；

②于42℃水浴中热激90秒，迅速置于冰上冷却1-2min；

③加800μl LB液体培养基，37℃培养45min至60min；

④取50-200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

6)重组质粒的筛选与鉴定

酶切检测：挑取单菌落于合适当抗生素的3ml LB液体培养基中，37℃培养过夜，快速小量提取质粒DNA，用适当限制性内切酶进行酶切反应，电泳后观察DNA条带位置以确定是否有外源片段的插入以及插入片段的大小是否正确，从而判断是否为重组克隆。

PCR检测：以提取的质粒DNA为模板，用特定引物在适当条件下做PCR扩增反应，电泳检测确定重组子。

实施例1植物表达载体pHIMES-SuH及其构建方法

植物表达载体pHIMES-SuH的构建方法参见图2A-2K，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

1)用HindIII和BamHI双酶切质粒pCAMBIA3300和pBI221，用连接酶将35S启动子插入pCAMBIA3300中，得到pCAMBIA3300-35S；再用EcoRI和SacI双酶切pCAMBIA3300-35S和pBI221，用连接酶将Tnos终止子插入pCAM3300-35S，得到pMH35B；

2)以质粒pCAMBIA3301为模板，用pfu酶进行PCR扩增Catalase内含子；以大肠杆菌P1噬菌体DNA为模板，PCR扩增Cre5’片段和Cre3’片段；用连接酶将Catalase内含子、Cre5’片段和Cre3’片段连接成含Catalase内含子的iCremut基因；用HindIII和EcoRI双酶切载体pUC19和含Catalase内含子的iCremut基因，用连接酶将含Catalase内含子的iCremut基因插入至载体pUC19中，得到中间载体pUC19-iCremut；

3)以pUC19-iCremut为模板，PCR扩增具有蓖麻过氧化氢酶基因的内含子序列且突变掉BamHI位点的Cre基因，命名为：iCremut，且通过PCR引物添加BamHI、ApaI、SalI和SacI酶切位点；用BamHI和SacI双酶切上述PCR产物和质粒pMH35B，用连接酶将iCremut基因插入pMH35B载体，得到中间载体pMH35B-iCremut；

4)用SacI酶单酶切中间载体pMH35B-iCremut，补平后自连，得到中间载体pMH35B-iCremutplus；质粒pBluescriptKSII经KpnI单酶切后补平，再经EcoRV单酶切后自连，得到中间载体pBlueKS II plus；中间载体pMH35B-iCremutplus经EcoRI单酶切后补平，再经PstI单酶切后，回收小片段，中间载体pBlueKS II plus经BamHI单酶切后补平，再经PstI单酶切，所述小片段与经PstI单酶切的pBlueKS II plus连接，得到中间载体pBlue-iCremut；

5)以玉米基因组DNA为模板，扩增hsp启动子，且通过PCR引物添加HindIII、PstI、ApaI和XbaI酶切位点；用PstI和ApaI双酶切PCR扩增产物和中间载体pBlue-iCremut，用大豆热激启动子hsp替换35S启动子，得到中间载体pBlue-hspcre；

6)以质粒pCAMBIA1300为模板，采用pfu酶PCR扩增35S-hptII-PA35S片段，且通过PCR引物添加SpeI、BstXI、PstI和XbaI酶切位点；用SmaI和XbaI双酶切质粒pUC19，用XbaI单酶切PCR产物；用连接酶将35S-hptII-PA35S片段插入质粒pUC19，得到中间载体pUC-35ShptII；

7)以质粒pBI221为模板，PCR扩增两端带有loxP位点的GUS基因，且通过PCR引物添加SacI、NotI、XbaI、SmaI、EcoRI、XhoI、XbaI、BamHI和EcoRV酶切位点；用EcoRV和SacI双酶切PCR产物和载体pGEM5Z，用连接酶将GUS基因插入pGEM5Z，得到中间载体pGSL-GUS；

8)用XbaI单酶切载体pGSL-GUS回收大片段，用SpeI和XbaI双酶切中间载体pUC-35ShptII，回收小片段；用连接酶连接上述大片段和小片段，得到中间载体pGSL-35ShptII；中间载体pGSL-35ShptII经BamHI和SacII双酶切后补平，自连，得到中间载体p5ZloxP-hptII；

9)用PstI和SpeI双酶切中间载体pBlue-hspcre，回收小片段；用PstI和XbaI双酶切中间载体p5ZloxP-hptII；用连接酶将iCremut基因的表达盒插入p5ZloxP-hptII中，得到中间载体p5ZloxP-crehptII；

10)用野生型农杆菌DNA为模板，PCR扩增OCS上游调控序列和MAS启动子，OCS上游调控序列两端通过引物加入BamHI酶切位点，MAS启动子两端通过引物加入BamHI和XbaI酶切位点；用BamHI单酶切OCS上游调控序列，用BamHI和XbaI双酶切MAS启动子，用连接酶将二者连接，得到Super启动子，以Super启动子为模板，PCR扩增得到两端带有PstI、SalI、BamHI和XbaI、SmaI的Super启动子片段；用PstI和SmaI分别双酶切载体pMH35B和Super启动子，用连接酶将Super启动子插入至载体pNH35B，得到中间载体p3300-Super；

11)用SacI单酶切中间载体p5ZloxP-crehptII后补平，再经SphI单酶切，回收大片段；用BstXI和XmnI双酶切质粒p3300-Super，回收大片段；用连接酶将iCremut基因和hptII基因的表达盒插入p1300-Super-pAnos中，得到最终植物表达载体pHIMES-SuH。

实施例2植物表达载体pHIMES-SuB及其构建方法

植物表达载体pHIMES-SuB的构建方法参见图3，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用XhoI单酶切中间载体pHIMES-SuH，回收大片段；用XhoI单酶切载体pCAMBIA3300，回收小片段；将pHIMES-SuH中的hptII抗性基因替换为bar抗性基因，得到最终植物表达载体pHIMES-SuB。

实施例3植物表达载体pHIMES-SuK及其构建方法

植物表达载体pHIMES-SuK的构建方法参见图4，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用XhoI单酶切中间载体pHIMES-SuH，回收大片段；用XhoI单酶切载体pCAMBIA2300，回收小片段；将pHIMES-SuH中的hptII抗性基因替换为nptII抗性基因，得到最终植物表达载体pHIMES-SuK。

实施例4植物表达载体pHIMES-35B及其构建方法

植物表达载体pHIMES-35B的构建方法参见图5，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用HindIII和BamHI双酶切中间载体pHIMES-UbB，回收大片段；用HindIII和BamHI双酶切中间载体pBI221，回收小片段；将pHIMES-UbB中的Ubi启动子替换为35S启动子，得到最终植物表达载体pHIMES-35B。

实施例5植物表达载体pHIMES-35K及其构建方法

植物表达载体pHIMES-35K的构建方法参见图6，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用HindIII和BamHI双酶切中间载体pHIMES-UbK，回收大片段；用HindIII和BamHI双酶切中间载体pBI221，回收小片段；将pHIMES-UbK中的Ubi启动子替换为35S启动子，得到最终植物表达载体pHIMES-35K。

实施例6植物表达载体pHIMES-35H及其构建方法

植物表达载体pHIMES-35K的构建方法参见图7，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用HindIII和BamHI双酶切中间载体pHIMES-UbH，回收大片段；用HindIII和BamHI双酶切中间载体pBI221，回收小片段；将pHIMES-UbB中的Ubi启动子替换为e35S启动子，得到最终植物表达载体pHIMES-e35H。

实施例7植物表达载体pHIMES-e35B及其构建方法

植物表达载体pHIMES-e35B的构建方法参见图8，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

以载体pCAMBIA-3300为模板，PCR扩增e35S片段，通过引物在片段两端添加HindIII和BamHI酶切位点；用HindIII和BamHI双酶切中间载体pHIMES-UbB，回收大片段；用HindIII和BamHI双酶切e35S扩增片段，回收；将pHIMES-UbH中的Ubi启动子替换为e35S启动子，得到最终植物表达载体pHIMES-e35B。

实施例8植物表达载体pHIMES-e35K及其构建方法

植物表达载体pHIMES-e35K的构建方法参见图9，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用HindIII和BamHI双酶切中间载体pHIMES-UbK，回收大片段；用HindIII和BamHI双酶切中间载体pMHe35B，回收小片段；将pHIMES-UbK中的Ubi启动子替换为e35S启动子，得到最终植物表达载体pHIMES-e35K。

实施例9植物表达载体pHIMES-e35H及其构建方法

植物表达载体pHIMES-e35H的构建方法参见图10，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用HindIII和BamHI双酶切中间载体pHIMES-UbH，回收大片段；用HindIII和BamHI双酶切中间载体pMHe35B，回收小片段；将pHIMES-UbK中的Ubi启动子替换为e35S启动子，得到最终植物表达载体pHIMES-e35H。

实施例10植物表达载体pHIMES-UbB及其构建方法

植物表达载体pHIMES-UbB的构建方法参见图11，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用HindIII和SmaI双酶切中间载体pHIMES-SuB，回收大片段；以玉米DNA模板，PCR扩增Pubi片段，通过引物在Pubi片段两端添加HindIII、PstI和BamHI、SmaI酶切位点，用HindIII和SmaI双酶切PCR产物-Pubi片段，回收；用连接酶将pHIMES-SuB中的Super启动子替换为Ubi启动子，得到最终植物表达载体pHIMES-UbB。

实施例11植物表达载体pHIMES-UbK及其构建方法

植物表达载体pHIMES-UbK的构建方法参见图12，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用HindIII和SmaI双酶切中间载体pHIMES-SuK，回收大片段；用HindIII和SmaI双酶切中间载体pHIMES-UbB，回收小片段；将pHIMES-SuK中的Super启动子替换为Ubi启动子，得到最终植物表达载体pHIMES-UbK。

实施例12植物表达载体pHIMES-UbH及其构建方法

植物表达载体pHIMES-UbH的构建方法参见图13，采用上述常规分子生物学方法，具体为：

用HindIII和SmaI双酶切中间载体pHIMES-SuH，回收大片段；用HindIII和SmaI双酶切中间载体pHIMES-UbB，回收小片段；将pHIMES-SuH中的Super启动子替换为Ubi启动子，得到最终植物表达载体pHIMES-UbH。

实验例1pHIMES系列载体在细菌中稳定性的验证

采用冻融法转化土壤农杆菌

①将土壤农杆菌菌株接种于含适当抗生素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养至对数期；

②4℃，6,000rpm离心2分钟，收集菌体于小离心管中；

③用400μl冰预冷的20mM CaCl₂重悬洗涤细胞；

④4℃，6,000rpm离心2分钟，细胞沉淀中加入50μl冰预冷的20mM CaCl₂，然后加入约1ug质粒DNA，轻轻混匀；

⑤于液氮中速冻2分钟，37℃温育5分钟；

⑥加入500μl LB液体培养基，28℃轻摇5小时；

取50-200μl菌液均匀涂布于含适当抗生素的LB选择平板上，28℃倒置培养两大。

以pHIMES-35B转化的农杆菌为例。用pHIMES-35B转化农杆菌LBA4404，随机选取一个转化的农杆菌菌落，接种于含适当抗生素的LB培养基中，28℃摇震培养48小时后，涂布到含适当抗生素的LB固体培养基上。对长出的单菌落进行PCR，扩增iCremut基因以确定pHIMES-35B载体是否在农杆菌中发生了重组。

PCR鉴定的100个单菌落中，均可扩增出iCremut基因，未检测到重组的单菌落。而用同样的方法，检测对照载体在农杆菌中的重组率为10％。该对照载体中的Cre基因不含蓖麻过氧化氢酶基因的内含子序列。可见，经改造的iCremut基因不在微生物中表达，克服了载体构建的困难。

实验例2pHIMES系列载体高效率转化植物的验证

采用叶盘法转化植物

①接种转化菌单菌落于含适当抗生素的2ml YEB液体培养基中，28℃培养1-2天，转接入40ml YEB液体培养基中，28℃继续培养至OD₆₀₀约0.5，5,000rpm离心10分钟，菌体用40ml MS液体培养基重新悬浮；

②取无菌植物叶片和不含腋芽的茎段，于MS固体培养基中25℃预培养一天；

③重新取出材料，用剪刀切成小块放入无菌MS液体培养基稀释过的农杆菌中，浸泡15-20分钟，其间不断轻摇几次；

④取出材料，用无菌滤纸吸去多余菌液，于MS固体培养基中25℃暗培养两天；

⑤把材料转入含相应抗性和500mg/L Cb和适当激素的分化培养基中，25℃光下培养至分化出愈伤组织，直至长出芽；

⑥将长至3-5cm的芽转入生根培养基上诱导生根。

以pHIMES-35B载体转化烟草为例。用含pHIMES-35B的农杆菌LBA4404转化野生型烟草W38，转化率为70％。而用对照载体转化烟草，转化率只有12％。该对照载体中的Cre基因不含蓖麻过氧化氢酶基因的内含子序列。显然，本发明所述可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体通过农杆菌转化植物的效率大大提高了。

不同植物可选择pHIMES系列中的不同载体进行转化。

单子叶植物应选择启动子为Ubi。双子叶植物则应选择启动子为35S、e35S或Super的载体。这三个启动子中Super驱动下游基因表达的活性最强，e35S也较强，35S稍弱。35S启动子来自烟草花叶病毒；e35S比35S启动子多一个增强子；Super启动子则是人工合成的，由农杆菌ocs启动子的上游激活序列与mas启动子连接组成。

不同植物对选择标记基因的敏感性也有差异。例如，有人转化水稻时习惯于用hptII基因做选择标记，认为可以提高水稻转化率。转化大豆和玉米时习惯使用bar基因做选择标记，认为在田间用除草剂大规模筛选转基因植株更为方便。

因此，本发明所述系列植物表达载体可在多种转基因植物培育中应用。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>林忠平

<120>一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体及其构建方法

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1221

<212>DNA

<213>蓖麻

<400>1

atgtccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga tgcaacgagt 60

gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat 120

acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac 180

cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg 240

cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgg 300

aggtaaattt ctagtttttc tccttcattt tcttggttag gacccttttc tctttttatt 360

tttttgagct ttgatctttc tttaaactga tctatttttt aattgattgg ttatggtgta 420

aatattacat agctttaact gataatctga ttactttatt tcgtgtgtct atgatgatga 480

tgatgttaca ggtccgggct gccacgacca agtgacagca atgctgtttc actggttatg 540

cggcgaatcc gaaaagaaaa cgttgatgcc ggtgaacgtg caaaacaggc tctagcgttc 600

gaacgcactg atttcgacca ggttcgttca ctcatggaaa atagcgatcg ctgccaggat 660

atacgtaatc tggcatttct ggggattgct tataacaccc tgttacgtat agccgaaatt 720

gccaggatca gggttaaaga tatctcacgt actgacggtg ggagaatgtt aatccatatt 780

ggcagaacga aaacgctggt tagcaccaca ggtgtagaga aagcacttag cctgggggta 840

actaaactgg tcgagcgatg gatttccgtc tctggtgtag ctgatgatcc gaataactac 900

ctgttttgcc gggtcagaaa aaatggtgtt gccgcgccat ctgccaccag ccagctatca 960

actcgcgccc tggaagggat ttttgaagca actcatcgat tgatttacgg cgctaaggat 1020

gactctggtc agagatacct ggcctggtct ggacacagtg cccgtgtcgg agccgcgcga 1080

gatatggccc gcgctggagt ttcaataccg gagatcatgc aagctggtgg ctggaccaat 1140

gtaaatattg tcatgaacta tatccgtacc ctggatagtg aaacaggggc aatggtgcgc 1200

ctgctggaag atggcgatta g 1221

<210>2

<211>189

<212>DNA

<213>蓖麻

<400>2

gtaaatttct agtttttctc cttcattttc ttggttagga cccttttctc tttttatttt 60

tttgagcttt gatctttctt taaactgatc tattttttaa ttgattggtt atggtgtaaa 120

tattacatag ctttaactga taatctgatt actttatttc gtgtgtctat gatgatgatg 180

atgttacag 189

Claims

1.一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体，其特征在于：所述表达载体含有Cre基因表达盒、选择标记基因表达盒以及驱动目的基因的启动子、目的基因的终止子和供目的基因插入的多克隆位点；所述Cre基因的碱基序列如SEQID NO：1所示；所述Cre基因表达盒和选择标记基因表达盒位于两个同向的loxP位点之间。

2.根据权利要求1所述的一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体，其特征在于所述Cre基因表达盒由来自大豆的热激启动子hsp、Cre基因和终止子组成。

3.根据权利要求1所述的一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体，其特征在于：所述驱动目的基因的启动子为Super启动子、35S启动子、e35S启动子或ubiquitin启动子。

4.根据权利要求1所述的一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体，其特征在于：所述选择标记基因为hptII基因、nptII基因或bar基因。

5.根据权利要求1所述的一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pHIMES-SuB、pHIMES-SuK、pHIMES-SuH、pHIMES-35B、pHIMES-35K、pHIMES-35H、pHIMES-e35B、pHIMES-e35K、pHIMES-e35H、pHIMES-UbB、pHIMES-UbK或pHIMES-UbH。

6.一种可高效删除转基因植物选择标记基因表达载体的构建方法，包括以下步骤：

2)构建Cre基因表达盒；

7.根据权利要求6所述的一种可高效删除转基因植物选择标记基因表达载体的构建方法，其特征在于：所述Cre基因表达盒由来自大豆的热激启动子hsp、Cre基因和终止子组成。

8.权利要求1所述可高效删除转基因植物选择标记基因表达载体在转基因植物培育中的应用。