KR930002887B1

KR930002887B1 - 세균에서 추출되는 효소 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR930002887B1
Application number: KR1019870700019A
Authority: KR
Inventors: 모린 소렌; 지브스코브 미카엘; 리이제 에릭
Original assignee: 에이/에스 알프레드 벤존; 피터 라우르센
Priority date: 1985-05-10
Filing date: 1986-05-09
Publication date: 1993-04-12
Also published as: DE229866T1; DK9787A; ATE83264T1; EP0229866A1; DK173445B1; DE3687266D1; ES557687A0; ES8801946A1; FI870052A0; AU5910086A; CN1008377B; DE3687266T2; ES554856A0; AU3679389A; KR880700069A; EP0229866B1; CN86104387A; WO1986006743A1; FI870052A; CA1327328C

Abstract

내용 없음.

Description

세균에서 추출되는 효소 및 그 제조방법

[도면의 간단한 설명]

제 1 도는 선형 제한 효소와 마르세신스(Serratia marcescens) W255의 뉴클리아제 유전자(Nuc)를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드 pNU121-nuc⁺의 유전자 지도이며 사용된 기호들은 다음과 같이 설명된다 :

구조 유전자 ■ ○^→프로모터 AP=앰피실린 저항성 : Tc=테트라사이클린 저항성 : C₁=λ억제유전자 : λ_pR=λ프로모터, P=Pst I : E1=EcoR I, E5=EcoRV : F2=FnuCII

제 2 도는 이. 클라이의 엑스-프레스(X-PRESS)용해물을 뉴클리아제로 처리한 후 시간에 따라 상대점도를 측정한 것이다.

y축 : 상대점도(기준치로는 0℃에서의 물의 점도) x축 : x-PRESS 용해후 0℃에서의 배양시간.

제 3 도는 이. 콜라이의 프렌치프레서(French Press) 용해물을 뉴클리아제로 처리한 후 시간에 따라 상대점도를 측정한 것이다.

y축 : 상대점도(기준치로는 0℃에서의 물의 점도) x축 : 프렌치 프레스 용해후 0℃에서의 배양시간.

제 4 도는 이. 클라이의 프렌치프레스 용해물을 뉴클리아제로 처리한 후 시간에 따라 살펴본 것이다.

좌측의 숫자는 세포용해 전이나 후에 첨가된 뉴클리아제(U/ml)의 농도를 나타낸 것으로 시료를 6종류로 만들어 각각 실험했다.

프렌치 프레스에서 나온 시간을 0으로 하여 0-70분까지 점도를 측정했다.

기호에 대한 설명은 그림칸에 있으며(0℃에서의 물을 기준치로 한)상대점도 0℃에서 70분과 15시간 배양한 후 측정했다.

제 5 도는 상대점도(기준 : 0℃물)(y축), 뉴클리아제 농도(x축)와 0℃에서의 배양시간과의 관계를 나타내주고 있다. 제 4 도의 결과를 그래프로 나타낸 것이며 x축은 log-단위를 사용했다.

제 6 도는 점도가"수성"인 것으로 측정되었을때의 분해불에 잔류하는 분해되지 않은 핵산을 한천젤 전기 영동법으로 분리한 그림이다.

시료들은 제 4 도에서 분해물을 취한 것이다.

제 7 도의 7a와 7b는 모두 세라티아 W255의 뉴클리아제 유전자를 가지고 있는 1.3Kb DNA단편(제 1 도의 F2-단편)의 염기 서열을 나타낸다.

제 8 도는 선형 제한 효소와 4.5Kb 벡터 pNU121 포스포리파아제 오페론 유전자를 가지고 있는 3.2Kb 세라티아 Al DNA 삽입체를 보여주는 그림이다.

○^→는 유전자의 프로모터와 전자 방향을, ■는 구조 유전자를 나타내며, Ap와 Tc는 각각 앰피실린과 테트라 사이클린에 대한 저항성을 나타내는 기호이다.

C1은 λ억제 유전자이며 제한 효소들은 다음과 같다 : E₁=EcoR I, E₅=EcoRV, P=Pst I, Sa=Sal I, Sm=Sma K, N=Nar I, H₃=HindIII, Bc=CclII, Ba=BamH I

제 9 도는 9a와 9b가 모두 포스포리파아제(phl) 유전자를 가지고 있는 3.2Kb 세라티아 Al DNA 중에서 1.6Kb의 DNA 염기 서열이다.

몇몇 제한효소가 작용하는 위치가 표시되어 있고, 줄이쳐진 CAP 부분은 추정상의 카타보라이트 액티베이터(catabolite activator) 결합위치이며 포스포리파아제 유전자의 제한 조절 구역인 S. D.는 리보좀 결합 위이에 대한 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno)상동성을 나타낸다.

유전자는 416에서 시작하여 1372에서 끝난다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 세균성 효소(즉, 세균에서 만들어지는 효소)의 제조방법, 하이브리드 플라스미드(hybrid plasmid) 및 이 방법에 이용되는 미생물에 관한 것이다.

더 나아가서는 유전자 발현을 시작하는데 유용한 억제조절 구역 뿐만 아니라 세균성 효소중의 하나인, 생체 물질에서 핵산을 제거하는 뉴클리아제(neclease)의 이용과도 관련이 있다.

세라티아(Serratia) 세균들은 배지로 분비되는 수많은 가스분해 효소들을 만들어 내는 것으로 밝혀졌다.

이는 단백질(효소들)이 배지보다는 패리플라스믹 스페이스(periplasmic space)로 분비되는 다른 그람-음성 세균들과 다른 점이다.

페리플라스믹 스레이스에 존재하는 이러한 단백질을 세포가 번식을 왕성하게 하여 균체 밀도가 매우 높아지면 배지로 빠져나가는 경향이 있다.

본 발명에 따르면 세라티아의 세포의 효소들(즉 세라티아에서 발현될때 세포외로 분비되는 효소들)을 생산하도록하는 DNA가 분리되었으며 유전자생산물(효소)의 대량 생산과, 세라티아 DNA를 이식받는데 적당한 미생물이 있어 이것이 성장하여 세라티아가 만들어내는 효소들을 생산하는 것으로 밝혀졌다.

세라티아의 세포의 효소들을 만들어내도록 하는 DNA를 가지고 있는 하이브리드 플라스미드가 보통은 자신의 유전자 생산물을 배지로 분비하지 않는 다른 미생물에 이식되어 존재할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

즉 이. 콜라이(E.coli)에서는 세라티아 효소가 이. 콜라이에 의해 배지로 분리된다(실시예 1과 6).

그러므로 비교적 간단한 방법으로 배지로 분비되는 세라티아 효소를 이. 콜라이로부터 부분적으로 정제할 수 있다.

여과법으로 이. 콜라이를 제거하고 황산 암모늄을 이용하여 여과물에서 효소를 침전시키는 방법을 이용하면 된다.

본 보고서에서 '분비'라는 말은 적어도 세포의 세포막을 통해 유전자 산물이 수송되는 것을 의미하는 말로 이해되어야 한다.

그러므로 본 발명은 또한 배지에서 배양법을 포함하여 세균에서 추출하는 효소의 제조방법과, 세라티아 세포의 효소를 만들어 내도록 하는 세라티아 DNA를 지닌 하이브리드 플라스미드를 이식받는 미생물 및 배양액에서 효소를 회수하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로 말해 본 발명은 세균성 단백질이 하나도 오염되지 않은 채로 세라티아 효소들을 제조하는 방법에 관한 것으로 미생물이 배지로 분비해 낸 효소를 배지에서 회수하는 것이다.

미생물 배양은 영양분과 미생물의 최적 성장에 필요한 무기물이 포함된 액체 배지에서 하는 것이 좋다.

효소의 회수는 알려진 방법대로 할 수 있다.

위에서도 언급했듯이 효소의 정제는, 일단 여과법으로 미생물을 제거한 다음 여액으로 뉴클리아제를 침전시키는 방법으로 이루어질 수 있다.

대개는 침전물이 예를들어 Tris-EDTA와 같은 적당한 완충용액에 용해되므로 투석으로 침전제를 제거한다.

세라티아에서 만들어지는 가수분해 효소들어 나열해보면, 핵산을 가수분해 하여 뉴클리오티드(uncleotide)나 올리고뉴클리오티드(oligo nucleotide) 혹은 작은 핵산 단위를 만들어 내는 뉴클리아제와 지질, 인지질에서 지방산을 가수분해하는 리파아제(lipase), 포스포리 피아제(phospholipase)가 있다.

매생물의 전형적인 것은 세균이며 그 중에서고 그람-음성 세균이다.

세라티아는 때로 독성 세균으로 작용하므로 그 이용성에 제한이 있으므로 따라서 세라티아 효소들을 제조하는데는 부적당하다.

게다가 우리가 원하는 생산물을 오염시키고 분해시키는 프로테아제(protease : 단백질 분해 효소)를 세포외로 분비하므로 더욱 더 적당치 못하다.

그러므로 세라티아 효소들을 생산하기 위해서 이용되는 그람-음성 세균은 일반적으로 이. 콜라이 이다.

본 발명은 또한 위에서도 언급했듯이 세라티아의 세포의 효소를 만들도록 하는 DNA를 지니는 하이브리드 플라스미드에 관한 것이다.

본 발명에 나타난 효소들을 생산하기 위한 벡터로서 유용한 플라스미드는 이식 받는 미생물에서 복제할 수 있는 것이면 된다.

문제가 되고 있는(관심이 되고 있는)효소를 다량으로 만드는데 이용되는 플라스미드는 보통 런어웨이(run away)플라스미드라고 부르는데 이는 복제 동작이 통제되지 않는 플라스미드이다.

이러한 플라스미드는 미국특허 제 4,495, 287호와 유럽 특허 출원, 공보 제 0109150호에서 밝혀진 바 있다. 세균성 뉴클리아제는 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 균주의 발효로 만들어진 산물과 같은 미생물 발효에 의해 제조된 단백질 산물을 정제하여 원래는 문제의 균주 세포와 별 관련이 없던 산물을 만들어 낸다는 점에서 상당한 가치가 있다.

이러한 산물의 정제 과정에서 중요한 단계는 그 균주의 핵산에서 단백질을 분리하는 것이다. 정제과정에서 핵산을 침전시키는 화학적 처리를 하면 분리를 어렵게 만드는, 원하는 산물을 포함하는 물질의 높은 점도 때문에 원하는 산물이 소실될 위험이 있으나 뉴클리아제를 사용하여 핵산을 분해 하면 원하는 산물에는 아무런 해도 없게 된다.

산물이 특히 사람에게 사용될 목적일때는 효율적이고 완전하 핵산의 제거가 매우 중요하다. 즉 몇몇 나라의 건강 당국에서는 문제의 산물을 생산하는데 사용된 세포의 재조합 DNA가 산물에 전혀 들어있지 않아야 된다고 요구하고 있기 때문이다.

그러므로 세라티아 효소중에서 아주 흥미있는 효소는 뉴클리아제로서 매우 강력한 작용을 나타내며 생체물질에서 핵산을 제거하는 면에서도 산업적으로 매우 중요한 것으로 밝혀졌다.

본 명세서에서 "핵산 제거"라는 용어는 길다란 핵산 연결고리를 짧은 연결 고리나 올리고뉴클리오티드, 때로는 단일 혹은 이중 뉴클리오티드로 분해하는 것을 가리키는 말로 쓰인다.

따라서 본 발명은 다음과 같은 아미노산 서열을 갖고 있는 세라티아 뉴클리아제에 관한 것이다.

(N-말단 신호 펩티드(terminal signal peptide)를 포함하여 공지의 방법으로 DNA 서열에서 유추된 아미노산서열)

이 효소는 위에서 언급한 방법대로 생산될 수 있다.

뉴클리아제가 정제된 생합성 산물에 잔류하는 핵산을 제거하기 위해 이용될때 처럼 특수하게 이용이 될때는 되도록이면 순수한 형태로 존재해야 한다.

실질적으로 순수한 효소를 얻으려면 조효소용액을 일단 한외여과나 황산 암모늄 등으로 침전시켜 어느 정도 정제한 다음 크로마토그라피(이온교환 크로마토그라피, 혹은 친화 크로마토그라피)나 젤 전기 영동법을 이용해 더욱 정제한다.

때로는 적당한 지지체에 효소를 고정화시키면 효소를 이용하여 뉴클리아제를 쉽게 제거한 다음 효소를 재 사용할수 있으므로 편리하다.

이러한 지지체로 이용되는 물질로는 덱스트란이나 한천젤 외에도 무기 화합물로서 실리카나 규산 및 이들의 유도체등이 있다.

또한 효소 고정화는 이미 알려진 방법대로 하면 된다.

뉴클리아제 이외에 흥미를 가질만한 효소로는 세라티아가 만들어내는 포스포리파아제이다.

그러므로 본 발명은 다음에 나타나 있는 DNA 서열로 만들어지는 세라티아 포스포리파아제 와도 관련이 있다.

한, 본 발명은 세라티아 뉴클리아제로 구성되어 있으며, 생체물질로부터 핵산을 제거하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 "생체 물질"이라는 용어는 한 성분이라도 생물에 기원이 있는 것이면 어떤 물질이든 가르키는 말로 이해되어야 한다.

그러므로 그 용어는 핵산만의 용액, 생합성 산물을 생산해낸 발효 배양액, 생합성 산물을 생산하는 세포가 성정하는 발효 배지 (여기에는 세포 파기물에서 나온 핵산 뿐만 아니라 생합성 산물도 포함되어 있다), 원심 분리 등으로 배지에서 회수된 다음에도 생합성 산물을 내는 세포의 재현탄액, 상하지 않은 세포(및 용해된 세포로 이루어진 세포 배양액 등과 같은 경우에 두루 적용된다.

"생합성 생성물"(상기에서 생합성 산물이라고도 했음)이란 용어는 단백질, 폴리펩타이드, 글리코리피드, 탄소화물 및 저분자량 화합물을 의미하는 말이다.

핵산은 생합성 생성물이 세포 외로 분비되지 않을때 특히 중요한 오염원이 된다. 즉 그 산물을 회수하기 위해서는 세포용해를 해야만 하는데 세포용해물이 점성을 갖게되어 원하는 산물의 정제가 어렵게 된다. 그러므로 세포 용해물의 점성을 줄이기 위해서는 본 발명의 세라티아 뉴클리아제와 같은 뉴클리아제를 함유하는 조성물을 이용하는 것이 바람직하다.

이런 뉴클리아제는 앞서 언급한 아미노산 서열을 가지고 있을 것이다.

뉴클리아제 조성물에 프로테아제가 존재하면 세포 배양에 따라 생산된 단백질 산물이 분해되는 가장 심각한 요인으로 작용하기 때문에 본 발명에 뉴클리아제 조성물에 단백질 작용이 있어서는 안된다.

본 발명에 의한 방법에 따라 만들어지는 뉴클리아제는, 즉 세라티아가 가지고 있는 유전자 암호에 따라 만들어지는 것으로 단백질 분해 작용이 없는 것으로 밝혀졌다(실시예 2참조).

다른 방법으로 정제된 단백질 생성물에서 잔류하는 핵산을 제거하기 위해 뉴클리아제 조성물을 이용할때는 특히 프로테아제 작용이 없어야 하는데 그 이유는 다음과 같다.

즉, 뉴클리아제가 정제되지 않은 세포 용해물에 첨가되면 용해물자체의 단백질 분해 작용이 뉴클리아제 조성물에 남아있는 단백질 분해 작용보다 훨씬 크기 때문이다.

그러므로 여러번 정제 단계를 거친 단백질 생성물에는 프로테아제 작용이 없는 뉴클리아제 조성물을 이용하는 것이 좋다.

뉴클리아제가 세포 용해물에 과량으로 첨가된다 하더라도(용해물의 핵산 성분때문에 나타나는 점도를 줄이는 정도에 대해 과량인)소량의 핵산은 단백질 산물을 오염시키게 된다.

이는 핵산과 막 또는 용해물의 단백질 성분과의 상호작용으로 인해 생기는데 즉 핵산의 "차폐(masking)"로 나타나는 현상이다.

그러나 재조합 DNA 기술이나 조직배양기술에 의해 만들어진 생합성 산물이 의학용으로 이용될때는 핵산의 완전 제거(DNA나 RNA 소식자(probe)에 의해 재조합할수 있는 핵산이 없음을 의미)가 FDA와 같은 여러나라의 건강 당국에서 흔히 요구되는 사항이다.

이러한 생합성 생성물이 다른 용도로 쓰일때도 소량의 핵산이 바람직한 결과를 얻는데 방해가 된다면 잔류하는 핵산을 완전히 제거하는 것이 매우 바람직하다.

본 발명에서는 특정한 계면활성제나 단백질을 파괴하는 작용이 있는 물질을 뉴클리아제와 함께 사용하면 잔류하는 핵산도 완전히 제거된다는 것을 밟혔다. 그러므로 핵산의 완전 제거를 요하는 응용에서는 본 발명에 따른 조성물이 세라티아 뉴클리아제와 같은 뉴클리아제와 계면활성제 및/또는 단백질 혼란제(chaotripic agent)를 같이 모두 포함하는 것이 바람직하다.

예를들면 Brij

58과 같은 폴리옥시에틸렌알콜과 Tritonⓡ X-100과 같은 옥토시놀(octoxynol) 등과 같이 비이온성 계면활성제일 수도 있고 도데실 황산나트륨(sodium dodecyl sulphate : SDS)이나 디옥시콜산나트륨(sodium deoxycholate)과 같은 디옥시콜산염(deoxycholate)등과 같이 이온성 계면활성제일 수도 있다.

단백질 혼란제로는 요소, 티오요소 또는 티오시안산염 중에서 선택할 수 있다.

발명은 또한 세라티아 뉴클리아제가 생체 물질에 첨가될때 생체물질에서 핵산을 제거하는 방법에도 관한 것이다.

특히 핵산으로 인한 오염으로 다음과 같은 문제를 일으키는 경우에 본 발명에 의한 방법은 매우 유용하다.

즉, 핵산으로 시험관적 실험이나 오염된 실험실 기구를 사용함에 따라 발생할 수 있는 핵산 현탄액이나 폐액이 생체물에 함유되어 있는 경우, 생체 물질에 생합성 생성물을 생산하는 세포가 들어있는 발효 배지가 포함되어 있을 경우로 이때는 세포용해 전단계나 후단계에 뉴클리아제를 과량으로 첨가하여 생체 물질에서 핵산을 제거해야 한다.

생합성 생성물을 생산하는 세포 배양이 진행되고, 또한 세포(세균)들이 계속적으로 없어져 가는 발효배지를 생체 물질이 함유하고 있을경우, 자연적으로 발생하는 세포의 파괴와 세포에서 배지로 분비되는 생합성 생성물로 인해 어느 정도의 핵산이 배지에 존재하게 된다.

즉, 생체 물질이, 발효 배지가 제거된 다음 생합성 생성물을 제조하는 세포의 재현탁액으로 되어 있을 경우에도 뉴클리아제가 세포용해 전단계나 후단계에 첨가될 수 있다.

이 뉴클리아제는 앞서 언급된 아미노산 서열을 지닌 바로 그 뉴클리아제이다.

본 발명은 본 발명의 뉴클리아제가 세포 용해에 앞서서 생체물질에 첨가될때 특히 좋은 결과가 나온다는 것을 밝혔다.

이. 콜라이와 같은 세균의 용해물(동결, 용융 용해물과 French Press 용해물)의 점도를 떨어뜨리는 과정에서 뉴클리아제가 세포 용해에 앞서서 세포 배양액에 첨가될 때 높은 재현성을 얻을 수 있음이 많은 실험에서 밝혀졌다.

또한 뉴클리아제가 세포용해후에 첨가되었을때 보다 전단계에 첨가되는 경우에 비교적 짧은 시간과낮은 온도로도 어느 정도의 상대 점도가 얻어지는 것으로 밝혀졌으며 이로써 생합성 수율이 높아지게된다(단백질 생성물이 핵산 제거과정에서 덜 파괴됨). 재조합 기술로 만들어진 미생물이 폐쇄 발효계에서 방출되어 나오기전에 모두 살균되어야 한다고 요구하는 건강 당국이 많다.

많은 경우에 있어서는 발효의 최종 단계에서 페놀이나 톨루엔을 첨가함으로써 살균한다.

본 발명의 뉴클리아제는 세균들을 죽이기 위해 쓰이는 페놀이나 톨루엔이 발효조에 다량으로 있을 경우에도 그 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌다.

생체물질의 점도를 줄이기 위해서 본 발명에 따라 생체물질에 뉴클리아제를 첨가하면 이 효소의 작용으로 단일 또는 이중 뉴클리오티드보다는 올리고뉴클리오티드가 여러가지 갖는 핵산 조가들이 최종 생성물로 나오게 된다.

재조합 가능한 핵산이 모두 제거된것으로 부터 아주 순수한 최종 생성물을 생성하려고 할때에는 생체 물질의 다른 성분에서 분리되어 적어도 충분히 정제된 생성물에 효소를 첨가하는 방법을 권하고 있다.

위에서도 언급했듯이 잔류하는 핵산, 즉 한정 분해(limit digest : 뉴클리아제가 점도를 줄이기 위해 과량으로 첨가되었을때 뉴클리아제를 첨가해도 핵산의 양이 더 이상 줄어들지 않는 경우)후에도 생체 물질에 잔류하는 핵산은 실로 어떤 생체 물질에 존재하는 전체 핵산의 0.1%도 안되는 소량으로 위에서 언급한 막성분이나 단백과의 상호 작용으로 뉴클리아제와 접하기 힘든 핵산이다.

그러나 계면활성제나 단백질 혼란제와 뉴클리아제를 함께 처리하면 잔류하는 핵산도 모두 분해될 수 있다.

그러므로 더 나아가 본 발명은 교배(hybridization)로는 찾아낼 수 없는 올리고뉴클리오티드나 뉴클리오티드로 존재하는 핵산을 분해할 목적으로 뉴클리아제를 계면활성제나 단백질 혼란제와 같이 사용함으로써, 생합성 생성물에서 잔류하는 핵산을 제거하는 방법에 관한 것이기도 한다.

계면활성제와 단백질 혼란제들은, 핵산과 뉴클리아제를 접촉하지못하게 하는 복잡한 구조를 만드는데 관련이 있는 소수성 힘과 정전기적 힘에 역행함으로써 그 작용을 나타낸다.

선택된 계면활성제와 단백질 혼란제는 생치물질에 존재하는 원하는 단백질 산물의 2차, 3차 단백질 구조에 영구손상을 주어서는 안된다.

즉 뉴클리아제가 헥산을 제거한 후에는 이들 물질(계면활성제와 단백질혼란제)도 제거될 수 있어서 산물의 올바른 구조가 유지되어야 한다.

이러한 계면활성제와 단백질 혼란제로 이용되는 것들이 바로 앞서 언급한 것들이다.

계면활성제나 단백질 혼란제를 이용할때는 주의가 요구되는데 뉴클리아제 활성에 영향을 주지 않도록 적절한 양을 사용해야 한다.

비이온성 계면활성제를 사용할때는 생체물질의 0.2-1.5% 특히 0.4-1.0%가 적당하며 이온성 계면활성제일 경우에는 일반적으로 0.01-1.0%를 사용한다.

단백질 혼란제는 보통 2-8M 가량(대략 무게/부피비로 생체물질의 10-50%)을 사용한다.

핵산이 전혀 없는 산물을 얻기 위해서는 생성과정의 초기단계에서 뉴클리아제를 첨가하여 세포 용해물의 점도를 줄이고 용해물에 포함된 다량의 핵산을 제거하는 것이 편리하다.

다음 단계로 정제 과정에서 순수한 뉴클리아제를 용액으로 또는 고정화 효소 형태로 첨가하여 산물에 잔류하는 핵산을 모두 제거한다.

또한 본 발명의 뉴클리아제를 포함한 조성물이 전염제의 전염 가능성을 없애는데도 이용될 수 있다는 것은 주시할만 하다.

즉 전염 가능성 그 자체를 제거한다거나 백신이나 치료제를 제조하는데 바람직한 이런 전염제의 적당한 성분을 회수하는 방법이 있다.

본 명세서에서의 "전염제"란 용어는 핵산 성분으로 인해 나타나는 전염 가능성을 지닌 생물적 혹은 무생물적물질을 의미한다.

이런 핵산 성분은 RNA에 대한 암호를 지니고/또는 전염 가능성을 나타내는데 필수적인 단백질을 만들어 내도록 하거나 혹은 순수하게 전염제에서 구조적인 역할을 수행한다.

전염제에는 플라스미드, 바이러스, 세균, 프리온(prion) 및 기생충(균)들이 포함된다.

이러한 전염제들의 전염 가능성은 화학 약품에 의해서도 파괴될 수 있으나 대부분은 오염 방지를 위해서 뉴클리아제를 사용하는 것이 좋다.

성장기중에 세포에서 유리된 플라스미드와 같은 DNA 분자들은 본 발명의 뉴클리아제를 처리하면 쉽게 분해되며, 실험결과 나온 폐기 물질에 존재하는 전염성이 있는 DNA도 이런 방법으로 분해된다.

안전을 위한 예방책으로 재조합 DNA 기술로 생합성 산물을 산업적으로 생산할때 나오는 폐기 물질에서 핵산을 제거하는 것이 바람직하다.

이런 폐기 물질에 존재하는 전염제의 핵산 성분이 뉴클리아제에 쉽게 접촉되지 못하면 계면활성제나 단백질 혼란제를 위에 제시한 방법대로 동시에 처리하여 남아있는 핵산을 모두 제거하는 것이 바람직하다.

본 발명의 뉴클리아제의 이용면에서 또 하나 주시할 것은 항원과 백신의 생산이다.

현재는 세균과 바이러스의 독성이 약화된 변종이 같은 종의 독성이 더 강한 것들에 대해 면역학적 반응을 유발하는 용도로 흔히 쓰이고 있는데 몸속에서 이들이 중식되는 제한된 기간동안에 전염제 표면이나 내부에 복잡한 항원 구조를 완전하게 갖고 있다는 점이 매우 유리하게 작용한다.

본 발명의 뉴클리아제를 이용하면 문제의 전염제와 관련된 어떠한 강력한 항원 결정기에 대해서도 면역학적 반응을 나타내는 항원적 복합성을 유지할 수 있는 반면 독성이 약화된 세균을 백신으로 사용할때 종종 나타내는 백신 후유증을 피할 수도 있다.

본 발명의 뉴클리아제는 핵산이 뉴클리아제의 작용을 잘 받도록 계면활성제나 단백질 혼란제와 병행해서 사용하여 전염제에서 핵산성분을 제거하는데 이용이 될 수 있으며 이때 사용되는 계면활성제 단백질 혼란제의 농도가 문제의 항원 구조에 영향을 미치지 않을 정도로 적당하게 사용한다.

본 발명에 나타난 방법에 따라 생산되는 세라티아의 가수분해 효소들은 세라티아 이던 이. 콜라이 이던 그 효소들을 생산하는 세균의 성장 주기에서 말기에 발현되는 것으로 밝혀졌다.

실시예에서 나타난 바와같이 이런 말기발현은 문제의 유전자 발현이 시작되는 억제 조절 구역(regulatory region)의 유전자 발현 억제 작용으로 인해 나타나는 현상이다.

그러므로 배양의 대수기 동안에는 가수분해 효소가 거의 합성되지 않는 반면 성장이 대수기 말기로 접어들면 유전자 발현이 활발히 일어난다.

본 명세서에서"억제조절 구역'이란 용어는 유전자의 전사 조절과 관계가 있는 염기 서열을 의미하며 유전자는 사이클릭 AMP 결합단백질(CAP)과 같은 (유전자 발현을 억제하는)억제 단백질이 결합하는 장소인 프로모터(promoter)와, 전사조절에서 아직 작용이 확실히 밝혀지지는 않았지만 삭제 지도법(deletion mapping)에 의해 전사 조절에 중요한 것으로 밝혀진 염기 서열들로 이루어져 있다.

이런 억제 조절 원리는 억제 조절 구역으로 지닌 플라스미드를 제공하는 본 발명에 적용될 수 있는데 억제 조절 구역의 아래쪽에 위치한 유전자의 발현이 플라스미드를 갖고 있는 미생물의 성장 말기에서 시작되거나 증가된다.

위에서 말한 바와같이 유전자 발현이 미생물의 성장 말기에서 시작되거나 증가되는 조절 기작은 흔히 미생물 배양에 유리하고도 바람직하게 작용한다.

그러므로 발효 공정에서 발효 말기에 나타나는 높은 균체 밀도로 인해 이 시기가 생산성이 가장 높은 기간이 되며 유전자 발현이 가장 높은 속도로 진행되므로 매우 중요한 시기인 것이다.

이는 이미 알려진 프로모터를 사용해서는 얻을 수 없는 효과인데, 왜냐하면 이미 알려진 프로모터의 활성은 보통 미생물의 성장 속도를 따르며 이로 인해 균체 밀도가 가장 높은 성장기에서 최소로 되기 때문이다.

미생물은 성장이 거의 중지되었을때 독성 물질을 합성할 뿐이기 때문에 세라티아 유전자에서 발견되는 억제 조절 구역의 특별한 작용은 미생물 배양에 의해 생산되는 생성물이 문제의 미생물에 독성을 나타내는 경우에 특히 중요한 의미를 지닌다.

결과적으로, 본 발명은 억제 조절 구역의 아랫쪽으로 위치한 유전자의 발현이 플라스미드를 가지고 있는 미생물의 성장 말기에서 시작되거나 증가되는 그런 억제 조절구역을 가지고 있는 플라스미드에 관한 것이기도하다.

이러한 억제 조절 구역은 억제 조절 구역과 원래는 관련이 없는 유전자의 발현을 억제 조절하는데 특히 유용하다.

즉 플라스미드를 지닌 미생물의 발효에 의해 기술 혹은 의학용의 다양한 생합성 생성물을 생산하기 위해 클로닝 혹은 생산 벡터로서 억제 조절 구역을 지닌 플라스미드가 이용될 수 있다.

이러한 생합성 생성물로는 폴리펩타이드와 단밸질 혹은 이것들의 단편 및 효소, 배지에 존재하는 화합물과 효소의 반응으로 만들어진 비단백질성 산물, 홀몬 같은 저분자물질과 핵산 등이 있고 특히 관심이 집중되고 있는 산물은 진핵 생물들이 만들어 내는 산물로 포유 동물 유전자 산물과 자기 자신에 독성 효과가 있는 산물들이 있다.

다른 생물체에도 유사한 억제 조절 구역이 존재한다해도 이 억제조절 구역은 세라티아 유전자에서 발견되는 것을 수 있다.

특히 세라티아의 뉴클리아제와 포스포리파아제의 억제조절 구역은 각각 제 7 도의 1-385와 제 9 도의 201-415이다.

위에서 말한 억제 조절 구역은 표준 재조합 기술을 이용해서 이미 알려져 있는 벡터나 새로운 클로닝 혹은 생산 벡터에 삽입될 수 있다.

위에 언급한 것과 같은 형의 억제 조절 구역을 지니는 클로닝 혹은 생산 벡터로서 유용하게 이용되는 플라스미드를 특히 런어웨이플라스미드 라고 부르는데, 조건을 맞춰 주면 복제를 계속하는 플라스미드이다.

이러한 플라스미드는 미국 특허 제4,495,287호와 유럽 특허 출원, 공보제0109150에서 밝혀졌다.

가령 뉴클리아제 유전자의 억제 조절 구역에 포함된 프로모터의 강도가 어떤 생산 목적에 이용하기에 항상 충분한 것은 아니다.

그러므로 성장과정이 억제 조절 구역의 아랫쪽에 위치한 유전자의 발현과 연관성 있게 해주는 억제조절 구역이라해도 성장기와 연관된 발현이 유지되도록 더 강한, 즉 항상 작용하는 프로모터(constitutive promoter)를 원해의 프로모터 대신 사용할 수 있다.

억제 조절 구역을 생합성 생성물의 발현에 이용하는 것과는 달리 억제 조절 구역의 아랫쪽에 위치한 유전자의 전사를 증가시키는데 이용할 수도 있는데, 즉 그 유전자는 세균성 플라스미드의 복제조절에 관여하는 것으로 플라스미드를 지닌 미생물의 성장 말기에서 계속적인 플라스미드 복제(런어웨이 복제)를 야기하게끔 하는 것이다.

지금까지 밝혀진 대부분의 런어웨이 복제 벡터는 복제를 계속 하도록 온도를 증가시켜 주든가 하는 식으로 성장조건을 외적으로 변화시켜 주어야 했다.

플라스미드 복제를 조절하기 위해 위에 말한 억제 조절 구역을 이용함으로써 플라스미드를 지닌 미생물의 성장기를 조절해 런어웨이 복제를 시작하는 방법이 가능해졌다.

이러한 방법은 세가지 관점에서 유리하다고 본다.

첫째, 성장조건을 외부에서 조작해 줄 필요가 없고, 둘째, 런어웨이 복제를 시작하는 데 숙주세포에 어떤 특별한 성질도, 요구되지 않으며 셋째, 미생물 배양이 대수기 말기로 접어들때, 즉 유전자의 복제 수를 증가시키는 효과가 최대로 될때 통제되지 않는 복제가 시작된다는 것이다.

대수기 말기에서 런어웨이 복제를 시작하는데 바람직한 억제 조절 구역은 포스포리파아제 억제 조절 구역이며 그 이유는 두 가지 조절체가 있기 때문이다.

하나는 포스포리파아제 억제 조절 구역에 의해 조절되는 유전자의 발현을 대수기 말기로 제한시키는 억제 체계이고 다른 하나는 첫번째 체계를 무효화시킬 수 있는 것으로 포도당 억제 체계를 포함한다.

위에서 말한 억제 조절 구역을 실제적으로 이용할때 포스포리파아제 억제 조절 구역의 두가지 조절 체계를 모두 가지고 있는 DNA 단편이 플라스미드로 끼어 들어갈 수 있으며 플라스미드가 적당한 숙주 세포 속으로 들어가면 이로 인해 변형된 숙주 세포가 포도당이 존재하는 조건에서 선택될 수 있다.

포도당이 결핍되면 이러한 변형된 숙주 세포들이 대수기 말기에서 런어웨이 복제를 하게 되는 것이다.

원하는 생합성 산물을 만들게 하는 유전자가 플라스미드로 끼어 들어가고 결과생성된 하이브리드 플라스미드가 적당한 숙주 세포로 들어갈 수 있으며 이런 숙주 세포는 포도당이 없거나 혹은 대수기 말기까지는 다 소모될 정도의 포도당이 존재할때 산물을 만들어 낼수 있도록 성장하게 된다.

이러한 모든 경우에도 억제 조절 구역의 전사가 증가되기 때문에 대수기 말기에서 복제가 통제 받지 않은채 계속 될수 있다.

그리하여 적당한 시간이 흘러 산물이 충분히 생산되었다고 생각될때 배양액으로 부터 생합성 생성물을 회수한다.

또한 배양은 숙주 세포로 이용되는 미생물에 최적이라고 알려져 있는 종래의 배지를 비롯해 종래의 기술을 이용하면 된다.

생합성 산물의 회수도 마찬가지로 특정한 생합성 생성물의 성질에 알맞고 숙주의 성질에 적당한 흔히 이용되는 방법을 따르면 된다.

본 발명은 또한 위에서 구체화된 억제 조절 구역을 지닌 플라스미드를 가지는 미생물을 제공해준다.

이 미생물은 바로 그람-음성 세균과 같은 전형적인 세균으로서, 바람직한 그람-음성 세균은 생합성 생성물의 생산에 일반적으로 잘 이용되는 이. 콜라이와 같은 것이다.

뉴클리아제의 N-말단 부분을 만들도록 하는 염기서열은 뉴클리아제가 막을 통과해 나가는데 필수적인 신호 펩타이드를 만드는 것으로 유전자 산물의 분비와 관련이 있으므로 이 염기 서열을 주시할 만한다.

원하는 생합성 산물을 만드는 염기서열은 뉴클리아제의 신호 펩타이드 C-말단을 만드는 염기서열과 직접적으로 결합하여 원하는 산물이 분비되면 이와 동시에 신호 펩타이드는 떨어져 나온다.

실제로 신호 펩타이드에 대한 암호를 지닌 염기서열(제 7 도)이 DNA 단편으로서 뉴클리아제 억제 조절구역과 함께 분리, 확인되어서 1-448까지인데 448위치는 Aha III에 대한 인지 위치와 부합하는 것으로 신호 펩타이드의 마지막 암호 한코돈과 정확하게 일치한다(신호 펩티다아제인지 위치를 포함하며) DNA 단편은 적당한 벡터가 있으면 어느 것으로든지 끼어들어가(크렙노우 폴리머라제(Klebnow ploymerase)에 의해)결찰된다.

뉴클리아제 억제 조절 구역이 존재하게 되면 유전자 발현이 세포의 성장 말기로 제한된다.

[준비물 및 방법]

이. 콜라이 K-12와 세라티아 마르센신스 W225 균주들은 표 1 에 플라스미드와 박테리오 파아지는 표 2 에 나타나 있다.

[표 1]

[표 2]

여기서 이용된 모든 실험적 방법은 다음과 같은 자료에서 언급된 표준 방법을 이용했다 :

T. Maniatis : Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, and J. Miller : Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972 배양은 모두 LB 배지(Bertani, J. Bact. 62, 1951, P. 293) 또는 비타민과 아미노산이 첨가된 A+B 최소배지(Clark and Maal

, J. Mol. Biol. 23, 1967, P. 99)에서 이루어졌다.

고형 배지로는 항생제를 첨가하기도 하고 첨가하지 않기도 했지만 LB 배지에 한천(agar) 농도가 1.5%되게 한천을 첨가했다.

항생제를 첨가할 시에 그 농도를 테트라사이클린 8㎍/ml, 앰피실린 50㎍/ml, 클로람페니콜 20㎍/ml로 했다.

뉴클리아제 역가를 찾아내기 위한 고형배지에는 DNase 역가실험용으로 Difco사에서 생산한 DNase test agar를 첨가해 주었다.

[실시예 1]

[세라티아 마르세신스 W225로부터 염색체성 DNA 제조]

세라티아 마르세신스 W225 균주는 1985년 5월 8일자로 독일연방공화국 괴팅겐(우편번호 D-3400) 그리제바흐 스트라쎄 8에 소재한 독일 미생물 수집소(DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)에 기탁번호 제3308호로 기탁되었으며 한국에는 1987년 2월 2일자로 한국과학기술원에 기탁번호 KCTC 8217P로 기탁되었다.

이 균주를 LB 배지에서 밤새배양하여 원심분리(800rpm으로 5분)로 회수했다.

원심분리 후에는 TEN 완충 용액(10mM Tris, HCL, pH 8, 1mM EDTA, 100mM NaCl)으로 두번 세척하여 라이소자임(lysozyme) 1mg/ml과 Rnase 01mg/ml가 포함되어 있는 TEN-완충 용액 20ml에 재현탁 시켰다.

그 다음에는 37℃에서 30분간 배양하고 20% SDS 를 최종 농도가 1%되도록 첨가했다.

37℃에서 60분 배양한 후(완전 용해를 위해)용해물을 4℃에서 밤새 배양했다.

다음날 세포 파괴물들을 원심분리(1300rpm으로 25분)로 제거하고 상등액을 3M 초산나트륨 2ml과 이소프로판올 4ml이 들어 있는 새로운 시험관에 옮겼다.

가볍게 흔들어서 섞어 준 후 실모양으로 침전된 DNA를 굽은 유리 바늘로 뽑아냈다.

침전된 DNA는 80%에탄올로 두번 세척한 다음 TEN-완충용액에 녹여 헌탁액을 만들었다.

다시 밀도차등 원심분리(buoyant density gradient centrfuhation)로 DNA를 더 정제한 다음 적절하게 희석하게 페놀로 추출하고, TE 완충용액(10mM Tris-HCl, pH 8, lmM EDTA)을 사용해 투석법을 실시했다.

마지막으로 제한 효소 완충용액을 넣어 37℃에서 배양하여 뉴클리아제가 없는지를 조사했다.

[세라티아 마르세신스 W225로 부터 유전자 은행 제조]

클로닝 벡터-플라스미드인 PNU 121이 세라티아 마르세신스 W225부터 유전자 은행을 만드는데 함께 이용되었다.

이 플라스미드는 앰피실린과 테트라 사이클린 저항성에 대한 암호를 지니는 pBR 322 유도체이지만, 테트라사이클린 저항성 유전자의 프로모터가 파지 λ프로모터인 λpR로 대치되었고, λ억제 유전자인 C₁이 pNU 121에도 존재하기 때문에 테트라사이클린 저항성은 흔히 나타나지 않는다.

그러나 C₁유전자에 따른 DNA가 끼어들어 C₁유전자가 파괴되면 저항성이 나타난다.

그러므로 C1 유전자에 독특한 EcoR I 위치를 가지는 pNU 121DNA는 제한 효소인 EcoR I에 의해 분해되었고 EcoR I에 의해 부분적으로 분해된 세라티아 마르세신스 DNA와 혼합되었다.

DNA는 15℃에서 T4리가아제(ligase)로 밤새 처리하여 결찰되었고, 이것을 이. 콜라이 MY 102 균주에 넣어 주었다.

그리고 8㎍/ml의 테트라 사이클린을 함유하는 고형 배지를 이용해 37℃에서 배양한 후, 세라티아에서 빠져나간 DNA를 가지고 있는 pNU121을 가지게 된 세포만이 콜로니(colony)를 형성하게 되어 이를 골라 낼수 있었다.

이런 방법으로 하여 세라티아 마르세신스 W225의 유전자 은행을 나타내는 약 2500개의 콜로니를 분리 했다.

[세라티아 마르세신스 W225로부터 뉴클리아제 유전자 분리]

세라티아 마르세신스 W225로부터 나온 유전자 은행을 DNase 지시용 고형배지에서 복사하여 37℃에서 이틀 동안 배양한 다음 고형배지 위에 0.1 N HCl을 떨어뜨려 주었다.

DMase 양성인 콜로니 들은 콜로니 주위에 투명한 지역을 나타낸다.

양성인 pNU 121-nuc⁺를 원해 고형 배지에서 재분리 하여 세포의 효소에 대한 암호를 지닌 다른 유전자들이 존재하는 지를 조사했다.

(Escherichia coli MT102/pNU 121-nuc+는 1985년 5월 8일 기탁번호 제 3309호로 DSM에 기탁되었으며 한국에는 1987년 2월 2일자로 한국 과학기술원에 기탁번호 KCTC 8218P로 기탁되었다.) 결과 이것은 RNase도 역시 가지고 있었으나 그 외의 세포의 효소는 발견되지 않았다.

뉴클리아제 유전자를 갖고 있는 EcoR I 단편도 역시 런어웨이 클로닝 벡터인

pBEU 50으로 끼어 들어가 플라스미드pBEU50-nuc+를 만들었다(Escherichia coli C600/pBEU 50-nuc+는 1985년 5월 8일 기탁번호 제 3310으로 DSM에 기탁되었으며 한국에는 1987년 2월 2일자로 한국 과학 기술원에 기탁번호 KCTC 8219 P로 기탁되었다.)

[뉴클리아제 유전자의 제한 효소 지도법]

뉴클리아제 유전자를 가지고 있는 이. 콜라이 MT102 균주로 부터 플라스미드 DNA가 만들어져 제한 효소 EcoR I, Pst I 과 EcoR I 에 의해 각각 분해되었다. Pst I을 처리해 분해된 DNA를 T4 DNA ligase로 다시 결찰시켜 MT102 균주에 넣어 주었다.

앞서와 마찬가지로 8㎍/ml 테트라 사이클린이 포함된 DNase 지시용 고형배지에서 콜로니를 골라 니였다. 배양후 나타난 콜로니들은 모두 뉴클리아제 양성 표현형을 나타내었다. EcoR V를 처리하여 분해된 DNA를 다시 결합시켜 MT102에 넣어주고 앰피실린 저항성을 지시제로 이용해 콜로니를 골라내면 모든 변형체들이 뉴클리아제 음성을 나타낸다. 그러므로 뉴클리아제 유전자는 제 1 도에서 Pst I에서 EcoR I에 걸치는 2Kb 단편 위에 있게 되는 것이다.

더욱 subcloning을 시키기 위해 플라스미드 DNA를 Pst I과 EcoR I으로 분해하고 전기 영동 후에 뉴클리아제 유전자를 지니는 Pst-EcoR I 단편을 젤로 부터 분리 정제했다.

그 DNA가 제한효소 FnuD II(뉴클리아제 유전자에 여러개의 쪼개지는 위치를 가지고 있는 4-base짜리제한 효소)에 의해 부분적으로 분해되어 플라스미드 pGV403의 DNA와 혼합되는데 이것은 제한효소 Sma I에 의해 분해된다.

혼합된 DNA를 T4 리가아제(ligase)로 결찰시켜 MT102로 넣어 주면 20㎍/ml 클로람 페니콜(pGV403의 저항성)을 함유한 LA 고형 배지에서 콜로니를 골라낼 수 있게 되며 이렇게 얻어진 변형체 MT102를 DNase 지시용 고형 배지에 레플리카 평판법으로 플레이팅 했다. 그 결과 20개의 뉴클리아제 양성 콜로니가 분리되었고 플라스미드 DNA가 마련되었다.

가장 작은 플라스미드는 1.3Kb짜리 DNA가 삽입되어 들어간 것이며 이 삽입체는 제 1 도의 EcoR V 위치와 일치한다. 이 플라스미드를 pGV403-SD2/10이라고 명명했다. 같은 삽입체를 갖고 있기는 하나 pGV403의 유일한 EcoR I과 HindIII인지 위치에 비해 반대의 방향일 때는 pGV403-SD2/14라고 명명했다.

[뉴클리아제 유전자의 염기서열]

벡터 플라스미드 pGV403(Amer Sham)의 염기 서열을 밝히는데 맥삼 앤드 길버트(Maxam Gilbert)방법(Proc. Natl, Acad, Sci, USA 74, 1977, PP560-64)을 사용했다.

시퀸싱 되는 DNA는 벡터의 Sma I 위치로 끼어 들어간다. Sma I은 제한효소 Tthlll I가 작용하는 두군데와 접하는데 이로 인해 서로 다른 5'-말단이 만들어지며, 효소가 비대칭적으로 잘라내기 때문에 32p로 붙여주면 곧 바로 서열을 알 수 있게 된다.

그러므로 pGV403의 Sma I에 의해 클로닝 된 1.3Kb짜리 뉴클리아제 단편은 Tthlll I로 하이브리드 플라스미드를 분해한 다음 한천젤 전기 영동법으로 분리되었다. 그 DNA 단편이 제한 효소 FnuDII나 HaeIII중의 하나에 의해 분해되고 Sma I으로 처리하여 쪼개진 pGV403 DNA와 결찰되었고 PO₄가 떨어져 나갔다. 그 DNA가 다시 MT102로 들어가면 20㎍/ml 클로람 페니콜을 함유한 LA 고형 배지에 콜로니가 나타나게 된다.

그리하여 변형체 MT102로 부터 플라스미드 DNA가 마련되고 분석되었다. 이런 식으로 하여 전체 1.3Kb짜리 단편의 일부들인 200에서 400개 정도의 염기쌍으로 이루어진 단편들이 각각 삽입된 일련의 pGV403 하이브리드 플라스미드가 만들어진다.

양쪽 가닥에서 이런 플라스미드의 염기 서열을 밝힌 것이 위에서 보여 준 염기 서열이다.

제 7 도에 드러난 염기 서열을 분석해 보면 뉴클리아제에 대한 암호는 386에서 1165에 걸쳐 존재한다는 것을 알 수 있다.

첫째, 이 구역의 암호에 따라 만들어지는 단백질은 30,000달톤짜리이다.

둘째, 온전한 리보좀 결합위치는 374-78위치에 존재하는데 시작 코돈의 바로 윗쪽인 것이다.

셋째, 제한 조절구역을 구성하는 염기 서열은 330에서 336(-10 sequence)위치와, 306에서 313(-35 sequence)위치에 존재한다.

뉴클리아제가 보족스트랜드(complementary strand)위에 존재하는 길다란 리딩 프레임(reading frame)이라기 보다는 특정한 염기 서열에 의해 만들어진다는 사실을 확실히 하기 위해서 pGV403-SD2/10과 pGV403-SD2/14의 삽입체들이 EcoR I과 HindIII의 이중 처리에 의해 분해되었다.

삽입체들의 방향이 pGV403 벡터의 제한 효소가 작용하는 두 위치에 대해 반대라는 것을 주목해야 한다.

쪼개진 단편들은 EcoR I과 HindIII로 이중 분해 되었던 pPL195와 다시 결찰되었다. 벡터 pPL195는 λpL프로모터의 아랫쪽에 있으며 EcoR I과 HindIII 인지 위치를 가지고 있는 폴리링커(polylinker)를 pLc28에 삽입시켜 줌으로써 만들어진 것이다.

그 다음 이. 콜라이 NFl에 넣어 주어 30℃에서 Ap^R에 대해 콜로니를 확인할 수 있었고 결과 두 종류의 플라스미드 pPL195-SD2/10과 pPL195-SD2/14가 분리되었다. pPL195-SD2/10에는 λpL프로모터가 추정상의 뉴클리아제 암호 지역의 위쪽에 위치하며 pPL195-SD2/14에는 보족스트랜드가 전사되는 방식으로 λpL프로모터가 자리잡는다. 이. 콜라이 NF1은 c1857 유전자에 의해 만들어지는 온도에 예민한 λ 억제제에 대한 암호를 지닌 결손 λ에 대해서는 비용해성을 나타낸다.

30℃에서는 c I 억제제의 활성이 있으며 pPL195에 존재하는 λpL이 억제되는 것처럼 프로모터도 억제제에 의해 억제 조절을 받는다.

그러나 37℃ 이상에서는 억제제의 활성이 없고 pPL195에 있는 λpL로 부터의 전사가 일어난다. 30℃와 42℃에서의 뉴클리아제 역가를 비교해 보면, pPL195-SD2/14가 아니라 pPL195-SD2/10만이 온도에 따라 뉴클리아제 합성을 이끌어낼 수 있으며 이는 λ 프로모터에 비해 뉴클리아제 대한 암호 구역의 방향이 pPL195-SD2/10과 맞아 떨어진다는 것을 나타내 준다.

온도가 이끌어내는 뉴클리아제 합성은 뉴클리아제 암호 구역이 λ 프로모터와 직접 연결될때 매우 많아진다.

제 7 도의 357에서 1295에 걸쳐 있는 pGV403-SD2/10의 Rsa I-HindIII 단편이 Sma I과 HindIII에 의해 분해된 pPL195와 결찰되면 암호지역은 λ 프로모터에 비해 pPL195-SD2/10에 위치하게 된다. 이런 플라스미드를 pPL195-SD2/RI라고 명명했다.

뉴클리아제 NH₂-말단에 상응되는 염기 서열은 부분적으로 정제된 단백질의 아미노산 서열 분석으로 확실하게 되었다. 뉴클리아제의 C-말산에 상응하는 염기 서열은 생거(Sanger)의 다수의 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, pp 5463-5467에 있는 디데옥시 뉴클리아제 시퀸싱 방법과 같은 다른 방법을 이용한 염기 서열로 확실하게 되었다. 뉴클리아제 NH₂-말단 서열은 20개의 아미노산으로 구성된 신호 단백질이 존재하며 이는 448위치에 존재하는 신호 펩타다아제에 대한 인지 서열로 종결된다는 것을 알려준다.

[뉴클리아제의 효소 역가]

플라스미드 pBEU50-nuc+를 가지고 있는 세라티아 마르세신스 W225와 이. 콜라이 C600을 30℃에서 LB 배지에 배양했더니 왕성하게 기하급수적으로 증식했다. 시간별로 하여 시료를 1ml 채취하여 450nm에서의 OD(OD₄₅₀)와 뉴클리아제 역가를 측정했다. 페리플라즘으로부터 효소를 방출시키기 위해 100μ1의 클로로포름을 첨가함으로써 뉴클리아제 역가 측정을 시작했다. 10,000rpm으로 15분간 원심 분리한 후 상등액 25μ1취해 효소역가를 측정하는데 그 방법은 다음과 같다.

뉴클리아제가 포함된 시료를 0.05M Tris(pH 8.0)+0.01M MgCl₂)에 용해되어 있는 연어정자 DNA(1mg/ml)0.5ml에 첨가했다. 이런 혼합물을 37℃에서 한시간 배양한 후 4% PCA(perchloric acid : 과염소산)를 0.5ml 첨가하여 30분 동안 얼음 속에 방치해 두었다. 원심 분리로 분해되지 않은 DNA 침전을 제거하고 OD₂₆₀(파장 260nm에서의 UV 흡광도)을 측정했다.

표 3에 나타난 역가는 성장의 정체기로 들어가는 시기에 시료를 채취하여 위에 언급한 방식으로 측정된 OD₂₆₀값이다. 두가지 균주 모두 효소가 성장 말기에서 활발히 합성되는 것으로 나타났다.

[표 3]

병행되는 실험에서 뉴클리아제가 페리플라즘과 배지에 어떤 비율로 존재하는지를 알아 보기 위해 미생물 배양시료를 두가지로 나누어 측정했다. 하나는 배지만을 갖는 시료이고 다른 하나는 페리플리즘과 배지에서 나온 물질을 모두 갖는 시료이다. 결과는 표 4 에 나타나 있다.

[표 4]

표에서 나타난 바와같이 세라티아 마르세신스 W225의 뉴클리아제는 거의 배지로 분비되는 반면 이. 콜라이의 경우는 단지 50%만이 배지로 분비된다.

[실시예 2]

[뉴클리아제의 정제]

성장 정체기에서 16-20시간이 경과한 뒤 pGV4-30SD2 플라스미드를 가지고 있는 이. 콜라이 MT102배양액 25ℓ를 0.45㎛ 필터를 이용해 한외 여과한 뒤 다시 10,000달톤짜리용 막을 이용해 한외 여과했다. 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA를 사용해 투석법을 실시한 뒤 유리 필터와 0.45, 0.22㎛ 필터를 이용해 여과한다.

이렇게 만들어진 효소 용액을 다음과 같은 표준 분석법으로 여러가지 변수에 대해 조사한다. 50mM Tris(pH 8.2), 1mM MgCl2, 50㎍/ml BAS, 100ml DNA 용액(물 1ml당 연어정자 DNA 5mg 용해)으로 구성된 완충용액 400μ1를 DNA를 제외한 앞의 완충용액에 희석한 효소액 25μ1를 혼합해 37℃에서 60분간 배양했다.

반응 용액에 4%짜리 차가운 PCA(과염소산)를 40μ1 첨가하여 얼음속에 30분간 정치한 다음 15000g로 5분간 원심 분리하여 260nm에서 상등액의 UV 흡광도를 측정했다.

효소 역가 1유니트는 표준 분석법으로 하여 OD₂₆₀1변화/1ml DNA/1hr로 정의된다. 최적 pH 값을 알아 내기 위해 표준 분석 완충용액의 pH를 변화함에 따른 효소 역가를 측정했다. 그 결과 뉴클리아제 역가에 대한 최적 pH 범위는 7.5-9.6이며 pH 8.5-9.2에서 최대가 된다.

Mg²⁺최적 농도 또한 MgCl₂의 농도를 0-100mM까지 변화시켜 가면서 표준 분석법대로 뉴클리아제 역가를 측정했다. 그리하여 MgCl₂농도가 0.1-1mM 범위일때 최적이지만 MgCl₂가 없이도 40%정도의 효소역가는 유지되는 것으로 나타났다.

1가 양이온의 최적 농도를 알아내기 위해서는 NaCl과 KCl의 농도를 변화시킴에 따른 효소 역가를 표준 분석법대로 측정했는데, Na⁺농도가 높아지면 효소역가가 급속하게 떨어지는 것으로 나타났다. KCl농도가 0-50mM정도일때는 효소의 활성이 유지되는데(역가의 감소가 없다) 이는 중요한 의미를 지닌 것으로 세포내의 K⁺농도가 100-150mM인 만큼이나 되듯이 특히 이. 콜라이의 세포용해로 매우 많은 양의 K⁺가 방출되기 때문이다.

단기간 동안의 효소 안정도는 DNA가 없는 완충용액을 표준 분석법대로 효소를 4,23,37℃에서 1,4,18기간 동안 미리 배양시킴으로써 조사했다.

DNA를 첨가하여 효소역가를 표준 분석법대로 분석한 결과 표 5 를 얻었는데 수치는 250nm에서 UV 흡광도를 나타낸다.

[표 5]

표 5로 부터 4℃와 23℃에서는 효소가 완충용액에서 13시간 안정하게 존재하지만 37℃에서는 전배양 시간이 길어질수록 역가가 떨어지는 것을 알 수 있다.

변성제의 효과는 요소, 비이온성 계면활성제(Brij

58, Triton

X-100)와 이온성 계면활성제(SDS(도데실 황상 나트륨)와 디옥시 콜산 나트륨)가 존재할때 효소 역가를 측정함으로써 알아보았다. 이런 물질들의 농도를 변화시켜 가면서 실험한 결과 요소 농도가 1-8M일 경우 효소가 활성을 나타내며 4-8M이며 역가각 증가하고 4M일때 역각가 최대였다.

또한 Brij

58(1%)과 Triton

X-100(0.4%)과 같은 비이온성 계면활성제가 존재할때도 효소가 활성을 띠지만 이온성 계면활성제의 경우에는 SDS가 0.01%를 초과하면 효소 활성이 완전하게 억제받게 되며 디옥시콜산 나트륨은 1%로 존재해도 효소활성이 40%정도 유지되었다.

효소의 순도는 SDS-PAGE를 이용해 분석되었다. 효소 조합제에는 수많은 단백질이 포함되어 있었다. 뉴클리아제(30,000) 분자량과 상응되는 위치에서 전체 효소 조합제의 5-10%를 나타내는 것으로 추정되는 뚜렷한 밴드가 있었다. 뉴클리아제 조합제에 있는 프로테아제 역가는 다른 방법으로 분석했다.

첫째는 50μ1의 뉴클리아제 시료를 단백질(탈지분유) 고형 배지(완충용액에 20% 분유 존재)위에 물에 떨어트렸을때 37℃에서는 24시간 후에, 23℃에서는 48시간 후에 투명한 지역(고형 배지의 우유 단백질이 분해된 것)이 나타났다.

둘째, 아조-카제인을 이용한 측정법으로 20μ1의 효소용액을 아조-카제인 1mg(완충용액 : 50mM Tris(pH 8.0), 10mM MgCl₂)과 혼합해 0,16,30℃에서 12시간 반응시킨 후 370nm에서 산에 용해되는 아조 염색제를 측정했다.

셋째, MgCl₂농도를 약 5mM로 하여 37℃에서 뉴클리아제를 배양하여 SDS-PAGE로 분석했는데 뉴클리아제 조합제에 존재하는 약 20여종의 단백질 유형에 아무런 변화가 없었다.

즉 자발적인 단백질 분해가 일어나지 않은 것으로 프로테아제가 없다는 것을 말해준다. 이는, 뉴클리아제의 실제적인 적용면에서, 효소 조합제에 존재하는 가능한한 낮은 단백질 분해 작용이 세포용해물에 있는 전체 프로테아제에 비해 최소화 될 수 있다는 것을 의미한다.

유기 용매가 있을때 DNA와 RNA를 분해하는 뉴클리아제의 활성이 어떻게 변화하는지를 알아보았다.

이. 콜라이 MT102의 FTL-용해물(부피비로 균체 1 : Tris-EDTA 완충용액 1의 비율로 혼합한 것에 세포 용해에 앞서 뉴클리아제를 1ml당 12,000유니트 첨가시킴) 적량에 페놀(1%), 톨루엔(1%), 클로로포름(1%), 에탄올(5%), EDTA(0.25M)를 첨가했다. 20℃에서 4.5시간 배양한 후 시료를 한천젤 전기 영동법으로 분석했다. EDTA(0.25M)를 첨가하면 뉴클리아제의 활성이 없어지므로 EDTA를 첨가한 시료를 비교치로 사용했다.

유기 용매를 첨가하지 않았을때와 비교했을때, 유기 용매의 첨가가 뉴클리아제 활성에 아무런 영향도 미치지 않는다는 것을 알았으며 DNA의 95%가 200bp와 그 이하의 단편들로 분해되었다.

[실시예 3]

[세포 용해물의 점도 감소]

실시예 2에서 만들어진 효소를 점성이 매우 높은 이. 콜라이 0.2g의 FTL(lysozyme-freeze-thaw)에 첨가했는데 효소를 2.6×10²과 2.6×10³유니트로 하고 전체 용량을 500μ1로 했다.

Mg2+를 첨가하지 않은 시료들과 10mM Mg²⁺를 첨가한 시료들로 나누어서 0℃, 20℃에서 배양했다.

표 6 은 세포 용해물이 수성이 되는데 소요된 시간을 나타낸 것이다. 즉 수성이란 점도가 물의 점도에 도달된 것을 의미한다.(용해물 시료를 피펫으로 빨아 올린 다음 점성이 없는 방울로 떨어지는지를 관찰함으로써 측정했다)

[표 6]

그러나 다른 용해물을 사용한 실험에서는 상당한 변동이 관찰되었다는 것을 알아야 한다. 즉 FP(French Press)용해물을 이용하면 핵산이 어느 정도 없어지게 된다. 이런 유형의 용해물은 효소의 좋은 기질로 작용 하는데 아마도 FP 용해물의 젤 구조가 비교적 엉성하기 때문일 것이다.

7.5g의 이. 콜라이 W3110(습윤 중량)으로부터 얻어진 FP용해물(15ml)의 점도는 0℃에서 효소를 1ml당 24유니트로 40분간 배양하면 수성이 된다.

[세포를 용해하기 전단계에 뉴클리아제 첨가]

A. 0.25ml TE(TE-10mM Tris(pH 8.0), 1mM EDTA)에 이. 콜라이 MC1000을 0.25g(습윤중량) 용해시키고 실시예 2에서 만들어진 뉴클리아제 12유니트를 첨가하여 표준 방법(동결-용해를 3차례 실시)에 따라 FTL 용해를 실시했다. 점도는 눈으로 관찰하여, 피펫으로 취해 "수성"방울로 떨어지게 되면 용해물의 점도가 감소된 것으로 간주했다. FTL 용해의 표준 방법을 따랐을때 3번째 동결-용해를 실시한 다음 용해물을 0℃에서 배양한 결과 5분 후에 "수성"이 되었다. 이 실험으로 인해 세포 용해 전에 효소를 첨가하는 것이 좋은 효과를 나타낸다는 것을 예기치 않게 알게 되었다. 즉 뉴클리아제가 세포 용해 전에 첨가될 경우에는 1ml당 24유니트 만으로도 5분이면 점도가 감소하게 되는 반면 세포 용해후에는 용해물 1ml당 5200유니트를 첨가해야 12분 정도에 점도가 감소한다.

B. 점도 감소를 좀 더 확실하게 정량하기 위해, 동결-용해효과와 고압 세포 용해가 결합된 방법인 X-PRESS(Biotec) 방법으로 만들어진 이. 콜라이 용해물에 대해 실험을 실시했다.

7.5ml의 TE에 이. 콜라이 MC 1000을 7.5g(습윤중량) 용해하여 MgCl₂농도가 2mM 되도록 MgCl₂를 첨가하고, 뉴클리아제를 1ml당 25유니트 첨가했다. 그리고는 X-Press에 넣은 재료 동결시켜 -20℃에서 5차례 압력을 가해주었다. 그 결과 만들어지는 균질물은 0℃에서 2시간에 걸쳐 용해 되었다.

눈으로 보기에 용해되는 동안 점도가 감소 되었으나(즉 피펫을 이용하여 수성으로 떨어지는 방울 확인)용해 시간이 길어지면 0시간을 설정하기가 어렵다. 그러므로 용해전 단계에 뉴클리아제가 첨가될 경우에는 용해물 1ml당 24유니트만 처리해도 X-PRESS 용해물의 점도를 감소시키는데 유용하다.

세포가 용해된 상태로 존재하는 균일물을 TE(0℃) 완충 용액에 용해하여 37.5ml이 되게 희석한 후 24시간동안 점도를 관찰했다(Ostwald 점도계) 뉴클리아제 분해 작용은 0℃에서 설치되어 있는 점도계에서도 계속되었다.

제 2 도의 x축에 나타난 시간에 따라 점도를 측정했다. 제 2 도의 y축은 0℃에서의 물의 점도에 대한 상대도 값을 나타낸다. 0℃에서 용해물 1ml당 9.6유니트의 뉴클리아제를 반응시켜 주었더니 처음 10분 동안에는 상대 점도가 급격하게 감소했고 그 후에는 더딘 속도로 떨어진다. 24시간이 경과한 후의 상대점도는 1.3였다.

C. 7.5g(습윤중량)의 이. 콜라이 MC 1000을 TE 7.5ml에 용해하여 여기에다 MgCl₂의 농가가 6mM되게 MgCl₂를 첨가하고 뉴클리아제는 1ml당 24유니트를 첨가했다.

이렇게 세균과 효소가 함께 들어있는 현탁액을 프렌치 프레서 셀에 넣어 10,000psi의 압력을 가해 주었다. 그 다음 즉시 0℃에서 배양했으며 압력을 가해 세균이 용해물로 나온 시간을 '0'시간으로 간주했다. 프렌치 프레서 셀에서 나올때는 '점성'이었던 것이 0℃에서 5분 안에 수성으로 변화되었다.

그러므로 FP 용해물의 점도를 감소시키는데도 뉴클리아제 24유니트면 족하다는 것을 알 수 있다. 5분이 되었을때 용해물을 TE(0℃)로 희석하여 30ml을 만든 다음 시간별로 Ostwald 점도계로 점도를 측정했다.(제 3 도, x축). 결과는 0℃에서의 물의 점도를 0으로 한 상대점도로 표시한 것이다.

점도계에서의 반응 조건은 다음과 같이 해 주었다 : 1ml당 이. 콜라이 MC 1000이 0.25g 용해되어 있는 용해물 1ml당 뉴클리아제를 12뉴클리아제를 12유니트 온도=0℃.

세포 용해전단계에 뉴클리아제를 첨가하는 것이 유리하다는 것을 보여주기 위해서 다음과 같은 실험을 실시했다.

용해물은 위에 언급된 방법대로 만들었고, 이. 콜라이 W3110(7.5g)이 용해된 현탁액 15ml 짜리 시료를 여러개 준비하여 뉴클리아제의 최종 농도가 용해물 1ml당 0.24에서 240유니트까지 다양하게 되도록 뉴클리아제를 처리했다(제 4 도의 막대그림 105) 프렌치 프레스로 세포를 용해한 다음 0℃에서 배양하며 피펫법을 이용해 눈으로 점도를 관찰했다.

1ml당 240유니트를 처리했을때(제 4 도의 막대그림 5)는 프렌치 프레스에서 흘러나올때 이미 세포 용해물이 수성인 반면 1ml당 2.4유니트(제 4 도의 막대그림 2)의 뉴클리아제를 처리했을때는 0℃에서 약 20분이 지나야 수성으로 바뀌었다.

1ml당 0.24유니트를 처리했을때는(제 4 도의 막대그림 1)70분에서 글리세롤과 같은 점성이었고 0℃에서 15시간 배양하는 동안 수성으로 바뀌었다.

위의 시료들을 2.5배 희석하여 0℃에서 70분과 15시간 배양한 후에 상대점도를 측정해 보았다.

제 4 도의 2-5는 액정일때 상대 점도 값이 1.5에서 2.1의 범위를 나타낸다는 것을 보여주고 있다.

효소를 과량으로 처리했을 때는(제 4 도의 막대그림 5) 최소치가 1.5이다.

70분에서 이 최소치에 도달하는 것으로 보이며, 이로써 핵산때문에 나타나는 점도 성분은 제거되었다는 것을 알게된다.

특별한 응용에 필요한 뉴클리아제의 양을 알아보기 위해 70분과 15시간에서 첨가된 효소와 점도와의 관계를 그래프로 나타내 보았다(제 5 도).

0℃에서 뉴클리아제 3600유니트를 첨가했더니 70분과 15시간 배양했을때의 점도가 대략 비슷해서 각각 1.52와 1.47이었다. 그러므로 1.5라는 값은 용해물의 상대 점도가 최소치로 간주될 수 있다. 0℃에서 70분간 배양한 후의 상대점도 값은 log(첨가된 효소)치나 log(효소농도)에 비례한다. 1500유니트(1ml당 100유니트)를 첨가하였더니 핵산때문에 나타날 수 있는 용해물의 점성이 완전 제거되었다.

즉, 효소를 1500유니트 정도되게 과량 첨가하거나 배양 시간을 연장하면 상대 점도값이 더 이상 감소되지 않는 수치를 찾을 수 있는데 이 최소치가 1.5이다.

효소양을 1/10로 하면 0℃로 하면 0℃에서 배양시간을 10배로 연장해야 같은 값의 점도를 얻을 수 있다는 것을 그림으로부터 알 수 있다.(즉, 36유니트/70분은 3.6유니트/15시간과 마찬가지 효과이고 360유니트/70분은 36유니트/15시간과 마찬가지 효과를 나타낸다)

세포 용해 전단계에 뉴클리아제를 처리하는 새로운 방법과 세포용해 후에 효소를 처리하는 종래의 방법을 비교하기 위해서, 위에 서술된 방법대로 용해물 15ml을 만들었는데 세포 용해 전에 뉴클리아제를 처리해주지 않았다. 프렌치 프레스로 세포를 용해한 다음 뉴클리아제 360유니트를 첨가하여 최종 효소 농도가 1ml당 24유니트가 되게하고 0℃에서 배양했다.

제 4 도의 막대그림 6은 단계별로 점도가 감소되어 40분이 경과한 후에 수성이 되고 있다는 것을 보여주고 있다.

상대 점도값이 떨어지는 시초의 속도는 다르다 하더라도 70분에서의 상대 점도 값이 그림 4의 막대그림3(세포용해전 1ml당 8유니트 첨가)에 나타난 시료의 상대점도 값과 비교될 수 있었다.

세포 용해전에 1ml당 약 1.5유니트의 뉴클리아제를 첨가했을때의 시간별 유형은 제 3 도의 막대그림 6과 마찬가지이지만 상대점도는 2.13-2.53 범위로 더 높은 값을 나타낸다.

그러므로 이득(gain)(효소 요구면에서)은 "점도감소"를 정의하는데 사용되는 범주에 따라 3 혹은 20이 될 수 있다.

제 4 도의 막대그림 2-6에 나와있는 용해물에서 시료를 취해, 이 시료들이 "수성"이 되었을 때, 그때 바로 한천젤 전기영동을 건 다음 이어서 EtBr(Ethidium Bromide)로 염색을 하면, 염색이 될 수 있는 잔류물질은 21Kbp 마커에서부터 퍼져 나가서 브로모페놀블루(bromophenol blue) 밴드를 이루게 되는데, 뉴클리아제 농도가 높은 시료에는 이렇게 서서히 이동하는 물질이 적어진다.

이 물질은 뉴클리아제를 처리하기 전에 존재하던 핵산의 양에 비해 1% 미만에서 수 %를 차지하고 있다(제 6 도 참조).

[실시예 4]

[잔류 핵산의 제거]

세포 용해물의 한정 분해물(limit digests)을 젤 전기 영동법으로 분석한 결과로부터 용해물에 존재하는 핵산의 약 0.1% 정도는 뉴클리아제 작용을 받기가 어렵다는 것을 알았다.

핵산이 잔류하게 된다는 것은 특별한 염기 서열이 존재해서 보호막 역할을 하기 때문이며, 핵산 총량중의 아주 소량만이 뉴클리아제 처리 후에도 남아 있는 것을 보면 이 염기서열은 막과 관련이 있는 부분인 것을 암시한다.

잔류 핵산을 제거하기 위해서 세포 용해물에, 여러 종류의 단백질 변성제와 함께 뉴클리아제를 처리했다.

이. 콜라이 0.25g(습윤중량)을 파괴한 FTL 용해물 0.6ml을 뉴클리아제 240유니트와 아울러 1-12M 요소로 처리했다. 그리고는 30℃에서 1시간 혹은 18시간을 배양했다. 배양 후 5μ1를 취해 한천젤 전기 영동을 켠 다음 EtBr로 염색했다.

18시간 배양한 것에서는 요소를 2-4M 처리했을 대가 가장 좋은 효과를 나타냈으며 특히 4M을 처리했을 때는 염색될 수 있는 모든 물질이 제거 되었다.

이. 콜라이 0.68g(습윤중량)을 파괴한 FTL 용해물을 TE에 용해시켜 2.5ml로 희석한 다음, 0.1% SDS 혹은 0.6% Triton

X-100과 함께 뉴클리아제를 2.6×103 유니트 처리해 16℃에서만 24시간 동안 배양했다.

그 다음 젤 전기영동을 이용한 분석을 통해, 계면활성제가 존재할때는 잔류 핵산이 뉴클리아제에 의해 분해될 수 있다는 것을 알았다.

이러한 실험들의 결과를 종합해 보면, 계면활성제와 단백질 변성제는 모두 용해물에 잔류하는, 차폐된 핵산이 뉴클리아제의 작용을 받을 수 있게 하는 작용을 하는 것으로 보여진다.

[실시예 5]

세라티아 Al(Serratia spp. Al)의 분리 썩은 오이에서부터 세균을 회수하여 DNase test agar에 접종을했다.

그 다음 엑소뉴클리아제(exonuclease) 역가가 높은 콜로니(colony) 한개를 좀 더 분석했다. 그람 염색 결과는 음성으로 나타났다.

이러한 임시적인 분리 동정 실험결과 분리된 균은 세라티아 리퀴화시엔스(Serratia liquefaciens)인 것으로 보여졌으나 분류가 완결될때 까지는 잠정적으로 Serratia spp. Al이라 명명했다.

이 균은 테트라 사이클린과 앰피실린에 대해 내성이 있으며 세라티아 마르세신스와 같은 유형의 엑소(exo)-효소를 가지고 있다(Serratia liquefaciens Al은 1985년 5월 8일 기탁번호 제3307로 DSM에 기탁되었으며 한국에는 1987년 2월 2일자로 기탁번호 KCTC 8219P로 한국과학기술원에 기탁되었다.)

[세라티아 Al으로부터 염색체성 DNA 분리]

세라티아 Al을 LB 배지에 접종하여 밤새 배양한 다음 원심분리를 이용해(8000rpm 5분) 균체를 회수했다.

TEN-완충용액(10mM Tris-HCl, pH 8, 1mM EDTA, 100mM NaCl)으로 두번 세척하여 1mg/ml 라이소자임과 0.1mg/ml RNase가 들어있는 TEN 완충용액 20ml에 다시 용해했다.

그다음 37℃에서 30분간 배양했으며 20% SDS를 첨가해 최종농도가 1%가 되도록 했다. (완전한 용해를 위해) 37℃에서 60분간 배양한 후 4C에서 밤새도록 방치했다.

다음날 원심분리(18000rpm, 25분)를 하여 세포 파괴물을 제거하고 상등액은, 3M 아세트산 나트륨 2ml과 이소프로판을 4ml이 들어있는 새로운 시험관에 옮겼다. 가볍게 혼합해 준 다음 실모양으로 침전된 DNA를 굽은 유리 바늘로 골라냈다.

침전된 DNA를 80% 에탄올로 두번 세척하고 TEN-완충용액에 다시 용해 시켰다. 이 DNA를 다시 밀도 차등원심분리로 정제하여 적절히 희석한 다음 페놀로 추출하여 TE-완충용액(10mM Tris HCl, pH 8 1mM EDTA)속에 넣어 투석벌을 실시했다.

마지막으로 뉴클리아제가 없아는 것은 37℃에서 제한 효소 완충용액과 함께 37℃에서 배양함으로써 알아 보았다.

[세라티아 Al으로부터 유전자 은행 제조]

이 작업에는 클로닝 벡터로 플라스미드 pNU 121을 사용했다. 이 플라스미드에 대해서는 실시예 1에 잘나와있다.

C1 유전자에 유일한 EcoRI 위치를 가지고 있는 pNU121 DNA를 EcoRI 제한효소로 분해하여, EcoRI에 의해 부분적으로 분해된 세라티아 Al DNA와 혼합했다.

15℃에서 T4 DNA 리가아제로 처리하여 밤새도록 두어서 서로 결합되게 한다음, 이. 콜라이 MT 102 균주에 넣어 주었다.

37℃에서 8㎍/ml 테트라사이클린이 들어있는 LB 고형 배지를 이용해 세라티아 DNA가 일부 끼어들어간 pNU121을 가지고 있는 세포만이 콜로니를 만들어내므로 이들 콜로니를 골라낼 수 있었다. 세라티아 Al의 유전자 은행인 것으로 보이는 약 8000개의 콜로니를 이 방법으로 분리했다.

[리파아제 역가 스크리닝]

이. 콜라이 MT 102는 세라티아 Al의 유전자 은행의 일부를 지니게 되어 변형이 되었고 이런 하이브리드 플라스미드를 가지고 있는 변형된 이. 콜라이 MT 102는 테트라 사이클린이 들어있는 LB 평판 배지를 이용해 분리했다.

콜로니를 골라내서 미량 적정용 접시에 옮겼는데 여기에는(A+B 배지+1% 카사미노산+비타민 B1+200mg/ml 스트렙토마이신+8㎍/ml 테트라 사이클린)이 들어있다.

균을 37℃에서 밤새도록 배양하여 레플리카를 만들었다. 리파아제 효소에 대한 기질인 P-니트로페닐팔 미틴산염을 6mg/ml의 농도로 이스프로필 알콜에 먼저 용해시켰다. 이 현탁액 10ml에 디옥산 콜산 나트륨207mg이 이 용해되어있는 pH 8인 0.05M 인산염 완충용액 90ml을 첨가하였다.

그 다음 이 용액을 0.5ml씩 취애 접시에 있는 각 구멍에 넣어 주었다. 구멍이 노란 색을 띠게 되면 리파아제 역가가 있다는 것을 말해주는 것이다.

그리하여 이러한 클론을 하나 얻게 되었고, 이렇게 만들어진 DNA를 이. 콜라이 CSH 50에 넣어 주었다. DNA를 받은 변형체들은 리파아제 역가를 갖게 되었다. 이런 클론을 다시 분리하여 DNA를 얻었으며, 이렇게 선별된 클론은 프로테아제, 포스포리파아제나 뉴클리아제 역가를 나타내지 않았다.

[리파아제 역가가 있는 플라스미드 pNU 121-lip⁺]

리파아제 역가가 있는 클론으로부터 분리된 플라스미드 DNA는 제한 효소 EcoRI을 처리하여 얻어진 약 8.4Kb 짜리 단편이 pNU 121에 끼어들어간 것이었다.

이런 하이브리드 플라스미드를 pNU 121에 기어들어간 것이었다.

이런 하이브리드 플라스미드를 pNU 121-lip+라고 명명한다(Escherichia coli CSH 50/pNU121-lip_는 1985년 5월 8일 기탁번호 제3313으로 DSM에 기탁되었으며 한국에는 1987년 2월 2일자로 기탁번호 KCTC 8221P로 한국과학기술원에 기탁되었다.)

[리파아제의 효소역가]

P-니트로페닐팔미틴산염을 기질로 사용하여 OD₄₁₀을 측정함으로써 리파아제 역가를 조사했다.

이. 콜라이 pNU 121-lip⁺와 세라티아 Al이(A+B 배지 +1% 카사미노산+비타민 B₁)배지에서 왕성하게 기하급수적으로 성장할때는 배지에 효소 역가가 있는 것으로 나타났다.

[실시예 6]

[라티아 Al으로부터 염색체성 DNA 제조]

세라티아 Al(실시예 5를 참고)을 LB 배지에서 밤새도록 배양하여 원심분리로(8000rpm, 5분) 균체를 회수하여 TEN-완충액(10mM Tris-HCl, pH 8, 1mM EDTA, 100mM NaCl)으로 두번 세척하고, 1mg/ml 라이소자임(lysozyme)과 0.1mg/ml RNase가 포함된 TEN-완충용액 20ml에 용해시켰다. 그 다음 37℃에서 배양하고 20% SDS를 첨가하여 SDS의 최종농도가 1%가 되도록 했다. (완전 분해를 위해) 37℃에서 60분을 배양한 다음 4℃에서 밤새도록 배양했다.

다음날 원심분리(1800rpm, 25분)를 해서 세포 파괴물을 제거하고 상등액은 3M 초산 나트륨 2ml과 이소-프로파놀 4ml이 들어있는 새로운 시험관에 옮겼다.

가볍게 혼합해 준 다음 실모양으로 침전된 DNA를 굽은 유리 바늘로 뽑아내어 80% 에탄올로 두번 세척한 다음 TEN-완충 용액에 용해시켰다.

밀도차등 원심분리를 이용해 DNA를 더 정제하여 적절하게 희석한 다음 페놀과 추출하여 TE-완충용액(10mM Trix-HCl, 1mM EDTA)에 넣어 투석법을 실시했다.

최종적으로 제한효소 완충 용액과 함께 37℃에서 배양함으로써 뉴클리아제가 없는지를 조사했다.

[세라티아 Al으로부터 유전자 은행조립]

이 작업에는 클로닝 벡터로 플라스미드 pNU 121(실시예 1 참고)을 이용했다(실시예 5 참고). C1 유전자에 유일한 EcoRI 위치를 가지고 있는 pNU121 DNA를 제한효소 EcoRI으로 분해한 것과 EcoRI을 처리하여 부분적으로 분해된 세라티아 Al DNA를 혼합했다. T4 DNA 리가아제를 처리하여 15℃에서 밤새도록 두어서 DNA가 결찰되게 한 다음 이. 콜라이 NT 102에 넣어 주었다.

37℃에서 8㎍/ml 테트라 사이클린이 들어있는 LB 평판 배지를 이용해 세라티아 DNA의 일부가 끼어 들어간 pNU 121을 가지고 있는 세포만이 콜로니를 만들어 낸다는 점때문에 이들 콜로니를 골라낼 수 있었다.

그리하여 세라티아 Al의 유전자 은행인 것으로 보이는 약 8000개의 콜로니를 이 방법으로 분리했다.

[포스포리파아제 양성클론 스크리닝]

이. 콜라이 MT 102는 세라티아 Al의 유전자 은행의 일부를 지니게 되어 변형이 되었고 이런 하이브리드 플라스미드를 가지고 있는 변형된 이. 콜라이 MT102는 테트라 사이클린이 들어있는 LB 평판 배지를 이용해 분리하여 역시 테트라 사이클린이 들어있는 난황평판 배지에 페플리카 평판배양 했다. 콜로니 주위에는 투명한 지역이 콜로니의 위에는 하얀 침전이 생기면 포스포리파아제 역가가 있다는 것을 말해주는 것이다.

이러한 콜로니를 15개 분리하여 DNA가 얻어졌고 이를 CSH 50을 변형시키는데 이용했다. 즉 포스포리파아제 클론으로 이용된 것은 바로 이러한 클론이었다.

이 클론이 바로 pNU 121-ph1⁺이며 포스포리파아제 역가만을 지니게 되었다.(Escherichia coli MT102/pNU121-ph1⁺는 1985년 5월 8일 기탁번호 제3311로 DSM에 기탁 되었으며 한국에는 1987년 2월 2일자로 기탁번호 KCTC 8220T로 한국과학기술원에 기탁되었다.)

[포스포리파아제 역가가 있는 플라스미드 pNU 121-ph1⁺와 pOU 57-ph1⁺]

포스포리파아제를 만들어 내는 클론에서부터 분리한 플라스미드 DNA인 pNU 121-ph1⁺는 C₁유전자(제 8 도)에 3.2kb EcoRI 단편이 끼어 들어가게 된 pNU 121이다.

이러한 EcoRI 단련은 런어웨이 플라스미드인 pOU 57에서 클로닝 되었다. 그리하여 런어웨이 하이브리드 플라스미드인 pOU 57-ph1⁺는 다른 이. 콜라이 균주에 포스포리파아제 표현형을 나타나게 하며, 세라티아 균주에는 있게 될때는 포스포리파아제의 발현을 증가시켰다.(Escherichia coli S17-1/pOU57-ph1⁺는 1985년 5월 8일 기탁번호 3312로 DSM에 기탁되었다)

온도를 30℃에서 40℃로 올리면 시험 대상인 균주에서의 포스포리파아제 발현이 증가되었다.

[포스포리파아제의 효소역가]

플라스미드 pNU 121-ph1⁺를 가지고 있는 이. 콜라이를 A+B+1% 카사미노산+비타민 B1 배지나 LB배지에서 배양했을 때, OD450의 값이 0.7에 도달하게 되면 배지에서 포스포리파아제 역각가 나타났다.

이. 콜라이의 생존성은 플라스미드의 존재 여부와는 결코 관계가 없었다. 포스포리파아제에 대한 역가 분석은 난황과의 반응으로 이루어졌다.

즉 균의 성장과 젤에서의 단백질 합성을 저해하는 클로람페니콜과 난황을 가지고 있는 2% 한천젤에서 효소가 역가를 분석했다.

젤에 작은 구멍을 만들고 여기에 상등액(원심분리로 세포를 제거했음)을 5μ1씩 넣어 주었다.

효소와 난황이 반응을 하여 혼탁한 젤에 투명한 지역을 만들었다. 효소 확산 속도는 즉 단위시간당 투명한 지역평방미리로 정의되는데 효소 역가를 측정하는 수단이 된다.

이. 콜라이 pNU 121-ph1⁺와 세라티아 Al 배양액으로부터 포스포리파아제 역가를 조사한 결과 표 7을 얻게 되었다.

[표 7]

표 7을 보면 이. 콜라이가 세라티아 보다 휠씬 효율적으로 효소를 배지로 분비한다는 것을 알 수 있다.

두 균주 모두, 성장기의 대수기 말기에 배지에서 효소 역가가 나타나 정체기 까지 계속된다. 그러나 배지에 포도당의 농도가 1%이면 두 균주 모두 효소의 합성이 저해를 받게 된다.

반면 계면활성제가 아주 소량만(0.5% Tween 80) 존재해도 분비가 촉진된다.

[포스포리파아제 클론의 DNA 시퀀싱]

포스포리파아제 유전자를 가지고 있는 3.2kb EcoRI 단편의 DNA 시퀀싱은 M13 파지 유도체인 Mp 8과 Mp 9에 대한 Messing외 다수가 고안한 "Shot-gun" 클로닝 방법(Nucl, Acid, Res. 9, 1981, p. 309)과 Sanger외 다수가 고안한 디데옥시 사슬 종결 방법을(Proc. Natl Acad. Sci. USA 74, 1981, P5463)을 이용하여 알아내었다.

EcoRI 단편의 서브-클로닝에는 여러 종류의 제한 효소를 이용했다 : Sau3A, TaqI. Alu I, RsaI, Sal I, Sma I, PstI, EcoR I, Pvu I, BssH II와 EccRV.

완전한 전체적인 DNA 시퀀시는 작은(100-300염기) 조각들의 시퀸시를 알아내고 이들 데이타를 모아 밝혀냈다.

대부분의 순서가 DNA 양쪽 시크랜드에 대해 결정되었다.

염기 시퀀스(제 9 도)는 단편의 왼쪽 끝인 416 위치에서 시작하여 Sal I 위치를 지나 1372에서 끝나게 되는 주 리딩-프레임을 나타낸다.

단편의 윗부분에는 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 동일성(Shine-Dalgaino, Nature 254, 1975, p.34)을 나타내는 염기 시퀀스인 AAGGAG가 ATG 시작 코돈의 바로 윗쪽인 405 위치에 존재한다.

리딩-프레임의 윗쪽은 프로모터 지역으로 351 위치에 -35 시퀀스인 CTGGC가, 374 위치에 -10 시퀀스인 TATTTA가 존재한다.

-35 시퀀스의 윗부분인, 306에서 336 위치까지는 CAP이 결합할 수 있는 자리이다.

제 9 도의 염기 시퀀스는 19개의 아미노산으로 구성되는 추정상의 분자량이 34056 dalton인 단백질을 만드는 유전자가 존재 한다는 것을 시사해 준다.

0 위치에서 lac 유전자의 윗쪽 441 위치까지 DNA 단편이 끼어들어 갔다는 것은 이 DNA 단편에 기능상의 프로모터가 있다는 것을 보여 주었다.

이런 프로모터는 균체의 밀도가 OD₄₅₀값으로 0.7이 되면 lac 발현을 시작하게 한다. 이 프로모터도 또한 포도당이 배지에 첨가되면 균체 농도에 관계 없이 작용을 못하게 되는데 이는 이화물 억제 작용(catabolitc repression)이 아마도 CAP 결합 위치와 관계가 있을 것이라는 점을 말해준다.

서브-클로닝을 함으로써 세포외 효소인 포스포리파아제에 대한 유전 정보가 360 위치에서 FspI 위치인 1551 까지에 걸치는 1.2kb 내에 있는 것으로 증명되었다.

또한 이. 콜라이에서 포스포리파아제 역가를 얻기 위해서는 프로모터 앞에 이 DNA 단편을 클로닝 하는 것이 필요하다는 것도 알게되었다. 이런 식으로 하여 유전자의 전사 방향도 역시 밝혀졌다. 유전자의 전사방향은 왼쪽 EcoRI 위치에서 부터 Fsp I 위치쪽이다. 사용된 프로모터는 온도에 의해 그 기능이 나타나는 c 1857과 λpR이다.

30℃에서 이. 콜라이의 포스포리파아제 합성은 통상적인 평판 배지 분석 결과 매우 느린 것으로 나타났다. 그러나 37℃를 넘게되면 효소의 생산이 크게 증대되었다. 1.2Kb 단편의 유전자 산물은 방사성 동위 원소로 치환된 메티오닌을 이용하여 생체 실험 및 시험관적 실험에서 모두 확인이 되었다.

SDS-폴리아크릴아미드 젤 전지 영동 결과 포스포리파아제 역가가 방사성 동위 원소로 라벨링한 34Kdalton 단백질과 함께 이동한 것으로 보아 유전자 산물의 크기를 34 Kdalton으로 결정했다.

Claims

세포외로 분비되는 세라티아 효소를 만드는 세라티아 에서 분리된 DNA가 삽입된 하이브리드 플라스미드를 갖고 있는 미생물을 배지에서 배양하는 것과 배양액으로 부터 효소를 회수하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 세균성 효소(세균의 성장기 중에서 만들어지는 효소)의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 효소가 미생물로 부터 배지로 분비되어 배지에서 회수 되는 것을 특징으로 하는 세균성 단백질이 거의 없는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 2항에 있어서, 세라티아 효소가 가수분해 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 세라티아 효소가(N-말단 신호 펩타이드를 포함하여) 다음과 같은 아미노산 시퀀스를 가지고 있는 세라티아 뉴클리아제 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 세라티아 뉴클리아제가 거의 순수한 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 세라티아 뉴클리아제가 매트릭스에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 2항에 있어서, 세라티아 효소가 세라티아 리파아제 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 2항에 있어서, 세라티아 효소가 다음과 같은 DNA 시퀀스에 의해 코딩되는 세라티아 포스포리파아제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 2항에 있어서, 하이브리드 플라스미드가 조건에 따라 복제가 통제되지 않는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 2항에 있어서, 억제조절구역의 아랫쪽에 위치한 유전자의 발현이 플라스미드를 가지고 있는 미생물의 성장 말기에서 시직되거나 증가되도록 하는 억제조절구역을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 그 유전자가 억제조절구역과 원래는 관계가 없는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 유전자가 플라스미드의 복제를 억제 조절하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 억제조절구역이 세라티아로 부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 억제조절구역이 세라티아의 뉴클리아제 또는 포스포리파아제 억제조절구역인 것을 특징으로 하는 방법.
상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 세균인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 미생물이 그람-음성 세균인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 그람-음성 세균이 이. 콜라이 인 것을 특징으로 하는 방법.
세라티아 뉴클리아제와 선택적으로 계면활성제 및/또는 단백질 혼란제를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물질로 부터 핵산을 제거하기 위한 조성물.
제18항에 있어서, 세라티아 뉴클리아제가 제 1 항 내지 3항과 제 4 항 내지 6항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 뉴클리아제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제18항 또는 19항에 있어서, 단백질 분해 작용이 거의 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
제18항에 있어서, 뉴클리아제와 계면활성제 및/또는 단백질 혼란제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제21항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 생물질에 대해 0.2-1.5%, 바람직하기로는 약 0.4-1.0%의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제21항에 있어서, 이온성 계면활성제가 생물질에 대해 0.01-1.0%의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제21항에 있어서, 단백질 혼란제가 2-8M의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제21항에 있어서, 계면활성제가 비이온성일 경우에는 Brij
58과 같은 폴리옥시에틸렌 알콜이나 Triton
X-100과 같은 옥토시놀 중에서 선택되며, 이온성일 경우에는 도데실 황산 나트륨(SDS)이나 디옥시콜산 나트륨과 같은 디옥시콜산염중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제21항에 있어서, 단백질 혼란제가 요소, 티오요소 또는 티오시안산염중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제21항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클리아제가 세라티아 뉴클리아제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제27항에 있어서, 세라티아 뉴클리아제가 제 1 항 내지 3항과 제 4 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 뉴클리아제인 것을 특징으로 하는 조성물.
세라티아 뉴클리아제를 생물질에 첨가하는 것을 특징으로 하는 생물질로 부터 핵산을 제거하는 방법.
제29항에 있어서, 생물질이 핵산 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 생물질이 생합성 생성물을 생산해내는 균체를 포함하고 있는 발효 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 생물질이 생합성 생성물을 생산해내는 균체가 성장하는 발효 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 생물질이 생합성 생성물을 생성해내는 세포 배양 현탁액인 것을 특징으로 하는 방법.
제31항 또는 33항에 있어서, 뉴클리아제가 세포 용해전에 생물질에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제29항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 세라티아 뉴클리아제가 제 1 항 내지 3항과 제 4 항 내지 6항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 뉴클리아제인 것을 특징으로 하는 방법.
뉴클리아제가 계면활성제 및/또는 단백질 혼란제와 함께 첨가되는 것을 특징으로 하는 생합성 생성물로 부터 잔류 핵산을 제거하는 방법.
제36항에 있어서, 뉴클리아제가 세라티아 뉴클리아제인 것을 특징으로 하는 방법.
제37항에 있어서, 세라티아 뉴클리아제가 1 항 내지 3항과 제 4 항 내지 6항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제36항 내지 38항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 비이온성일 경우에는 Brij
58과 같은 폴리옥시에틸렌 알콜이나 Triton
X-100과 같은 옥토시놀 중에서 선택되며, 이온성일 경우에는 도데실 황산 나트륨이나 디옥시콜산 나트륨과 같은 디옥시콜산 염 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제39항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 생합성 생성물에 대해 0.2-1.5%, 바람직하게는 0.4-1.0% 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제39항에 있어서, 이온성 계면활성제가 생합성 생성물에 대해 0.01-1.0%의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제36항 내지 38항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 혼란제가 요소, 티오요소 또는 티오시안산염 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제42항에 있어서, 단백질 혼란제가 2-8M의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법