CN110283881B - 一种提高酶稳定性的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高酶稳定性的方法及其应用，属于蛋白质工程技术领域。利用本发明的筛选方法可较为较为准确的得到酶中与酶稳定性，尤其是酶热稳定性相关的氨基酸残基；本发明通过将筛选出的酶中与酶稳定性相关的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸，与附近内源性的基准氨基酸残基形成二硫键，构建出具有更高热稳定性的酶，使酶在65℃下保温后半衰期延长1.5～2.0倍；本发明对提高酶的工业应用价值具有非常重要的意义，且本发明操作简单、安全无毒，具有良好的可遗传性，应用前景良好。

Description

一种提高酶稳定性的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种提高酶稳定性的方法及其应用，属于蛋白质工程技术领域。
背景技术
热稳定性是衡量酶质量的一个关键因素，酶的热稳定性强不仅有利于延长酶的贮藏时间、减少酶在保存、运输过程中活力的损失，而且可以使酶在较高的温度下保持较高的活力，从而提高反应效率，缩短生产周期，进而降低生产成本。
目前，已经研究表明，酶蛋白内两个半胱氨酸形成的二硫键是影响酶蛋白稳定性的重要因素，是决定酶蛋白结构和功能的核心内在因素之一，因此，在酶蛋白内构建新的二硫键对于提高酶蛋白的稳定性具有重要意义。
二硫键属于共价键，是由一条多肽链内或二条多肽链之间的2个半胱氨酸残基经脱氢氧化生成，包括链内二硫键和链间二硫键两种。几乎所有的多肽和蛋白中都可以发现发现这些共价键。二硫键的形成和半胱氨酸有关，半胱氨酸(Cys)的侧链有一个非常活跃的反应性巯基，此基团中的的氢原子很容易被自由基和其他基团取代，当一个半胱氨酸的硫原子与位于多肽或蛋白不同位置的另一个胱氨酸的硫原子形成共价单键时，一个二硫键就形成了。
因此，当酶蛋白内存在单个半胱氨酸时，将其周围的其他氨基酸残基突变为半胱氨酸，有可能能够使得这个突变后的半胱氨酸与酶蛋白内已经存在的单个半光氨酸形成新的二硫键，进而提高酶蛋白的稳定性。
但是，酶蛋白中的氨基酸残基数量过于庞大，逐个尝试效率过低，不符合实际，因此，急需找到一种筛选酶中与酶稳定性相关的氨基酸残基的方法，以为进一步提高酶的稳定性提供思路和方向。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种筛选酶中与酶稳定性相关的氨基酸残基的方法以进一步提高酶的稳定性。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种筛选酶中与酶稳定性相关的氨基酸残基的方法，所述方法为选择酶中的半胱氨酸作为基准氨基酸残基，以基准氨基酸残基为基准，筛选出酶中与该基准氨基酸残基相应的备选氨基酸残基；
基准氨基酸残基与和该基准氨基酸残基相应的备选氨基酸残基之间的位置关系需至少满足以下要求中的一个：
(1)基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基所形成的二面角的角度为80～100°；
(2)基准氨基酸残基的Cα与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基的Cα之间的距离在
Figure BDA0002104721450000021
之间；
(3)将以基准氨基酸残基为基准筛选出来的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸后，基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基的2个巯基所形成的夹角为-10～10°或80～100°；
满足上述要求的备选氨基酸残基即为酶中与酶稳定性相关的氨基酸残基。
所述酶稳定性是指酶抵抗各种因素的影响，维持一定空间结构，保持生物活性相对稳定的能力。
所述二面角是指多肽链中，两个氨基酸残基侧链顶端巯基与相应氨基酸残基的Cα所形成的二面角。
所述Cα是指氨基酸中与羧基相连的碳原子。
在本发明的一种实施方式中，所述基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基所形成的二面角的角度为85～95°。
在本发明的一种实施方式中，所述基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基所形成的二面角的角度为90°。
在本发明的一种实施方式中，将以基准氨基酸残基为基准筛选出来的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸后，所述基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基的2个巯基所形成的夹角为-5～5°或85～95°。
在本发明的一种实施方式中，将以基准氨基酸残基为基准筛选出来的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸后，所述基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基的2个巯基所形成的夹角为0°或90°。
在本发明的一种实施方式中，所述基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基中至少有一个为保守氨基酸残基；所述保守氨基酸残基是指，在细胞传代过程中，保持不变的氨基酸残基。
在本发明的一种实施方式中，所述保守氨基酸残基为保守性大于70％的氨基酸残基；所述保守性是指，在细胞传代过程中，氨基酸残基保持不变的能力；所述保守性大于70％是指，在细胞传代过程中，氨基酸残基保持不变的几率大于70％。
在本发明的一种实施方式中，所述保守性可通过Jevtrace2(v3.12b)软件检测得到。
在本发明的一种实施方式中，所述酶稳定性是指酶的热稳定性和/或pH稳定性。
在本发明的一种实施方式中，所述酶稳定性是指酶的热稳定性。
在本发明的一种实施方式中，所述酶为淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉酶为淀粉分支酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶为来源于Geobacillusthermoglucosidans STB02的淀粉分支酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
本发明提供了上述一种筛选酶中与酶稳定性相关的氨基酸残基的方法在改变酶的稳定性方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述酶稳定性是指酶的热稳定性和/或pH稳定性。
在本发明的一种实施方式中，所述酶稳定性是指酶的热稳定性。
在本发明的一种实施方式中，所述酶为淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉酶为淀粉分支酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶为来源于Geobacillusthermoglucosidans STB02的淀粉分支酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶来源于Geobacillusthermoglucosidans STB02，氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
在本发明的一种实施方式中，所述改变是指提高。
本发明提供了一种改变酶稳定性的方法，所述方法为将应用上述方法筛选得到的备选氨基酸残基进行突变。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将应用上述方法筛选得到的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述酶稳定性是指酶的热稳定性和/或pH稳定性。
在本发明的一种实施方式中，所述酶稳定性是指酶的热稳定性。
在本发明的一种实施方式中，所述酶为淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉酶为淀粉分支酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶为来源于Geobacillusthermoglucosidans STB02的淀粉分支酶。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶来源于Geobacillusthermoglucosidans STB02，氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
在本发明的一种实施方式中，所述改变是指提高。
本发明提供了应用上述一种改变酶稳定性的方法制备得到酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第44位色氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为W44C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第75位缬氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为V75C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第77位苏氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为T77C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第207位苏氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为T207C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第251位甘氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为G251C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第252位亮氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为L252C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第450位酪氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为Y450C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第531位苯丙氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为F531C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第613位异亮氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为I613C。
本发明提供了一种淀粉分支酶突变体，所述淀粉分支酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第44位色氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为W44C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第75位缬氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为V75C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第77位苏氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为T77C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第207位苏氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为T207C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第251位甘氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为G251C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第252位亮氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为L252C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第450位酪氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为Y450C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第531位苯丙氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为F531C；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第613位异亮氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为I613C。
有益效果：
(1)利用本发明的筛选方法可较为准确的得到酶中与酶稳定性，尤其是酶热稳定性相关的氨基酸残基；
(2)本发明通过将筛选出的酶中与酶稳定性相关的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸，与附近内源性的基准氨基酸残基形成二硫键，构建出具有更高热稳定性的酶，使酶在65℃下保温后半衰期延长1.5～2.0倍；
(3)本发明对提高酶的工业应用价值具有非常重要的意义，且本发明操作简单、安全无毒，具有良好的可遗传性，应用前景良好。
附图说明
图1为野生型、突变体Y450C、突变体V75C、突变体T77C以及突变体I613C热稳定性曲线；其中，为野生型，▼为突变体Y450C，■为突变体V75C，○为突变体T77C，●为突变体I613C。
图2为野生型、突变体G251C、突变体W44C、突变体F531C、突变体L252C以及突变体T207C热稳定性曲线；其中，为野生型，+为突变体G251C，◆为突变体W44C，◇为突变体F531C，△为突变体L252C，▲为突变体T207C。
图3为突变体W44C的部分分子模拟结构。
图4为突变体V75C的部分分子模拟结构。
图5为突变体T77C的部分分子模拟结构。
图6为突变体T207C的部分分子模拟结构。
图7为突变体G251C的部分分子模拟结构。
图8为突变体L252C的部分分子模拟结构。
图9为突变体Y450C的部分分子模拟结构。
图10为突变体F531C的部分分子模拟结构。
图11为突变体I613C的部分分子模拟结构。
具体实施方式
下述实施例中所使用的酶蛋白为淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme；EC 2.4.1.18)，是属于糖苷水解酶家族13(GH 13)的一类糖基转移酶，能够催化淀粉分子α-1,4-糖苷键的断裂形成游离短链，并通过转糖苷作用将切割下的短链以α-1,6-糖苷键的形式连接于受体链上，在淀粉分子原主链上形成新的α-1,6-分支点。通过该种转糖基反应，淀粉分支酶能够增加淀粉的分支度，提高淀粉的抗消化性和慢消化性，延缓淀粉的回生过程，增强淀粉的稳定性并改善淀粉的使用性能，可用于生产具有良好应用价值的淀粉衍生物。
下述实施例中涉及的表达载体pET-20b(+)购自Invitrogen公司；下述实施例中涉及的E.coli DH5α、E.coli JM109以及E.coli BL21(DE3)购自北纳生物。
本发明涉及的检测方法如下：
淀粉分支酶热稳定性的分析方法：
将淀粉分支酶在一定温度下保温，不同时间点取样，迅速冷却至0℃，测定酶的残余活力，以未保温酶液的活力为100％，绘制相对酶活-时间曲线。
淀粉分支酶活力的测定方法：
用10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液，加入0.01g/mL淀粉分支酶后混合均匀并置于50℃水浴条件下反应15min，反应结束后沸水浴灭酶，取175mL反应液加入2.5mL显色液(0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I2，pH 7.5)置于室温下静置15min以充分显色，显色15min后在530nm处测定吸光值；
其中，酶活的定义为：在530nm处，吸光值每分钟降低1％所需加入酶的量为一个酶活力单位(1U)。
本发明所用的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。
LB固体培养基：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L，pH 7.0。
TB培养基：酵母粉24g/L、胰蛋白胨12g/L、甘油5g/L、KH2PO417mM、K2HPO472mM，pH7.0。
实施例1：氨基酸残基位点的筛选
筛选方法如下：
选择酶中的半胱氨酸作为基准氨基酸残基，以基准氨基酸残基为基准，筛选出酶中与该基准氨基酸残基相应的备选氨基酸残基；
基准氨基酸残基与和该基准氨基酸残基相应的备选氨基酸残基之间的位置关系需至少满足以下要求中的一个：
(1)基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基所形成的二面角的角度为80～100°；
(2)基准氨基酸残基的Cα与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基的Cα之间的距离在
Figure BDA0002104721450000071
之间；
(3)将以基准氨基酸残基为基准筛选出来的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸后，基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基的2个巯基所形成的夹角为-10～10°或80～100°；
满足上述要求的备选氨基酸残基即为酶中与酶稳定性相关的氨基酸残基。
在上述筛选方法的基础上，进一步要求基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基所形成的二面角的角度为85～95°。
在上述筛选方法的基础上，进一步要求基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基所形成的二面角的角度为90°。
在上述筛选方法的基础上，将以基准氨基酸残基为基准筛选出来的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸后，进一步要求基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基的2个巯基所形成的夹角为-5～5°或85～95°。
在上述筛选方法的基础上，将以基准氨基酸残基为基准筛选出来的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸后，进一步要求基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基的2个巯基所形成的夹角为0°或90°。
在上述筛选方法的基础上，进一步要求基准氨基酸残基与以其为基准筛选出来的备选氨基酸残基中至少有一个为保守氨基酸残基。
在上述筛选方法的基础上，进一步要求保守氨基酸残基为保守性大于70％的氨基酸残基。
将上述筛选方法运用于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的淀粉分支酶中，得到第44位点、第75位点、第77位点、第207位点、第251位点、第252位点、第450位点、第531位点和第613位点；
其中，第44位点满足以下要求：
1、与第42位点的半胱氨酸所形成的二面角的角度为90±5°；
2、其Cα与第42位点的Cα之间的距离为
Figure BDA0002104721450000081
3、其突变后的巯基与第42位点的巯基之间夹角为0°；
4、该位点为保守氨基酸残基。
第75位点满足以下要求：
1、与第42位点的半胱氨酸所形成的二面角的角度为90±5°；
2、其Cα与第42位点的Cα之间的距离为
Figure BDA0002104721450000082
3、其突变后的巯基与第42位点的巯基之间夹角为0°；
4、该位点为保守氨基酸残基。
第77位点满足以下要求：
1、与第42位点的半胱氨酸所形成的二面角的角度为90±5°；
2、其Cα与第42位点的Cα之间的距离为
Figure BDA0002104721450000083
3、其突变后的巯基与第42位点的巯基之间夹角为0°；
4、该位点为保守氨基酸残基。
第207位点满足以下要求：
1、与第207位点的半胱氨酸所形成的二面角的角度为90±5°；
2、其Cα与第207位点的Cα之间的距离为
Figure BDA0002104721450000084
3、其突变后的巯基与第207位点的巯基之间夹角为90±5°；
4、该位点为保守氨基酸残基。
第251位点满足以下要求：
1、与第246位点的半胱氨酸所形成的二面角的角度为90±5°；
2、其Cα与第246位点的Cα之间的距离为
Figure BDA0002104721450000085
3、其突变后的巯基与第246位点的巯基之间夹角为180°；
4、该位点为保守氨基酸残基。
第252位点满足以下要求：
1、与第246位点的半胱氨酸所形成的二面角的角度为90±5°；
2、其Cα与第246位点的Cα之间的距离为
Figure BDA0002104721450000091
3、其突变后的巯基与第246位点的巯基之间夹角为0°；
4、该位点为保守氨基酸残基。
第450位点满足以下要求：
1、与第450位点的半胱氨酸所形成的二面角的角度为90±5°；
2、其Cα与第450位点的Cα之间的距离为
Figure BDA0002104721450000092
3、其突变后的巯基与第450位点的巯基之间夹角为0°；
4、该位点为保守氨基酸残基。
第531位点满足以下要求：
1、与第548位点的半胱氨酸所形成的二面角的角度为90±5°；
2、其Cα与第548位点的Cα之间的距离为
Figure BDA0002104721450000093
3、其突变后的巯基与第548位点的巯基之间夹角为0°；
4、该位点为保守氨基酸残基。
第613位点满足以下要求：
1、与第613位点的半胱氨酸所形成的二面角的角度为90±5°；
2、其Cα与第613位点的Cα之间的距离为
Figure BDA0002104721450000094
3、其突变后的巯基与第613位点的巯基之间夹角为0°；
4、该位点为保守氨基酸残基。
实施例2：酶突变体的构建
将实施例1中筛选得到的备选氨基酸残基突变为半胱氨酸以与基准氨基酸残基形成二硫键，将未经突变的淀粉分支酶命名为野生型，将这些突变后的淀粉分支酶突变体分别命名为突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C，具体步骤如下：
运用化学合成法获得编码淀粉分支酶的基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.2)，将获得的基因通过双酶切连接到表达载体pET-20b(+)上，以获得的重组载体gbe/pET-20b(+)为模板，设计实验所需的互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照TaKaRa公司STARPrimer GXL试剂盒说明书所示方法进行定点突变，获得含有编码不同酶突变体基因的重组载体gbe/pET-20b(+)-1、gbe/pET-20b(+)-2、gbe/pET-20b(+)-3、gbe/pET-20b(+)-4、gbe/pET-20b(+)-5、gbe/pET-20b(+)-6、gbe/pET-20b(+)-7、gbe/pET-20b(+)-8以及gbe/pET-20b(+)-9；
PCR反应体系依照STAR Primer试剂盒说明书中所设定条件：5×PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)10μL，模板DNA 1μL，正向和反向引物(10μM)均为1μL，PrimeSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，最后加入超纯水32.5μL；
PCR扩增条件为：98℃条件下预变性5min；随后以98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 7min为一个循环，在以上条件下进行35个循环；最后72℃下保温15min。
表1淀粉分支酶突变位点的引入
Mutation Primer sequence(5’-3’)
W44C-正向 SEQ ID NO.3：GTTTTGCGTA<u>TGC</u>GCTCCGCATG
W44C-反向 SEQ ID NO.4：CATGCGGAGC<u>GCA</u>TACGCAAAAC
V75C-正向 SEQ ID NO.5：TAATCAAGGT<u>TGC</u>TGGACGATTTTT
V75C-反向 SEQ ID NO.6：AAAAATCGTCCA<u>GCA</u>ACCTTGATTA
T77C-正向 SEQ ID NO.7：CAAGGTGTATGG<u>TGC</u>ATTTTTATTCCG
T77C-反向 SEQ ID NO.8：CGGAATAAAAAT<u>CGA</u>CCATACACCTTG
T207C-正向 SEQ ID NO.9：GATATCAAGGA<u>TGC</u>GGTTATTATT
T207C-反向 SEQ ID NO.10：AATAATAACC<u>GCA</u>TCCTTGATATC
G251C-正向 SEQ ID NO.11：AGATGAACAT<u>TGC</u>TTATACATGTTTG
G251C-反向 SEQ ID NO.12：CAAACATGTATAA<u>GCA</u>ATGTTCATCT
L252C-正向 SEQ ID NO.13：GAACATGGA<u>TGT</u>TACATGTTTG
L252C-反向 SEQ ID NO.14：CAAACATGTA<u>ACA</u>TCCATGTTC
Y450C-正向 SEQ ID NO.15：GCTGTATGGG<u>TGT</u>TTGCTAACAC
Y450C-反向 SEQ ID NO.16：GTGTTAGCAA<u>ACA</u>CCCATACAGC
F531C-正向 SEQ ID NO.17：CAAAGTATT<u>TGC</u>TCATTTGTCCGC
F531C-反向 SEQ ID NO.18：GCGGACAAATGA<u>GCA</u>AATACTTTG
I613C-正向 SEQ ID NO.19：CCGTTTGGC<u>TGC</u>TCCATTTTA
I613C-反向 SEQ ID NO.20：TAAAATGGA<u>GCA</u>GCCAAACGG
实施例3：含有编码酶突变体基因的基因工程菌的构建
含有编码淀粉分支酶突变体基因的工程菌的构方法如下：
将实施例2获得的重组载体gbe/pET-20b(+)以及重组载体gbe/pET-20b(+)-1、gbe/pET-20b(+)-2、gbe/pET-20b(+)-3、gbe/pET-20b(+)-4、gbe/pET-20b(+)-5、gbe/pET-20b(+)-6、gbe/pET-20b(+)-7、gbe/pET-20b(+)-8、gbe/pET-20b(+)-9分别按照E.coli DH5α感受态转化方法转入到E.coli DH5α中，并将受体菌涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上；将涂布后的LB固体培养基倒置于37℃恒温培养箱中培养12h；挑取阳性单克隆接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基并于37℃下培养10～12h；将收集到的菌体提取质粒并采用双酶切电泳和测序鉴定；在37℃下，用Dpn I处理PCR产物2h，随后将处理好的PCR产物转化到E.coli JM109中，将转化的E.coli JM109涂布到含有100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基中，在37℃恒温箱中过夜培养12h，从中挑选出单菌落接种到含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃下、200r/min培养过夜并按照质粒提取试剂盒说明书所示方法提取质粒鉴定测序；将测序正确的质粒通过化学转化法转入表达宿主E.coliBL21(DE3)感受态中，得到基因工程菌E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+))、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-1)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-2)、E.coli BL21(DE3)(gbe/pET-20b(+)-3)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-4)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-5)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-6)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-7)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-8)以及E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-9)。
实施例4：酶突变体的表达
具体步骤如下：
将实施例3获得的基因工程菌E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+))、E.coliBL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-1)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-2)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-3)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-4)、E.coli BL21(DE3)(gbe/pET-20b(+)-5)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-6)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-7)、E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-8)以及E.coli BL21(DE 3)(gbe/pET-20b(+)-9)分别在含有100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中过夜培养12h，获得单菌落；
挑取阳性单菌落接种于15mL含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，于37℃、200r/min的条件培养12h，获得活化好的菌液；
取200μL活化好的菌液接种于50mL含有100μg/mL氨苄霉素的TB培养基中，于37℃、200r/min的条件下培养至OD600达到1.0～1.5之间后，在培养液中加入终浓度为0.01mM的IPTG，继续于25℃的条件下诱导16h，获得发酵液；
将发酵液离心取上清，获得含有野生型、突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C的发酵上清液；
将含有野生型、突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C的发酵上清液进行纯化，得到野生型、突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C。
实施例5：酶突变体的热稳定性检测
具体步骤如下：
将实施例4获得的野生型、突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C分别用pH为7.0的10mM磷酸缓冲液调整为酶浓度1μmol/L的酶液后，将分别含有野生型、突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C的酶液在65℃下保温一段时间，间隔一定时间取样，以未经保温的分别含有野生型、突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C的酶液的酶活为100％，检测其在在50℃下的残余酶活，检测结果见表2以及图1-2。
如表2以及图1-2所示，突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体Y450C及突变体I613C在65℃下的半衰期t1/2(min，65℃)分别较野生型延长了1.1～1.4倍；突变体W44C、突变体G251C、突变体L252C及突变体F531C在65℃下的半衰期t1/2(min，65℃)则分别较野生型略有降低。
表2野生型和突变体的半衰期
野生型/突变体 半衰期t<sub>1/2</sub><sup>1</sup>(min,65℃)
野生型 42
W44C 40
V75C 58
T77C 59
T207C 53
G251C 39
L252C 42
Y450C 57
F531C 41
I613C 60
实施例6：酶突变体的酶活检测
具体步骤如下：
以10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制浓度为0～5mg/mL的马铃薯支链淀粉溶液，分别加入实施例4获得的野生型、突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C在50℃下测定酶活，并且，将所得数据导入到SigmaPlot程序(Systat Software Inc.,version 10.0forWindows)中得到米氏(Michaelis-Menten)方程以计算KM值，酶活以及KM值检测结果见表3；
其中，米氏(Michaelis-Menten)方程为：
Figure BDA0002104721450000131
V为不同底物浓度下淀粉分支酶突变体的比活；S为底物浓度；Vmax为最大反应速率；KM为米氏常数。
由表3可知，突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C对淀粉分支酶的酶活与催化能力影响不大。
表3野生型和突变体的酶活力和KM值
野生或突变体酶 活力(unit/mg) K<sub>m</sub>
野生型 282.3±0.4 1.08±0.02
W44C 265.4±0.7 1.14±0.10
V75C 313.5±0.8 1.04±0.06
T77C 305.4±1.1 1.05±0.04
T207C 279.7±1.1 1.03±0.03
G251C 281.4±1.3 1.02±0.04
L252C 283.7±0.2 1.01±0.08
Y450C 280.4±1.7 0.98±0.02
F531C 269.2±3.6 1.16±0.04
I613C 283.6±2.1 1.13±0.05
实施例7：酶突变体的结构分析
具体步骤如下：
以来源于大肠杆菌的GBE为模板(PDB ID:1M7X)，利用GROMACS程序包模拟突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C的晶体结构图，在模拟过程中，使用NPT系综，初始积分步长为2fs，采用V-rescale和Berendsen温度耦合算法将体系的温度和压强控制在300K和一个大气压的范围内，淀粉分支酶原子间的范德华相互作用和盐桥分别采用
Figure BDA0002104721450000141
Figure BDA0002104721450000142
的截断值和PME方法处理，使用LINCS约束算法限制所有化学键的键长，使用OPLS力场描述淀粉分支酶内二硫键的形成，使用伞形采样方法采集该过程中淀粉分支酶自由能的变化，输出结果采用PyMol分子制图软件系统进行制图，突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C的晶体结构图分别见图3-11。
由图3-11可知，突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C均可形成二硫键。
实施例8：酶突变体的加酶量分析
具体步骤如下：
配制10％的马铃薯淀粉溶液为底物，调节pH 7.5，按25U/g加酶量加入实施例4获得的野生型，在60℃下反应改性24h，反应结束后沸水浴灭酶；配制10％的马铃薯淀粉溶液为底物，调节pH 7.5，按不同的加酶量分别加入实施例4获得的突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C，检测在与野生型相同的改性效果时，突变体W44C、突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体G251C、突变体L252C、突变体Y450C、突变体F531C以及突变体I613C的加酶量，检测结果见表4。
由表4可知，突变体V75C、突变体T77C、突变体T207C、突变体Y450C及突变体I613C的加酶量较野生型有了明显的减少，突变体W44C、突变体G251C、突变体L252C及突变体F531C的加酶量较野生型有了明显的增多。
表4野生型和突变体的加酶量
野生型/突变体 加酶量(U/g)
野生型 25<sup>e</sup>
W44C 29<sup>h</sup>
V75C 19<sup>b</sup>
T77C 18<sup>a</sup>
T207C 24<sup>d</sup>
G251C 26<sup>f</sup>
L252C 27<sup>g</sup>
Y450C 19<sup>b</sup>
F531C 27<sup>g</sup>
I613C 21<sup>c</sup>
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种提高酶稳定性的方法及其应用
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 643
<212> PRT
<213> Geobacillus thermoglucosidans STB02
<400> 1
Met Ser Val Val Pro Pro Thr Asp Leu Glu Ile Tyr Leu Phe His Glu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Tyr Lys Ser Tyr Glu Leu Phe Gly Ala His Val Ile Lys
20 25 30
Gln Asn Asp Val Val Gly Thr Arg Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala
35 40 45
Arg Gln Val Arg Leu Val Gly Ser Phe Asn Asp Trp Asn Gly Thr Asn
50 55 60
Phe Asn Leu Val Lys Val Ser Asn Gln Gly Val Trp Thr Ile Phe Ile
65 70 75 80
Pro Glu Asn Leu Glu Gly His Leu Tyr Lys Tyr Glu Ile Thr Thr Ser
85 90 95
Asp Gly Asn Val Val Leu Lys Ala Asp Pro Tyr Ala Phe His Ser Glu
100 105 110
Leu Arg Pro Arg Thr Ala Ser Ile Val Tyr Asp Ile Lys Gly Tyr Gln
115 120 125
Trp Asn Asp Gln Thr Trp Arg Arg Lys Lys Gln Arg Lys Arg Ile Tyr
130 135 140
Asp Gln Pro Leu Phe Ile Tyr Glu Leu His Phe Gly Ser Trp Lys Lys
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Thr Tyr Arg Glu Met Ala Asp Glu Leu
165 170 175
Leu Pro Tyr Val Met Glu His Gly Phe Thr His Ile Glu Leu Leu Pro
180 185 190
Leu Val Glu His Pro Leu Asp Arg Ser Trp Gly Tyr Gln Gly Thr Gly
195 200 205
Tyr Tyr Ser Ala Thr Ser Arg Tyr Gly Thr Pro His Asp Leu Met His
210 215 220
Phe Ile Asp Arg Phe His Gln Ala Gly Ile Gly Val Ile Phe Asp Trp
225 230 235 240
Val Pro Gly His Phe Cys Lys Asp Glu His Gly Leu Tyr Met Phe Asp
245 250 255
Gly Ala Pro Thr Tyr Glu Tyr Asp Asn Ile Gln Asp Arg Glu Asn Gly
260 265 270
Glu Trp Gly Thr Ala Asn Phe Asp Leu Gly Lys Pro Glu Val Arg Ser
275 280 285
Phe Leu Ile Ser Asn Ala Leu Phe Trp Met Glu Tyr Phe His Val Asp
290 295 300
Gly Phe Arg Val Asp Ala Val Ala Asn Met Leu Tyr Trp Pro Asn Arg
305 310 315 320
Glu Ala Ala Gln Gln Asn Pro His Ala Val Gln Phe Leu Gln Lys Leu
325 330 335
Asn Glu Thr Val Phe Ala His Asp Pro Gly Ile Leu Met Ile Ala Glu
340 345 350
Asp Ser Thr Glu Trp Pro Leu Val Thr Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly
355 360 365
Leu Gly Phe Asn Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met Asn Asp Ile Leu
370 375 380
Thr Tyr Met Glu Thr Ala Pro Glu Lys Arg Lys His Val His Asn Lys
385 390 395 400
Val Thr Phe Ser Leu Leu Tyr Ala Tyr Ser Glu Asn Phe Ile Leu Pro
405 410 415
Phe Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Lys Ser Leu Leu Asn Lys
420 425 430
Met Pro Gly Thr Tyr Glu Glu Lys Phe Ala Gln Leu Arg Leu Leu Tyr
435 440 445
Gly Tyr Leu Leu Thr His Pro Gly Lys Lys Leu Leu Phe Met Gly Gly
450 455 460
Glu Phe Ala Gln Phe Asp Glu Trp Lys Asp Ala Glu Gln Leu Asp Trp
465 470 475 480
Met Leu Phe Asp Phe Glu Met His Gln Lys Met Asn Met Tyr Val Lys
485 490 495
Ala Leu Leu Lys Cys Tyr Lys Arg Cys Lys Ser Leu Tyr Glu Leu Asp
500 505 510
His Ser Pro Asp Gly Phe Glu Trp Ile Asp Val His Asn Ala Glu Gln
515 520 525
Ser Ile Phe Ser Phe Val Arg Arg Gly Lys Lys Glu Asn Asp Leu Leu
530 535 540
Val Val Val Cys Asn Phe Thr Ser Lys Val Tyr His Asp Tyr Lys Val
545 550 555 560
Gly Val Pro Leu Phe Ala Lys Tyr Arg Glu Ile Ile Ser Ser Asp Ala
565 570 575
Ala Lys Phe Gly Gly Trp Gly Asn Val Asn Ala Lys Pro Val Ala Ala
580 585 590
Ser Lys Glu Pro Phe His Gly Lys Pro Tyr His Ile Arg Met Thr Val
595 600 605
Pro Pro Phe Gly Ile Ser Ile Leu Arg Pro Val Lys Lys Arg Gly Glu
610 615 620
Arg Ser Val Asp Gly Lys Glu Lys Val His Arg His Val Ile Gly Gly
625 630 635 640
Arg Ala Arg
<210> 2
<211> 1929
<212> DNA
<213> Geobacillus thermoglucosidans STB02
<400> 2
atgagcgttg tccctccgac cgatctggaa atttatttat ttcacgaagg cagcttatat 60
aaaagttatg aattgtttgg cgcgcatgtg ataaaacaaa acgacgttgt cggaacccgg 120
ttttgcgtat gggctccgca tgcgcggcaa gtgcggttag tcggcagttt taatgactgg 180
aacggaacta attttaatct tgtaaaagta agtaatcaag gtgtatggac gatttttatt 240
ccggaaaact tggaagggca tttatataaa tacgaaatta ccactagcga tggaaatgtc 300
gtgttaaaag cagatccata cgcgtttcac tccgaattgc gcccccgtac tgcctccatc 360
gtctacgaca taaaaggtta tcaatggaat gaccaaacat ggcgacggaa gaaacagcga 420
aagcgaatat atgaccagcc tttgttcatt tatgagcttc acttcggttc gtggaaaaag 480
aaagaaaacg gcaattttta tacatatcgg gagatggcag atgagttact tccatacgtg 540
atggaacatg gttttaccca cattgaattg cttccgctcg ttgaacatcc gcttgaccgc 600
tcctggggat atcaaggaac aggttattat tcagcaacaa gccgctacgg gacgccgcat 660
gatttgatgc attttattga tcgcttccat caagcgggca ttggcgtcat tttcgattgg 720
gttcccggcc acttttgcaa agatgaacat ggattataca tgtttgatgg agcaccgaca 780
tacgaatatg acaacataca agatcgggaa aatggcgaat ggggcacggc gaattttgat 840
cttggcaagc cggaagtccg cagctttttg atttccaatg cgttgttttg gatggaatat 900
ttccacgtcg acggatttcg ggtggatgcg gtggccaata tgctgtattg gccaaataga 960
gaggcagcac agcaaaaccc gcatgctgtt cagtttttgc aaaaattaaa tgagaccgta 1020
tttgcgcatg acccgggcat attgatgatt gccgaagatt cgacggaatg gccgctcgtc 1080
actgctccaa cgtatgccgg agggctgggg tttaactata aatggaacat ggggtggatg 1140
aacgatattt taacatatat ggaaacggcg ccggagaagc gaaaacatgt gcacaataaa 1200
gtaacctttt cccttttgta cgcgtattcg gaaaatttta ttttaccttt ttcccacgat 1260
gaggtcgtgc atggaaaaaa atcgctgcta aataaaatgc cggggacgta tgaggaaaag 1320
tttgcacaat taaggctgct gtatgggtat ttgctaacac atcccggcaa gaaactattg 1380
tttatgggcg gcgaatttgc ccagtttgat gagtggaagg atgcagagca gctggattgg 1440
atgctttttg atttcgagat gcaccagaaa atgaatatgt acgtgaaagc attattgaaa 1500
tgttataagc gctgcaaatc tttgtatgag ctagaccatt ctccagacgg gtttgagtgg 1560
attgatgttc ataacgctga acaaagtatt ttctcatttg tccgcagagg aaaaaaagaa 1620
aacgatttgc ttgttgtcgt gtgcaatttt accagtaaag tgtatcacga ttataaagtt 1680
ggcgttccgc tatttgccaa ataccgggaa atcatcagca gcgatgcggc caaattcggg 1740
gggtggggca atgtcaatgc aaagccggtt gcggcgagca aagaaccgtt tcatggaaag 1800
ccgtatcata ttcgcatgac ggttccgccg tttggcattt ccattttaag accagtgaaa 1860
aaacgggggg agagaagcgt tgatggcaaa gaaaaagtgc atcgccatgt tattggcggg 1920
agggcaagg 1929
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttttgcgta tgcgctccgc atg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catgcggagc gcatacgcaa aac 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taatcaaggt tgctggacga ttttt 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaaatcgtc cagcaacctt gatta 25
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caaggtgtat ggtgcatttt tattccg 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cggaataaaa atcgaccata caccttg 27
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gatatcaagg atgcggttat tatt 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aataataacc gcatccttga tatc 24
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agatgaacat tgcttataca tgtttg 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caaacatgta taagcaatgt tcatct 26
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaacatggat gttacatgtt tg 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caaacatgta acatccatgt tc 22
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gctgtatggg tgtttgctaa cac 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gtgttagcaa acacccatac agc 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
caaagtattt gctcatttgt ccgc 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcggacaaat gagcaaatac tttg 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ccgtttggct gctccatttt a 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
taaaatggag cagccaaacg g 21

Claims (1)

1.一种淀粉分支酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的淀粉分支酶的第75位缬氨酸突变为半胱氨酸得到的；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第77位苏氨酸突变为半胱氨酸得到的；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第207位苏氨酸突变为半胱氨酸得到的；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第450位酪氨酸突变为半胱氨酸得到的；
或者，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的第613位异亮氨酸突变为半胱氨酸得到的。
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