DD272102B5 - Verfahren zur Herstellung von thermostabiler Bacillus-beta-1,3-1,4-Glukanase - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von thermostabiler Bacillus-beta-1,3-1,4-Glukanase Download PDF

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Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von thermostabiler Bacillus-beta-i^-M-Glukanase, wobei ein geeignetes Gen für diese Glukanase isoliert und mittels eines Vektors in einem Mikroorganismus-Stamm exprimiert wird und wobei ferner eine stabile Expression dieses Gens gewährleistet ist, ohne daß Zusätze von Antibiotika gebraucht werden.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Glukanasen werden für die Herstellung verschiedener Nahrungs-, Genuß- und Futtermittel sowie als Hilfsstoffe in der biologischen Forschung eingesetzt, wenn die hydrolytische Spaltung der beta-glykosidischen Bindungen von beta-1,3-1,4-Glukanen beabsichtigt ist; vor allem in der Brauindustrie wird durch den Einsatz solcher pflanzenglukan-hydrolisierender Enzyme die Verarbeitung größerer Rohfruchtmengen, zum Beispiel von Gerste anstelle von Malz, möglich, ohne daß dabei Schwierigkeiten bei der Filtration und Läuterung der Braumaische infolge ungenügend abgebauter, viskositäts-erhöhender Glukan-Verbindungen zu befürchten wären.
Es ist seit langem bekannt, die Viskosität der Brauwürze mit Hilfe von beta-Glukanasen mesophiler Bacillus-Stämme, wie von Bacillus amyloliquefaciens oder von Bacillus subtilis, herabzusetzen/1 /. Auch die Verwendung gentechnisch manipulierter Stämme, die das beta-Glukanase-Gen von Bacillus amyloliquefaciens in amplifizierter Form auf einem Vektorplasmid enthalten, ist zur Verbesserung der Ausbeute von mesophiler Glukanase entsprechend einem älteren Vorschlag der gleichen Anmelderin bereits ins Auge gefaßt/2/.
Der Nachteil dieser vorbekannten Glukanasen liegt in ihrer Temperaturempfindlichkeit; sie werden nur in einer frühen Phase des Maischprozesses wirksam, oberhalb 600C aber sind sie nicht mehr aktiv.
Es ist ferner bekannt, daß Bacillus macerans eine beta-Glukanase produziert, die demgegenüber auch über der angegebenen Temperatur noch ihre Wirksamkeit entfaltet/3/; wegen seiner geringen PRoduktivität ist ein solcher Mikroorganismus aber für eine wirtschaftliche Enzym-Produktion völlig ungeeignet.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, eine thermostabile Glukanase der eingangs näher bezeichneten Art in wirtschaftlicher industrieller Herstellung zu gewinnen.
-2- 272 102 Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen Nachteile zu vermeiden und gentechnisch eine Glukanase zu erzeugen, die ein thermostabiles Verhalten oberhalb 60°C mit einem produktiven Herstellungsverfahren verbindet. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das Gen aus einem Donorstamm von Bacillus macerans gewonnen und unter Verwendung eines Mikroorganismus-Stammes zur Expression gebracht wird, der der Art Bacillus subtilis nahesteht oder angehört.
Die stabile Expression eines Gens, das nicht in der Umgebung von Bacillus subtifis angesiedelt ist, ist in einem Mikroorganismus dieser Art zunächst nicht zu erwarten. Bekanntlich wird die Produktion von Fremdprotein durch die Instabilität rekombinierter Plasmid-DNS in gram-positiven Bakterien und durch den proteolytischen Abbau des kodierten Gen-Produktes negativ beeinflußt/4/. Wirtschaftlich nutzbar erschien bisher nur die Herstellung von Gen-Produkten mittels manipulierter Bazillen, wenn die verwendeten Gene aus Bacillus subtilis selbst oder einem nahe verwandten Mikroorganismus wie Bacillus amyloliquefaciens isoliert wurden/2/. Hingegen i*t der erfindungsgemäße Gebrauch von Bacillus macerans als Donorstamm unter Lieferung der gewünschten Ausbeute durchaus überraschend, weil Bacillus macerans taxonomisch deutlich von Bacillus subtilis und dessen verwandtem Umkreis abgegrenzt werden muß/5/.
Es ist besondere vorteilhaft, wenn das Gen für die beta-Glukanase aus einem Donorstamm E138 von Bacillus macerans gewonnen wird. In bekannter Weise ist es zweckmäßig, daß als Vektor ein Vektorplasmid, beispielsweise ein Escherichia-coli-PlasmidpBR 322/6/ oder ein Streptokokken-Plasmid pDB 101/7/, verwendet wird. Schließlich ist es besonders günstig, wenn die Expression des Gens mittels einer wäßrigen Lösung von Kongorot, mit der der Lichenin enthaltende Agar überflutet ist, nachgewiesen wird. Die von rekombinanten, glukanasebildenden Klonen erzeugten Hydrolyse-Zonen erlauben die schnelle Identifizierung der gesuchten Klone. Mittels dieses Verfahrens isolierte Transformanten von Escherichia coli enthaltenden Bacillus-DNS in einer Größe von 5000 Basenpaaren.
Durch die Subklonierung von Reatriktionsfragmenten und die Durchführung unidirektionaler Delegationen mit dem Enzym Exonuklease III kann die das Gen für die beta-Glukanase umgebende Fremd-DNS in bekannter Weise weitgehend entfernt werden/8/. Nach einer Transformation in Eecherichia coli kann man zeigen, daß ein DNS-Fragment von 900 Basenpaaren noch beta-Glukanase exprimiert und demzufolge das vollständige Gen für die beta-Glukanase enthalten muß. Die Expressionshöhe der beta-Glukanase ist bei verschiedenen Vektoren durchaus unterschiedlich; auffallenderweise erhält man bei Verwendung des Escherichia-coli-Plasmids pBR322 und einem DNS-Fragment mit dem Gen für beta-Glukanase eine um etwa 40mal höhere Enzymaktivität, als sie mit dem Donorstamm E138 erzielt wird. Durch Transformation eines Escherichia-coli-Stammes mit einem rekombinanten Vektorplasmid pBR 12/2 (siehe Ausführungsbeispiel) erhält man etwa die gleiche Menge beta-Glukanase wie aus einem Produktionsstamm für mesophile beta-Glukanase von Bacillus amyloliquefaciens BE20/78/9/. Gereinigte Enzympräparate, die aus dem KuKurfiltrat von Bacillus macerans und aus Escherichia-coli-Zellen mit dem Vektorplasmid pBR 12/2 isoliert werden, haben die gleichen Eigenschaften: bei 650C und in Gegenwart von Kalziumionen werden 50% der Enzymaktivität nach 40minütiger Inkubation erreicht.
Überraschenderweise ist die Expression de« Gens für beta-Glukanase aus einem Donorstamm von Bacillus macerans besonders hoch in einem Stamm von Bacillus subtilis und liegt etwa 30mal höher als in dem Donorstamm E138 von Bacillus macerans selbst. Deshalb sind für eine wirtschaftliche industrielle Herstellung Mikroorganismus-Stämme besonders geeignet, die mit Bacillus subtilis oder Bacillus amyloliquefaciens verwandt sind bzw. diese selbst, weil sie die beta-Glukanase in das Kulturmedium sekretieren und die mit dem Aufschluß der Zellen in der Praxis unvermeidlich auftretenden Schwierigkeiten wegfallen.
Besondere Sorgen bei der Anwendung gentechnisch manipulierter Mikroorganismus-Stämme bereitet ihre hohe Instabilität. Um ein rekombinantes Vektorplasmid in einer Zelle zu erhalten, ist die Zugabe von Antibiotika in das Kulturmedium eigentlich unumgänglich. Es ist bereits bekannt, daß das Streptokokken-Plasmid pDB 101 in Bacillus subtilis und in ähnlichen Mikroorganismus-Stämmen außerordentlich stabil ist; so wurde es erfolgreich für die Herstellung von beta-Glukanase aus Bacillus amyloliquefaciens in industriellen Mirkoorganismus-Stämmen eingesetzt/2/. Allerdings ist die Sequenz von beta-Glukanase aus Bacillus subtilis und von beta-Glukanase aus Bacillus amyloliquefaciens weitgehend homolog/8/, während sich die Sequenz von beta-Glukanase aus Bacillus macerans sehr deutlich von jenen unterscheidet. Es ist deshalb durchaus überraschend, daß ein DNS-Fragment mit dem Gen der beta-Glukanase aus Bacillus macerans ebenfalls—ohne Selektionsdruck durch ein Antibiotikum — im Kulturmedium stabil erhalten wird.
Für eine ausreichende Absenkung der Viskosität der Braumaische genügt der Zusatz von erfindungsgemäß hergestellter beta-Glukanase von weniger als 50% der Aktivität mesophiler beta-Glukanasen.
Ausfuhrungsbefspiele
In den folgenden drei Ausführungsbeispielen wird die Erfindung an Hand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen
Fig. 1: ein DNS-Fragment, kloniert aus Bacillus macerans, das das Gen für beta-Glukanase (abgekürzt: bgl) enthält, Fig. 2: die Struktur der Vektorplasmide pBR 11 /4 und pBR 12/2 und die Konstruktion eines Plasmids pUC 19/1 (mit den
Abkürzungen Bl für BamHI, SHI für SflulllA, Pl für Pstl, El für EcoRI und BII für BgIII) und Fig.3: die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids pBMG1 aus dem Vektorplasmid pDB 101 und dem PlasmidpUC 19/1 (mit den Abkürzungen Hptt für HpaM, HpI für Hpal, HW für Hindlil und И für ,invertiert repetitive Sequenz'}.
BeispieM
Klonierung des Gens für thermostabile beta-Glukanase
Chromoeomale DNS von Bacillus macerans E138 wird mit einem Restrulctionsenzym Sau3A partiell verdaut. 20 Mikrogramm dieser DNS werden mit Б Mikrogramm des Vektorplasmids pBR 322 (linearisiert mit BamH 1) ligiert und in Escherichia-coli-DHS-Zellen transformiert. Es entstehen etwa 20000 ampicillinresistente Transformanten; davon sind etwa 20% sensitiv gegenüber Tetrazyklin infolge der Inaktivierung des Resistenz-Gens durch inserierte Fremd-DNS. Die Anwesenheit des Gens für die beta-Glukanase wird durch Plattierung dertetrazyklin-empfindlichen Transformanten auf Lichenin-Agar geprüft. Nach Überschichten mit 0,1 %iger Lösung von Kongorot werden Kolonien gefunden, die einen Hydrolyse-Hof aufweisen. Ein Teil der beta-glukanasepositiven Klone wird isoliert und die Plasmid-DNS präpariert. Die DNS der Vektorplasmide pBR 11 /4 und pBR 12/2 wird mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, und die erhaltenen DNS-Fragmente werden durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert.
Beide Vektorplasmide haben eine homologe Region mit den Restriktionsorten Pst1, EcoR5 und Hpa 1.
Zunächst wird eine Subklonierung des EcoR 1-BgI 2-Fragmentes von pBR 12/2 in ein Vektorplasmid pUC 19/10/ durchgeführt, bei der ein resultierender Klon pUC 19/1 erhalten wird, der eine lichenin-hydrolysierende Aktivität hat, die durch ein 2600-Basenpaare-DNS-Fragment kodiert wird. Werden ferner verschiedene Teile dieses DNS-Fragments weiter subkloniert, dann zeigt sich, daß das Gen für die beta-Glukanase auf einem 1800 Basenpaare langen Pst 1-BgI 12-Abschnitt des DNS-Fragmentes lokalisiert ist.
Eine unidirektionale Deletion des so gewonnenen Vektorplasmids pUC 19/A wird in folgender Weise durchgeführt.
4 Mikrogramm Plasmid-DNS werden mit den Restriktionsenzymen Kpn 1 und Sa11 verdaut. In einem Gesamtvolumen von 10 Mikrogramm wird die Plasmid-DNS mit 1 Mikroliter Exonuklease III bis zu 5 Minuten bei 300C inkubiert. Jeweils in 1 minütigen Abständen werden 2 Mikroliter Aliquote aus dem Ansatz entfernt. Jede Probe wird bei 700C mit 3 Mikroliter Wasser gemischt und anschließend auf Eis gelagert. Zur Entfernung der einzelsträngigen DNS werden 3 Mikroliter S 1-Nuklease zusammen mit 1S Mikroliter S1 -Puffer zu jeder Probe hinzugefügt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von S Mikroliter 0,8 M-Tris/HCL-Puffer pH 8 gestoppt. Die deletierten Vektorplasmide werden rezirkularisiert und in Escherichia coli transformiert. Außer für beta-Glukanase negativen Klonen werden auch dafür positive gefunden mit einem DNS-Insert von nur 8SO Basenpaaren (s. Anlage 1). Damit kann das Gen für die beta-Glukanase innerhalb des zugehörigen DNS-Fragmentes des Vektorplasmids pUC 19/A lokalisiert werden.
Das DNS-Fragment hat Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Pvull (Bp.34), Hinfl (Bp.92 und 146), Hpall (Bp. 130), Accl (Bp.213und420), EcoRV (Bp. 376), Mbol (Bp. 505), Haell (Bp. 701) und Dral (Bp. 789). Subklonierungen mit verschiedenen Restriktionsfragmenten zeigen, daß die genetische Information für die beta-Glukanase zwischen den Basenpaaren 34 und 789 lokalisiert ist, das heißt, 755 Nukleotide sind ausreichend für die Expression der beta-Glukanase aus Bacillus macerans (Fig. 1).
Nach einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese der gereinigten beta-Glukanase ergibt sich dessen Molekulargewicht zu etwa 23kD. Antikörper, die mittels gereinigter beta-Glukanase von Bacillus amyloliquefaciens hergestellt werden, zeigen keine oder nur eine schwache Kreuzreaktion mit dem Bacillus-macerans-Enzym, ebenso wie Antikörper für beta-Glukanase von Bacillus macerans nur sehr schwach reaktiv mit dem Bacillus-amyloliquefaciens-Enzym sind.
Das Temperatur-Optimum der beta-Glukanase von Bacillus macerans liegt bei 60 bis 650C und damit um etwa lOgrd über dem der mesophilen beta-Glukanasen von Bacillus subtilis oder Bacillus amyloliquefaciens.
Beispiel 2
Expression des Gens für thermostabile beta-Glukanase in Escherichia coli
Zur Überprüfung der Bildungsrate an beta-Glukanase können verschiedene Plasmide, die das Gen für die beta-Glukanase aus Bacillus macerans enthalten (Fig. 2), in Escherichia coli transformiert werden; die transformierten Stämme werden 24 Stunden in einem Glukose-Pepton-Medium — Kulturvolumen: 50ml—bei 37°C und 220min"1 geschüttelt. Die Aktivität der beta-Glukanase in den durch Ultraschall-Behandlung hergestellten Zellextrakten wird in üblicherweise mit Lichenin als Substrat bestimmt.
Das Ergebnis ist in Tabelle 1 festgehalten. Eine Enzym-Einheit ist dabei als diejenige Menge Enzym definiert, die eine Freisetzung von reduzierender Substanz—äquivalent einem Mikromol Glukose—bewirkt.
Tabelle 1: Vergleich der Bildung von beta-Glukanase mit verschiedenen Donostämmen und Vektorplasmiden
Donorstamm Vektorplasmid beta-Glukanase
in E/ml h
Вас. macerans E138 _ 0,49
Вас. amylotiquefa- — 19,3
ciens BE 20/78
Escher, coli DH 5 PBR322 0
Escher, coli DH 5 pBRH/4 28,7
Escher, coii DH 5 PBR12/2 20,0
Escher, coli DH 5 PUC19/1 11,3
Zum Vergleich ist die Aktivität in der Kulturflüssigkeit des DonorstammesE138 von Bacillus macerans und eines zur industriellen Verwendung bestimmten Stammes BE 20/78 von Bacillus amyloliquefaciens/2/ angegeben, die unter gleichen Bedingungen erhalten wird. Es ist zu sehen, daß Stamme mit rekombinanten Vektorplasmiden eine bis zum 40fachen gesteigerte Produktion von beta-Glukanase erreichen im Vergleich zum Donorstamm. Das quantitative Niveau der von den transformierten Escherichiacoli-Stämmen gebildeten Aktivität liegt dabei in der Größenordnung industrieller Bacillus-Produktions-Stämme.
Beispiel 3
Expression des Gens für thermostabile beta-Glukanase in Bacillus subtilis
Als Vektorplasmid für die Expression in Bacillus wird das Streptokokken-Plasmid pDB101 genutzt (Fig.3). 0,5 Mikrogramm Plasmid-DNS werden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Hpall geschnitten. Ein DNS-Fragment mit dem Gen für die beta-Glukanase von Bacillus macerans wird durch Verdauung von 0,5 Mikrogramm des Plasmides pUC 19/1 mit den Restruktionsenzymen EcoRI und Hpal erhalten. Das DNS-Fragment wird ligiert und das Ligationsgemisch — das rekombinante Plasmid pBMG 1 — in kompetente Bacillus-subtilis-Zellen transformiert, die nach SPIZIZEN präpariert sind/11/. Als Wirtsstamm wird ein glukanase-defizienter Stamm BG 314/12/verwendet. Mit 0,1 Mikrogramm des Ligationsgemsiches werden etwa 100 Transformanten erhalten, von denen stets einige zur Produktion von beta-Glukanase befähigt sind. Die Isolate werden zur Präparation von Plasmid-DNS verwendet und durch Retransformation und Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Zur Überprüfung der Stabilität der gewonnenen Vektorplasmide wird der Stamm BG 314, der mit einem der Vektorplasmide transformiert ist, 30 Generationen lang in erythromycin-freiem Kulturmedium (Glukose-Nährbouillon) ohne Selektionsdruck kultiviert. Anschließend wird die Kultur in geeignetere Verdünnung auf Nähr-Agar ausplattiert, so daß bis zu 200 Kolonien auf einer Petrischale wachsen. Anschließend wird auf antibiotikumhaltigem Lichenin-Agar—5 Mikrogramm/ml Erythromyzin — und Nähr-Agar überstempelt. Auf beiden Kulturmedien wächst die gleiche Anzahl Kolonien, die alle auf Lichenin-Agar Lyse-Zonen ausbilden. Nach 30 Generationen Wachstum in antibiotikum-freien Kulturmedium werden 0,5 ml in 50 ml Glukose-Nährbouillon überimpft und 24h bei 376C geschüttelt. Es zeigt sich, daß die Aktivität für beta-Glukanase im Kulturmedium etwa 3,0 E/ml · h beträgt, gleichgültig, ob dabei Erythromyzin zugesetzt wird oder nicht. Damit liegt aber die Aktivität etwa 6mal höher als in dem Donorstamm E 318 von Bacillus macerans.
Literatur
1 Borries, R., u. Schröder, K.-L, Zbl.Bakt. II. Abt., 136 (1981), S. 324-329.
2 DD-PS 226012.
3 Borriss, R., u. Zemek, J., Zbl.Bakt. II. Abt., 136<1981), S.63-69.
4 Borriss, R., Biotechnology Weinheim, 7a, S. 35-62.
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6 Bolivar, F., et al., Gene 2 (1977), S. 95-113.
7 Behnke, D., u. Ferretti, J. F., Plasmid 4 (1980), S. 130-138.
8 Hofemeister, J., et al., Gene 49 (1986), S. 177-187.
9 Borriss, R., Bäumlein, H., u. Hofemeister, J.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 22 (1985), S.63-71.
10 Messing, J., Methods Enzymol. 101 (1983), S.20ff.
11 Anagnostopoulos, C/Spizizen, J.,J.Bacteriol.81 (1961), S. 741-746.
12 Borris, R., et al., J. Gen. Microbiol. 132 (1986), S. 431-442.
Anlage 1
-90 -80 -70 -АО -50 -40 -30 -20 -10 t*t *«« «t* A6C TCe 8AT ATA СТА TAA TTA CCC А66 TAA AAT ATT CCA АСА CCG Т66 CTC CAT AAC TTC GTT CAT ATT TAA AAT CAT TTT 66A GGT 6CA
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90 100 110 120 130 140 ISO 160 170
6ТБ TTC TG6 BAA CCA TTA AGT TAT TTT AAT CCG AGT AC6 GAA AAG 6CA GTG 6TA TCC AAT В6Б 666 T6T TCA ATT 6CA CAT 6CT 6CC AAC VaI Phe Trp GIu Pro Leu Ser Tyr Phe Asn Pro Ser Thr GIu Lys Ala VaI VaI Ser Asn GIy GIy Cys Ser lie Ala His Ala Ala Asn
180 190 200 210 220 230 240 250 260
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270 280 290 300 310 320 330 340 350
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360 370 380 390 400 410 420 430 440
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450 460 470 480 490 500 510 520 530
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540 550 560 570 580 590 600 610 620
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630 640 650 660 670 680 690 700 710
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720 730 740 750 ι ι ι ι T6C ABC Τ66 BCA Τ6Α 6CT TTT TAB TCC ACT CCA 66C AT6 С

Claims (6)

  1. Patentansprüche:
    1. Verfahren zur Herstellung von thermostabiler Bacillus-beta-1,3-1,4-Glukanase, wobei
    - ein geeignetes Gen für diese Glukanase isoliert und
    - mittels eines Vektors in einem Mikroorganismus-Stamm exprimiert wird und wobei ferner
    - eine stabile Expression dieses Gens gewährleistet ist, ohne daß Zusätze von Antibiotika gebraucht werden,
    dadurch gekennzeichnet, daß
    - das Gen aus einem Donarstamm von Bacillus macerans gewonnen und
    - unter Verwendung eines Bacillus subtilis oder Bacillus amyloliquefaciens-Stammes zur Expression gebracht wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für die beta-Glukanase aus einem Donarstamm E 138 von Bacillus macerans gewonnen wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektor ein Vektorplasmid verwendet wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektor ein Escherichia-coli-Plasmid pBR 322 verwendet wird.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektor ein Streptokokken-Plasmid pDB 101 verwendet wird.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Gens mittels einer wäßrigen Lösung von Kongorot, mit der der Lichenin enthaltende Agar überflutet ist, nachgewiesen wird.
DD31570688A 1988-05-12 1988-05-12 Verfahren zur Herstellung von thermostabiler Bacillus-beta-1,3-1,4-Glukanase DD272102B5 (de)

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EP0707640A4 (de) * 1993-07-07 2000-10-11 Biomolecular Res Inst Ltd (1 $m(7) 3, 1 $m(7) 4)-$9(b)-GLUCANOX MIT ERHÖHTER STABILITÄT
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