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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft α-Amylasenmutanten,
in die eine oder mehrere Disulfidbindungen eingeführt sind.
Insbesondere werden die Disulfidbindungen durch Mutation eines α-Amylasenvorläufers eingeführt, um
einen oder mehrere Cysteinreste einzuführen, so dass eine Disulfidbindung
zwischen zwei Cysteinresten in der α-Amylasenmutante erzeugt wird. Es ist
speziell vorgesehen, dass die Mutante veränderte Leistungsdaten, wie
z.B. veränderte
Stabilitäts-
und/oder veränderte
Aktivitätsprofile,
aufweist.
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Hintergrund
der Erfindung
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α-Amylasen
(α-1,4-Glucan-4-glucanohydrolase,
EC 3.2.1.1) hydrolysieren auf weitgehend zufällige Weise interne α-1,4-glykosidische
Bindungen in Stärke,
um Maltodextrine mit niedrigerem Molekulargewicht zu erzeugen. α-Amylasen
weisen einen beträchtlichen
Handelswert auf und werden in den Anfangsphasen (Verflüssigung)
der Stärkeverarbeitung,
bei der Alkoholherstellung, als Reinigungsmittel in Waschmittelmatrices
und in der Textilindustrie für
die Stärkeentschlichtung
verwendet. α-Amylasen werden von
einer Vielzahl von Mikroorganismen, einschließlich Bacillus und Aspergillus,
produziert, wobei die meisten kommerziellen Amylasen aus Bakterienquellen,
wie z.B. Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus
subtilis oder Bacillus stearothermophilus, hergestellt werden. In
den letzten Jahren sind bevorzugte Enzyme bei der kommerziellen
Verwendung jene aus Bacillus licheniformis gewesen, und zwar aufgrund
ihrer Hitzestabilität und
Leistungsfähigkeit
unter industriellen Betriebsbedingungen.
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Im
Allgemeinen besteht die Verarbeitung von Stärke zu Fructose aus vier Schritten:
Verflüssigung
von gekörnter
Stärke,
Verzuckerung der verflüssigten
Stärke
zu Dextrose, Reinigung und Isomerisierung zu Fructose. Das Ziel
des Stärkeverflüssigungsprozesses
ist die Umsetzung einer konzentrierten Suspension von Stärkepolymerkörnern zu
einer Lösung
von löslichen
kürzerkettigen
Dextrinen niedriger Viskosität.
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Dieser
Schritt ist für
die praktische Handhabung mit Standardanlagen und für die effiziente
Umsetzung zu Glucose oder anderen Zuckern essentiell. Um Stärkekörner zu
verflüssigen,
ist es notwendig, die Körner durch
Temperaturerhöhung
der Stärkekörner auf
mehr als ungefähr
72°C zu
gelatinieren. Der Erwärmungsvorgang
zerstört
die unlöslichen
Stärkekörner sofort,
um eine wasserlösliche
Stärkelösung zu
erzeugen. Die Lösung
der solubilisierten Stärke
wird dann durch α-Amylase
(EC 3.2.1.1) verflüssigt.
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Ein
gebräuchliches
enzymatisches Verflüssigungsverfahren
umfasst das Stellen des pH-Werts einer Stärkekörneraufschlämmung auf zwischen 6,0 und
6,5, das pH-Optimum der von Bacillus licheniformis stammenden α-Amylase,
mit der Zugabe von Calciumhydroxid, Natriumhydroxid oder Natriumcarbonat.
Die Zugabe von Calciumhydroxid hat den Vorteil, dass sie auch Calciumionen
bereitstellt, die bekanntermaßen
die α-Amylasen
gegen Inaktivierung stabilisieren. Nach Zugabe von α-Amylasen
wird die Suspension durch einen Dampfstrahl gepumpt, um die Temperatur
sofort auf zwischen 80 und 115°C
zu erhöhen.
Die Stärke
wird sofort gelatiniert und aufgrund der Anwesenheit von α-Amylasen
durch Zufallshydrolyse von α(1-4)-glykosidischen Bindungen
zu einer flüssigen
Masse depolymerisiert, die leicht gepumpt werden kann.
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In
einer zweiten Variante des Verflüssigungsverfahrens
wird α-Amylase
der Stärkesuspension
zugegeben, die Suspension bei einer Temperatur von 80–100°C gehalten,
um die Stärkekörner teilweise
zu hydrolysieren, und die teilweise hydrolysierte Stärkesuspension
durch eine Düse
bei Temperaturen von mehr als ungefähr 105°C gepumpt, um jegliche verbleibende
Körnerstruktur
gründlich
zu gelatinieren. Nach dem Abkühlen der
gelatinierten Stärke
kann eine zweite Zugabe von α-Amylase
vorgenommen werden, um die Stärke
weiter zu hydrolysieren.
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Eine
dritte Variante des Verfahrens wird Trockenmahlverfahren genannt.
Beim Trockenmahlverfahren wird Vollkorn gemahlen und mit Wasser
vereinigt. Der Keim wird gegebenenfalls durch Flotationstrennung
oder gleichwertige Verfahren entfernt. Das resultierende Gemisch,
das Stärke,
Fasern, Protein und andere Komponenten des Korns enthält, wird
unter Verwendung von α-Amylase
verflüssigt.
Wenn das Trockenmahlverfahren verwendet wird, ist die allgemeine
Praxis auf dem Gebiet der Erfindung die Durchführung der enzymatischen Verflüssigung
bei einer niedrigeren Temperatur. Im Allgemeinen wird angenommen,
dass bei der Umsetzung von Stärke
zu löslichen
Dextrinen die Verflüssigung
bei niedriger Temperatur weniger effizient ist als die Verflüssigung
bei hoher Temperatur.
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Typischerweise
wird die Stärkelösung nach
Gelatinierung in Anwesenheit von α-Amylase bei einer
erhöhten
Temperatur belassen, bis ein DE von 10–20 erreicht ist, üblicherweise
für einen
Zeitraum von 1–3
Stunden. Dextroseäquivalent
(DE) ist der Industriestandard für
die Messung der Gesamtkonzentration an reduzierenden Zuckern und
berechnet sich als D-Glucose auf Trockengewichtsbasis. Das unhydrolysierte
Stärkekorn hat
ein DE von nahezu Null, wogegen das DE von D-Glucose mit 100 festgelegt
ist.
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Die
Maximaltemperatur, bei der eine α-Amylase
enthaltende Stärkelösung belassen
werden kann, hängt
von der Mikroorganismenquelle, aus der das Enzym erhalten wurde,
und von der Molekülstruktur
des α-Amylasenmoleküls ab. Von
Bacillus-subtilis- oder Bacillus-amyloliquefaciens-Stämmen der
Wildform produzierte α-Amylasen
werden aufgrund der übermäßigen thermischen
Inaktivierung bei mehr als 90°C
typischerweise bei Temperaturen von nicht mehr als 90°C verwendet,
wogegen von Bacillus-licheniformis-Stämmen der Wildform produzierte α-Amylasen
bei Temperaturen von bis zu ungefähr 110°C verwendet werden können. Die Gegenwart
von Stärke
und Calciumionen stabilisiert bekanntermaßen α-Amylasen gegen Inaktivierung.
Trotzdem werden α-Amylasen
bei pH-Werten über
6 verwendet, um sie gegen rasche Inaktivierung zu schützen. Bei
niedrigen Temperaturen zeigt α-Amylase
aus Bacillus licheniformis bekanntermaßen Hydrolyseaktivität an Stärkesubstrat
bei so niedrigen pH-Werten wie 5. Wenn das Enzym jedoch für die Stärkehydrolyse
bei herkömmlichen
Düsentemperaturen,
z.B. zwischen 102°C
und 109°C,
verwendet wird, muss der pH auf mehr als zumindest 5,7 gehalten
werden, um eine übermäßig rasche
Inaktivierung zu vermeiden. Die pH-Anforderung sorgt leider für ein sehr
schmales Verarbeitungsfenster, da pH-Werte über 6,0 in unerwünschte Nebenprodukte,
z.B. Maltulose, resultieren. Daher wird der Verflüssigungs-pH
in der Praxis im Allgemeinen zwischen 5,9 und 6,0 gehalten, um eine
zufrieden stellende Ausbeute an hydrolysierter Stärke zu erlangen.
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Ein
weiteres mit dem Verflüssigungs-pH
zusammenhängendes
Problem ist die Notwendigkeit, den pH-Wert der Stärkesuspension
von ungefähr
4, dem pH-Wert einer Maisstärkesuspension
wie sie aus der Nassmahlstufe hervorgeht, auf 5,9 bis 6,0 zu erhöhen. Diese
pH-Einstellung erfordert die kostspielige Zugabe von säureneutralisierenden
Chemikalien und erfordert außerdem
eine zusätzliche
Ionentauscher-Raffination des endgültigen Stärkeumsetzungsprodukts, um die
Chemikalie zu entfernen. Darüber
hinaus erfordert der nächste
Verfahrensschritt nach der Verflüssigung,
typischerweise die Verzuckerung der verflüssigten Stärke zu Glucose mit Glucoamylase,
einen pH-Wert von 4–4,5;
daher muss der pH von 5,9–6,0
auf 4–4,5
zurückgestellt
werden; dies erfordert weitere Chemikalienzugabe- und Raffinationsschritte.
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Im
Anschluss an die Verflüssigung
wird die verarbeitete Stärke
mit Glucoamylase zu Glucose verzuckert. Ein Problem mit dem gegenwärtigen Prozess
tritt auf, wenn Reststärke
aufgrund einer unvollständigen Verzuckerung
der Stärke,
z.B. aufgrund ineffizienter Amylose-Hydrolyse durch Amylase, im
Verzuckerungsgemisch verbleibt. Reststärke ist gegen Glucoamylase-Hydrolyse
höchst
resistent. Sie bedeutet einen Ausbeuteverlust und stört die Downstream-Filtration
der Sirupe.
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Außerdem erfordern
viele α-Amylasen
bekanntermaßen
die Zugabe von Calciumionen für
die Stabilität.
Dies verursacht eine weitere Erhöhung
der Kosten der Verflüssigung.
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Im
US-Patent Nr. 5.322.778 wurde eine Verflüssigung zwischen pH 4,0 und
6,0 durch Zugeben eines Antioxidans wie z.B. Bisulfit oder eines
Salzes davon, Ascorbinsäure
oder eines Salzes davon, Erythorbinsäure oder von phenolischen Antioxi dantien
wie z.B. butyliertem Hydroxyanisol, butyliertem Hydroxytoluol oder α-Tocopherol
zur Verflüssigungsaufschlämmung erzielt.
Nach diesem Patent muss Natriumbisulfit in einer Konzentration von
mehr als 5 mM zugegeben werden.
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Im
US-Patent Nr. 5.180.669 wurde eine Verflüssigung zwischen pH 5,0 und
6,0 durch die Zugabe von Carbonationen im Überschuss zur für die Pufferung
der Lösung
benötigten
Menge zur gemahlenen Stärkeaufschlämmung erzielt.
Aufgrund eines erhöhten
pH-Werts, der mit der Zugabe von Carbonationen auftritt, wird die
Aufschlämmung
im Allgemeinen durch Zugaben einer Wasserstoffionenquelle, beispielsweise
einer anorganischen Säure,
wie z.B. Salzsäure
oder Schwefelsäure,
neutralisiert.
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In
der PCT-Anmeldung Nr. WO 95/35382 wird eine α-Amylasenmutante mit verbesserter
Oxidationsstabilität
beschrieben, die Änderungen
an den Positionen 104, 128, 187 und/oder 188 in der B.-licheniformis-α-Amylase
aufweist.
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In
der PCT-Anmeldung Nr. WO 96/23873 werden α-Amylasenmutanten beschrieben,
die beliebige einer Reihe von Mutationen aufweisen.
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In
der PCT-Anmeldung Nr. WO 94/02597 wird eine α-Amylasenmutante mit verbesserter
Oxidationsstabilität
beschrieben, worin ein oder mehrere Methionine durch beliebige Aminosäuren mit
Ausnahme von Cystein oder Methionin ersetzt sind.
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In
der PCT-Anmeldung Nr. WO 94/18314 wird eine α-Amylasenmutante mit verbesserter
Oxidationsstabilität
beschrieben, worin ein oder mehrerer von Methionin-, Tryptophan-,
Cystein-, Histidin- oder Tyrosinrest(en) durch eine nicht-oxodierbare
Aminosäure
ersetzt ist.
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In
der PCT-Anmeldung Nr. WO 91/00353 werden die mit der Verflüssigung
mit der Bacillus-licheniformis-α-Amylase
in Zusammenhang stehenden Leistungsdaten und Probleme angegangen,
indem die α-Amylase
genetisch so manipuliert wird, dass sie die spezifischen Substitutionen
Ala-111-Thr, His-133-Tyr und/oder Thr-149-IIe enthält.
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WO
96/39528 beschreibt Alpha-Amylase-Enzyme mit veränderten Aktivitäts- und
Stabilitätsprofilen, bei
denen ein oder mehrere Asparaginreste durch Substitution oder Deletion
mutiert sind.
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In
Protein Engineering 8(10), 1029–1037
(1995), beschreiben Declerck et al. die Substitution von His133
und Ala209 in B.-licheniformis-Alpha-Amylase durch alle 19 anderen
Aminosäurereste
und beschreiben die daraus folgenden Wirkungen auf die Stabilität.
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Untersuchungen
unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, um zu erforschen,
welche Reste für
die katalytische Aktivität
von Amylasen von Bedeutung sind, und/oder um die Wirkung der Modifizierung gewisser
Aminosäuren
innerhalb der aktiven Stelle verschiedener Amylasen und Glycosylasen
zu erforschen, sind von verschiedenen Forschern durchgeführt worden
(Vihinen et al., J. Biochem. 107, 267–272 (1990); Holm et al., Protein
Engineering 3, 181–191
(1990); Takase et al., Biochemica et Biophysica Acta 1120, 281–288 (1992);
Matsui et al., FEBS Letters 310, 216–218 (1992); Matsui et al.,
Biochemistry 33, 451–458 (1992);
Sogaard et al., J. Biol. Chem. 268, 22480–22484 (1993); Sogaard et al.,
Carbohydrate Polymers 21, 137–146
(1993); Svensson, Plant Mol. Biol. 25, 141–157 (1994); Svensson et al.,
J. Biotech. 29, 1–37
(1993)). Forscher haben auch untersucht, welche Reste für die thermische
Stabilität
von Bedeutung sind (Suzuki et al., J. Biol. Chem. 264, 18933–18938 (1989);
Watanabe et al., Eur. J. Biochem. 226, 277–283 (1994)); und eine Gruppe
hat derartige Verfahren verwendet, um Mutationen an verschiedenen
Histidinresten in eine Bacillus-licheniformis-Amylase einzuführen mit
der Begründung,
dass Bacillus-licheniformis-Amylase, die bekanntermaßen im Vergleich
zu anderen ähnlichen
Bacillus-Amylasen relativ thermostabil ist, einen Überschuss
an Histidinen aufweist; daher wurde vorgeschlagen, dass das Ersetzen
eines Histidins die Thermostabilität des Enzyms beeinflussen könnte. Die
Arbeit resultierte in der Identifizie rung von stabilisierenden Mutationen
am Histidinrest an der +133-Position und am Alaninrest an Position
+209 (Declerck et al., J. Biol. Chem. 265, S. 15481–15488 (1990);
FR 2 665 178-A1; Joyet et al., Bio/Technology 10, 1579–1583 (1992)).
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Die
Einführung
von Disulfidbindungen in Proteine durch ortsgerichtete Mutagenese
bietet ein Mittel zur Stabilisierung von nativen, gefalteten Konformationen,
siehe z.B. Villafranca et al., Science 222, 782–788 (1983). Hazes et al.,
Prot. Eng. 2(2), 119–125
(1988), schlagen die Einführung
von Disulfidbindungen in ein Protein durch einen Modellierungsalgorithmus
vor, der mit der Erzeugung der Cβ-Position
aus den aus einem bekannten dreidimensionalen Modell verfügbaren N-,
Cα- und
C-Atompositionen beginnt. Ein erster Satz von Resten wird auf Basis
der Cβ-Cβ-Abstände gewählt; es
werden diejenigen Sγ-Positionen
erzeugt, welche die Anforderung erfüllen, dass der Abstand zwischen
dem Sγ von
Rest 1 und Cβ von
Rest 2 in einem Paar (durch den Bindungswinkel an Sγ2 ermittelt)
bei idealen Werten für
die Cα-Cβ- und Cβ-Sγ-Bindungslängen und
für den
Bindungswinkel an Cβ den
idealen Wert einnimmt oder diesem sehr nahe kommt; und es werden
die beiden annehmbaren Sβ-Positionen für jedes
Cystein festgestellt und die vier verschiedenen Konformationen für jede Disulfidbindung
ermittelt. Schließlich
werden die vier Konformationen einem Energieminimierungsverfahren
unterzogen, um große
Abweichungen von der idealen Geometrie zu beseitigen und ihre endgültigen Energien
zu berechnen. Sowdhamini et al., Prot. Eng. 3(2), 95–103 (1989),
offenbaren, dass die Einführung
von Disulfidbindungen in Proteine durch ortsgerichtete Mutagenese
ein Mittel der Stabilisierung nativer gefalteter Konformationen
bietet, und schlägt
Computermodellierungstechniken zur Beurteilung der stereochemischen Eignung
von Restepaaren in Proteinen als mögliche Stellen zur Einführung von
Cystein-Disulfid-Vernetzungen vor. Die Autoren schlagen vor, dass
die elementare Bedingung zur Erwägung
von Restepositionen in Proteinen als mögliche Stellen für die Cysteineinführung zur
Erzeugung von spannungsfreien Disulfiden jene ist, dass der Alpha-Kohlenstoff-Abstand
zwischen den beiden über
die Disulfidbindung zu verbindenden Cysteinresten (Cα-Cα) weniger
als oder gleich 6,5 Angström
beträgt
und dass der Beta-Kohlen stoff-Abstand zwischen den beiden über die
Disulfidbindung zu verbindenden Cysteinresten (Cβ-Cβ) weniger als oder gleich 4,5
Angström beträgt.
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Trotz
der früher
auf dem Gebiet der Erfindung erzielten Fortschritte besteht ein
Bedarf an einer α-Amylase,
die in kommerziellen Verflüssigungsverfahren
effektiver ist, die jedoch eine Aktivität bei niedrigeren als gegenwärtig praktikablen
pH-Werten ermöglicht.
Außerdem
besteht ein Bedarf an verbesserten Amylasen mit Eigenschaften, die
sie unter den Bedingungen der Waschmittelverwendung effektiver machen.
Da im Handel erhältliche
Amylasen unter vielen Bedingungen aufgrund von Stabilitätsproblemen
inakzeptabel sind, beispielsweise aufgrund der hohen Alkalinität von Waschmitteln
und den hohen darin enthaltenen Oxidationsmittelmengen (Bleichmittelmengen)
oder Temperaturen, bei denen sie angewendet werden, besteht ein
Bedarf an einer Amylase mit veränderten,
vorzugsweise erhöhten,
Leistungsprofilen unter diesen Bedingungen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine α-Amylase mit veränderten
Leistungsprofilen bereitzustellen.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine α-Amylase
mit verbesserter Stabilität
bei hoher Temperatur bereitzustellen.
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Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung eine α-Amylasenmutante
bereit, in die ein oder mehrere Cysteinreste eingeführt sind,
worin zumindest einer der eingeführten
Cysteinreste fähig
ist, eine Disulfidbindung mit einem anderen Cysteinrest auszubilden.
Das/die eingeführte(n)
Cystein(e) und der andere Cysteinrest, mit dem es eine Disulfidbindung
bilden soll, entsprechen Positionen im α-Amylasenvorläufer mit
einem Cα-Cα-Bindungsabstand
zwischen ungefähr
4,4 und 6,8 Angström
einem Cβ-Cβ-Bindungsabstand von zwischen
ungefähr
3,45 und 4,5 Angström.
In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt
die α-Amylase
von ei ner Bakterien- oder Pilzquelle und umfasst eine Substitution,
die E119C/5130C- und/oder
D124C/R127C-Bacillus-licheniformis entspricht. Insbesondere bevorzugt
stammt die α-Amylase
von Bacillus.
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Die
Erfindung umfasst außerdem
Nucleinsäuren,
die für
solche Amylasenmutanten kodieren, Vektoren, die solche Nucleinsäuren enthalten,
Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert sind, und Verfahren
der Expression von α-Amylasenmutanten
unter Einsatz solcher Wirtszellen.
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Die
Erfindung umfasst außerdem
die Verwendung der α-Amylasenmutanten
gemäß der Erfindung
zur Verflüssigung
von Stärke
im Stärkeverarbeitungsweg
zu Glucose und anderen Stärkederivaten,
als Zusatz in Detergenzien, wie z.B. in Waschmitteln und Geschirrspülmitteln,
als Backhilfe und für
die Entschlichtung von Textilien.
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Kurzbeschreibung
der Abbildungen
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1 illustriert
die Regionen der Sekundärstruktur,
die durch die Einführung
von E119C/S130C und D124C/R127C, welche Bacillus-licheniformis-α-Amylase
entsprechen, stabilisiert werden.
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2 illustriert
die DNA-Sequenz des Gens für α-Amylase
aus Bacillus licheniformis (NCIB 8061) (Seq.-ID Nr. 1) und die abgeleitete
Aminosäuresequenz
des Translationsprodukts (Seq.-ID Nr. 2), wie von Gray et al., J.
Bacteriology 166, 635–643
(1986), beschrieben.
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3 illustriert
die Aminosäuresequenz
(Seq.-ID Nr. 3) des reifen α-Amylaseenzyms
aus Bacillus licheniformis.
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4 illustriert
eine Angleichung der Primärstrukturen
von drei Bacillus-α-Amylasen.
Die Bacillus-licheniformis-α-Amylase
(Am-Lich) (Seq.-ID Nr. 4) wird von Gray et al., J. Bacteriology
166, 635–643
(1986), beschrieben; die Bacillus-amyloliquefaciens-α- Amylase (Am-Amylo)
(Seq.-ID Nr. 5) wird von Takkinen et al., J. Biol. Chem. 258, 1007–1013 (1983),
beschrieben; und die Bacillus-stearothermophilus-α-Amylase
(Am-Stearo) (Seq.-ID Nr. 6) wird von Ihara et al., J. Biochem. 98,
95–103
(1985), beschrieben.
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5 illustriert
das Plasmid pHP13, worin CmR sich auf Chloramphenicol-Resistenz
bezieht, EmR sich auf Erythromycin-Resistenz
bezieht und Rep pTA1060 sich auf den Replikationsstartpunkt aus
Plasmid pTA1060 bezieht.
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6 illustriert
das pBLapr-Plasmid, worin sich BL AA auf das Bacillus-licheniformis-α-Amylase-Gen bezieht; aprE bezieht
sich auf den Promotor und das Signalpeptid, das für die Region
des aprE-Gens kodiert; AmpR bezieht sich auf das Ampicillin-Resistenzgen
aus pBR322; und CAT bezieht sich auf das Chloramphenicol-Resistenzgen
aus pC194.
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7 illustriert
das pHP.BL-Plasmid, welches das Gen für Bacillus-licheniformis-α-Amylase trägt.
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Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Unter „α-Amylase" wird eine enzymatische
Aktivität
verstanden, welche die α(1,4)glykosidische
Bindung, z.B. jene in Stärke,
Amylopektin- oder Amylose-Polymeren, spaltet. α-Amylase umfasst, wie hierin
verwendet, natürlich
auftretende α-Amylasen sowie rekombinante α-Amylasen.
Bevorzugte α-Amylasen
in der vorliegenden Erfindung sind jene, die sich von Bacillus licheniformis,
Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus stearothermophilus ableiten,
sowie α-Amylasen
aus Pilzen, wie z.B. jene, die sich von Aspergillus (d.h. A. oryzae
und A. niger) ableiten.
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Unter „rekombinanter α-Amylase" wird eine α-Amylase
verstanden, bei der die für
die natürlich
auftretende α-Amylase
kodierende DNA-Sequenz so modifiziert ist, dass eine DNA-Sequenzmutante
produziert wird, die für
die Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren in
der α-Amylaseseguenz
im Vergleich zur natürlich
auftretenden α-Amylase
kodiert.
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Unter „Expressionsvektor" wird ein DNA-Konstrukt
verstanden, das eine DNA-Sequenz umfasst, die operabel an eine geeignete
Kontrollsequenz gebunden ist, die fähig ist, die Expression der
DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Derartige Kontrollsequenzen
können
Folgendes umfassen: einen Promotor, um die Transkription zu bewirken,
eine optionale Operatorsequenz, um eine derartige Transkription
zu kontrollieren, eine Sequenz, die für geeignete mRNA-Ribosombindungsstellen
kodiert, und Sequenzen, welche die Termination der Transkription
und Translation kontrollieren. Ein bevorzugter Promotor ist der
aprE-Promotor aus Bacillus subtilis. Der Vektor kann ein Plasmid,
ein Phagenteilchen oder lediglich ein mögliches genomisches Insert
sein. Wenn er einmal in einen geeigneten Wirt transformiert ist,
kann sich der Vektor replizieren und unabhängig von Wirtsgenom wirken
oder kann sich in manchen Fällen
in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Anmeldung werden
Plasmid und Vektor manchmal wechselseitig verwendet, da das Plasmid
derzeit die am häufigsten
verwendete Vektorform ist. Jedoch umfasst die Erfindung derartige
andere Formen von Expressionsvektoren, die gleichwertigen Funktionen
dienen und die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind oder in
Zukunft bekannt werden.
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Unter „Wirtsstamm" oder „Wirtszelle" wird ein geeigneter
Wirt für
einen Expressionsvektor verstanden, der DNA umfasst, die für die α-Amylase
gemäß der vorliegenden
Erfindung kodiert. In der vorliegenden Erfindung zweckdienliche
Wirtszellen sind im Allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische
Wirte, einschließlich beliebiger
transformierbarer Mikroorganismen, bei denen die Expression von α-Amylase
gemäß der vorliegenden
Erfindung erzielt werden kann. Im Speziellen sind Wirtsstämme derselben
Spezies oder Gattung, von der die α-Amylase stammt, geeignet, wie
z.B. ein Bacillus-Stamm. Vorzugsweise wird ein α-Amylase-negativer Bacillus-Stamm (Gene deletiert)
und/oder ein α-Amylase-
und Protease-deletierter Bacillus-Stamm (ΔamyE, Δapr, Δnpr) verwendet. Wirtszellen
werden mit Vektoren transfor miert oder transfiziert, die unter Verwendung rekombinanter
DIVA-Techniken konstruiert sind. Derartige transformierte Wirtszellen
sind fähig,
entweder für die α-Amylase
und ihre Varianten (Mutanten) kodierende Vektoren zu replizieren
oder die gewünschte α-Amylase
zu exprimieren.
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Unter „Verflüssigung" oder „verflüssigen" wird ein Verfahren
verstanden, durch das Stärke
zu kürzerkettigen
und weniger viskosen Dextrinen umgesetzt wird. Im Allgemeinen umfasst
dieses Verfahren die Gelatinierung von Stärke gleichzeitig mit oder gefolgt
von der Zugabe von α-Amylase.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine α-Amylasenmutante
bereitgestellt, in die ein erster Cysteinrest eingeführt ist,
der zur Ausbildung einer Disulfidbindung mit einem zweiten Cysteinrest
fähig ist.
Vorzugsweise umfasst der erste Cysteinrest eine Addition oder Substitution
zu einem α-Amylasenvorläufer. Es
ist außerdem
möglich,
auch einen zweiten Cysteinrest als Addition oder Substitution einzubauen,
und dies kann bevorzugt sein, sollte kein zweckdienlicher Cysteinrest
an einer Stelle vorhanden sein, die zur Stabilisierung des gewünschten
Abschnitts des Moleküls
brauchbar ist. Bezüglich
der α-Amylase
aus Bacillus licheniformis ist es notwendig, zwei Cysteinreste einzubauen,
da das Molekül
der Wildform keine Cysteine aufweist. Die Addition oder Substitution
einer hierin verwendeten Aminosäure
bezieht sich auf jegliche Modifikation der Aminosäuresequenz
des α-Amylasenvorläufers selbst,
bezieht sich jedoch vorzugsweise auf die Verwendung genetischer
Manipulation, um eine Nucleinsäure
zu mutieren, die für
den α-Amylasenvorläufer kodiert,
so dass der substituierte oder addierte Cysteinrest im exprimierten
Protein kodiert wird. Die α-Amylasenvorläufer umfassen natürlich auftretende α-Amylasen
und rekombinante α-Amylasen.
Die Modifizierung der DNA-Vorläufersequenz,
die für
die Aminosäuresequenz
des α-Amylasenvorläufers kodiert,
kann durch hierin und in den allgemein eingeräumten US-Patenten Nr. 4.760.025
und 5.185.258 beschriebene Verfahren erfolgen.
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Außerdem wird
Folgendes bereitgestellt: ein Nucleinsauremolekül(DNA), das für eine Aminosäuresequenz
kodiert, welches die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte α-Amylasenmutante
umfasst, Expressionssysteme, die derartige DNA enthalten, einschließlich Vektoren
und Phagen, Wirtszellen, die mit derartiger DNA transformiert sind,
und Antisense-DNA-Stränge,
die dem DNA-Molekül
entsprechen, das für
die Aminosäuresequenz
kodiert. Ebenso umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Herstellung einer α-Amylasenmutante
durch Exprimieren der auf einem Expressionssystem enthaltenen DNA,
die in eine Wirtszelle transformiert worden ist. Die α-Amylasenmutante
der Erfindung kann bei der Verzuckerung von Stärke, als Bestandteil von Waschmitteln,
Geschirrspülmitteln
für Geschirrspüler, Reinigungsprodukten
für harte
Oberflächen,
bei der Nahrungsmittelverarbeitung, einschließlich Backanwendungen, in der
Textilverarbeitung, einschließlich
als Entschlichtungsmittel, oder in einer beliebigen anderen Anwendung
verwendet werden, bei der α-Amylaseaktivität zweckdienlich
ist.
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Der α-Amylasenvorläufer kann
durch jegliche Quelle produziert werden, die zur Produktion von α-Amylase
fähig ist.
Geeignete Quellen von α-Amylasen
sind prokaryotische oder eukaryotische Organismen, einschließlich Pilze,
Bakterien, Pflanzen oder Tiere. Vorzugsweise wird der α-Amylasenvorläufer durch
einen Bacillus-Stamm produziert; bevorzugter durch Bacillus licheniformis,
Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus stearothermophilus; insbesondere
bevorzugt stammt der α-Amylasenvorläufer aus
Bacillus licheniformis.
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Homologien
sind zwischen nahezu allen bisher sequenzierten Endoamylasen gefunden
worden und erstrecken sich von Pflanzen, Säugetieren bis hin zu Bakterien
(Nakajima et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 23, 355–360 (1986);
Rogers, Biochem. Biophys. Res. Commun. 128, 470–476 (1985); Janecek, Eur.
J. Biochem. 224, 519–524
(1994)). Es gibt vier Bereiche von besonders hoher Homologie in
gewissen Bacillus-Amylasen,
wie in 4 dargestellt ist, worin die unterstrichenen Abschnitte
die Bereiche hoher Homologie bezeichnen. Sequenzangleichungen sind
ebenfalls verwendet worden, um die Verwandtschaft zwischen Bacillus-Endoamylasen
abzubilden (Feng et al., J. Molec. Evol. 35, 351–360 (1987)). Die verhältnismäßige Sequenzhomologie
zwischen Bacillus-stearothermophifus- und Bacillus-licheniformis-Amylase
beträgt
ungefähr
66% und jene zwischen Bacillus-licheniformis- und Bacillus-amyloliquefaciens-Amylasen
ungefähr
81%, wie von Holm et al., Protein Engineering 3(3), 181–191 (1990),
ermittelt wurde. Obwohl Sequenzhomologie wichtig ist, gilt als allgemein
anerkannt, dass Strukturhomologie beim Vergleich von Amylasen oder
anderen Enzymen ebenfalls wichtig ist. Beispielsweise ist auf eine
Strukturhomoiogie zwischen Pilzamylasen und Bakterienamylasen hingewiesen
worden, und daher sind Pilzamylasen in der vorliegenden Erfindung
ebenfalls umfasst.
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Unter
anderem werden hierin Substitutionen an Resten, die E119C/S130C
und/oder D124C/R127C in Bacillus-licheniformis-α-Amyiase entsprechen, zur Substitution
ermittelt. Folglich beziehen sich spezielle Reste, wie z.B. E119,
auf eine Aminosäurepositionsnummer
(d.h. +119), welche sich auf die der in 2 illustrierten,
reifen Bacillus-licheniformis-α-Amylasesequenz
zugeordneten Nummer bezieht. Die Erfindung ist jedoch nicht auf
die Mutation der speziellen reifen α-Amylase von Bacillus licheniformis
eingeschränkt,
sondern erstreckt sich auf α-Amylasevorläufer, die
Aminosäurereste
an Positionen enthalten, die zum jeweiligen in Bacillus-licheniformis-α-Amylase
identifizierten Rest äquivalent
sind. Ein Rest eines α-Amylasevorläufers ist
zu einem Rest der Bacillus-licheniformis-α-Amylase äquivalent, wenn er entweder
homolog (d.h. der Position für entweder
Primär-
oder Tertiärstruktur
entspricht) oder analog zu einem speziellen Rest oder Abschnitt
dieses Rests in Bacillus-licheniformis-α-Amylase ist (d.h. dieselbe oder eine ähnliche
funktionelle Fähigkeit
zur chemischen oder strukturellen Kombination, Reaktion oder Wechselwirkung
aufweist).
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Um
eine Homologie zur Primärstruktur
festzustellen, wird die Aminosäuresequenz
eines α-Amylasevorläufers direkt
mit der Primärsequenz
der Bacillus-licheniformis-α-Amylase und im Speziellen
mit einem Satz von Resten verglichen, die bekanntermaßen in allen α-Amylasen
unveränderlich
sind, für
die Sequenzen bekannt sind (siehe z.B. 4). Es ist
außerdem
möglich, äquivalente
Reste mittels Tertiärstrukturanalyse
der für
Schweinepankreas-α-Amylase
(Buisson et al., EMBO Journal 6, 3909– 3916 (1987); Qian et al.,
Biochemistry 33, 6284–6294
(1994); Larson et al., J. Mol. Biol. 235, 1560–1584 (1994)); Taka-Amylase
A aus Aspergillus oryzae (Matsuura et al., J. Biochem. (Tokyo) 95,
697–702
(1984)); und eine saure α-Amylase
aus A. niger (Boel et al., Biochemistry 29, 6244–6249 (1990)), wobei die ersteren
beiden Strukturen ähnlich
sind, und für
Gersten-α-Amylase
(Vallee et al., J. Mol. Biol. 236, 368–371 (1994); Kadziola, J. Mol.
Biol. 239, 104–121
(1994)) beschriebenen Kristallstrukturen zu ermitteln. Es sind mehrere
Voruntersuchungen veröffentlicht
worden, welche die Sekundärstruktur
von α-Amylase
behandeln, d.h. (Suzuki et al., J. Biochem. 108, 379–381 (1990);
Lee et al., Arch. Biochem. Biophys. 291, 255–257 (1991); Chang et al.,
J. Mol. Biol. 229, 235–238
(1993); Mizuno et al., J. Mol. Biol. 234, 1282–1283 (1993)), und zumindest
eine Struktur ist für
kristalline Bacillus-licheniformis-α-Amylase veröffentlicht worden (Machius
et al., J. Mol. Biol. 246, 545–549
(1995)). Jedoch haben mehrere Forscher gemeinsame Supersekundärstrukturen
zwischen Glucanasen (McGregor, Biochem. J. 259, 145–152 (1989))
und in α-Amylasen
und anderen Stärke-metabolisierenden
Enzymen (Jaspersen, J. Prot. Chem 12, 791–805 (1993), MacGregor et al,
Starke 45, 232–237
(1993)) und Sequenzähnlichkeiten
zwischen Enzymen mit ähnlichen
Supersekundärstrukturen
zu α-Amylasen
(Janecek, FEBS Letters 316, 23–26
(1993); Janecek et al., J. Prot. Chem. 12, 509–514 (1993)) vorhergesagt.
Eine Struktur für
das Bacillus-stearothermophilus-Enzym ist an jener von Taka-Amylase
A modelliert worden (Holm et al., Protein Engineering 3, 181–191 (1990)).
Die in 4 dargestellten vier höchst konservierten Regionen
enthalten zahlreiche Reste, von denen angenommen wird, dass sie
Teil des aktiven Zentrums sind (Matsuura et al., J. Biochem. (Tokyo)
95, 697–702 (1984);
Buisson et al., EMBO Journal 6, 3909–3916 (1987); Vihinen et al.,
J. Biochem. 107, 267–272
(1990)), einschließlich
His +105; Arg +229; Asp +231; His +235; Glu +261 und Asp +328 unter
Verwendung des Bacillus-licheniformis-Nummerierungssystems.
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Bei
der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung sind gewisse
Parameter zweckdienlich, um geeignete Substitutionen exakt zu ermitteln.
Es sollten Informationen bezüglich
der Kristallstruktur eines speziellen Enzyms erlangt werden. Kristallstrukturen
der oben angegebenen Bacillus-licheniformis-α-Amylase, Schweinpankre as-α-Amylase,
Aspergillus-niger- und Aspergillus-oryzae-α-Amylase und Gersten-α-Amylase sind für diesen
Zweck brauchbar. Mit Informationen bezüglich der Kristallstruktur
des Zielenzyms ist es dann zweckdienlich, Informationen bezüglich der
Instabilität
des Enzyms unter speziellen Bedingungen und vorzugsweise Informationen
bezüglich
der Gegenwart spezieller instabiler Reste oder Regionen zu erlangen,
die zur Gesamtinstabilität
des Enzyms beitragen. Als spezielles Beispiel war den Anmeldern
bekannt, dass aus Bacillus licheniformis stammende α-Amylase
mehrere Reste enthält,
die unter oxidierenden Bedingungen besonders instabil sind, d.h.
M197 und W138. Bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung untersuchten
die Anmelder im Speziellen die S148 umgebende Region, und zwar aufgrund
der Fähigkeit
der S148N-Mutation, erhöhte
Stabilität
zu verleihen. Die Hypothese, dass diese Region Sekundärstrukturelemente
aufweisen könnte,
die durch diese Substitution stabiler werden, führte die Anmelder zu dem Ansatz,
das Enzym über
die Einführung
von Disulfidbindungen in die proximalen Regionen der Sekundärstruktur
zu stabilisieren.
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Um
die speziellen Reste für
die Substitution zu ermitteln, wurden die Abstände zwischen den Alpha-Kohlenstoffen
und den Beta-Kohlenstoffen für
jeden der Reste im gefalteten Protein aus der Kristallstruktur gemessen,
um zu ermitteln, welche Paare in den Bereich erlaubter Anstände für eine Disulfidbindung
fallen, wo beide Reste Cysteine sind. Beispielsweise sollte das
Restepaar, für
das die in zwei Cysteinreste resultierende Einführung einer oder mehrerer Substitutionen)
beabsichtigt ist, vorzugsweise einen Alpha-Kohlenstoffabstand (Cα-Cα) von zwischen
ungefähr
4,4 und ungefähr
6,8 Angström
aufweisen. Gleichermaßen
sollte der Beta-Kohlenstoffabstand (Cβ-Cβ) zwischen ungefähr 3,45
und 4,5 Angström
betragen. Durch Auswählen
von Aminosäurepaaren,
die diese Kriterien für
den Kohlenstoffabstand erfüllen,
und die Nutzung von in Swodhamini et al., s.o., und Hazes et al.,
s.o., dargelegten Strategien war es möglich, die Störung des
Proteins zu minimieren, die durch die Substitution eines Cysteins
und die anschließende
Bildung einer Disulfidbindung zwischen zwei derartigen Cysteinen
verursacht werden könnte.
Auf diese Weise ist es möglich,
einen ersten und zweiten Cysteinrest auszuwählen, für welche die Bedingungen zur
Bildung einer Disulfidbindung günstig
sind. Die Anmelder wählten
da durch D124-R127 und E119-S130 als insbesondere bevorzugte Substitutionen
aus. Jedoch kann jedes Restpaar genützt werden, solange es im Bereich
der hierin bereitgestellten, geeigneten Kriterien liegt.
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α-Amylasen
gemäß der vorliegenden
Erfindung, die veränderte
Leistungsdaten aufweisen und wünschenswerte
und unerwartete Ergebnisse bereitstellen, sind in den verschiedenen
Anwendungen zweckdienlich, für
die α-Amylasen üblicherweise
verwendet werden. Beispielsweise sind α-Amylasen gemäß der vorliegenden
Erfindung, die veränderte
Leistungsdaten bei niedrigem pH, einschließlich verbesserter Thermostabilität, verbesserter
pH-Stabilität
und/oder verbesserter Oxidationsstabilität aufweisen, bei der Verflüssigung
von Stärke
bei niedrigem pH zweckdienlich. Eine erhöhte Thermostabilität ist zur
Verlängerung
der Haltbarkeit von Produkten zweckdienlich, die α-Amylasen
enthalten. Erhöhte
Oxidationsstabilität
oder verbesserte Leistungsfähigkeit
ist insbesondere bei Reinigungsprodukten und zur Verlängerung
der Haltbarkeit von α-Amylase
in Gegenwart von Bleichmitteln, Perborat, Percarbonat oder Persäuren, die
in solchen Reinigungsprodukten verwendet werden, wünschenswert.
Im Gegensatz dazu kann eine verminderte Thermostabilität oder Oxidationsstabilität für industrielle
Prozesse zweckdienlich sein, welche die rasche und effiziente Unterdrückung amylolytischer
Aktivität
erfordern.
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α-Amylasen
der vorliegenden Erfindung, die eine verbesserte Stabilität bei niedrigem
pH aufweisen, sind speziell bei der Stärkeverarbeitung und insbesondere
bei der Stärkeverflüssigung
zweckdienlich. Bedingungen während
kommerziell wünschenswerten
Verflüssigungsverfahren
umfassen charakteristischerweise niedrigen pH, hohe Temperatur und
mögliche
Oxidationsbedingungen, welche α-Amylasen
erfordern, die eine verbesserte Leistungsfähigkeit bei niedrigem pH, eine
verbesserte Thermostabilität
und verbesserte Oxidationsstabilität aufweisen. Demgemäß weisen α-Amylasen
gemäß der vorliegenden
Erfindung, die bei der Verflüssigung
besonders zweckdienlich sind, eine verbesserte Leistungsfähigkeit
bei einem pH von weniger . als ungefähr 6, vorzugsweise weniger
als ungefähr
5,5 und insbesondere bevorzugt weniger als ungefähr 5,0, auf. Zusätzlich sind α-Amylasen
gemäß der vorliegenden Erfindung,
die eine erhöhte
Thermostabilität
bei Temperaturen von zwischen ungefähr 80 und 120°C und vorzugsweise
zwischen ungefähr
100–110°C und eine
erhöhte
Stabilität
in Gegenwart von Oxidationsmitteln aufweisen, insbesondere zweckdienlich.
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Weitere
Komponenten, die dem Fachkundigen als bei der Verflüssigung
zweckdienlich bekannt sind, einschließlich beispielsweise Antioxidantien,
Calciumionen, Salze oder andere Enzyme, wie z.B. Endoglycosidasen,
Cellulasen, Proteasen, Lipasen oder andere Amylaseenzyme, können abhängig von
den beabsichtigten Reaktionsbedingungen zugegeben werden. Beispielweise
können
Kombinationen der α-Amylase
der vorliegenden Erfindung mit α-Amylasen
aus anderen Quellen für
einzigartige Wirkungsprofile sorgen, die unter speziellen Verflüssigungsbedingungen
besondere Verwendung finden. Insbesondere ist beabsichtigt, dass
die Kombination der α-Amylase gemäß der vorliegenden
Erfindung mit aus Bacillus stearothermophilus stammender α-Amylase
aufgrund von komplementären
Wirkungsprofilen für
eine gesteigerte Verflüssigung
bei pH-Werten unter 5,5 sorgt.
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Während der
Verflüssigung
werden Stärke,
im Speziellen Stärkekörneraufschlämmungen
aus einem Nass- oder Trockenmahlverfahren, mit einer α-Amylase
der vorliegenden Erfindung gemäß bekannten
Verflüssigungstechniken
behandelt. Im Allgemeinen wird im ersten Schritt des Stärkeabbauverfahrens
die Stärkeaufschlämmung durch
Erhitzen bei einer relativ hohen Temperatur (zwischen ungefähr 80°C und ungefähr 110°C) gelatiniert.
Nachdem die Stärkeaufschlämmung gelatiniert
worden ist, wird sie unter Verwendung einer α-Amylase verflüssigt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
Waschmittelzusammensetzungen in flüssiger, gelartiger oder granulärer Form,
welche die α-Amylase gemäß der vorliegenden
Erfindung enthalten, zweckdienlich sein. Derartige Waschmittelzusammensetzungen
werden insbesondere aus dem Zusatz einer α-Amylase gemäß der vorliegenden Erfindung
Nutzen ziehen, die eine erhöhte
Thermostabilität
aufweist, um die Haltbarkeit zu verbessern, oder die eine erhöhte Oxida tionsstabilität aufweist,
so dass die α-Amylase eine
verbesserte Widerstandsfähigkeit
gegen Bleichmittel oder Persäure-Verbindungen
aufweist, die in Waschmitteln üblicherweise
vorhanden sind. Folglich kann α-Amylase
der vorliegenden Erfindung vorteilhaft in bekannte pulverförmige, flüssige oder
gelartige Waschmittel mit einem pH von zwischen ungefähr 6,5 bis ungefähr 12,0
formuliert werden. Waschmittelzusammensetzungen, welche die α-Amylase
gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen, können
weiters andere Enzyme, wie z.B. Endoglycosidasen, Cellulasen, Proteasen,
Lipasen oder andere Amylaseenzyme, insbesondere aus Bacillus stearothermophilus
stammende α-Amylase,
sowie zusätzliche
auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Bestandteile enthalten.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst außerdem zusätzlich zur Substitution von
zwei oder mehreren Cysteinresten eine oder mehrere beliebige auf
dem Gebiet der Erfindung bekannte Substitutionen, um Stabilität oder erhöhte Aktivität zu verleihen.
Beispielsweise die Deletion oder Substitution eines Methioninrests
oder eines Tryptophanrests, beispielsweise M15, M197 oder W138,
wie beschrieben in WO 94/18314; Substitution an H133Y, wie beschrieben
in der PCT-Anmeldung Nr. WO 91/00353; oder Substitution an A209,
wie beschrieben in DeClerck et al., J. Biol. Chem. 265, 15481–15488 (1990);
oder beliebige der in den PCT-Anmeldungen Nr. WO 95/10603, WO 96/23873
und WO 96/23874 beschriebenen Substitutionen. In insbesondere bevorzugten
Ausführungsformen
kann die α-Amylase
gemäß der vorliegenden
Erfindung außerdem
eine Deletion oder Substitution an einem oder mehreren Resten umfassen,
die M15, A33, A52, S85, N96, V128, H133, S148N, S187, N188, A209,
A269 und/oder A379 in Bacillus-licheniformis-α-Amylase entsprechen. Spezielle
Ausführungsformen
der Amylase der vorliegenden Erfindung können ein Substitutionsmuster
umfassen, das M15T/E119C/S130C/N188S, M15L/E119C/S130C/N188S, M15T/E119C/S130C/H133Y/N188S,
M15T/E119C/S130C/H133Y/N188S/A209V, M15T/E119C/S130C/N188S/A209V,
M15TIE199C/V128E/S130C/H133Y/N188S, M15T/E119C/S130C/S187D/N188S,
M15T/E199C/S130C/H133Y, M15T/E119C/S130C/H133Y/N188S/A209V, M15T/E199C/S130C/H133Y/A209V
oder M15T/E119C/S130C/H133Y/S148N/A209V/A379S in Bacillus licheniformis
entspricht.
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Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung, die eine Kombination der α-Amylase
der vorliegenden Erfindung mit Proteaseenzymen umfassen, enthalten
vorzugsweise oxidationsstabile Proteasen, wie z.B. jene, die in
US-Re. 34.606 beschrieben sind, sowie im Handel erhältliche
Enzyme, wie z.B. DURAZYM (Novo Nordisk) und PURAFECT® OxP
(Genencor International Inc.). Verfahren zur Herstellung solcher
Proteasemutanten (oxidationsstabiler Proteasen) und insbesondere
solcher Mutanten, die eine Substitution des Methionins an einer
zu M222 in Bacillus amyloliquefaciens äquivalenten Position aufweisen,
sind in US-Re. 34.606 beschrieben.
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Eine
zusätzliche
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst DNA, die für eine α-Amylase gemäß der vorliegenden Erfindung
kodiert, sowie derartige DNA umfassende Expressionsvektoren. Die DNA-Sequenzen
können
exprimiert werden, indem sie operabel an eine Expressionskontrollsequenz
in einem geeigneten Expressionsvektor gebunden werden, wobei dieser
Expressionsvektor eingesetzt wird, um einen geeigneten Wirt nach
wohlbekannten Techniken zu transformieren. Es kann eine breite Vielfalt
an Wirt/Expressionsvektor-Kombinationen bei der Expression der DNA-Sequenzen
dieser Erfindung eingesetzt werden. Zweckdienliche Expressionsvektoren
umfassen beispielsweise Segmente von chromosomaien, nicht-chromosomalen
und synthetischen DNA-Sequenzen, wie z.B. die verschiedenen zu diesem
Zweck brauchbaren bekannten Plasmide und Phagen. Außerdem werden
in diesen Vektoren beliebige einer breiten Vielfalt von Expressionskontrollsequenzen
allgemein verwendet. Beispielsweise haben die Anmelder herausgefunden,
dass eine bevorzugte Expressionskontrollsequenz für Bacillus-Transformanten
das aus Bacillus subtilis stammende aprE-Signalpeptid ist.
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Eine
breite Vielfalt von Wirtszellen ist für die Expression der DNA-Sequenzen
dieser Erfindung ebenfalls zweckdienlich. Diese Wirte können wohlbekannte
eukaryotische und prokaryotische Wirte umfassen, wie z.B. Stämme von
E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, verschiedene Pilze,
Hefen und Tierzellen. Vorzugsweise exprimiert der Wirt die α-Amylase
der vorliegenden Erfindung extrazellulär, um die Reinigung und Downstream-Aufarbeitung
zu erleichtern. Die Expression und Reinigung der α-Amylasenmutante
der Erfindung kann durch Mittel und Wege bewirkt werden, die zur
Durchführung
solcher Verfahren auf dem Gebiet der Erfindung anerkannt sind.
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Die
verbesserten α-Amylasen
gemäß der vorliegenden
Erfindung sind dafür
vorgesehen, mehrere wichtige Vorteile im Vergleich zu Bacillus-α-Amylasen
der Wildform bereitzustellen. Beispielsweise ist einer der Vorteile
die erhöhte
Aktivität
bei niedrigem pH und hoher Temperatur, die für gebräuchliche Stärkeverflüssigungsverfahren typisch sind.
Ein weiterer Vorteil ist die erhöhte
Stabilität
bei hohem pH und erhöhte
Oxidationsstabilität,
die ihre Verwendung in Waschmitteln erleichtern. Ein weiterer Vorteil
ist es, dass eine vollständigere
Hydrolyse von Stärkemolekülen erzielt
wird, welche die Menge an Reststärke
im Prozessstrom herabsetzt. Noch ein weiterer Vorteil ist ihre verbesserte
Stabilität
in Abwesenheit von Calciumionen. Noch ein weiterer Vorteil ist es,
dass die Zugabe gleicher Proteindosen von α-Amylase gemäß der Erfindung für eine überlegene
Leistungsfähigkeit
im Vergleich zu Bacillus-licheniformis-α-Amylase der Wildform sorgt,
und zwar aufgrund von Verbesserungen der spezifischen Aktivität sowie
Stabilität
unter Stressbedingungen. Mit anderen Worten übersetzt die erhöhte spezifische
Aktivität
der Amylasen der vorliegenden Erfindung gegenüber Stärke wegen der allgemein erhöhten Stabilität der erfindungsgemäßen Amylasen
zu noch größeren möglichen
Leistungsvorteile dieser Variante. Unter Bedingungen, wo das Enzym
der Wildform inaktiviert wird, überlebt
nicht nur mehr die erfindungsgemäße Amylase
aufgrund ihrer erhöhten
Stabilität,
sondern die überlebende
Amylase weist aufgrund ihrer erhöhten
spezifischen Aktivität
auch eine proportional höhere
Aktivität
auf.
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Das
Folgende wird beispielhaft dargelegt und ist nicht als eine Einschränkung des
Schutzumfangs der Ansprüche
auszulegen. Hierin verwendete Abkürzungen, insbesondere die Dreibuchstaben-
oder Einbuchstaben-Schreibweisen für Aminosäuren sind, in J.W. Dale, Molecular
Genetics of Bacteria, Jöhn
Wiley & Söns, Appendix
B (1989), beschrieben.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Konstruktion des Plasmids
pHP.BL
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Das
in 2 dargestellte α-Amylase-Gen
wurde aus Bacillus licheniformis NCIB8061 kloniert (Gray et al.,
J. Bacteriol. 166, 635–643
(1986)). Das PstI-SstI-Fragment von 1,72 bp, das für die letzten
drei Reste der Signalsequenz, das gesamte reife Protein und die
Terminatorregion kodiert, wurde in M13mp18 subkloniert. Ein synthetischer
Terminator wurde zwischen die BcII- und SstI-Stellen eingefügt, und
zwar unter Verwendung einer synthetischen Oligonucleotidkassette
der folgenden Form:
5'-GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT-3' (SEQ-ID NR:7)
3'-TTTTGTATTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAAAAATAATAAAAAC-5' (SEQ:ID NR:8)
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Diese
war so konstruiert, dass sie den Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin-Transkriptionsterminator enthielt
(Wells et al., Nucleic Acid Research 11, 7911–7925 (1983)).
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Das
pBLapr-Plasmid wurde konstruiert und trug das Gen für die Bacillus-licheniformis-α-Amylase.
Wie in 6 illustriert ist, umfasst pBLapr ein Plasmid
von 6,1 kb, einschließlich
des Ampicillin-Resistenzgens aus pBR322 und des Chloramphenicol-Resistenzgens aus
pC194, des aprE-Promotors und des für die Bacillus-licheniformis-α-Amylase
(„BL
AA") kodierenden
Gens. Der aprE-Promotor wurde aus einem 660-bp-HindIII-PstI-Fragment
konstruiert, das für
den Promotor und die Signalsequenz der Alkalischen Protease von
Bacillus subtilis kodiert. Die PstI-Stelle wurde entfernt und eine
SfiI-Stelle nach der aprE/BL-AA-Verbindung angefügt. Das BL-AA-Gen umfasst das oben
beschriebene PstI-SstI-Fragment von 1720 bp. In der hierin beschriebenen Arbeit
wurde pBLapr mit einer dem 5'-Ende
des Starts der kodierenden Sequenz für das reife Amylase-Gen benachbarten
SfiI-Stelle konstruiert. Im Speziellen wurde das 5'-Ende der pBLapr-Konstruktion
an einem EcoRI-SstII-Fragment aus pBLapr in M13BM20 (Boehringer
Mannheim) subkloniert, um ein Templat mit kodierendem Strang für das unten
angeführte
mutagene Oligonucleotid zu erhalten:
5'-CCC ATT AAG ATT GGC CGC CTG GGC CGA
CAT GTT GCT GG-3' (SEQ:ID
NR:9)
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Dieser
Primer führte
eine SfiI-Stelle (durch Unterstreichung gekennzeichnet) ein, was
das Screening korrekter Formen durch die Gegenwart dieser einzigartigen
Restriktionsstelle ermöglichte.
Die Subklonierung des EcoRI-SstII-Fragments zurück in den pBLapr-Vektor lieferte
eine Version des Plasmids, die eine SfiI-Stelle enthielt.
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Plasmid
pHP13 (Haima et al., Mol. Gen. Genet. 209, 335–342 (1987)) (5)
wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaut und
der resultierende Vektor an einem Polyacrylamidgel gereinigt und dann
eluiert. Plasmid pBLapr wurde mit HindIII, Asp718 und in einer gesonderten
Inkubation mit Asp718, EcoRI verdaut und gelgereinigt. Zwei Banden,
HindIII-Asp718 (1203 bp) und Asp718-EcoRI (1253 bp), wurden gelgereinigt,
aus dem Gel eluiert und durch eine dreiteilige Ligation in den Vektor
ligiert, um Plasmid pHO.BL zu liefern, wobei das Plasmid bei der
Expression der α-Amylase
verwendet wurde (7).
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Beispiel 2
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Konstruktion eines für α-Amylase
kodierenden Plasmids, umfassend die Substitutionen an E119C/S130C
oder D124C/R127C
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Ein
pBLapr-Plasmid, wo Methionin durch Threonin an Aminosäure 15 substituiert
war, wurde gemäß der US-Patentanmeldung
mit der Seriennummer 08/194.664 (PCT-Anmeldung WO 94/18314) konstruiert.
Um die zusätzlichen
Cysteinreste ein zuführen,
wurden die folgenden mutagenen, für die Substitutionen E119C/S130C
und D124C/R127C kodierenden Primer gemeinsam mit nicht-mutagenen
Primern verwendet, um die gewünschten
Mutationen in lineare mehrfache Tandemwiederholungen des Plasmids
mit dem unten beschriebenen Multimerisierungsverfahren einzuführen.
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Ein
Fragment, das am mutagenen Primer (oben dargestellt) beginnt und
am 3'-Ende der kodierenden Region
endet, wurde mittels PCR erzeugt. Dieses Fragment wurde gelgereinigt
und dazu verwendet, um lange lineare Tandemwiederholungen des für die gewünschten
Cysteinmutationen kodierenden Plasmids wie folgt zu erzeugen:
Der
Vektor (pBLapr/M15T) wurde durch Restriktionsverdau (Sal I) linearisiert
und unter Verwendung von Qiagen-Sets gereinigt. Die Multimerisierungsreaktionen
enthielten typischerweise 5,4 mM Tris-Puffer, pH 8,0, 1x XL-Puffer
(Perkin Elmer, Branchburg, NJ), 0,2 mM dNTPs, 1,1 mM Mg(OAc)2, 3 ng/μl
Eingangsfragment, 0,15 ng/μl
linearisierten Vektor, 4 U rTth-DNA-Polymerase, XL (Perkin Elmer)
in 100 μl
Reaktionsgemisch. Die PCR-Reaktionen wurden typischerweise in einem
Thermocycler unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 20
Zyklen (15 s 94°C,
5 Min. 68°C)
und 15 Zyklen (15 s 94°C,
10 Min. 68°C).
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Die
resultierenden Multimere wurden direkt in kompetente B.-subtilis-Zellen
unter Verwendung von Standardtechniken transformiert. Plasmid-DNA
wurde aus den Transformanten unter Verwendung von Standardtechniken
isoliert.
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Die
Mutationen wurden mittels Didesoxysequenzierung (Sanger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1977)) bestätigt.
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Beispiel 3
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Transformation von Plasmiden
in Bacillus subtilis, Expression und Reinigung einer α-Amylasenmutase
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α-Amylase
kann nach Transformation mit den oben beschriebenen Plasmiden in
Bacillus subtilis exprimiert werden. pHP13 ist ein Plasmid, das
zur Replikation in E. coli und Bacillus subtilis fähig ist.
Plasmide, die verschiedene Varianten enthielten, wurden unter Verwendung
von E.-coli-Stamm MM294 konstruiert; die Plasmide wurden isoliert
und dann wie von Anagnostopoulos et al., J. Bacter. 81, 741–746 (1961),
beschrieben in Bacillus subtilis transformiert. Beim Bacillus-Stamm
waren zwei Proteasen (Δapr, Δnpr) (siehe
z.B. Ferrari et al., US-Patent Nr. 5.264.366) und Amylase (ΔamyE) (siehe
z.B. Stahl et al., J. Bacter. 158, 411–418 (1984)) deletiert. Nach
der Transformation wurde die sacU(Hy)-Mutation (Nenner et al., J.
Bacter. 170, 296–300 (1988))
durch PBS-1-vermittelte Transduktion (Hoch, J. Bact. 154, 1513–1515 (1983))
eingeführt.
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Sekretierte
Amylase wurde aus Bacillus-subtilis-Kulturen wie folgt gewonnen:
Natriumchlorid wurde dem Kulturüberstand
auf 20 mM zugegeben und der pH mit 1 M Tris-Puffer, pH 7,2, auf
ungefähr
7,0 gestellt. Der Überstand
wurde dann 15 Minuten lang auf 70°C
erwärmt
und das Präzipitat
durch Zentrifugation entfernt. Ammoniumsulfat wurde dem Überstand
auf 1,3 M zugegeben, gefolgt von 20 ml Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-6-Harz
(hohe Substitution) (Pharmacia). Nach dem Schütteln wurde das Harz durch
Filtration abgetrennt und in 1 M Ammoniumsulfat, 20 mM Ammoniumacetat,
pH 7,0, 5 mM Calciumchlorid gewaschen. Die gebundene Amylase wurde
in 20 mM Ammoniumacetat, pH 7,0,5 mM Calciumchlorid eluiert und
durch Zugabe von Ammoniumsulfat auf 70 % Sättigung präzipitiert. Das präzipitierte
Material wurde durch Zentrifugation pelletiert, in einem minimalen
Volumen von 20 mM Ammonium acetat, pH 7,0, 5 mM Calciumchlorid wieder
aufgelöst
und gegen denselben Puffer dialysiert.
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Die
Konzentration wurde unter Verwendung des Tests mit löslichem
Substrat unter Annahme der spezifischen Aktivität der Wildform bestimmt.
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Beispiel 4
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Test zur Bestimmung
der α-Amylase-Aktivität
-
Test
mit löslichem
Substrat: Ein Geschwindigkeitstest wurde auf Basis eines von Megazyme
(Aust.) Pty. Ltd. gelieferten Endpunkttestsets entwickelt. Ein Fläschchen
Substrat (p-Nitrophenylmaltoheptaosid, BPNPG7) wurde in 10 ml sterilem
Wasser gelöst,
gefolgt von einer 1:4-Verdünnung
in Testpuffer (50 mM Maleatpuffer, pH 6,7, 5 mM Calciumchlorid,
0,002% Tween20). Die Tests wurden durch Zugabe von 10 μl Amylase zu
790 μl des
Substrats in einer Küvette
bei 25°C
durchgeführt.
Hydrolysegeschwindigkeiten wurden als die Änderung der Absorptionsgeschwindigkeit
bei 410 nm nach einer Verzögerung
von 75 Sekunden gemessen. Der Test war bis zu Geschwindigkeiten
von 0,2 Absorptionseinheiten pro Minute linear.
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Die α-Amylase-Proteinkonzentration
wurde unter Verwendung des Bio-Rad-Standardtests (Bio-Rad Laboratories)
auf Basis des Verfahrens von Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976),
unter Verwendung von Rinderserumalbuminstandards gemessen.
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Beispiel 5
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Herstellung
und Testen von weiteren α-Amylasemutanten
auf Thermostabilität
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Es
wurden B.-licheniformis-Alpha-Amylasemutanten hergestellt, die Substitutionen
an M15T oder M15T/E119C/S130C aufwiesen. Thermische Inaktivierungsgeschwin digkeiten
für die
verschiedenen Mutanten wurden nach dem folgenden Verfahren gemessen.
Amylase-Stammlösungen
wurden eingehend in 20 mM Ammoniumacetat, 4 mM CaCl2,
pH 6,5, dialysiert. Jede Probe wurde auf zwei identische Fläschchen
aufgeteilt, und einem der Fläschchen
wurde Dithiothreit auf 10 mM zugegeben und zumindest über Nacht
bei 4°C
gelagert. Zur Messung der Stabilität wurde diese Stammlösung > 50-fach in 50 mM Ammoniumacetat,
5 mM CaCl2, 0,02% Tween 20, pH 4,8, auf
eine Endkonzentration von zwischen 30 und 50 μg/ml verdünnt. Für jene Stammlösungen,
die 10 mM DTT enthielten, enthielten die Verdünnungspuffer 1 mM DTT. Sechs
100-μl-Aliquoten wurden
in Eppendorf-Röhrchen
gefüllt
und in ein Wasserbad oder in einen Heizblock bei 83°C gegeben.
Die Eppendorf-Röhrchen
wurden in regelmäßigen, gemessenen
Zeitabständen
von zwischen 30 Sekunden und 5 Minuten entfernt und auf Eis gegeben,
um die Inaktivierung zu stoppen. Die Restaktivität wurde unter Verwendung eines
löslichen
Substrats wie in Beispiel 4 beschrieben getestet. Der natürliche Logarithmus
der Aktivität wurde
gegen die Inkubationszeit aufgetragen und die Geschwindigkeitskonstante
der Inaktivierung aus der Steigung der Geraden erhalten. Ergebnisse
für verschiedene
Mutanten sind in Tabelle 1 bereitgestellt.
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Wie
in Tabelle 1 dargestellt ist, weisen Enzymmutanten, in die zwei
zur Ausbildung einer Disulfidbindung fähige Cysteinreste eingeführt wurden,
eine signifikant erhöhte
Stabilität
gegenüber
der M15T-Mutante ohne eingeführte
Cysteinbindungen auf. Außerdem
weisen Enzymmutanten, in die eine Disulfidbindung zwischen E119C
und S130C eingeführt
wurde, eine signifikant verbesserte Stabilität gegenüber der M15T-Mutante oder der
M15T/E119C/S130C-Mutante auf, die mit DTT behandelt wurde (d.h.
Disulfidbindung reduziert oder aufgebrochen), wie in Tabelle 1 dargestellt
ist.
