CN101709306B - 含单链dna结合蛋白的融合蛋白及其表达和纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类表达载体，该载体包含启动子和编码融合蛋白的多核苷酸序列。本发明还提供一类融合蛋白，包含单链DNA结合蛋白以及直接或间接融合于单链DNA结合蛋白C端或N端的目的蛋白或多肽，该融合蛋白能与单链DNA结合。本发明还提供了一类纯化蛋白的方法，通过与单链DNA相结合的亲和层析，使得该融合蛋白得到高效纯化。

Description

含单链DNA结合蛋白的融合蛋白及其表达和纯化的方法
技术领域
本发明主要涉及蛋白质表达与纯化技术，更具体地说，本发明涉及含单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding protein，SSB)的融合蛋白的表达与纯化方法。
背景技术
目前大量生物的基因组序列已经得到，随着DNA重组技术的进步，基因的克隆及在原核或真核细胞中表达这些基因已经成为一项简单的技术。而对蛋白质功能的生化阐明需要得到高纯度的蛋白质。
有很多种方法能将蛋白质从生物样品中的其它组分中分离纯化出来。这些方法包括利用它们的电荷不同进行分离的离子交换层析，利用分子大小进行分离的排阻层析，以及亲和层析。亲和层析是利用一个蛋白和特定分子之间的专一作用而衍生出来的纯化方法，如抗体与抗原之间的专一性结合，因而它具有更高的特异性，比其它纯化方法更有效。相互配对的一个部分可以作为目的蛋白的“标签”，而另一个作为亲和配基。可以通过重组，使该“标签”以融合蛋白的形式表达。然后，带标签的融合蛋白与它的配基通过亲和作用力得到纯化。如有需要，可通过专一性切割去除标签得到原来的蛋白。然而，已知的亲和层析存在诸如纯化效率不高，所需时间长，花费大，以及洗脱条件特殊等缺点。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供一种简单高效并能经济地表达和纯化重组蛋白的方法和体系。
本发明的一个目的是提供一类质粒表达载体，该质粒包含启动子和一段编码融合蛋白的多核苷酸序列；其中编码融合蛋白的多核苷酸序列与启动子恰当地连接，因此融合蛋白的转录受该启动子控制；该融合蛋白包含一个单链DNA结合蛋白(SSB)和一个直接或间接融合在SSB的C端或N端的目的蛋白或多肽；该融合蛋白能够与单链DNA结合。
本发明的一个方面是提供了一种纯化目的蛋白的方法。具体地说，该方法包括将表达载体转入宿主细胞，其中该表达载体包含启动子和与之恰当连接的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码一个由SSB与目的蛋白组成的融合蛋白，目的蛋白直接或间接地连接在SSB的C端或N端，使得该融合蛋白可以与单链DNA相结合；在适当的条件下培养宿主细胞，使融合蛋白表达；裂解宿主细胞得到细胞裂解液；将细胞裂解液与固定了单链DNA的介质接触，使融合蛋白结合到该介质的单链DNA上；清洗介质以除去杂质；再将结合的融合蛋白从介质上洗脱下来；这样，目的蛋白就以融合蛋白的形式得到表达和纯化。
本发明的另一方面是提供一种融合蛋白，它包括SSB和直接或间接地连接于SSB的C端或N端的目的蛋白或多肽，其中该融合蛋白能够与单链DNA结合；因此该融合蛋白可以通过固定了单链DNA的介质进行纯化。
本发明在表达及纯化蛋白质上具有明显的优点。首先，该融合蛋白是可溶的，并可在生理条件下直接用单链DNA纤维素进行亲和纯化。第二，在单链DNA纤维素一步层析中，前面提到的融合蛋白同细胞裂解液中其它蛋白和杂质的分离效率很高，明显优于其它亲和层析，如镍-琼脂糖亲和层析。第三，仅通过提高盐(KCl或NaCl)浓度的办法，就可以从单链DNA纤维素中洗脱下该融合蛋白，这使得从单链DNA纤维素回收前面提到的融合蛋白非常简单并且高效。
本发明的目的及优点可以从下面的有详细描述的几个实施例中得到很好的体现，这些实施例附有相关的图表。
附图说明
图1A是一系列pSSB-B表达质粒的图谱，包括pSSB-B1的图示表征。这一系列质粒适用于细菌宿主。同时还给出了pSSB-B、pSSB-B2、pSSB-B3和pSSB-B4质粒的专一蛋白酶酶切位点。另外，在pSSB-B3和pSSB-B4质粒中，SSB的N端还附加了一个六组氨酸的标签。
图1B是一系列pSSB-Y表达质粒的图谱，包括pSSB-Y1的图示表征。这一系列质粒适用于裂殖酵母宿主。同时还给出了pSSB-B1、pSSB-B2、pSSB-B3和pSSB-B4质粒的专一蛋白酶酶切位点。此外，还标明了pSSB-Y1或pSSB-Y2表达载体中的六组氨酸的标签，SSB，肠激酶或凝血酶切割位点，以及多克隆位点。
图1C是一系列pSSB-I表达质粒的图谱，包括pSSB-11的图示表征。这一系列质粒适用于昆虫细胞宿主。同时还给出了pSSB-11、pSSB-12、pSSB-13和pSSB-14质粒的专一蛋白酶酶切位点。在pSSB-13和pSSB-14表达载体中，SSB的N端还有一个六组氨酸的标签。
图1D是一系列pSSB-H表达质粒的图谱，包括pSSB-H1的图示表征。这一系列质粒适用于人细胞宿主。同时还给出了pSSB-11、pSSB-12、pSSB-13和pSSB-14质粒的专一蛋白酶酶切位点，在pSSB-H3和pSSB-H4表达载体中，SSB的N端还有一个六组氨酸的标签。
图2显示了融合蛋白6His-SSB-Sap1，6His-Sap1和6His-GST-Sap1在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS细胞中过表达的表达水平。从可溶性组分电泳道上可以看到，这三种融合蛋白在细胞裂解液中都是可溶的。图中还给出了没有表达融合蛋白的负对照组。所有数据中的MW是分子量(molecular weigbt)的缩写。kDa是kilo-Dalton的缩写。
图3A给出了融合蛋白6His-SSB-Sap1经过单链DNA纤维素亲和层析纯化的结果。取全细胞提取液进行单链DNA纤维素亲和层析。不结合的蛋白及其它杂质直接从单链DNA纤维素柱中流出。结合的6His-SSB-Sap1在盐浓度约0.4MKC1时从单链DNA纤维素上洗脱下来。
图3B显示的是经单链DNA纤维素亲和层析纯化的6His-SSB-Sap1能够很好地与镍-琼脂糖结合，并在咪唑(imidazo1e)浓度250mM时洗脱下来。此结果表明，若需要，6His-SSB-Sap1可以用镍柱进一步纯化。
图4是细胞裂解液中的融合蛋白SSB-Fen1用单链DNA纤维素柱进行纯化的结果。Fen1是人细胞里的一种DNA片段内切酶1(human flap endonuclease1)。融合蛋白SSB-Fen1在E.coli细胞中过表达。含有SSB-Fen1的细胞裂解液进行ssDNA纤维素亲和层析。结合的SSB-Fen1在盐浓度约0.4M KCl时洗脱下来。
图5是细胞裂解液中的6His-GST-Sap1用还原型谷胱甘肽(glutathione)-sepharose4B进行纯化的结果。融合蛋白6His-GST-Sap1在E.coli细胞中过表达。包含6His-GST-Sap1的细胞裂解液用还原型谷胱甘肽-Sepharose4B进行亲和层析。当柱子用不含还原型谷胱甘肽的缓冲液充分洗涤后，结合的GST-Sap1首先用10mM还原型谷胱甘肽洗脱。残留于柱的GST-Sap1用0.5％SDS才从还原型谷胱甘肽-Sepharose4B上进一步洗脱下来。
图6是细胞裂解液中的6His-Sap1用镍-琼脂糖亲和层析纯化的结果。6His-Sap1在E.coli细胞中过表达。含6His-Sap1的细胞裂解液过镍柱，并用含20mM咪唑的缓冲液洗几个柱体积，以除去不结合的蛋白及其它杂质。结合的6His-Sap1用250mM咪唑洗脱下来。
图7是从人细胞裂解液中纯化SSB-Sap1的结果。SSB-Sap1在人细胞中过表达。含SSB-Sap1的人细胞裂解液进行单链DNA纤维素亲和层析。通过分步梯度洗脱的办法，大部分结合的SSB-Sap1在盐浓度0.2至1.0M KCl时被洗脱下来。图7-9中的SSB-Sap1条带标明了该蛋白在SDS-PAGE胶中的位置。
图8是从昆虫细胞裂解液中纯化SSB-Sap1的结果。SSB-Sap1在昆虫细胞中过表达。含SSB-Sap1的昆虫细胞裂解液进行单链DNA纤维素柱亲和层析。大部分结合的SSB-Sap1在盐浓度0.2至1.0M KCl时被洗脱下来。
图9是从裂殖酵母细胞裂解液中纯化SSB-Sap1的结果。SSB-Sap1在裂殖酵母细胞中过表达。含SSB-Sap1的酵母细胞裂解液进行单链DNA纤维素亲和层析。大部分结合的SSB-Sap1在盐浓度0.2至1.0M KCl时被洗脱下来。
图10是6His-SSB-Sap1用凝血酶切割，并用镍-琼脂糖层析除去6His-SSB的结果。
具体实施方式
下面结合一些具体细节进一步详细地阐述本发明，以使本发明更容易被理解。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本文中涉及到的文献引用，直接显示于本文中，这样，能更好地明示本发明中所用的技术。
本发明在操作中将用到分子生物学(包括DNA重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术已为人们熟知，若如无例外，将不再特别指出。这些技术在文献中已经有很好的描述，如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版(Sambrook et a1.，1989)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel et a1.，eds.，1987)。
本发明的一个方面，提供了一类表达载体，这类载体能在原核生物(如大肠杆菌)和真核细胞(如酵母，昆虫细胞，哺乳动物细胞)中表达融合蛋白。“融合蛋白”是一个由多肽链相互连接形成的嵌合分子。不同的多肽链可以直接相连，也可以通过一个或多个多肽连接片段相互连接。嵌合分子中所指的“连接片段”可以是任何能连接嵌合分子组成成分的分子。当嵌合分子为融合蛋白时，连接片段可以是包含于融合蛋白中的一段多肽。
融合蛋白包含一个单链DNA结合蛋白(SSB)。这里提到的SSB指任何可以结合单链DNA的蛋白或多肽链；所以，当目的蛋白或多肽链融合在SSB的C端或N端时，融合蛋白可以通过SSB结合到单链DNA上得到纯化。当单链DNA被固定到一个介质上，一种有效的亲和层析纯化体系就被建立起来了，它可以被用来纯化含SSB的融合蛋白；这样，目的蛋白可以很容易地被表达和纯化。
适合本发明的SSB可以是来自于任何有机体的作为基因组功能的一部分正常表达的天然蛋白。例如，T7噬菌体表达了一个分子量为25.6kDa的单链DNA结合蛋白(SSB)(Dunn jj，Studier FW(1983)Complete nucleotide sequence ofbacteriophage T7DNA and the lOcation of T7genetic elements.J Mol Biol.166(4)：477-535)。在生理条件下，该蛋白以同源二聚体形式存在，是一个可溶性很高的蛋白。该蛋白能特异地结合单链DNA，亲和性高，且无序列特异性。在盐浓度1.0M时，T7SSB与单链DNA分离。用于融合蛋白的SSB也可以是天然SSB蛋白的一个片段或变异或经过改变的SSB。还可以从人工序列库筛选具有单链DNA结合能力的蛋白，如噬菌体展示，得到合适的单链DNA结合蛋白。当筛选到的SSB更小时，它有可能优于天然蛋白，因为不需要再将SSB从融合蛋白中除去。在很多情况下，当SSB融合蛋白具有正常的生物活性和生物功能时，可能没有必要除去SSB。
在特定实施例中，融合蛋白包含一段置于SSB和目的蛋白之间并可切割的连接序列，以便用化学方法或酶解除去融合蛋白中的SSB。显然，可切割序列可以根据使用者的意愿，置于融合蛋白的任何位置。在表达载体中，可切割序列包含一段编码一个特定氨基酸或几个氨基酸的序列，在这些氨基酸的C端可以进行化学切割或酶解。
可用于切割的化学试剂有溴化氰(cyanogen bromide)，BNPS-skatole(2-(2-nitrophenylsulfenyl)-3-bromo-3’-methylindolinium)和羟胺(hydroxylamine)等。溴化氰在甲硫氨酸残基的C端进行切割。BNPS-skato1e在色氨酸残基的C端进行切割。羟胺在天冬酰胺-Z的C端进行切割，Z可以是甘氨酸，亮氨酸或丙氨酸。
可用于切割的酶有胰蛋白酶(trypsin)，木瓜蛋白酶(papain)，胃蛋白酶(pepsin)，血纤维蛋白溶酶(plasmin)，凝血酶(thrombin)，肠激酶(enterokinase)等。每一个都对识别的特定氨基酸序列进行切割。例如肠激酶，识别氨基酸序列-(天冬氨酸)n-赖氨酸-(n为2至4的整数)。
在特定实施例中，融合蛋白包含一个或多个其它的纯化标签。例如，六个组氨酸残基融合到SSB的N端或C端，这样纯化含六个组氨酸残基和SSB的融合蛋白时，可以将镍-琼脂糖和固定了单链DNA的介质结合起来。纯化后，SSB和六组氨酸残基部分可以用化学方法或酶解除去。事实上，任何纯化标签在这里都是适用的，包括myc标签，HA标签，Flag-peptide，KT3epitope，alpha-tubulin epitope，T7gene10protein peptide标签，GST(glutathione-S-transferase)，strep标签，牛胰蛋白酶抑制剂(bovine pancreatictrypsin inhibitor，BPTI)和麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)。
表达载体由核苷酸构成，通过重组或合成得到，含有能在宿主中有效表达基因或cDNA的元件，这些序列与宿主是相容的。重组表达载体包括一个或多个调控序列，这些序列恰当地与编码核苷酸序列相连，使核苷酸能够转录为mRNA，并翻译得到目标蛋白。这里，“调控序列”是一种笼统的说法，它包含启动子，增强子或其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调控序列为该领域里的人所熟知。(例如，Goeddel(1990)Gene Expression Technology：Meth.Enzymol.185，A cademic Press，San Diego，Calif.)
在特定实施例中，表达载体是一系列构建的质粒表达载体(pSSB)，保证SSB融合蛋白可以在广泛的宿主细胞中表达：pSSB-B1-B4用于细菌中的表达，pSSB-Y1-Y2用于酵母中的表达，pSSB-11-14用于昆虫细胞中的表达，pSSB-M1-M4用于哺乳动物细胞表达(图1)。在插入编码目的蛋白的DNA序列之前，一个典型表达载体包含：1)启动子区域；2)一个5’非编码序列；3)蛋白编码区；4)一个3’非编码序列；5)转录终止位点。蛋白编码区的构建保证目的蛋白序列能容易地插入并形成融合蛋白。例如，蛋白翻译区包含一个来自噬菌体T7的编码SSB的DNA片段，即699bp的T7基因2.5的DNA序列。在特定实施例中，专一的蛋白酶(如凝血酶或肠激酶)识别位点插到SSB的C端或N端附近。多克隆位点也设计在这些蛋白酶酶切位点的下游或上游，编码目的蛋白或多肽的DNA序列可以由此插入。此外，其它纯化标签也可以包含在“蛋白编码区”中。更佳的，目的多肽可以与组成型启动子或可诱导的/组织特异性启动子恰当地连接。
在特定实施例子中，表达载体可以来自科斯质粒(cosmids)或病毒。例如可以用复制缺陷的反转录病毒(retroviruses)，腺病毒(adenoviruses)和腺病毒相关的病毒(adeno-associated viruses)。表达载体的另一个例子是酵母人工染色体(YAC)，包含一个中心粒和两个端粒，使YAC可以作为小的线性染色体得到复制。大量已经商业化的恰当的表达体系可以通过改进，使它适用本专利的载体。这里阐述的表达体系包含(但不局限于)杆状病毒(baculovirus)表达载体。
如上所述，表达载体克隆，构建和扩增的技术已经相当成熟。因此，SSB融合蛋白的表达载体可以用常规的步骤构建；为了不使本发明变得费解，这里就不再提供进一步的细节。
本发明的另一方面，提供了一个以融合蛋白形式对目的蛋白进行纯化的方法，该融合蛋白利用SSB作为标签。根据DNA在细胞中以双链形式存在的特性，大量的蛋白能够以不同的亲和力与双链DNA结合，但是能与单链DNA结合的蛋白极少。SSB是在进化过程中选择并保留下来，在DNA复制阶段，它在DNA复制叉处结合并保护单链DNA的蛋白。简单来说，将前面描述的SSB融合蛋白的表达质粒引入相容的宿主细胞中；在合适条件下培养宿主细胞使融合蛋白在宿主细胞内表达；裂解细胞得到细胞裂解液；将细胞裂解液与固定了单链DNA的亲和介质接触；洗去杂质；洗脱得到融合蛋白。
这里用到的术语“宿主细胞”包括可以转化并表达SSB融合蛋白的重组表达载体的任何细胞或细胞系。合适的宿主细胞包括(但不局限于)海藻细胞，细菌(如大肠杆菌)，酵母细胞(如出芽酵母，裂殖酵母)，真菌细胞，植物细胞，无脊椎动物细胞(如SF9昆虫细胞等)，以及脊椎动物细胞，包括哺乳动物细胞。例如，表达体系包括在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体。一个用细胞提取物的体外转录翻译体系也可被用于生产SSB融合蛋白。
编码SSB融合蛋白的表达质粒可以通过转染或转化这样的标准技术引入宿主细胞。本发明包含所有可以将核酸引入宿主细胞的常规技术。
本发明的亲和介质包含固定化的单链DNA，作为结合SSB融合蛋白中SSB的配基。配基与介质通过共价或非共价形式结合。介质包括固体(solids)，凝胶(gels)，浆体(pastes)，膜(membranes)或者浆料(slurries)等。合适的基质材料包括(但不局限于)玻璃(glass)，珠子(beads)，孔径可控玻璃(controlled pore glass)，磁珠(magnetic beads)，各种膜或各种刚性多聚树脂如聚苯乙烯(polystyrene)，聚苯乙烯乳剂(po1ystyrene/latex)，以及其它天然或人工合成的有机或无机多聚体。具体来说，多聚体包括聚乙烯，聚丙烯(polypropylene)，聚4-甲基丁烯(poly(4-methylbutene))，聚苯乙烯(polystyrene)，聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)，聚对苯二甲酸乙二酯(poly(ethylene terephthalate))，人造纤维(rayon)，尼龙(nylon)，聚缩丁醛乙烯(poly(vinyl butyrate))，聚偏(二)弗乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)，硅酮(silicones)，聚甲醛(polyformaldehyde)，纤维素(cellulose)，纤维素乙酸酯(cellulose acetate)和硝化纤维。也可使用其它材料如纸、玻璃、矿物、陶瓷、金属、非金属、塑料、半导体材料或水泥。另外，也可以用能形成胶体的物质，包括蛋白(如白明胶gelatins)，脂多糖(1ipopolysaccharides)，硅酸盐(silicates)，琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(polyacrylamides)等。多聚体能形成几种水相，包括(但不局限于)右旋糖苷(dextrans)，聚亚烷基二醇(polyalkylene glycols)以及如磷脂(phospholipids)长链烷基铵盐(1ong chain allkyl ammonium salts)等合适的表面活性剂。
首选的基质材料包括树脂，例如合成树脂(如交联聚苯乙烯(cross-linkedpolystyrene)，二乙烯基苯(divinyl benzene)等)，交联多聚糖(如纤维素，右旋糖苷(sephadex)，琼脂糖，sepharose)等。在特定实施例中，基质材料包括能与SSB形成共价键的活性基团。例如，基质材料包含乙二醛活化的琼脂糖，包含巯基活性基团的材料，或溴化氰活化的基质材料。SSB也可通过交联试剂与琼脂糖树脂连接。这些试剂被精通这些技术的人所熟知，包括碳二亚胺(carbodiimides)，顺丁烯二酰亚胺(maleimides)，琥珀酰亚胺(succinimides，)，还原性二硫键。
本发明的亲和介质可以采用任何通常的形式。例如，亲和介质可以装成柱，微型柱，毛细管，微毛细管或电泳毛细微管(capillary electrophoresis tube)。又如，亲和介质可以在多相溶液中悬浮于某一相。在这种情况下，亲和介质就起了将带标签的分子从多相体系中分隔到特定的相的作用。这样的多相纯化体系对于大体积或高通量的情况非常适用。
在特定实施例中，亲和介质是纤维素。单链DNA通过共价或非共价的方式固定到纤维素上。当单链DNA通过非共价的方式连接到纤维素上时，结合的单链DNA从纤维素的泄露或释放被控制到最小。单链DNA不需要特定序列。若使用双链DNA(如鲑鱼精子DNA)时，首先将其变性得到单链DNA，然后固定到纤维素上，得到单链DNA亲和介质。
在特定实施例中，包含SSB融合蛋白的全细胞裂解液用单链DNA纤维素层析柱进行层析。SSB融合蛋白通过SSB结合到被固定化的单链DNA上，其它蛋白和杂质直接流出柱。结合的SSB融合蛋白只要通过提高盐(KCl或NaCl)浓度就可以洗脱下来。本发明的蛋白纯化过程能天然有效地将外来蛋白或多肽以SSB融合蛋白的形式从细胞杂质中分离纯化。
在特定实施例中，每毫升膨胀的单链DNA纤维素亲和介质至少能够结合12mg融合蛋白。在E.coli中过表达SSB融合蛋白，每升细胞培养物可以得到3至30mg蛋白，不同的目的蛋白在E.coli中过表达的量是不同的。单链DNA纤维素亲和介质在纯化同一蛋白质时可以使用多次，或用1.5M NaCl洗后回收。另外，单链DNA纤维素亲和介质是以干燥的固体状态保存的，因此可以无限期保存，而不丢失结合能力及从杂质中分离SSB融合蛋白的能力。
本发明的另一方面，提供了一类SSB融合蛋白，融合蛋白包含SSB和直接或间接融合的目的蛋白。SSB融合蛋白可以进一步包含一个或多个其它亲和纯化标签，以及用来除去SSB和其它亲和标签的连接片段。SSB融合蛋白可以用表达载体表达，用单链DNA固定化的介质进行纯化，或结合其它上面提到过的镍-琼脂糖等亲和介质进行共同纯化。
若融合蛋白的SSB部分不干扰特定的生化反应，目的蛋白或多肽仍具抗原性和生物功能活性，则本发明中的融合蛋白可以直接用于随后的生化反应。或者，融合蛋白可以通过切割除去SSB部分，得到纯的目的蛋白或多肽。如果需要得到这样的目的蛋白或多肽，可在融合蛋白中的SSB和目的蛋白之间引入可切割的连接片段。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于阐述本发明的一些原理及应用，而不用于限制本发明的范围。
实施例1：表达质粒载体pSSB-B1，B2，B3和B4的构建与表达
设计引物进行聚合酶链反应(PCR)，从噬菌体T7基因组DNA中得到编码T7SSB的DNA片段，插入到表达载体pET28a的Nco1和BamH1位点，得到表达载体pSSB-B1。在pSSB-B1载体中，可被肠激酶识别的连接片段位于SSB标签和BamH1位点之间。表达质粒载体pSSB-B2，B3和B4用相似方法构建。在这四种质粒中，SSB以及肠激酶或凝血酶的切割位点位于pET28a载体的NcoI和BamHI位点之间。另外，在载体pSSB-B3和pSSB-B4中，六组氨酸标签恰好置于SSB的N端。物理图谱和多克隆位点见图1A。这一系列质粒载体用来在E.coli中表达带SSB或者6His-SSB标签的融合蛋白。
实施例2：表达质粒载体pSSB-Y1和Y2的构建
设计引物进行聚合酶链反应(PCR)，从噬菌体T7基因组DNA中得到编码T7SSB的DNA片段，插入到表达载体pSLF1072的XhoI和NotI位点，得到表达载体pSSB-Y1和Y2。在pSSB-Y1中，肠激酶的切割位点位于SSB标签和NotI位点之间；在pSSB-Y2中，凝血酶的切割位点位于SSB和NotI位点之间。另外，在载体pSSB-Y1和pSSB-Y2中，六组氨酸标签恰好置于SSB的N端。物理图谱和多克隆位点见图1B。这一系列质粒载体用来在酵母中表达带SSB或者6His-SSB标签的融合蛋白。
用类似的方法，构建了用于昆虫和人细胞表达带SSB标签的融合蛋白。图1C和图1D显示了这些表达质粒载体。
实施例3：在E.coli中融合蛋白6His-SSB-Sap1和SSB-Fen1的过表达及用单链DNA纤维素层析纯化
Sap1是DNA复制起始相关的必需蛋白，在裂殖酵母中大量存在，分子量约为30kDa。通过PCR反应从裂殖酵母基因组DNA中扩增得到sap1基因的DNA片段，插入到pSSB-B4载体的BamHI和HindIII位点。编码融合蛋白6His-SSB-Sap1的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)pLysS细胞中，得到单克隆。单克隆接到50mL含20μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养过夜。过夜的菌液以1：50到1：100的比例接到新鲜培养基中，在37℃培养至OD590=～0.3。然后加IPTG到0.1mM，诱导3.5小时。然后离心得到细胞，用含0.4M KCl的缓中液A(50mM Tris-HCl，pH7.4，5mM醋酸镁，5mM DTT，1mM EDTA，1mMEGTA，0.04％NP-40，10％甘油)悬浮。超声破碎细胞，37,000g离心30分钟。全细胞提取物，以及随后的细胞裂解液的沉淀和上清用SDS-PAGE检验。图2结果表明：1)6His-SSB-Sap1融合蛋白在细胞蛋白总量中大约占25％；2)6His-SSB-Sap1融合蛋白非常可溶，因此离心后绝大部分在上清组分中。由于Sap1是DNA结合蛋白，用含0.4M KCl的缓冲液A保证Sap1从染色质DNA上分离开来。
用缓冲液A将含6His-SSB-Sap1的上清组分的盐浓度调到0.2M，再进行单链DNA纤维素层析。用含0.2M KCl的缓冲液A洗去不结合的蛋白和其它杂质。然后，结合的融合蛋白6His-SSB-Sap1在盐浓度0.4M KCl时洗脱下来。如图3A所示，单链DNA纤维素层析一步纯化后，根据密度测定法(densitometry)，6His-SSB-Sap1的纯度达到～96％。
为了检测融合蛋白6His-SSB-Sap1是否能通过融合蛋白N端的六组氨酸残基与镍-琼脂糖结合，通过单链DNA纤维素亲和层析纯化的6His-SSB-Saq1进行镍-琼脂糖层析。如图3B所示，6His-SSB-Sap1能够很好地与镍柱结合，在咪唑250mM浓度时洗脱下来。这表明，带6His-SSB标签的融合蛋白可以用两种不同特性的层析柱进行纯化。一种是单链DNA纤维素柱，另一种是镍-琼脂糖柱。通过单链DNA纤维素柱与镍-琼脂糖柱的结合，即使是低含量的6His-SSB融合蛋白，一般也能达到很高的纯度，用于后面的生化分析。
用相似的方法，在pSSB-B1载体的SacI和HindIII位点插入人fen1基因。融合蛋白SSB-Fen1在E.coli BL21(DE3)pLysS细胞中过表达。和融合蛋白6His-SSB-Sap1一样，SSB-Fen1在含0.1M KCl的缓冲液A中也是可溶的。如图4所示，SSB-Fen1能与单链DNA纤维素结合，并在盐浓度0.4M KCl时洗脱下来。同样的，经过单链DNA纤维素层析一步纯化，根据密度测定法(densitometry)，SSB-Fen1的纯度可达到～96％。
为了比较SSB-，GST-和6His-三种融合蛋白分别与单链DNA纤维素，还原型谷胱甘肽-Sepharose4B和镍-琼脂糖的纯化效率，在pET-28a的NheI和EcoRI位点插入编码GST-Sap1的DNA片段GST-Sap1；在pET-28a的NheI和BamHI位点插入编码Sap1的DNA片段Sap1。得到的两种融合蛋白6His-GST-Sap和6His-Sap1都能在E.coli BL21(DE3)pLysS细胞中高表达，并达到细胞总蛋白的～25％。在细胞提取液中，6His-GST-Sap1和6His-Sap1在盐浓度0.4M KCl时都是可溶的。用缓中液A将含6His-GST-Sap1或6His-Sap1的细胞提取液调整到盐浓度0.2M，然后分别进行还原型谷胱甘肽-Sepharose4B或镍-琼脂糖层析。柱子用含0.2M KCl的缓冲液A洗去不结合的蛋白和其它杂质。纯化6His-Sap1时，柱子用含0.2MKCl和20mM咪唑的溶液A洗。结合的6His-GST-Sap1先用10mM还原型谷胱甘肽洗脱，残留的6His-GST-Sap1用0.5％SDS洗脱。如图5所示，GST-Sap1的纯度在用10mM还原型谷胱甘肽和0.5％SDS洗脱时，纯度分别达到了～20％和～70％。图6的结果表明，6His-Sap1在咪唑浓度250mM时洗脱下来，纯度达到了～70％。如图3A所示，单链DNA纤维素层析纯化后，6His-SSB-Sap1融合蛋白的纯度达到了～96％。如图2所示，E.coli细胞中6His-SSB-Sap1，6His-GST-Sap1和His-Sap1的表达水平大致相当，但在单链DNA纤维素，还原型谷胱甘肽-Sepharose4B层析和镍-琼脂糖亲和层析后，这三种融合蛋白明显达到了不同的纯度，其中6His-SSB-Sap1纯度最高。
实施例4：人细胞、昆虫细胞和裂殖酵母细胞中SSB-Sap1的过表达及用单链DNA纤维素亲和柱层析纯化
重组质粒用常规步骤构建，这些质粒分别在人细胞、昆虫细胞和裂殖酵母细胞中过表达SSB-Sap1融合蛋白。得到包含SSB-Sap1的细胞提取物，再过单链DNA纤维素柱。图7，8和9的结果显示，SSB-Sap1的表达量在上述三种表达体系的全细胞蛋白中的比例小于或约等于1％。在人细胞、昆虫细胞或酵母细胞中过表达的SSB-Sap1都是可溶的，能结合单链DNA，在盐浓度0.2至1.0M KC1时洗脱下来。通过单链DNA纤维素层析，在人细胞、昆虫细胞或酵母细胞中过表达的SSB-Sap1纯度分别达到了～70％，～80％和～90％。
实施例5：SSB融合蛋白中SSB的切除
100μg6His-SSB-Sap1蛋白加1单位的凝血酶在含0.1M KCl和2.5mM CaCl2的缓冲液A中室温温育2到5小时。如图10所示，6His-SSB-Sap1融合蛋白能被凝血酶充分酶解，6His-SSB通过镍-琼脂糖层析除去。
类似的，十数种SSB融合蛋白在大肠杆菌，酵母，昆虫或人细胞中过量表达。无论目的蛋白或多肽来自原核细胞或真核细胞，这些SSB融合蛋白都具有很好的可溶性。过量表达的SSB融合蛋白进行单链DNA纤维素层析，都能较好地与单链DNA纤维素结合，表明目的蛋白或多肽上融合的SSB保持了结合单链DNA的能力，目的蛋白或多肽不会在空间上阻碍SSB与单链DNA的结合，从而保证了SSB融合蛋白在进行单链DNA纤维素亲和层析时可以与其它杂质很好地分开。
在设计表达质粒载体时，所有SSB融合蛋白的SSB和目的蛋白之间插入了一个酶切割位点。由于这个切割位点，可以得到不含SSB的目的蛋白或多肽。所有纯化得到的SSB融合蛋白是凝血酶或肠激酶等进行专一性切割的好底物。更佳的，选择的蛋白酶不会对SSB或目的蛋白本身进行切割。切割后，SSB可以用单链DNA纤维素除去，如果六组氨酸残基融合在SSB的N端，还可以用镍-琼脂糖除去。
由于融合蛋白结合了表达量高，可溶性好，纯化效率高，以及酶切位点专一的特点，pSSB载体将是一个表达和纯化目的蛋白和多肽的强大体系。
本发明用实施例进行了描述，应理解，这些实施例仅用于阐述目的，而不用于限制本发明范围。熟知本发明包含的技术的人应该很容易将本发明扩展于其它实施例。应当认为，这些替代实施例也属于本发明的范围。相应地，本发明的范围将在所附权力要求书中定义并进一步描述。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (18)

1.表达载体，其特征在于，它包含启动子和编码融合蛋白的核苷酸序列；其中表达融合蛋白的核苷酸序列与启动子连接，使编码融合蛋白的核苷酸序列的转录受启动子的控制；其中融合蛋白包含一个单链DNA结合蛋白以及直接或间接融合于该单链DNA结合蛋白的C端或N端的目的蛋白或多肽链；该融合蛋白能够结合单链DNA。 
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述单链DNA结合蛋白是T7噬菌体的单链DNA结合蛋白。 
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述单链DNA结合蛋白来自于噬菌体、细菌、古细菌、嗜热菌、病毒、酵母或多细胞生物的真核细胞。 
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述单链DNA结合蛋白来自于编码具有单链DNA结合能力的多肽链的人造多核苷酸序列。 
5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述融合蛋白包含一个或多个纯化标签，所述纯化标签包括多组氨酸残基或谷胱甘肽-S-转移酶。 
6.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述目的蛋白或多肽链通过一个可切割的片段与单链DNA结合蛋白连接。 
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述可切割片段能被位点专一性蛋白酶切割。 
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述可切割片段能被肠 激酶、凝血酶、凝血因子Xa或凝乳酶切割。 
9.一种纯化目的蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤： 
将表达载体转入宿主细胞，其中表达载体包括启动子和与之恰当连接的编码融合蛋白的多核苷酸序列，该融合蛋白包括单链DNA结合蛋白以及直接或间接融合于单链DNA结合蛋白的N-端或C-端的目的蛋白或多肽链，该融合蛋白具有结合单链DNA的能力； 
培养宿主细胞，使融合蛋白表达； 
裂解宿主细胞得到细胞裂解液； 
细胞裂解液与固定了单链DNA的介质接触，使融合蛋白结合到该介质的单链DNA上； 
洗介质除去杂质； 
将介质上的融合蛋白洗脱下来； 
这样目的蛋白就以融合蛋白的形式得到表达及纯化。 
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白通过一个可切割的片段与单链DNA结合蛋白融合。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述可切割片段能被位点专一性蛋白酶切割。 
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述可切割片段能被肠激酶、凝血酶、凝血因子Xa或凝乳酶切割。 
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。 
14.一种融合蛋白，其特征在于，它包含单链DNA结合蛋白以及直接或间接融合于单链DNA结合蛋白C端或N端的目的蛋白或多肽，所述融合蛋白具有与单链DNA结合的能力。 
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其特征在于，它包含一个位于单链DNA结合蛋白和目的蛋白之间的可切割片段，所述可切割片段上有切割位点，能分割开单链DNA结合蛋白和目的蛋白。 
16.根据权利要求15所述的融合蛋白，其特征在于，所述可切割片段可以被位点专一性蛋白酶切割。 
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其特征在于，所述可切割片段能被肠激酶、凝血酶、凝血因子Xa或凝乳酶切割。 
18.根据权利要求14所述的融合蛋白，其特征在于，它连接或内置了纯化标签。 
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