CN102586437B - Ccdc72基因及其表达产物在制备诊断及治疗卵巢癌制剂中的应用 - Google Patents
Ccdc72基因及其表达产物在制备诊断及治疗卵巢癌制剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属分子生物学特别是基因诊断领域，提供一种新的卵巢癌诊断标志物和药物治疗靶点，具体涉及CCDC72基因及其表达产物作为肿瘤标志物和药物疗靶点以及基于CCDC72及其表达产物的应用。该应用比现有技术检测省时、灵敏度与准确度更高、成本更低、和/或更高效。另外，本发明还提供了用于这些应用的试剂盒以及引物对等。
Description
技术领域
本发明属分子生物学特别是基因诊断领域，具体涉及一种新的肿瘤相关抗原CCDC72基因及其表达产物和在制备诊断和治疗卵巢癌制剂中的应用。
背景技术
研究显示，在女性生殖器官的恶性肿瘤中，卵巢癌其发病率居第三位，病死率居于首位。卵巢癌是一种形态学和生物学上均具有异质性的疾病，其分型繁多，同时其发生发展及转移是一个涉及多基因、多信号通路调控的网络体系。据报道，目前全世界每年约有二十万以上的妇女饱受卵巢癌折磨。尽管已有很多研究表明，不同亚型的卵巢癌分子机制分析差异明显，但目前临床上仍将不同亚型的卵巢癌作为一个单一的整体诊断和治疗，这无疑会降低诊断的敏感性和治疗的有效性。临床实践显示，卵巢癌患者普遍存在复发率高、5年生存率低的状况，而该疾患起病隐匿且缺乏有效准确的诊断标志物是重要影响因素。目前临床上诊断卵巢癌的三种主要的传统的检查方法，即：结合临床表现进行盆腔检查、经阴道超声检查、血清检测CA125水平各具优势，但均存在局限性和缺陷。免疫组化染色诊断成为重要的辅助诊断方法。因此，迫切需要寻找一种能够早期诊断卵巢癌的标志物及有效的靶向治疗方法。
现有技术公开了CCDC72(coiled-coil domain containing-72)基因，最初是从体外凝集性生长状态下的毛乳头细胞(DPC)中筛选并克隆出的一种造血干细胞分化相关基因，其产物为7.06kKD小分子可溶性蛋白。该基因在人体多种组织器官中表达，特别是一些新陈代谢旺盛的组织，如皮肤、肿瘤、淋巴组织等。这种分布特征提示，该基因可能与细胞增殖、分化有关。
目前，有关CCDC72的研究极少，其生物学功能不甚明确。迄今为止，仅有研究显示，RNA干扰技术使CCDC72基因在毛乳头细胞(DPC)中的表达减弱或消失后，DPC生长速度明显减慢，细胞失去凝集性生长特性，CCDC72重组蛋白可促进DPC的增殖及DNA合成。尚未见有关CCDC72基因在上皮性卵巢癌中的表达和功能的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的卵巢癌诊断标志物和药物治疗靶点，具体涉及CCDC72基因及其表达产物作为肿瘤标志物和药物疗靶点以及基于CCDC72及其表达产物的应用。该应用比现有技术检测省时、灵敏度与准确度更高、成本更低、和/或更高效。
另外，本发明还提供了用于这些应用的试剂盒以及引物对等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了CCDC72基因及其表达产物可作为肿瘤标志物和药物治疗靶点。
本发明中：
1，采用免疫组织化学方法检测CCDC72在卵巢组织中的表达，结果显示：CCDC72的表达与卵巢组织的恶性程度有关，恶性程度越高，CCDC72表达越高；CCDC72的表达与不同卵巢癌的组织学分型有关，CCDC72在黏液性腺癌中的阳性表达率为42.4％(14/33)，明显低于浆液性腺癌的阳性表达率96.4％(106/110)和子宫内膜样腺癌的阳性表达率88.9％(56/63)，差异具有统计学意义(P＜0.001)。
2，检测不同组织学来源的卵巢癌细胞系中CCDC72 mRNA水平，结果显示，CCDC72在不同的细胞系中表达具有差异性，其中浆液性腺癌细胞系普遍高表达CCDC72，尤其是SKOV3ip细胞系。
3，采用RNA干扰技术检测CCDC72对卵巢癌细胞凋亡的影响，结果显示，与阴性对照组(NC)相比，siRNA-1、siRNA-2分别转染SKOV3ip及OVCA433细胞48h，干扰效率均可达到50％及以上，SKOV3ip细胞系的干扰效果优于OVCA433细胞；采用Annexin V-FITC/PI染色细胞流式方法检测CCDC72基因对细胞凋亡的作用，结果证实，siRNA-1组与siRNA-2组细胞凋亡率均明显升高，差异具有统计学意义。
4，检测CCDC72对卵巢癌细胞周期的影响，结果显示，与NC组相比，CCDC72siRNA-1、siRNA-2组的细胞数在G0/G1、S期增多，G2/M期降低，结果表明，干扰CCDC72基因后会诱导SKOV3ip细胞阻滞在G0/G1、S期，促进细胞凋亡。
5，检测CCDC72对卵巢癌细胞增殖能力的影响，结果表明，干扰CCDC72基因在卵巢癌细胞中的表达可以抑制卵巢癌细胞的生长。
6，检测CCDC72对卵巢癌细胞信号转导通路的影响，结果显示，干扰组与对照组相比，Src的表达无明显改变，但磷酸化的Src表达明显减弱；24h后对照组、干扰组出现p-Src的变化，而48h后则无明显改变，FAK/p-FAK、Akt/p-Akt、Erk1/2/p-Erk1/2的变化与Src/p-Src相似。
本发明的试验结果表明，CCDC72在卵巢癌中高表达且在不同组织学类型的卵巢癌中表达不同，CCDC72可作为具有较高灵敏度与准确度的肿瘤诊断标志物，有效地提高不同亚型卵巢癌的诊断水平。
在第二方面，本发明提供了用于免疫检测用的CCDC72检测试剂盒、基因诊断用的荧光定量PCR试剂盒，和其他类型的诊断试剂或方法用于肿瘤、基因检测或细胞学研究，如分子生物学试剂：RT-PCR、生物芯片等；基于CCDC72的单克隆或多克隆抗体的试剂与方法：ELISA、流式细胞计数、Western-Blot等。所述试剂盒中，其包括基于CCDC72基因序列的特异性探针与引物对。试剂盒中各成分都是分离放置的。
所述的的试剂盒还可以包含纯化的兔抗人CCDC72单克隆抗体加生物素标记的羊抗兔二抗，加链亲和素标记的辣根过氧化物酶与底物3，3，-二氨基联苯胺(DAB)等成分。
本发明第三方面基于上述基因功能实验结果，CCDC72具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用，表明CCDC72可以作为卵巢癌治疗的新的靶标，基于此，进一步构建RNA干扰系统，或作为肿瘤药物筛选的靶分子制备药物，或构建针对该基因的基因表达调控系统等用于治疗卵巢癌。
本发明经实验证实，CCDC72基因可以有效地促进卵巢癌细胞增殖、抑制癌细胞凋亡，可作为一种有效的诊断标志物及治疗的靶标基因。具体的，CCDC72基因可作为卵巢癌及其不同组织学亚型诊断的标志基因，包括各种免疫组化诊断方法，原位杂交，RT-PCR，病理诊断及早期诊断方面的应用；CCDC72基因可作为卵巢癌癌基因治疗及药物筛选靶标的应用。本发明用于诊断具有特异性高，检测准确性高的优点；用于肿瘤药物筛选靶分子，具有靶标明确的优点。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和具体实施方式对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。
附图说明
图1显示了CCDC72在不同类型卵巢组织中的表达情况，其中，
图1A：免疫组织化学方法检测CCDC72在不同卵巢肿瘤中的表达；图1B：CCDC72在卵巢癌中高表达，在不同亚型的卵巢癌中红表达不同；图1C：将265例不同卵巢组织分别按照年龄、手术病例分期、病理分级、良恶性肿瘤及恶性肿瘤的不同组织学亚型分类，进行统计学分析，列表。
图2显示了CCDC72在八株不同组织学亚型来源的卵巢癌细胞系中mRNA的表达情况，
其中，细胞从左到右依次是：浆液性(SKOV3ip、SKOV3、OVCA433、OVCA439)，黏液性(RMUG-S，3AO)，子宫内膜样(TOV112D)，透明细胞性(ES2)。CCDC72在浆液性腺癌细胞系表达普遍偏高，尤其是SKOV3ip细胞
图3显示了CCDC72对卵巢癌细胞凋亡的作用，
其中，图3A：在SKOV3ip和OVCA433细胞中，与NC相比，siRNA有效的干扰了CCDC72的表达；图3B：对3A的柱形图和统计分析；图3C：Annexin V/PI细胞流式凋亡实验证实，与NC相比，CCDC72-siRNA促进了细胞的凋亡。
图4显示了CCDC72对卵巢癌细胞的细胞周期分布的影响，
其中，包括细胞流式仪对三组实验组的细胞周期分期的分析，及数据柱形图和统计分析。
图5显示了CCDC72对卵巢癌细胞增殖能力的作用，
其中，经CCK8实验测定，SKOV3ip和OVCA433细胞的CCDC72 siRNA组与NC组相比，24h，48h，72h，96h后，生长速率均明显降低。
图6显示了CCDC72对细胞信号转导通路的影响，
其中，Western-blotting法测定，siRNA组相比NC组，p-Fak、p-Src、p-Akt、p-Erk1/2表达均减弱，且24h即出现变化。
具体实施方式
本发明将通过具体的实施例来进行示例性的说明，其中，如有未尽之处，可参见《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，北京)等实验手册以及市售的试剂和仪器的使用说明。
本发明所述的CCDC72基因序列为根据Genbank登录号NM015933.3所示的序列。
本发明所述的细胞系均为本领域公知渠道市购。
实施例1
1)检测CCDC72在卵巢组织中的表达情况
收集离体的卵巢组织265例，其中，包括24例正常卵巢组织和241例卵巢肿瘤组织(110例浆液性腺癌，33例黏液性腺癌，63例子宫内膜样腺癌，5例移行细胞癌，22例良性肿瘤，8例交界性上皮性肿瘤)，采用免疫组织化学方法检测CCDC72的表达，结果显示：CCDC72的表达与卵巢组织的恶性程度有关，恶性程度越高，CCDC72表达越高；CCDC72的表达与不同卵巢癌的组织学分型有关，CCDC72在黏液性腺癌中的阳性表达率为42.4％(14/33)，明显低于浆液性腺癌的阳性表达率96.4％(106/110)和子宫内膜样腺癌的阳性表达率88.9％(56/63)，差异具有统计学意义(P＜0.001)。
2)检测CCDC72在卵巢癌细胞中的表达：
检测不同组织学来源的卵巢癌细胞系中CCDC72 mRNA水平，其中：浆液性：SKOV3ip，SKOV3，OVCA439，OVCA433；黏液性：RMUG-S，3AO；子宫内膜样：TOV112D；透明细胞：ES2，结果显示，CCDC72在不同的细胞系中表达具有差异性，其中浆液性腺癌细胞系普遍高表达CCDC72，尤其是SKOV3ip细胞系。
3)检测CCDC72对卵巢癌细胞凋亡的影响：
采用目前常用的基因功能研究方法的RNA干扰技术，通过siRNA干扰高表达CCDC72的细胞系SKOV3ip和OVCA433，用Negative-control、siRNA-1、siRNA-2分别转染SKOV3ip和OVCA433，24h、48h、72h后，定量real-time PCR检测干扰效果，结果显示，与阴性对照组(NC)相比，siRNA-1、siRNA-2分别转染SKOV3ip及OVCA433细胞48h，干扰效率均可达到50％及以上，SKOV3ip细胞系的干扰效果优于OVCA433细胞；进一步采用了Annexin V-FITC/PI染色细胞流式方法检测CCDC72基因对细胞凋亡的作用，结果证实，与NC相比，siRNA-1组与siRNA-2组细胞凋亡率均明显升高，差异具有统计学意义。
4)检测CCDC72对卵巢癌细胞周期的影响：
用negative-control RNA、CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2转染SKOV3ip细胞48h小时后，收集细胞流式分析，结果显示，与NC组相比，CCDC72 siRNA-1、siRNA-2组的细胞数在G0/G1、S期增多，G2/M期降低，结果表明，干扰CCDC72基因后会诱导SKOV3ip细胞阻滞在G0/G1、S期，促进细胞凋亡。
5)检测CCDC72对卵巢癌细胞增殖能力的影响：
分别将negative control-siRNA，CCDC72 siRNA-1，CCDC72 siRNA-2转染入SKOV3ip和OVCA433细胞系，接种于96孔板，5000细胞/孔，分别培养24h、48h、72h、96h后，用CCK8法检测细胞生长速率，结果显示，在SKOV3ip细胞系中，阴性对照组的细胞生长速率随着时间的延长不断增加，而siRNA-1组的细胞数在24h、48h、72h中不断降低，96h升高，siRNA-2组的细胞数变化趋势与1组相似；在OVCA433细胞系中，三组实验组的细胞数均随着时间的延长而不断增加，但两组CCDC72干扰组细胞增长速率低于阴性对照组，结果表明，干扰CCDC72基因在卵巢癌细胞中的表达可以抑制卵巢癌细胞的生长。
6)检测CCDC72对卵巢癌细胞信号转导通路的影响
western-blotting检测SKOV3ip细胞三个实验组negative-control siRNA、CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2转染24h、48h后FAK、Src、Akt、Erk1/2的蛋白表达，结果显示，两组干扰组与NC组相比，Src的表达无明显改变，但磷酸化的Src表达明显减弱；24h后NC组、siRNA-1组、siRNA-2组即出现p-Src的变化，而48h后则无明显改变，FAK/p-FAK、Akt/p-Akt、Erk1/2/p-Erk1/2的变化与Src/p-Src相似。
试验结果表明，CCDC72在卵巢癌中高表达且在不同组织学类型的卵巢癌中表达不同，CCDC72可作为具有较高灵敏度与准确度的肿瘤诊断标志物，CCDC72具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用，表明CCDC72可以作为卵巢癌治疗的新的靶标。
实施例2制备CCDC72检测试剂盒
按常规方法制备CCDC72检测试剂盒，其中采用纯化的兔抗人CCDC72单克隆抗体加生物素标记的羊抗兔二抗，再通过加链亲和素标记的辣根过氧化物酶与底物3，3，-二氨基联苯胺(DAB)的显色反应可来鉴别诊断不同病理类型的卵巢癌及不同组织学亚型的卵巢癌。
实施例3制备诊断CCDC72用的荧光定量PCR试剂盒
根据CCDC72核苷酸序列设计特异性探针，核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得；其中对于PCR扩增法，根据公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，用cDNA库作为模板，扩增而得有关序列；重组法中，用来大批量地获得有关序列，将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列；核酸探针与扩增的标记序列接触，该探针优选连接到一种发色团，但可被放射标记，探针也可连接到一种结合伴侣上，如抗体或生物素，或另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。
设计及合成表达siRNA(small interfering RNA)的化学片段：
化学合成siRNA干扰目的基因：
选择CCDC72的特定序列，分别设计
negative-control RNA：sense-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，
antisense-ACGUGACACGUUCGGAGAATT；
CCDC72 siRNA-1：sense-CCUUGGCCACAGGUGGAAUTT；
antisense-AUUCCACCUGUGGCCAAGGTT；
CCDC72 siRNA-2：sense-CCCUUUAUUUCAUCUGUAUTT；
antisense-AUACAGAUGAAAUAAAGGGTT.
用Negative-control RNA、CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2分别转染SKOV3ip和OVCA433细胞24h、48h、72h后，定量real-time PCR检测CCDC72 mRNA表达。结果显示，在SKOV3ip细胞中，与阴性对照(NC)相比，siRNA-1分别降低73.1％、76.2％、76.4％的CCDC72 mRNA表达；siRNA-2分别降低41％、46.2％、54.5％的CCDC72 mRNA表达；在OVCA433细胞中，与NC相比，siRNA-1分别降低26.6％、55.2％、43.9％的CCDC72 mRNA表达；siRNA-2分别降低46.2％、65.6％、47.8％的CCDC72 mRNA表达；结果表明，CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2分别转染SKOV3ip及OVCA433细胞干扰效率均可达到50％及以上。
实施例4
采用CCDC72检测试剂盒对265例样本进行免疫组化染色，用纯化的兔抗人CCDC72单克隆抗体加生物素标记的羊抗兔二抗，再通过加链亲和素标记的辣根过氧化物酶与底物3，3，-二氨基联苯胺(DAB)的显色反应。免疫组化染色结果分析显示，CCDC72在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤、交界性上皮性卵巢肿瘤、恶性上皮性卵巢癌中的阳性表达率逐渐升高，且在不同组织学亚型的上皮性卵巢癌中表达具有差异性，浆液性腺癌中表达最高；CCDC72在上皮和间质的表达呈现出规律的负性相关
实施例5
采用诊断CCDC72用的荧光定量PCR试剂盒检测八种不同组织学来源的卵巢癌细胞系(浆液性：SKOV3ip，SKOV3，OVCA439，OVCA433；黏液性：RMUG-S，3AO；子宫内膜样：TOV112D；透明细胞：ES2)中CCDC72 mRNA水平，结果显示，CCDC72在八种卵巢癌细胞系中均有不同程度的表达，经18S内参标准化后，CCDC72mRNA的相对表达量在SKOV3ip(7.53)中最高，其次分别为SKOV3(2.2)、ES2(2.0)、OVCA433(0.94)、OVCA439(0.54)、TOV112D(0.5)、3AO(0.48)，在RMUG-S(0.34)中最低，与黏液性来源的细胞系相比，浆液性卵巢癌细胞系高表达CCDC72，尤其是SKOV3ip细胞系，统计学分析检测，各组间的mRNA表达差异均具有统计学意义。
实施例6检测CCDC72对卵巢癌细胞凋亡、增殖的影响
采用Annexin V-FITC/PI染色细胞流式方法检测细胞凋亡情况，其中Annexin V-/PI-染色代表活细胞；Annexin V+/PI-染色代表早期凋亡的细胞；Annexin V+/PI+染色代表细胞晚期凋亡或坏死细胞，结果显示，在SKOV3ip和OVCA433细胞系中，siRNA-1、siRNA-2组与阴性对照组(NC)相比，细胞凋亡率均明显升高，差异具有统计学意义。
采用细胞流式术检测干扰CCDC72基因后对卵巢癌细胞SKOV3ip细胞周期分布的影响，用negative-control RNA、CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2转染SKOV3ip细胞48h小时后，收集细胞流式分析，结果显示，与NC组相比，CCDC72siRNA-1、siRNA-2组的细胞数在G0/G1、S期增多，G2/M期降低，结果表明，干扰CCDC72基因后使诱导SKOV3ip细胞阻滞在G0/G1、S期，促进细胞凋亡。
细胞计数实验(cell counting kit-8 assay)检测CCDC72基因对SKOV3ip和OVCA433细胞增殖活性的影响，实验分为三组：阴性对照(NC)组、CCDC72siRNA-1组、CCDC72 siRNA-2组，结果显示：SKOV3ip和OVCA433细胞的两组干扰组与NC组相比，生长速率均明显降低；在SKOV3ip细胞系中，NC组的细胞生长速率随着时间的延长(24h、48h、72h、96h)不断增加，而干扰组的细胞生长速率在24h、48h、72h中不断降低，96h后升高；在OVCA433细胞系中，三组的细胞生长速率均随着时间的延长而不断增加，但两组干扰组细胞增长速率低于阴性对照组，结果表明，干扰CCDC72基因在卵巢癌细胞中的表达可以抑制卵巢癌细胞的生长，统计学检验，组间差异具有统计学意义。
分别用negative-control RNA、CCDC72 siRNA-1、CCDC72 siRNA-2转染SKOV3ip细胞24h、48h后，收集细胞蛋白，western-blotting检测FAK、Src、Akt、Erk1/2的蛋白表达，结果显示，两组干扰组与NC组相比，Src的表达无明显改变，但磷酸化的Src表达明显减弱；24h后NC组、siRNA-1组、siRNA-2组即出现p-Src的变化，而48h后则无明显改变，FAK/p-FAK、Akt/p-Akt、Erk1/2/p-Erk1/2的变化与Src/p-Src相似，结果表明，CCDC72能通过Src/Fak、Akt、Erk1/2信号通路途径影响卵巢癌细胞的增殖、凋亡。
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