WO2021020995A1 - Бастерия рода bacillus, продуцирующая гиалуронувую кислоту - Google Patents

Бастерия рода bacillus, продуцирующая гиалуронувую кислоту Download PDF

Info

Publication number
WO2021020995A1
WO2021020995A1 PCT/RU2020/000311 RU2020000311W WO2021020995A1 WO 2021020995 A1 WO2021020995 A1 WO 2021020995A1 RU 2020000311 W RU2020000311 W RU 2020000311W WO 2021020995 A1 WO2021020995 A1 WO 2021020995A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gsib
prpsf
promoter
hyaluronic acid
gene
Prior art date
Application number
PCT/RU2020/000311
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Сергеевич МИРОНОВ
Лопес Любовь ЭРРАИС
Наталья Валентиновна КОРОЛЬКОВА
Ольга Викторовна БАЕВА
Ирина Юносовна БАТТАЛОВА
Алексей Николаевич БРОВКИН
Петр Владимирович СМИРНОВ
Сергей Викторович РЫКОВ
Юлия Валерьевна ЮРЧЕНКО
Василий Евгеньевич КАЛУЖСКИЙ
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "ЦЕНТР ТРАНСФЕРА БИОТЕХНОЛОГИЙ ОКА-Биотех"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "ЦЕНТР ТРАНСФЕРА БИОТЕХНОЛОГИЙ ОКА-Биотех" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "ЦЕНТР ТРАНСФЕРА БИОТЕХНОЛОГИЙ ОКА-Биотех"
Priority to EP20847292.8A priority Critical patent/EP4006156A4/en
Publication of WO2021020995A1 publication Critical patent/WO2021020995A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01022—UDP-glucose 6-dehydrogenase (1.1.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01212—Hyaluronan synthase (2.4.1.212)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to biotechnology, in particular to bacteria of the genus Bacillus, in particular, bacteria Bacillus subtilis, producing hyaluronic acid, as well as to a method of microbiological synthesis of hyaluronic acid by cultivating such a bacterium.
  • Hyaluronic acid, hyaluronate, or hyaluronan - (C14H2S011) p is an organic compound belonging to the group of unsulfated glycosoaminoglycans.
  • the presence of numerous sulfated groups in related glycosoaminoglycans is the reason for the existence of numerous diverse isomers, which is not observed in hyaluronic acid, which is always chemically identical, regardless of the methods and sources of production.
  • the hyaluronic acid molecule is built of repeating fragments of D-glucuronic acid and I-acetyl-O-glucoseamine, linked by a b- (1-3) glycosidic bond.
  • the bases of sugar fragments are a glucopyranose ring with various substituents (acetamide group, hydroxyl and carboxyl functional groups).
  • the hyaluronic acid molecule is characterized by the formation of a large number of hydrogen bonds both inside the molecule and between neighboring carbohydrate residues located at a considerable distance from each other, and in an aqueous solution even between neighboring molecules through the carboxyl and acetamide groups.
  • hyaluronic acid has an acidic reaction of the medium due to the presence of a non-protonated carboxyl group.
  • the acidic properties of hyaluronic acid make it possible to obtain water-soluble salts with alkali metals.
  • hyaluronic acid is present in the form of a sodium salt - hyaluronate.
  • Hyaluronic acid is an anionic linear polysaccharide with various molecular weights. The molecular weight depends on the method of production, and, due to the absence of isomerism, the resulting hyaluronate is always chemically identical to the standard one.
  • Hyaluronate is present in hyaline cartilage, synovial joint fluid and skin tissue as in dermis and epidermis. Hyaluronate is also involved in many physiological functions such as adhesion, development, cell motility, carcinogenesis, angiogenesis, and wound healing. Due to its unique physical and biological properties, hyaluronate is used in eye and joint surgery and is being developed for use in other medical procedures. Hyaluronate preparations have also been developed for use in orthopedics, rheumatology and dermatology. As an active ingredient, hyaluronate is found in many cosmetic compositions.
  • All known methods of obtaining hyaluronic acid can be divided into two groups: the physicochemical method, which consists in extracting hyaluronate from the tissues of animal raw materials of mammals and birds, for example, from the vitreous body of the eye of cattle, chicken combs or umbilical cords of newborns, and the microbial method obtaining hyaluronate from bacteria-producers.
  • hyaluronate isolation is often complicated by the fact that in the tissues and organs of mammals and birds, the biopolymer is in a complex with proteins; the presence of related glycosaminoglycans also hinders the release of hyaluronate.
  • Another potential risk of using drugs of animal origin is their contamination with nucleic acids, prions and viruses.
  • the biotechnological method of obtaining hyaluronate, based on the cultivation of microorganisms-producers of hyaluronate, is devoid of these disadvantages.
  • the raw materials for obtaining polysaccharide by microbiological synthesis are available compounds and components: glucose, yeast extract, mineral salts, etc.
  • the production of hyaluronate based on microbiological synthesis does not depend on the supply of animal raw materials, and is also easily scalable and repurposed in the event of a change in market conditions.
  • International publications WO 99/51265 and WO 00/27437 describe fermentation methods for producing hyaluronic acid using a Pasteurella multocida strain. US Pat. No.
  • microorganisms used to obtain hyaluronic acid by fermentation are strains of pathogenic bacteria, the main of which are various species of Streptococcus.
  • Group A and Group C streptococci surround themselves with a non-antigen capsule consisting of hyaluronate, which is identical in composition to that found in connective tissue and joints
  • hyaluronan synthase The key and last enzyme in the biosynthesis of hyaluronic acid is hyaluronan synthase.
  • Hyaluronan synthases of vertebrates, bacterial pathogens and algal viruses have been described (DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci, 56: 670-682).
  • International publication WO 99/23227 describes group I hyaluronate synthase Streptococcus equisimilis.
  • International publications WO 99/51265 and WO 00/27437 describe Pasteurella multocida group II hyaluronate synthase.
  • the hyaluronan synthase operon of Streptococcus pyogenes has been described, which consists of three genes has A, hasB and hasC, encoding hyaluronate synthase, UDP-glucose dehydrogenase and UDP-glucose pyrophosphorylase, respectively (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98001) .4663,2 International publication WO 99/51265 describes a nucleic acid segment containing the coding region of Streptococcus equisimilis hyaluronate synthase.
  • the technical objective of the present group of inventions was to develop a more productive method for the microbiological synthesis of hyaluronic acid.
  • This problem was also solved by developing a method for the microbiological synthesis of hyaluronic acid by cultivating this bacterium in a nutrient medium, followed by the release of hyaluronic acid from the culture fluid.
  • the present invention relates to a bacterium of the genus Bacillus, in particular B. subtilis, producing hyaluronic acid, which contains in the chromosome the fusion of the heterologous hasA gene from S. equisimilis with the tuaD gene from B. subtilis under the control of the hybrid tandem promoter PrpsF-gsiB and optionally contains as part of a chromosome:
  • the present invention also relates to the bacterium described above, which contains the gtaB gene on the chromosome under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter.
  • the present invention also relates to a bacterium as described above, containing the gcaD-prs operon on the chromosome under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter.
  • the present invention also relates to a bacterium as described above, containing on the chromosome the gtaB gene under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter and the gcaD-prs operon under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter.
  • the present invention relates to the bacterium described above, which is B. subtilis. Also, the present invention relates to a method for producing hyaluronic acid, comprising:
  • the present invention relates to a method for producing hyaluronic acid, which uses a nutrient medium of the following composition, May. %:
  • FIG. 1 shows the scheme of biosynthesis of hyaluronic acid. The genes and the reactions of biosynthesis of hyaluronic acid controlled by them are indicated.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the PrpsF-gsiB hybrid promoter.
  • the -35 and -10 promoter regions are in bold capital letters, the ribosome binding site is underlined. Transcription starts are indicated as +1.
  • the junction of the PrpsF and PgsiB promoters is indicated by an arrow.
  • FIG. 3 shows the structure of plasmid pDG268.
  • FIG. 4 shows a comparison of the efficiency of functioning of the hybrid PrpsF-gsiB promoter and a single PrpsF promoter during fermentation in the B. subtilis strain using the example of the lacZ reporter gene encoding b-galactosidase.
  • FIG. 5 shows the structure of the pLEl vector.
  • FIG. 6 shows the relative transcription levels of the hasA, tuaD, gtaB and gcaD genes in strains AM2640, AM2681, AM2686 and AM2694.
  • bacterium of the genus Bacillus means a bacterium that belongs to the genus Bacillus in accordance with the classification known to the specialist in the field of microbiology.
  • a bacterium of the genus Bacillus is a bacterium selected from the group including Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus licaterus lautus, Bacillus lentus, megacillus lentus, megacillus lentus , Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis.
  • the genus Bacillus includes more than 200 species of bacteria, the most practically important of which, in addition to general morphological and physiological cultural properties, are distinguished by certain similarities in the organization of the genome and the mechanisms of gene expression. It has been shown in direct experiments that, for example, the promoter of the extracellular proteinase gene argE of B. subtilis is able to initiate the synthesis of a reporter protein in cells of various bacilli species, sometimes even to a greater extent than in B. subtilis cells (Genome Biology, 5, 77, 2004) ...
  • bacterium Bacillus subtilis means a bacterium that is classified as a Bacillus subtilis species in accordance with the classification known to a person skilled in the field of microbiology.
  • hyaluronic acid is defined herein as an unsulfated glucosaminoglycan composed of repeating disaccharide units of N-acetylglucosamine (GlcNAc) and glucuronic acid (GlcUA) linked together by alternating beta-1,4- and beta-1,3-glycosidic bonds.
  • Hyaluronic acid sodium salt is also known as hyaluronan, or hyaluronate.
  • hyaluronan synthase is defined herein as a synthase (EC 2.4.1.212) that catalyzes the elongation of the hyaluronan chain by the addition of the sugar precursors GlcUA and GlcNAc.
  • the present invention uses the fusion of the heterologous hasA gene from S. equisimilis with the tuaD gene from B. subtilis under the control of the hybrid tandem PrpsF-gsiB promoter.
  • Genes involved in the biosynthesis of sugar precursors for the production of hyaluronic acid include the tuaD gene of B. subtilis, encoding UDP-glucose- ⁇ -dehydrogenase (EC1.1.1.22), the gtaB gene of B. subtilis, encoding UDP-glucose pyrophosphorylase (EC 2.7.7.9 ), gene B. subtilis gcaD encoding UDP-N-acetylgucosamine pyrophosphorylase (EC 2.7.7.23) and the prs gene encoding phosphoribosyl pyrophosphate synthase (EC 2.7.6.1) (see Fig. 1).
  • heterologous gene means that the specified gene is isolated from a chromosome of an organism other than a bacterium of the genus Bacillus, in particular B. subtilis.
  • the bacterium containing the heterologous hasA gene from S. equisimilis in the chromosome is obtained by standard recombinant DNA methods, in particular by transformation, transfection.
  • the host cell of the genus Bacillus in particular Bacillus subtilis, may additionally contain one or more second nucleic acid constructs containing one or more genes encoding enzymes for the biosynthesis of sugar precursors under the control of the hybrid tandem PrpsF-gsiB promoter.
  • PrpsF-gsiB tandem promoter is operably linked to the target gene or "gene is under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter" means that the natural promoters of these genes are replaced with the PrpsF-gsiB promoter.
  • the tandem PrpsF-gsiB promoter is a fusion of the rpsF gene promoter, which encodes the synthesis of the ribosomal protein S6, and the gsiB gene promoter, which is responsible for the total cell stress protein (PgsiB).
  • the PrpsF promoter contains the -35 (TTGTAA) consensus sequence region, the -10 consensus sequence (TATAAT).
  • the PrpsF promoter is one of the strongest promoters in the B. subtilis genome and provides the highest transcription level at the logarithmic stage of bacterial growth. Transcription of this promoter is initiated by the vegetative sigma subunit of RNA polymerase (sA).
  • the nucleotide sequence of the B. subtilis rpsF gene is listed in the GenBank database under GenelD: 937919 (nucleotides 4199445 to 4199732 in the sequence NC 000964.3).
  • the initiation of the gsiB gene transcription is initiated with the participation of the alternative sigma subunit bV and reaches a maximum at the stationary phase of bacterial growth.
  • the nucleotide sequence of the B. subtilis gsiB gene is listed in the GenBank database under GenelD: 938235 (nucleotides 494506 to 494877 in the sequence NC 000964.3).
  • the nucleotide sequence of the PrpsF-gsiB tandem promoter used in the present invention is shown in FIG. 2 and listed in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 1.
  • Said tandem PrpsF-gsiB promoter can be obtained by any method known to a person skilled in the art, in particular by chemical synthesis, by PCR using overlapping primers, fusion of PrpsF and PgsiB and the like.
  • the authors of the present invention have shown that the use of the PrpsF-gsiB hybrid promoter allows one to obtain an optimal expression profile of the target gene during bacterial cultivation and seems to be very promising for enhancing the expression of target genes used for the production of target products, in particular, hyaluronic acid.
  • the activity of the PrpsF-gsiB hybrid promoter increases during fermentation and reaches a maximum at the late stages of stationary growth.
  • This activity profile of the hybrid PrpsF-gsiB promoter, as well as a comparison of the efficiency of the hybrid PrpsF-gsiB promoter and the single PrpsF promoter during fermentation of B. subtilis strains are shown in FIG. 4 by the example of the lacZ reporter gene encoding b-galactosidase.
  • the constructed genetic constructs based on Bacillus subtilis are super-producers of hyaluronic acid and have the following properties.
  • Ferments saccharides such as glucose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trehalose and starch hydrolyzate; alcohols such as glycerin, mannitol, and sorbitol; organic acids such as gluconic, fumaric, citric and succinic acids; and the like.
  • the obtained genetic constructs based on B. subtilis are stable and do not lose the ability to synthesize hyaluronic acid after 10 passages in a complete medium.
  • the methods according to the present invention include a method for producing hyaluronic acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium in order to produce and accumulate the target product in said nutrient medium and isolate the target product from the culture liquid.
  • the cultivation, collection and purification of the target product from the culture liquid or the like can be carried out in a manner similar to the conventional cultivation methods in which the target product is produced by a microorganism.
  • the culture medium used for cultivation can be either synthetic or natural, provided that said medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral supplements and, if necessary, an appropriate amount of nutritional supplements that the microorganism requires for growth.
  • Carbon sources include various carbohydrates such as glucose and sucrose, various organic acids, or alcohols such as ethanol and glycerin.
  • nitrogen source various ammonium salts such as ammonium sulfate, other nitrogen compounds such as ammonia, amines, natural nitrogen sources such as peptone and fermentolysates of microorganisms can be used.
  • mineral additives potassium monophosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like are used.
  • the cultivation is carried out under aerobic conditions with stirring (for example, by shaking, using a stirrer or bubbling, etc.) at a temperature in the range of 30-38 ° C, preferably at 37 ° C.
  • the pH of the medium is maintained within the range of 5-9, preferably 6.5-. 2.
  • the pH of the medium is adjusted with buffer solutions or the addition of ammonia, calcium carbonate, various acids, bases. Cultivation for 1 to 3 days leads to the accumulation of the target product - hyaluronic acid in the culture medium.
  • the method allows to accumulate hyaluronic acid both during the growth of the culture and after the growth of biomass in the stationary growth phase.
  • solid residues such as cells can be removed from the culture liquid by centrifugation or membrane filtration, and then hyaluronic acid can be collected and purified by stepwise precipitation with cetylpyridinium and isopropyl alcohol, followed by purification by columnar chromatography on adsorption and ion-exchange media. Ultrafiltration and lyophilization can also be used in the latter stages of isolation.
  • the concentration of hyaluronic acid in the culture fluid freed from cells is determined by the carbazole method (T. Bitter, NM Muir. Analytical Biochemistry, v. 4, p. 330-334, 1962).
  • PROMOTOR P rpsF-gsiB PROMOTOR P rpsF-gsiB.
  • the present invention uses an engineered tandem promoter functioning in a bacterium of the genus Bacillus, in particular in B. subtilis, containing the nucleotide sequences of the rpsF gene promoter and the gsiB gene promoter, the rpsF promoter being located upstream of the gsiB promoter.
  • the preparation of said promoter is described in a pending application entitled "TANDEM PROMOTOR FUNCTIONING IN BACTERIA OF THE GENUS Bacillus, BACTERIA OF THE GENUS Bacillus IS A PRODUCER OF USEFUL METABOLITE, CONTAINING AN INDICATED PROMOTOR, PROMOTOR.”
  • the PrpsF promoter is one of the strongest promoters in the B.
  • subtilis genome and provides the highest transcription level at the logarithmic stage of bacterial growth.
  • the transcription of this promoter is initiated with the participation of the vegetative sigma subunit of RNA polymerase (bA).
  • the initiation of transcription of the gsiB gene which is responsible for the protein of general cellular stress, is initiated with the participation of the alternative sigma subunit of bV and reaches a maximum at the stationary phase of bacterial growth.
  • the tandem promoter contains the -35 and -10 regions and the start of transcription of the rpsF gene promoter, the -35 and -10 regions and the start of the transcription of the gsiB gene promoter, and a ribosome binding site (Fig. 2).
  • the PrpsF-gsiB hybrid promoter shown in FIG. 2 was digested with EcoRI and BamHI restriction enzymes and cloned into the corresponding sites of the plasmid pDG268 (Cell 111: 747-756, 2002), which contains a cassette containing a polylinker for cloning, a lacZ reporter gene without its own promoter, and a chloramphenicol resistance (CmR) gene (see FIG. 3).
  • the cassette is flanked by fragments of the ashyE gene, which allows the integration of the vector with the cloned fragment into the ashyE locus on the chromosome of bacteria of the genus Bacillus, in particular, B. subtilis.
  • the resulting plasmid named pDG268-P, was transformed into competent cells of the E. coli TG1 strain. Transformants were selected on LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. Plasmid DNA was purified in an agarose gel and purified using columns (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit from Illustra) or DNA Gel Extractionkit beads. The DNA nucleotide sequence of the insert was confirmed by DNA sequencing using primer 1 (SEQ ID NO: 2) (forward) and primer 2 (SEQ ID NO: 3) (reverse).
  • the resulting plasmid can be integrated into the chromosomal locus of the bacillus of the genus Bacillus, in particular B. subtilis.
  • the plasmid DNA pDG268-P was linearized using the XbaI restriction enzyme to ensure integration into the chromosome by double crossing over instead of simple crossing over.
  • Competent cells of B. subtilis 168 strain were transformed with XbaI-treated DNA of plasmid pDG268-P, and transformants were selected on LB medium containing 10 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • An indicator medium containing amylopectin at a concentration of 0.2% was used to confirm the integration of the plasmid into the chromosomal locus of AshyE.
  • the plasmid pDG268-P was constructed, containing the PrpsF-gsiB hybrid promoter and the adjacent lacZ reporter gene, which allows testing the activity of this hybrid promoter under fermentation conditions.
  • the hybrid promoter contains two -35 and -10 regions and two starts of transcription, which, as believed by the authors of the present invention, without intending to be limited by any theory, can be used interchangeably at different stages of culture growth and provide optimal expression of genes found under the control of the specified promoter (Fig. 4).
  • Example 2 Construction of the AM2640 genetic construct by introducing into the chromosome of the recipient strain Bacillus subtilis 168 of the S. equisimilis has A gene fusion with the B. subtilis tuaD gene under the control of the hybrid tandem promoter P rpsF-gs m.
  • the construction of the S. equisimilis hasA gene fusion with the B. subtilis tuaD gene under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter was carried out in several stages.
  • the hasA gene was synthesized chemically, based on the nucleotide sequence of the hasA gene S. equisimilis, and cloned into the pUC57 vector.
  • the obtained plasmid DNA was used for PCR amplification of the hasA gene 1250 bp.
  • primer 3 SEQ ID NO: 4 containing the BamHI restriction enzyme recognition site and primer 4 (SEQ ID NO: 5) containing at the 5'-end a sequence complementary to the N-terminus of the tuaD gene from B. subtilis.
  • PCR amplification was performed in 50 ⁇ l of an incubation mixture containing 3 ng of pUC57 plasmid DNA as a template, 20 pmol of primers 3 (SEQ ID NO: 4) and 4 (SEQ ID NO: 5), lx PCR buffer, dNTP mixture ( each at a concentration of 0.5 mM) and 2 units.
  • Act. thermostable Taq polymerase The reactions were carried out in a Mu Cycler BioRad thermocycler programmed for 1 cycle at 95 ° C for 5 min; 30 cycles each at 95 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes, and 1 cycle at 72 ° C for 5 minutes.
  • the products were analyzed by gel electrophoresis in 1.2% agarose in 1x TAE. The expected fragment was approximately 1270 bp.
  • PCR amplification of the tuaD gene was carried out with the chromosomal DNA of B. subtilis using primer 5 (SEQ ID NO: 6) containing at the 5 '-end the sequence complementary to the C-terminus of the S. equisimilis hasA gene, and primer 6 (SEQ GO NO: 7) containing the Notl restriction enzyme recognition site.
  • PCR amplification was performed in 50 ⁇ l of an incubation mixture containing 5 ng of B. subtilis chromosomal DNA as a template, 20 pmol of primers 5 (SEQ ID NO: 6) and 6 (SEQ ID NO: 7), lx PCR buffer, mixture dNTP (each at a concentration of 0.5 mM) and 2 units.
  • Act. thermostable Taq polymerase The reactions were carried out in a Mu Cycler BioRad thermocycler programmed for 1 cycle at 95 ° C for 5 min; 30 cycles each at 95 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes, and 1 cycle at 72 ° C for 5 minutes.
  • the products were analyzed by gel electrophoresis in 1.2% agarose in 1x TAE. The expected fragment was approximately 1450 bp.
  • PCR amplification was performed in 50 ⁇ l of an incubation mixture containing 5 ng of DNA fragments, obtained using primer pairs 3-4 and 5-6, 1x buffer for PCR, a mixture of dNTPs (each at a concentration of 0.5 mM) and 2 units. Act. thermostable Taq polymerase.
  • the reactions were carried out in a Mu Cycler BioRad thermocycler programmed for 1 cycle at 95 ° C for 5 min; 10 cycles each at 95 ° C for 30 seconds, at 52 ° C for 30 seconds, at 72 ° C for 2 minutes, and 1 cycle at 72 ° C for 5 minutes. Thereafter, primer 3 (SEQ ID NO: 4) containing the BamHI restriction enzyme recognition site and primer 6 (SEQ ID NO: 7) containing the restriction enzyme recognition site were added to the reaction mixture Notl, and PCR was performed in the following mode: 25 cycles, each at 95 ° C for 30 sec, at 56 ° C for 30 sec, at 72 ° C for 2.5 min, and 1 cycle at 72 ° C for 5 min. The products were analyzed by gel electrophoresis in 1.2% agarose in 1x TAE. The expected fragment was approximately 2700 bp.
  • the resulting PCR fragment of 2700 bp. was treated with restriction enzymes BamHI and Notl, and cloned into the corresponding sites of the previously obtained plasmid pDG268-P containing the hybrid tandem promoter PrpsF-gsiB.
  • the resulting plasmid named pDG268-PHT, was transformed into competent cells of the E. coli TG1 strain. Transformants were selected on LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. Plasmid DNA was purified in agarose gel and eluted using columns (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit from Illustra) or DNA Gel Extractionkit beads (Fermentas). The nucleotide sequence of the insert DNA was confirmed by DNA sequencing using primers 1 (SEQ ID NO: 2) (forward) and 2 (SEQ ID NO: 3) (reverse).
  • the obtained plasmid pDG268-PHT was integrated into the chromosomal locus of B. subtilis.
  • the plasmid DNA pDG268-PHT was linearized with the XbaI restriction enzyme to ensure integration into the chromosome by double crossing over instead of simple crossing over.
  • Competent cells of B. subtilis 168 strain were transformed with XbaI-treated DNA of plasmid pDG268-P, and transformants were selected on LB medium containing 10 ⁇ g / ml chloramphenicol.
  • An indicator medium containing amylopectin at a concentration of 0.2% was used to confirm the integration of the plasmid into the chromosomal locus of AshyE.
  • the gtaB gene in the genome of the B. subtilis AM2640 genetic construct obtained above was put under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter to enhance its expression.
  • the PrpsF-gsiB promoter region was cloned into the pLEl expression vector, capable of replication both in the cells of bacteria of the genus Bacillus, in particular, B. subtilis, and E. coli, and containing the erythromycin resistance gene (Fig. 5 ).
  • Vector pLEl is a deletion variant of plasmid pKSl (FEMS Microbiol. Letters, 245: 315-319, 2005), in which the kanamycin resistance marker has been deleted.
  • PCR amplification was performed with the participation of primer 7 (SEQ ID NO: 8) containing the Pstl restriction site, flanking the tandem promoter, and primer 8 (SEQ ID NO: 9) containing a Hindlll restriction site.
  • the resulting PCR product with a size of 232 bp. purified in agarose gel, digested with restriction enzymes Pstl and Hindlll and cloned into the pLEl vector at the Pstl and Hindlll sites.
  • the resulting plasmid containing the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter was named pLE3.
  • PCR amplification of the promoter-proximal region of the gtaB gene was performed from the chromosomal DNA of the B. subtilisl68 trpC2 strain using primer 9 (SEQ ID NO: 10) containing a SacII site and primer 10 (SEQ ID NO: 11) containing a Pstl site ...
  • the resulting PCR product with a size of 394 bp. purified in agarose gel, treated with restriction enzymes SacII and Pstl, and cloned into the pLE3 vector containing the PrpsF-gsiB promoter at the SacII and Pstl sites.
  • PCR amplification of a fragment of the reading frame of the gtaB gene is carried out using primer I (SEQ ID NO: 12) containing a Hindlll site and primer 12 (SEQ ID NO: 13) containing a Kpnl site.
  • the resulting PCR product with a size of 397 bp. was purified in an agarose gel, treated with restriction enzymes Hindlll and Kpnl, and cloned at the same sites into the pLE3 vector obtained in the previous step containing the PrpsF-gsiB promoter and the promoter-proximal region of the gtaB gene.
  • the natural promoter of the gtaB gene is replaced with the PrpsF-gsiB promoter.
  • subtilis strain AM2640 with the selection of EmR transformants on medium with erythromycin (3 ⁇ g / ml).
  • erythromycin 3 ⁇ g / ml
  • Several obtained EmR clones were cultured in liquid LB medium with erythromycin (3 ⁇ g / ml) at 37 ° C overnight, and then plated on plates with LB medium with erythromycin (3 ⁇ g / ml) and incubated for 24 h at 37 ° C.
  • EmR recombinants were formed as a result of the integration of the plasmid pLE5 (gtaB'-PrpsF-gsiB-'gtaB) into the corresponding chromosomal locus gtaB, which was confirmed by the accumulation of a 901 bp PCR fragment. when using primers 9 (SEQ ID NO: 10) and 12 (SEQ ID NO: 13).
  • Several obtained EmR clones were inoculated into liquid LB medium without antibiotic and incubated on a shaker at 30 ° C for 48 hours, and then plated on plates with LB medium without antibiotic and incubated for 24 hours at 30 ° C.
  • the grown clones were checked for cleavage of the integrated plasmid pLE5, which was judged by the appearance of erythromycin-sensitive clones.
  • Plasmid cleavage occurs either with the preservation of the wild-type promoter of the gtaB gene in the chromosome, or with the replacement of the wild-type promoter with the PrpsF-gsiB promoter. Integration of the PrpsF-gsiB promoter upstream of the gtaB gene into the chromosome of B. subtilis strain was confirmed by the accumulation of a 791 bp PCR fragment. using primers 1 (SEQ ID NO: 2) and 13 (SEQ ID NO: 14) and its subsequent sequencing.
  • the gcaD-prs operon in the genome of the B. subtilis AM2640 genetic construct obtained above was substituted under the control of the hybrid tandem PrpsF-gsiB promoter to enhance its expression.
  • PCR amplification of the promoter-proximal region of the gcaD-prs operon was carried out from the chromosomal DNA of the B. subtilis 168 trpC2 strain using primer 14 (SEQ ID NO: 15) containing the SacII site, and primer 15 (SEQ ID NO: 16 ) containing the Pstl site.
  • the resulting PCR product was 419 bp in size. was purified in agarose gel, treated with restriction enzymes SacII and Pstl, and cloned into the pLE3 vector obtained in the previous step, containing the PrpsF-gsiB promoter, at the SacII and Pstl sites.
  • the plasmids pLE8 (gcaD'-PrpsF-gsiB-'gcaD) isolated from the tested clones were transformed into the previously constructed genetic constructs of B. subtilis AM2640 and AM2681 with the selection of EmR transformants on medium with erythromycin (3 ⁇ g / ml).
  • EmR clones obtained by transformation of the genetic constructs AM2640 and AM2681, were cultured in liquid LB medium with erythromycin (3 ⁇ g / ml) at 37 ° C overnight, and then plated on plates with LB medium with erythromycin (3 ⁇ g / ml) and incubated for 24 hours at 37 ° C.
  • the resulting EmR recombinants were formed as a result of the integration of the pLE8 plasmid (gcaD'-PrpsF-gsiB-'gcaD) into the corresponding chromosomal locus gcaD, which was confirmed by the accumulation of a PCR fragment of 891 bp.
  • Plasmid cleavage occurs either with the preservation of the wild-type promoter of the gcaD-prs operon in the chromosome, or with the replacement of the wild-type promoter with the PrpsF-gsiB promoter. Integration of the PrpsF-gsiB promoter upstream of the gcaD-prs operon into the chromosome of the B. subtilis strain was confirmed by the accumulation of a 772 bp PCR fragment.
  • genetic constructs of B. subtilis AM2640 and AM2681 which included the gcaD-prs operon under the control of the PrpsF-gsiB promoter, and received the names AM2686 and AM2694, accumulated up to 2.83 and 3.21 g / L of hyaluronic acid, respectively, during fermentation in within 48 hours (Table 1).
  • Example 5 Determination of the level of transcription of target genes in the obtained genetic constructs by real-time PCR.
  • the reverse transcription reaction was carried out in the presence of oligonucleotides specific for the genes under study using the Superscript III First-Strand Synthesis Kit for RT-PCR (Invitrogen). Then 1 ⁇ l of the volume of the entire reverse transcription reaction was used as a template for PCR with real-time detection. The expression levels of the rmA and gyrB genes were used for normalization.
  • the analysis was performed using a set of reagents for real-time PCR manufactured by Syntol, Russia. Amplification was performed on a DTlite device (DNA technology). The reaction products were analyzed by electrophoresis in a 2% agarose gel to confirm that the resulting products were of the expected size. Each reaction was set three times, the average value was taken as the result. The level of transcription was determined by the values of the threshold cycle, taking into account the fact that the concentration of the original specific DNA fragments increases approximately as 2N, where N is the number of cycles. The results of determining the level of transcription of the hasA, tuaD, gtaB, and gcaD genes in strains AM2640, AM2681, AM2686, and AM2694 are shown in Fig. 6.
  • Example 6 Obtaining hyaluronic acid using the obtained genetic constructs.
  • a seed culture of a strain of the claimed genetic construct Bacillus subtilis, producing hyaluronic acid is obtained by growing with shaking (200-220 rpm) for 18 hours at 37 ° C on an LB medium of the following composition, May. %:
  • the resulting seed culture is inoculated with a fermentation medium of the following composition, wt%: Sucrose - 8.0;
  • Isolation of hyaluronic acid from the culture fluid includes the following stages:
  • a 10% aqueous solution of cetylpyridinium is added to the supernatant to a final concentration of 1%.
  • the solution is left for 1.5 hours with constant stirring at 37 ° C. After the end of incubation, the solution is centrifuged at 8000 rpm for 30 minutes.
  • the precipitate is dissolved in 0.5M NaCl (the volume is 2-2.5 times less than the initial volume of the supernatant), with stirring and 37 ° C, with complete dissolution, an equal volume of isopropanol (1: 1) is poured, and left at -20 ° C at night.
  • the formed HA precipitate is centrifuged at 8000 rpm for 30 min and then work with it.
  • the HA precipitate is dissolved in distilled water until complete dissolution.
  • the resulting viscous yellowish liquid is decolorized on an activated carbon column. If the liquid is cloudy, then filter through a filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m before loading onto the column. Elution from the column is carried out with distilled water. The color of the liquid coming out should be colorless or slightly creamy. If the color is more intense, the preparation is applied to the charcoal again.
  • Example 7 The level of synthesis of hyaluronic acid during the cultivation of the obtained genetic structures.
  • the obtained genetic constructs containing in the chromosome the fusion of the heterologous S. equisimilis hasA gene with the B. subtilis tuaD gene under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter, as well as additionally containing the gtaB gene in the chromosome under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter and / or the gcaD-prs operon under the control of the PrpsF-gsiB hybrid tandem promoter was tested for the ability to synthesize hyaluronic acid when cultured in a laboratory fermenter with a volume of 3 using a fermentation medium as described in Example 7.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к трансформированной клетке бактерии рода Bacillus, в частности В. subtilis, продуцирующей гиалуроновую кислоту, содержащей в хромосоме слияние гетерологичного гена hasA из S. equisimilis с геном tuaD из В. subtilis под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB, а также дополнительно необязательно ген gtaB под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB и/или оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB. Также настоящее изобретение относится к способу получения гиалуроновой кислоты с использованием указанной трансформированной клетки.

Description

БАСТЕРИЯ РОДА BACILLUS, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ ГИАЛУРОНУВУЮ КИСЛОТУ
Область техники
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к бактерии рода Bacillus, в частности, бактерии Bacillus subtilis, продуцирующей гиалуроновую кислоту, а также к способу микробиологического синтеза гиалуроновой кислоты путем культивирования такой бактерии.
Предшествующий уровень техники
Раскрытие функций и механизмов биологического действия ряда биополимеров способствует созданию все новых продуктов и препаратов на их основе. Одним из таких биополимеров животного происхождения является гиалуроновая кислота. Гиалуроновая кислота, гиалуронат, или гиалуронан - (С14Н2Ш011)п - органическое соединение, относящееся к группе несульфатированных гликозоаминогликанов. Наличие многочисленных сульфатированных групп у родственных гликозоаминогликанов является причиной существования многочисленных разнообразных изомеров, чего не наблюдается у гиалуроновой кислоты, которая всегда химически идентична, вне зависимости от методов и источников получения. Молекула гиалуроновой кислоты построена из повторяющихся фрагментов D- глюкуроновой кислоты и И-ацетил-О-глюкозоамина, соединенных b-(1-3) гликозидной связью. Основы фрагментов сахаров - это глюкопиранозное кольцо с различными заместителями (ацетамидная группа, гидроксильные и карбоксильные функциональные группы). Для молекулы гиалуроновой кислоты характерно образование большого количества водородных связей как внутри молекулы, так и между соседними углеводными остатками, находящимися на значительном расстоянии друг от друга, а в водном растворе даже между соседними молекулами через карбоксил и ацетамидную группу. Имеет кислую реакцию среды ввиду наличия непротонированной карбоксильной группы. Кислотные свойства гиалуроновой кислоты позволяют получать растворимые в воде соли с щелочными металлами. В организме гиалуроновая кислота присутствует в виде натриевой соли - гиалуроната. Гиалуроновая кислота - это анионный линейный полисахарид с различной молекулярной массой. Молекулярная масса зависит от способа получения, причем, ввиду отсутствия изомерии, получаемый гиалуронат всегда химически идентичен стандартному.
Определены многочисленные функции гиалуроната в организме. Гиалуронат присутствует в гиалиновом хряще, синовиальной суставной жидкости и кожной ткани как в дерме, так и в эпидермисе. Г иалуронат также участвует во многих физиологических функциях, таких как адгезия, развитие, клеточная подвижность, канцерогенез, ангиогенез и заживление ран. Вследствие уникальных физических и биологических свойств гиалуронат используется в глазной и суставной хирургии и разрабатывается для применения в других медицинских процедурах. Препараты гиалуроната также разработаны для применения в ортопедии, ревматологии и дерматологии. В качестве активного ингредиента гиалуронат входит в состав многих косметических композиций.
Все известные способы получения гиалуроновой кислоты можно разделить на две группы: физико-химический метод, который заключается в экстрагировании гиалуроната из тканей животного сырья млекопитающих и птиц, например, из стекловидного тела глаза крупного рогатого скота, гребней кур или пупочных канатиков новорожденных, и микробный метод получения гиалуроната на основе бактерий-продуцентов.
Ранее наибольшее распространение, в силу доступности сырья и высокого содержания биополимера, получил метод выделения гиалуроновой кислоты из петушиных гребней. Экстракция производится смесью ацетона с хлороформом (удаление белка), водой, либо водно- спиртовой смесью (пропионовый, трет-бутиловый спирты) с последующей сорбцией на активированном угле, посредством электрофореза или на ионообменной смоле. При анализе животных источников гиалуроната становится очевидным, что сырьевая база промышленного получения данного полисахарида весьма ограничена и не может полностью удовлетворить постоянно растущий спрос на гиалуронат. Кроме того, выделение гиалуроната из животного сырья часто осложняется тем, что в тканях и органах млекопитающих и птиц биополимер находится в комплексе с белками; присутствие родственных гликозаминогликанов также затрудняет выделение гиалуроната. Еще одним потенциальным риском использования препаратов животного происхождения является их контаминация нуклеиновыми кислотами, прионами и вирусами.
Этих недостатков лишен биотехнологический способ получения гиалуроната, основанный на культивировании микроорганизмов-продуцентов гиалуроната. Сырьем для получения полисахарида микробиологическим синтезом являются доступные соединения и компоненты: глюкоза, дрожжевой экстракт, минеральные соли и т. п. Производство гиалуроната на основе микробиологического синтеза не зависит от поставок животного сырья, а также легко масштабируется и перепрофилируется в случае изменения конъюнктуры рынка. В международных публикациях WO 99/51265 и WO 00/27437 описаны способы ферментации для получения гиалуроновой кислоты с использованием штамма Pasteurella multocida. В патенте US 4801539 и в международной публикации WO 99/23227 описаны способы ферментации для получения гиалуроновой кислоты с использованием штаммов Streptococcus zooepidemicus и Streptococcus equisimilis с приведенными выходами, составляющими примерно 3,6 г гиалуроновой кислоты на литр. В Европейских патентах ЕР 0694616 и ЕР 2046969 описаны способы ферментации, использующие улучшенный штамм Streptococcus zooepidemicus с приведенными выходами, составляющими примерно 3,5 г гиалуроновой кислоты на литр.
Микроорганизмы, используемые для получения гиалуроновой кислоты путем ферментации, представляют собой штаммы патогенных бактерий, основные из которых представляют собой различные виды Streptococcus. Стрептококки группы А и группы С окружают себя неантигенной капсулой, состоящей из гиалуроната, который по композиции идентичен тому, который обнаружен в соединительной ткани и суставах
Ключевым и последним ферментом на пути биосинтеза гиалуроновой кислоты является гиалуронансинтаза. Описаны гиалуронансинтазы позвоночных, бактериальных патогенов и вирусов водорослей (DeAngelis, Р. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci, 56: 670-682). В международной публикации WO 99/23227 описана гиалуронатсинтаза группы I Streptococcus equisimilis. В международных публикациях WO 99/51265 и WO 00/27437 описана гиалуронатсинтаза группы II Pasteurella multocida. Описан оперон гиалуронансинтазы Streptococcus pyogenes, который состоит из трех генов has A, hasB и hasC, кодирующие гиалуронатсинтазу, UDP-глюкозодегидрогеназу и UDP-глюкозопирофосфорилазу, соответственно (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 4658-4663,2001). В международной публикации WO 99/51265 описан сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий кодирующую область гиалуронатсинтазы Streptococcus equisimilis.
После идентификации генов, вовлеченных в биосинтез гиалуроната, оказалось возможным проводить генетическую модификацию большой группы бактерий (Bacillus, Agrobacterium, Е. coli and Lactococcus) с целью их использования в качестве продуцентов гиалуроната (WO 2012/032153, Appl. Microbiol. Biotechnol. 84:63-69, 2009).
Перспективные для продукции гиалуроната результаты получены при создании рекомбинантных штаммов бацилл В. subtilis (публикация заявки US 2014/0038235 и патент RU 2346049 компании Novozymes). Экспрессионная система таких штаммов содержит гетерологичный ген has А, клонированный из S. equisimilis и входящий в единый оперон с одним или несколькими природными генами В. subtilis (гомологами генов hasB, hasC и hasD Streptococcus). Преимуществами этих продуцентов является то обстоятельство, что получаемый продукт не содержит экзотоксинов и эндотоксинов стрептококков.
Хотя продукция гиалуроната была существенно улучшена путем получения вышеуказанных штаммов микроорганизмов или улучшения процесса его получения, необходимо разрабатывать более эффективные процессы получения гиалуроната для того, чтобы удовлетворить растущие потребности в этом соединении для нужд медицины, ветеринарии и косметологии.
Раскрытие изобретения
Технической задачей настоящей группы изобретений являлась разработка более продуктивного способа микробиологического синтеза гиалуроновой кислоты.
Указанная задача была решена путем конструирования бактерии рода Bacillus, в частности В. subtilis, продуцирующей гиалуроновую кислоту, которая содержит в составе хромосомы слияние гетерологичного гена hasA из S. equisimilis с геном tuaD В. subtilis под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB и которая дополнительно необязательно содержит в составе хромосомы :
- ген gtaB под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB; и/или
- оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
Указанная задача также была решена путем разработки способа микробиологического синтеза гиалуроновой кислоты путем культивирования указанной бактерии в питательной среде с последующим выделением гиалуроновой кислоты из культуральной жидкости.
Настоящее изобретение относится к бактерии рода Bacillus, в частности В. subtilis, продуцирующей гиалуроновую кислоту, которая содержит в составе хромосомы слияние гетерологичного гена hasA из S. equisimilis с геном tuaD из В. subtilis под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB и дополнительно необязательно содержит в составе хромосомы :
- ген gtaB под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB; и/или
- оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
Также настоящее изобретение относится к описанной выше бактерии, содержащей в хромосоме ген gtaB под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
Также настоящее изобретение относится к описанной выше бактерии, содержащей в хромосоме оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
Также настоящее изобретение относится к описанной выше бактерии, содержащей в хромосоме ген gtaB под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB и оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
Также настоящее изобретение относится к описанной выше бактерии, которая представляет собой В. subtilis. Также настоящее изобретение относится к способу получения гиалуроновой кислоты, включающему:
а) культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, пригодной для продукции гиалуроновой кислоты, и
б) выделение гиалуроновой кислоты из культуральной жидкости.
Также настоящее изобретение относится к способу получения гиалуроновой кислоты, в котором используют питательную среду следующего состава, мае. %:
Сахароза - 8,0;
Мальтоза - 4,0;
Дрожжевой экстракт - 0,5;
Мочевина - 0,6;
КН2Р04 - 0,6;
К2НР04 - 1 ,4;
(NH4)2S04 - 0,3;
Na-цитрат - 0,2;
Казаминовые кислоты - 0.04;
MgS04 - 0.3.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 показана схема биосинтеза гиалуроновой кислоты. Указаны гены и контролируемые ими реакции биосинтеза гиалуроновой кислоты.
На Фиг. 2 показана нуклеотидная последовательность гибридного промотора PrpsF-gsiB. Заглавными жирными буквами обозначены -35 и -10 участки промоторов, подчеркнут сайт связывания рибосомы. Старты транскрипции обозначены как +1. Место стыка промоторов PrpsF и PgsiB обозначено стрелкой.
На Фиг. 3 показана структура плазмиды pDG268.
На Фиг. 4 показано сравнение эффективности функционирования гибридного промотора PrpsF-gsiB и одиночного промотора PrpsF в процессе ферментации в штамме В. subtilis на примере репортерного гена lacZ, кодирующего b-галактозидазу.
На Фиг. 5 показана структура вектора pLEl . На Фиг. 6 показаны относительные уровни транскрипции генов hasA, tuaD, gtaB и gcaD в штаммах АМ2640, АМ2681, АМ2686 и АМ2694.
Осуществление изобретения
Термин «бактерия рода Bacillus» означает бактерию, которую относят к роду Bacillus в соответствии с классификацией, известной для специалиста в области микробиологии. В частности, к бактерии рода Bacillus относится бактерия, выбранная из группы, включающей Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis.
Известно, что род Bacillus включает в себя больше 200 видов бактерий, наиболее практически важные из которых, кроме общих морфологических, физиологических культуральных свойств, отличаются определенным сходством в организации генома и механизмах экспрессии генов. В прямых экспериментах показано, что, например, промотор гена внеклеточной протеиназы аргЕ В. subtilis способен инициировать синтез репортерного белка в клетках бацилл различного вида, иногда даже в большей степени, чем в клетках В. subtilis (Genome Biology, 5, 77, 2004).
Термин «бактерия Bacillus subtilis» означает бактерию, которую относят к виду Bacillus subtilis в соответствии с классификацией, известной для специалиста в области микробиологии.
Термин «гиалуроновая кислота» определяется здесь как несульфатиро ванный глюкозаминогликан, состоящий из повторяющихся дисахаридных единиц N- ацетилглюкозамина (GlcNAc) и глюкуроновой кислоты (GlcUA), связанных вместе перемежающимися бета- 1,4- и бета-1,3-гликозидными связями. Натриевая соль гиалуроновой кислоты также известна как гиалуронан, или гиалуронат.
Термин «гиалуронансинтаза» определяется здесь как синтаза (КФ 2.4.1.212), которая катализирует удлинение цепи гиалуронана путем добавления сахарных предшественников GlcUA и GlcNAc. Для продукции гиалуроновой кислоты в клетках рода Bacillus, в частности, В. subtilis в настоящем изобретении используется слияние гетерологичного гена has А из S. equisimilis с геном tuaD из В. subtilis под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF- gsiB.
Гены, участвующие в биосинтезе предшественников сахара для получения гиалуроновой кислоты, включают ген tuaD В. subtilis, кодирующий UDP-глюкозо-б-дегидрогеназу (КФ1.1.1.22), ген gtaB В. subtilis, кодирующий UDP-глюкозопирофосфорилазу (КФ 2.7.7.9), ген gcaD В. subtilis, кодирующий UDP-N-ацетилгюкозамин-пирофосфорилазу (КФ 2.7.7.23), и ген prs, кодирующий фосфорибозилпирофосфат синтазу (КФ 2.7.6.1) (см. Фиг. 1).
Термин «гетерологичный ген», означает, что указанный ген выделен из хромосомы организма, отличного от бактерии рода Bacillus, в частности, В. subtilis. Бактерию, содержащую гетерологичный ген hasA из S. equisimilis в хромосоме, получают стандартными методами рекомбинантных ДНК, в частности трансформацией, трансфекцией.
Помимо гетерологичного гена hasA Streptococcus equisimilis клетка-хозяин рода Bacillus, в частности, Bacillus subtilis может дополнительно содержать одну или более вторых конструкций нуклеиновой кислоты, содержащих один или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза предшественника сахара под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF- gsiB.
Термины «тандемный промотор PrpsF-gsiB функционально связан» с целевым геном или «ген находится под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB» означает, что природные промоторы указанных генов заменены на промотор PrpsF-gsiB. Тандемный промотор PrpsF-gsiB представляет из себя слияние промотора гена rpsF, кодирующего синтез рибосомного белка S6, и промотора гена gsiB, ответственного за белок общего клеточного стресса (PgsiB). Промотор PrpsF содержит близкую к консенсусной последовательности область -35 (TTGTAA), консенсусную последовательность области -10 (ТАТААТ). Промотор PrpsF относится к наиболее сильным промоторам в геноме В. subtilis и обеспечивает максимально высокий уровень транскрипции на логарифмической стадии роста бактерий. Инициация транскрипции этого промотора осуществляется с участием вегетативной сигма- субъединицы РНК-полимеразы (sA). Нуклеотидная последовательность гена rpsF В. subtilis представлена в базе данных «GenBank» под номером GenelD: 937919 (нуклеотиды с 4199445 по 4199732 в последовательности NC 000964.3). Инициация транскрипции гена gsiB инициируется с участием альтернативной сигма-субъединицы бВ и достигает максимума на стационарной фазе роста бактерий. Нуклеотидная последовательность гена gsiB В. subtilis представлена в базе данных «GenBank» под номером GenelD: 938235 (нуклеотиды с 494506 по 494877 в последовательности NC 000964.3).
Нуклеотидная последовательность тандемного промотора PrpsF-gsiB, используемого в настоящем изобретении, показана на Фиг. 2 и приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.
Указанный тандемный промотор PrpsF-gsiB может быть получен любым способом, известным специалисту в данной области техники, в частности путём химического синтеза, методом ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров, слияния PrpsF и PgsiB и подобными методами.
Авторами настоящего изобретения показано, что использование гибридного промотора PrpsF-gsiB позволяет получать оптимальный профиль экспрессии целевого гена в ходе культивирования бактерии и представляется весьма перспективным для усиления экспрессии целевых генов, используемых для продукции целевых продуктов, в частности, гиалуроновой кислоты. Так, активность гибридного промотора PrpsF-gsiB в процессе ферментации нарастает и достигает максимума на поздних стадиях стационарного роста. Указанный профиль активности гибридного промотора PrpsF-gsiB, а также сравнение эффективности функционирования гибридного промотора PrpsF-gsiB и одиночного промотора PrpsF в процессе ферментации штаммов В. subtilis показаны на Фиг. 4 на примере репортерного гена lacZ, кодирующего b-галактозидазу.
В рамках настоящего изобретения на основе исходного штамма В. subtilis 168 был получен ряд конструкций, а именно, АМ2640, АМ2681, АМ2686, АМ2694, продуцирующих гиалуроновую кислоту. Более детальное описание генетических конструкций и способы их получения подробно описаны в последующих примерах.
Характеристика генетических конструкций
Сконструированные генетические конструкции на основе Bacillus subtilis являются суперпродуцентами гиалуроновой кислоты и имеют следующие свойства.
Культурально-морфологические признаки.
Спорообразующая грамположительная палочка с закругленными концами и краевым расположением спор. При рассеве на LB-arape (Миллер Дж. 1979. Эксперименты в молекулярной генетике. Мир) и культивировании при 37°С на вторые сутки образует колонии с неровным краем диаметром 3-4 мм, а на минимальной среде Спицайзена (J. Bacteriol. 81 :741- 746, 1961) такие же колонии диаметром 2-3 мм.
Физиолого-биохимические признаки.
Сбраживает сахариды, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трегалоза и гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин, маннитол и сорбитол; органические кислоты, такие как глюконовая, фумаровая, лимонная и янтарная кислоты, и подобные соединения.
Хранение.
В лиофилизированном виде или в парах жидкого азота. Стабильность.
Полученные генетические конструкции на основе В. subtilis стабильны и не теряют способности синтезировать гиалуроновую кислоту после 10 пересевов на полноценной среде.
Способ согласно настоящему изобретению.
К способам согласно настоящему изобретению относится способ получения гиалуроновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления целевого продукта в указанной питательной среде, и выделения целевого продукта из культуральной жидкости.
Согласно настоящему изобретению выращивание, сбор и очистка целевого продукта из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам культивирования, в которых целевой продукт продуцируется микроорганизмом. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, различные органические кислоты или такие спирты, как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как сульфат аммония, другие соединения азота, такие как аммиак, амины, природные источники азота, такие как пептон и ферментолизаты микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения.
Культивирование осуществляют в аэробных условиях с перемешиванием (например, путем встряхивания, с использованием мешалки или барботирования и т.д.) при температуре в пределах 30-38°С, предпочтительно при 37°С. pH среды поддерживают в пределах 5-9, предпочтительно 6.5-Ί.2. pH среды регулируют буферными растворами или добавлением аммиака, карбоната кальция, различных кислот, оснований. Культивирование в течение от 1 до 3 суток приводит к накоплению целевого продукта - гиалуроновой кислоты в культуральной среде. Способ позволяет накапливать гиалуроновую кислоту как в процессе роста культуры, так и после наращивания биомассы в стационарной фазе роста.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем гиалуроновая кислота может быть собрана и очищена путем ступенчатого осаждения цетилпиридинием и изопропиловым спиртом с последующей очисткой методом колоночной хроматографии на адсорбционных и ионообменных носителях. На последних стадиях выделения также может применяться ультрафильтрация и лиофилизация.
Концентрацию гиалуроновой кислоты в освобожденной от клеток культуральной жидкости определяют карбазольным методом (Т. Bitter, Н.М. Muir. Analytical Biochemistry, v.4, p. 330-334, 1962).
Настоящее изобретение более детально описано со ссылкой на примеры.
Последующие примеры приведены для целей разъяснения сущности настоящего изобретения и не ограничивают каким-либо образом объём правовой охраны, определяемый формулой настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Конструирование плазмиды pDG268-P, содержащей гибридный
ПрОМОТОр Р rpsF-gsiB.
В настоящем изобретении используется сконструированный тандемный промотор, функционирующий в бактерии рода Bacillus, в частности, в В. subtilis, содержащий последовательности нуклеотидов промотора гена rpsF и промотора гена gsiB, причем промотор rpsF расположен выше по ходу транскрипции относительно промотора gsiB. Получение указанного промотора описано в находящейся на рассмотрении заявке, озаглавленной «ТАНДЕМНЫЙ ПРОМОТОР, ФУНКЦИОНИРУЮЩИЙ В БАКТЕРИИ РОДА Bacillus, БАКТЕРИЯ РОДА Bacillus - ПРОДУЦЕНТ ПОЛЕЗНОГО МЕТАБОЛИТА, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ПРОМОТОР, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОЙ БАКТЕРИИ». Промотор PrpsF относится к наиболее сильным промоторам в геноме В. subtilis и обеспечивает максимально высокий уровень транскрипции на логарифмической стадии роста бактерий. Инициация транскрипции этого промотора осуществляется с участием вегетативной сигма-субъединицы РНК-полимеразы (бА). Инициация транскрипции гена gsiB, ответственного за белок общего клеточного стресса, инициируется с участием альтернативной сигма-субъединицы бВ и достигает максимума на стационарной фазе роста бактерий. Тандемный промотор содержит -35 и -10 участки и старт транскрипции промотора гена rpsF, -35 и -10 участки и старт транскрипции промотора гена gsiB, и сайт связывания рибосомы (Фиг. 2).
Гибридный промотор PrpsF-gsiB, показанный на Фиг. 2, нуклеотидная последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1, обрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI и клонировали в соответствующие сайты плазмиды pDG268 (Cell 111: 747-756, 2002), которая содержит кассету, включающую полилинкер для клонирования, репортерный ген lacZ без собственного промотора и ген устойчивости к хлорамфениколу (CmR) (см. Фиг. 3). Кассета фланкирована фрагментами гена ашуЕ, что позволяет проводить интеграцию вектора с клонированным фрагментом в локус ашуЕ на хромосоме бактерии рода Bacillus, в частности, В. subtilis. Полученную плазмиду, получившую наименование pDG268-P, трансформировали в компетентные клетки штамма Е. coli TG1. Трансформанты отбирали на LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Плазмидную ДНК очищали в агарозном геле и очищали с помощью колонок (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit фирмы Illustra) или шариков DNA Gel Extractionkit. Нуклеотидную последовательность ДНК вставки подтверждали путем секвенирования ДНК с использованием праймера 1 (SEQ ID NO: 2) (прямой) и праймера 2 (SEQ ID NO: 3) (обратный).
Полученная плазмида, получившая наименование pDG268-P, содержащая гибридный промотор PrpsF-gsiB, может быть интегрирована в хромосомный локус ашуЕ бактерии рода Bacillus, в частности, В. subtilis. Так, перед трансформацией в клетки В. subtilis плазмидную ДНК pDG268-P линеаризовали с помощью рестриктазы Xbal для обеспечения интеграции в хромосому путем двойного кроссинговера вместо простого кроссинговера. Компетентные клетки штамма В. subtilis 168 трансформировали обработанной рестриктазой Xbal ДНК плазмиды pDG268-P и проводили отбор трансформантов на среде LB, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола. Для подтверждения интеграции плазмиды в хромосомный локус ашуЕ использовали индикаторную среду, содержащую амилопектин в концентрации 0,2 %.
Таким образом, в результате проведенных манипуляций была сконструирована плазмида pDG268-P, содержащая гибридный промотор PrpsF-gsiB и примыкающий к нему репортерный ген lacZ, что позволяет провести тестирование активности этого гибридного промотора в условиях ферментации.
Как следует из Фиг. 2, гибридный промотор содержит по два -35 и -10 участка и два старта транскрипции, которые, как полагают авторы настоящего изобретения без намерения быть ограниченными какой-либо теорией, могут быть попеременно использованы на различных стадиях роста культуры и обеспечивать оптимальную экспрессию генов, находящихся под контролем указанного промотора (Фиг. 4).
Пример 2. Конструирование генетической конструкции АМ2640 путем введения в хромосому штамма-реципиента Bacillus subtilis 168 слияния гена has A S. equisimilis с геном tuaD В. subtilis под контролем гибридного тандемного промотора Р rpsF-gsm.
Конструирование слияния гена hasA S. equisimilis с геном tuaD В. subtilis под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB проводили в несколько этапов. Сначала ген hasA синтезировали химически, взяв за основу нуклеотидную последовательность гена hasA S. equisimilis, и клонировали в вектор pUC57. С полученной плазмидной ДНК провели ПЦР- амплификацию гена hasA 1250 п.н. с использованием праймера 3 (SEQ ID NO: 4), содержащего сайт узнавания рестриктазы BamHI, и праймера 4 (SEQ ID NO: 5), содержащего на 5'-конце последовательность, комплементарную участку N-конца гена tuaD из В. subtilis.
ПЦР-амплификацию проводили в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей 3 нг плазмидной ДНК pUC57 в качестве матрицы, по 20 пмоль праймеров 3 (SEQ ID NO: 4) и 4 (SEQ ID NO: 5), lx буфер для ПЦР, смесь dNTP (каждый в концентрации 0.5 мМ) и 2 ед. акт. термостабильной Taq-полимеразы. Реакции проводили в термоциклере Му Cycler BioRad, запрограммированном на 1 цикл при 95оС в течение 5 мин; 30 циклов, каждый при 95 °С в течение 30 сек, при 58оС в течение 30 сек, при 72°С в течение 2 мин, и 1 цикл при 72°С в течение 5 мин. Продукты анализировали гель-электрофорезом в 1.2% агарозе в 1х ТАЕ. Ожидаемый фрагмент составлял примерно 1270 п.н.
На следующем этапе с хромосомной ДНК В. subtilis провели ПЦР-амплификацию гена tuaD с использованием праймера 5 (SEQ ID NO: 6), содержащего на 5 '-конце последовательность, комплементарную С-концу гена hasA S. equisimilis, и праймера 6 (SEQ ГО NO: 7), содержащего сайт узнавания рестриктазы Notl.
ПЦР-амплификацию проводили в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей 5 нг хромосомной ДНК В. subtilis в качестве матрицы, по 20 пмоль праймеров 5 (SEQ ID NO: 6) и 6 (SEQ ID NO: 7), lx буфер для ПЦР, смесь dNTP (каждый в концентрации 0.5 мМ) и 2 ед. акт. термостабильной Taq-полимеразы. Реакции проводили в термоциклере Му Cycler BioRad, запрограммированном на 1 цикл при 95оС в течение 5 мин; 30 циклов, каждый при 95°С в течение 30 сек, при 58оС в течение 30 сек, при 72°С в течение 2 мин, и 1 цикл при 72°С в течение 5 мин. Продукты анализировали гель-электрофорезом в 1.2% агарозе в 1х ТАЕ. Ожидаемый фрагмент составлял примерно 1450 п.н.
Затем с помощью ПЦР проводили состыковку фрагментов, полученных с использованием пар праймеров 3-4 и 5-6, путем их отжига друг на друга с использованием следующего режима ПЦР: ПЦР-амплификацию проводили в 50 мкл инкубационной смеси, содержащей по 5 нг ДНК фрагментов, полученных с использованием пар праймеров 3-4 и 5-6, 1х буфер для ПЦР, смесь dNTP (каждый в концентрации 0.5 мМ) и 2 ед. акт. термостабильной Taq-полимеразы. Реакции проводили в термоциклере Му Cycler BioRad, запрограммированном на 1 цикл при 95оС в течение 5 мин; 10 циклов, каждый при 95°С в течение 30 сек, при 52оС в течение 30 сек, при 72°С в течение 2 мин, и 1 цикл при 72°С в течение 5 мин. После этого в реакционную смесь добавляли праймер 3 (SEQ ID NO: 4), содержащий сайт узнавания рестриктазы BamHI, и праймер 6 (SEQ ID NO: 7), содержащий сайт узнавания рестриктазы Notl, и проводили ПЦР в режиме: 25 циклов, каждый при 95°С в течение 30 сек, при 56оС в течение 30 сек, при 72°С в течение 2.5 мин, и 1 цикл при 72°С в течение 5 мин. Продукты анализировали гель-электрофорезом в 1.2% агарозе в 1х ТАЕ. Ожидаемый фрагмент составлял примерно 2700 п.н.
Полученный ПЦР фрагмент размером 2700 п.н. обрабатывали рестриктазами BamHI и Notl, и клонировали в соответствующие сайты полученной ранее плазмиды pDG268-P, содержащей гибридный тандемный промотор PrpsF-gsiB. Полученную плазмиду, получившую наименование pDG268-PHT, трансформировали в компетентные клетки штамма Е. coli TG1. Трансформанты отбирали на LB-среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Плазмидную ДНК очищали в агарозном геле и элюировали с помощью колонок (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit фирмы Illustra) или шариков DNA Gel Extractionkit (компания «Fermentas»). Нуклеотидную последовательность ДНК вставки подтверждали путем секвенирования ДНК с использованием праймеров 1 (SEQ ID NO: 2) (прямой) и 2 (SEQ ID NO: 3) (обратный).
На заключительном этапе проводили интеграцию полученной плазмиды pDG268-PHT в хромосомный локус ашуЕ В. subtilis. С этой целью перед трансформацией в клетки В. subtilis плазмидную ДНК pDG268-PHT линеаризовали с помощью рестриктазы Xbal для обеспечения интеграции в хромосому путем двойного кроссинговера вместо простого кроссинговера. Компетентные клетки штамма В. subtilis 168 трансформировали обработанной рестриктазой Xbal ДНК плазмиды pDG268-P и проводили отбор трансформантов на среде LB, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола. Для подтверждения интеграции плазмиды в хромосомный локус ашуЕ использовали индикаторную среду, содержащую амилопектин в концентрации 0,2 %.
Таким образом, в результате проведенных манипуляций была получена генетическая конструкция на основе В. subtilis, содержащей в хромосоме слияние гена hasA S. equisimilis с геном tuaD В. subtilis под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
Пример 3. Конструирование генетической конструкции АМ2681 путем введения в хромосому реципиента Bacillus subtilis АМ2640 гена gtaB под контролем гибридного тандемного промотора Р fpsF-gsiB.
Ген gtaB в геноме полученной выше генетической конструкции В. subtilis АМ2640 подставляли под контроль гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB для усиления его экспрессии. Для этого на первом этапе проводили клонирование промоторной области PrpsF- gsiB в экспрессионный вектор pLEl, способный к репликации как в клетках бактерий рода Bacillus, в частности, В. subtilis, так и Е. coli, и содержащий ген устойчивости к эритромицину (Фиг. 5). Вектор pLEl является делеционным вариантом плазмиды pKSl (FEMS Microbiol. Letters, 245: 315-319, 2005), у которой делетирован маркер устойчивости к канамицину. С этой целью с ДНК плазмиды pDG268-P, содержащей гибридный промотор PrpsF-gsiB, проводили ПЦР амплификацию с участием фланкирующих тандемный промотор праймера 7 (SEQ ID NO: 8), содержащего сайт рестрикции Pstl, и праймера 8 (SEQ ID NO: 9), содержащего сайт рестрикции Hindlll.
Полученный ПЦР-продукт размером 232 п.н. очищали в агарозном геле, обрабатывали рестриктазами Pstl и Hindlll и клонировали в векторе pLEl по сайтам Pstl и Hindlll. Полученная плазмида, содержащая гибридный тандемный промотор PrpsF-gsiB, получила наименование pLE3.
На следующем этапе с хромосомной ДНК штамма В. subtilisl68 trpC2 проводили ПЦР амплификацию промотор-проксимального участка гена gtaB с помощью праймера 9 (SEQ ID NO: 10), содержащего сайт SacII, и праймера 10 (SEQ ID NO: 11), содержащего сайт Pstl.
Полученный ПЦР-продукт размером 394 п.н. очищали в агарозном геле, обрабатывали рестриктазами SacII и Pstl и клонировали в векторе pLE3, содержащем промотор PrpsF-gsiB, по сайтам SacII и Pstl.
Затем с хромосомной ДНК штамма В. subtilisl 68 trpC2 проводят ПЦР амплификацию фрагмента рамки считывания гена gtaB с помощью праймера И (SEQ ID NO: 12), содержащего сайт Hindlll, и праймера 12 (SEQ ID NO: 13), содержащего сайт Kpnl.
Полученный ПЦР-продукт размером 397 п.н. очищали в агарозном геле, обрабатывали рестриктазами Hindlll и Kpnl и клонировали по тем же сайтам в полученный на предыдущем этапе вектор pLE3, содержащий промотор PrpsF-gsiB и промотор-проксимальную область гена gtaB. У полученной в результате проведенных манипуляций плазмидной конструкции pLE5 gtaB’-PrpsF-gsiB-‘ gtaB природный промотор гена gtaB замещен на промотор PrpsF-gsiB.
Сконструированной таким образом плазмидой pLE5 проводили трансформацию штамма Е. coli TG1 с отбором трансформантов EmR на среде с эритромицином (300 мкг/мл) при ЗОоС. Полученные клоны проверяли с помощью ПЦР на присутствие в их клетках плазмиды pLE5 с клонированным в ее составе фрагментом gtaB’-PrpsF-gsiB-‘gtaB. Выделенными из проверенных клонов плазмидами pLE5 (gtaB’-PrpsF-gsiB-‘gtaB) проводили трансформацию в родительский штамм В. subtilis АМ2640 с отбором трансформантов EmR на среде с эритромицином (3 мкг/мл). Несколько полученных клонов EmR культивировали на жидкой среде LB с эритромицином (3 мкг/мл) при 37оС в течение ночи, а затем рассевали на чашки со средой LB с эритромицином (3 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 ч при 37оС. Полученные рекомбинанты EmR сформировались в результате интеграции плазмиды pLE5 (gtaB’-PrpsF- gsiB-‘gtaB) в соответствующий хромосомный локус gtaB, что подтверждали наработкой ПЦР- фрагмента размером 901 п.н. при использовании праймеров 9 (SEQ ID NO: 10) и 12 (SEQ ID NO: 13). Несколько полученных клонов EmR засевали в жидкую LB среду без антибиотика и инкубировали на качалке при ЗОоС в течение 48 часов, а затем рассевали на чашки со средой LB без антибиотика и инкубировали 24 часа при ЗОоС.
Наконец, на последнем этапе работы выросшие клоны проверяли на выщепление интегрированной плазмиды pLE5, о чем судили по появлению эритромицин-чувствительных клонов. Выщепление плазмиды происходит либо с сохранением в составе хромосомы промотора дикого типа гена gtaB, либо с заменой промотора дикого типа на промотор PrpsF- gsiB. Интеграцию промотора PrpsF-gsiB перед геном gtaB в хромосому штамма В. subtilis подтверждали наработкой ПЦР-фрагмента размером 791 п.н. с участием праймеров 1 (SEQ ID NO: 2) и 13 (SEQ ID NO: 14) и его последующим секвенированием. Один из вариантов штамма В. subtilis АМ2640, включивший ген gtaB под контролем промотора PrpsF-gsiB, получивший наименование АМ2681, накапливал до 2,21 г/л гиалуроновой кислоты при ферментации в течение 48 часов (Таблица 1).
Пример 4. Конструирование генетических конструкций АМ2686 и АМ2694 путем введения в хромосому реципиентов Bacillus subtilis АМ2640 и АМ2681, соответственно, оперона gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора Р rpsF-gsiB.
Оперон gcaD-prs в геноме полученной выше генетической конструкции В. subtilis АМ2640 подставляли под контроль гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB для усиления его экспрессии. Для этого на первом этапе с хромосомной ДНК штамма В. subtilis 168 trpC2 проводили ПЦР амплификацию промотор-проксимального участка оперона gcaD-prs с помощью праймера 14 (SEQ ID NO: 15), содержащего сайт SacII, и праймера 15 (SEQ ID NO: 16), содержащего сайт Pstl.
Полученный ПЦР-продукт размером 419 п.н. очищали в агарозном геле, обрабатывали рестриктазами SacII и Pstl и клонировали в полученный на предыдущем этапе вектор pLE3, содержащий промотор PrpsF-gsiB, по сайтам SacII и Pstl.
Затем с хромосомной ДНК штамма В. subtilis 168 trpC2 проводили ПЦР амплификацию фрагмента рамки считывания гена gcaD с помощью праймера 16 (SEQ ID NO: 17), содержащего сайт Clal, и праймера 17 (SEQ ID NO: 18), содержащего сайт Kpnl.
Полученный ПЦР-продукт размером 394 п.н. очищали в агарозном геле, обрабатывали рестриктазами Clal и Kpnl и клонировали по тем же сайтам в полученный на предыдущем этапе вектор pLE3, содержащий промотор PrpsF-gsiB и промотор-проксимальную область оперона gcaD-prs. У полученной в результате проведенных манипуляций плазмидной конструкции pLE8 gcaD’-PrpsF-gsiB-‘gcaD природный промотор оперона gcaD-prs замещен на промотор PrpsF- gsiB. Сконструированной таким образом плазмидой pLE8 проводили трансформацию штамма Е. coli TG1 с отбором трансформантов EmR на среде с эритромицином (300 мкг/мл) при ЗОоС. Полученные клоны проверяли с помощью ПЦР на присутствие в их клетках плазмиды pLE8 с клонированным в ее составе фрагментом gcaD’-PrpsF-gsiB-‘gcaD. Выделенными из проверенных клонов плазмидами pLE8 (gcaD’-PrpsF-gsiB-‘gcaD) проводили трансформацию в сконструированные ранее генетические конструкции В. subtilis АМ2640 и АМ2681 с отбором трансформантов EmR на среде с эритромицином (3 мкг/мл). Несколько полученных клонов EmR, полученных при трансформации генетических конструкций АМ2640 и АМ2681 , культивировали на жидкой среде LB с эритромицином (3 мкг/мл) при 37оС в течение ночи, а затем рассевали на чашки со средой LB с эритромицином (3 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 ч при 37оС. Полученные рекомбинанты EmR сформировались в результате интеграции плазмиды pLE8 (gcaD’-PrpsF-gsiB-‘gcaD) в соответствующий хромосомный локус gcaD, что подтверждали наработкой ПЦР-фрагмента размером 891 п.н. при использовании праймера 14 (SEQ ID NO: 15) и праймера 17 (SEQ ID NO: 18). Несколько полученных клонов EmR засевали в жидкую LB среду без антибиотика и инкубировали на качалке при ЗОоС в течение 48 часов, а затем рассевали на чашки со средой LB без антибиотика и инкубировали 24 часа при ЗОоС.
Наконец, на последнем этапе работы выросшие клоны проверяли на выщепление интегрированной плазмиды pLE8, о чем судили по появлению эритромицин-чувствительных клонов. Выщепление плазмиды происходит либо с сохранением в составе хромосомы промотора дикого типа оперона gcaD-prs, либо с заменой промотора дикого типа на промотор PrpsF-gsiB. Интеграцию промотора PrpsF-gsiB перед опероном gcaD-prs в хромосому штамма В. subtilis подтверждали наработкой ПЦР-фрагмента размером 772 п.н. с участием праймера 1 (SEQ ID NO: 2) и праймера 18 (SEQ ID NO: 19) и его последующим секвенированием. По одному варианту генетические конструкции В. subtilis АМ2640 и АМ2681, включившие оперон gcaD-prs под контролем промотора PrpsF-gsiB, получившие наименование АМ2686 и АМ2694, накапливали до 2,83 и 3,21 г/л гиалуроновой кислоты, соответственно, при ферментации в течение 48 часов (Таблица 1).
Пример 5. Определение уровня транскрипции целевых генов в полученных генетических конструкциях методом ПЦР в реальном времени.
Уровень транскрипции генов has A, tuaD, gtaB и gcaD определяли методом ПЦР в реальном времени. С этой целью клеточные культуры анализируемых генетических конструкций растили до ОП600 = 1.4- 1.6 и выделяли тотальную РНК. Очистку РНК проводили с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen) в соответствии с инструкцией фирмы- производителя. Полученные препараты РНК обрабатывали ДНКазой I. Качество полученной тотальной РНК анализировали в 1% агарозном геле с добавлением формамйда. Количество определяли спектрофотометрически по величине поглощения при длине волны 260 нм. Перед проведением реакции обратной транскрипции образцы РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo). Реакцию обратной транскрипции осуществляли в присутствии специфичных для исследуемых генов олигонуклеотидов при помощи набора“Superscript III First-Strand Synthesis Kit for RT- PCR” (Invitrogen). Далее 1 мкл от объема всей реакции обратной транскрипции использовали в качестве матрицы для ПЦР с детекцией в реальном времени. Уровни экспрессии генов rmA и gyrB использовали для нормализации.
Анализ проводили с использованием набора реагентов для ПЦР в реальном времени производства компании Синтол, Россия. Амплификацию проводили на приборе DTlite (ДНК- технология). Продукты реакции анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле для подтверждения того, что полученные продукты имеют ожидаемый размер. Каждая реакция была поставлена трижды, в качестве результата бралось среднее значение. Уровень транскрипции определяли по значениям порогового цикла с учетом того, что концентрация исходных специфических фрагментов ДНК увеличивается приблизительно как 2N, где N - количество циклов. Результаты определения уровня транскрипции генов hasA, tuaD, gtaB и gcaD в штаммах АМ2640, АМ2681, АМ2686 и АМ2694 представлены на Фиг. 6.
Как следует из данных на Фиг. 6, подстановка генов hasA, tuaD, gtaB и gcaD под контроль тандемного гибридного промотора PrpsF-gsiB обеспечивает примерно одинаковое, почти 30-кратное увеличение их уровня транскрипции.
Пример 6. Получение гиалуроновой кислоты с помощью полученных генетических конструкций.
Посевную культуру штамма заявляемой генетической конструкции Bacillus subtilis, продуцирующей гиалуроновую кислоту, получают путем выращивания при встряхивании (200- 220 об/мин) в течение 18 часов при 37°С на среде LB следующего состава, мае. %:
Пептон казеиновый - 1,0;
Дрожжевой экстракт - 0,5;
NaCl - 0,5;
Глюкоза - 1,0;
MgS04 - 0,02.
Полученной посевной культурой засевают ферментационную среду следующего состава, мас.%: Сахароза - 8,0;
Мальтоза - 4,0;
Дрожжевой экстракт - 0,5;
Мочевина - 0,6;
КН2Р04 - 0,6;
К2НР04 - 1 ,4;
(NH4)2S04 - 0,3;
Na-цитрат - 0,2;
Казаминовые кислоты - 0,04,
MgS04 - 0,3.
Ферментацию штамма-продуцента проводили в течение 48 час. при температуре 37оС. Выделение гиалуроновой кислоты из культуральной жидкости включает в себя следующие стадии:
Удаление клеточной массы из культуральной жидкости, в которой выращивались описанные выше генетические конструкции, центрифугированием при 8000 об/мин. Осадок отбрасывают, а супернатант используют далее.
Прецепитирование ГК раствором цетилпиридиния и изопропанола.
К супернатанту добавляют 10% водный раствор цетилпиридиния до конечной концентрации 1%. Раствор оставляют на 1,5 часа при постоянном помешивании на 37°С. После окончания инкубации раствор центрифугируют при 8000 об/мин 30 мин.
Осадок растворяют в 0,5М NaCl (объем в 2-2,5 раза меньший начального объема супернатанта), при помешивании и 37°С, при полном растворении, наливают равный объем изопропанола (1 :1), и оставляют при -20°С на ночь. Сформировавшийся осадок ГК центрифугируют при8000 об/мин 30 мин и далее работают с ним.
Осадок ГК растворяют в дистиллированной воде до полного растворения. Полученную вязкую желтоватую жидкость обесцвечивают на колонке с активированным углем. Если жидкость мутная, то перед нанесением на колонку фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Элюцию с колонки ведут дистиллированной водой. Цвет выходящей жидкости должен быть бесцветный или слабо-кремовый. Если цвет более интенсивный, препарат наносят на уголь еще раз. К образцу ГК добавляют до концентрации 0,1 % 10% суспензию бентонита с 0,5% Na2C03, предварительно подкислив образец ГК 100% уксусной кислотой до рН=3,5. Инкубируют в течение 2 часов при помешивании 150 об/мин. После инкубации центрифугируют раствор при 8000 об/мин или фильтруют раствор через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
Ультрафильтрация через мембрану РеШсоп 2 - 300 Кда. Пропущенный через 0,45 мкм препарат ГК фильтруют от остатков цетилпиридиния и соли против 10-20 кратного объема дистиллированной воды. Проводимость препарата ГК не должна превышать 2 мСм/см. Готовый препарат ГК оставляют при температуре +4оС на 1-2 суток. Если через сутки препарат помутнеет, фильтруют его через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм или 0,22 мкм.
Пример 7. Уровень синтеза гиалуроновой кислоты при культивировании полученных генетических конструкций.
Полученные генетические конструкции, содержащие в составе хромосомы слияние гетерологичного гена hasA S. equisimilis с геном tuaD В. subtilis под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB ,а также дополнительно содержащие в составе хромосомы ген gtaB под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB и/или оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB, проверяли на способность синтезировать гиалуроновую кислоту при культивировании в лабораторном ферментере объемом З л е использованием ферментационной среды, как описано в Примере 7.
Результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Динамика накопления гиалуроновой кислоты в культуральной жидкости полученных генетических конструкций - продуцентов гиалуроновой кислоты.
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Как следует из данных Таблицы 1, все полученные генетические конструкции демонстрировали более высокий уровень накопления гиалуроновой кислоты по сравнению с исходным штаммом В. subtilis 168. Наиболее высокий уровень накопления целевого продукта демонстрировала генетическая конструкция АМ2694, в которой наряду с amyE::PrpsF-gsiB- hasA-tuaD в составе хромосомы присутствовали ген gtaB и оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB. Указанная генетическая конструкция накапливала 3.21 г/л гиалуроновой кислоты.

Claims

Формула изобретения
1 Трансформированная клетка бактерии рода Bacillus, продуцирующая гиалуроновую кислоту и содержащая в составе хромосомы слияние гетерологичного гена hasA из S. equisimilis с геном tuaD из В. subtilis под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB; причем указанная клетка дополнительно характеризуется тем, что необязательно содержит в составе хромосомы ген gtaB под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB и/или оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
2 Трансформированная клетка по п. 1, содержащая в хромосоме ген gtaB под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
3 Трансформированная клетка по п. 1, содержащая в хромосоме оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
4 Трансформированная клетка по п. 1, содержащая в хромосоме ген gtaB под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB и оперон gcaD-prs под контролем гибридного тандемного промотора PrpsF-gsiB.
5 Трансформированная клетка по любому из п.п. 1-4, где указанная бактерия рода Bacillus является бактерией В. subtilis.
6 Способ получения гиалуроновой кислоты, включающий:
а) культивирование трансформированной клетки по любому из пп.1-5 в питательной среде, пригодной для продукции гиалуроновой кислоты, и
б) выделение гиалуроновой кислоты из культуральной жидкости.
7 Способ по п. 6, характеризующийся тем, что используют жидкую питательную среду следующего состава, мае. %:
Сахароза - 8,0;
Мальтоза - 4,0;
Дрожжевой экстракт - 0,5; Мочевина - 0,6;
KH2P04 - 0,6;
K2HP04 - 1,4;
(NH4)2S04 - 0,3;
Na-цитрат - 0,2;
Казаминовые кислоты - 0.04; MgS04 - 0.3;
Остальное - вода.
PCT/RU2020/000311 2019-07-26 2020-06-26 Бастерия рода bacillus, продуцирующая гиалуронувую кислоту WO2021020995A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20847292.8A EP4006156A4 (en) 2019-07-26 2020-06-26 HYALURONIC ACID PRODUCING BACTERIA OF THE BACILLUS GENUS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019123612 2019-07-26
RU2019123612A RU2719140C1 (ru) 2019-07-26 2019-07-26 Бактерия рода bacillus, продуцирующая гиалуроновую кислоту, и способ получения гиалуроновой кислоты с использованием указанной бактерии

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021020995A1 true WO2021020995A1 (ru) 2021-02-04

Family

ID=70277909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/000311 WO2021020995A1 (ru) 2019-07-26 2020-06-26 Бастерия рода bacillus, продуцирующая гиалуронувую кислоту

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4006156A4 (ru)
RU (1) RU2719140C1 (ru)
WO (1) WO2021020995A1 (ru)

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4801539A (en) 1984-05-25 1989-01-31 Shiseido Company Ltd. Fermentation method for producing hyaluronic acid
EP0694616A2 (en) 1994-07-26 1996-01-31 POLI INDUSTRIA CHIMICA S.p.A. Process for the preparation of hyaluronic acid by fermentation with streptococcus
WO1999023227A2 (en) 1997-10-31 1999-05-14 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Hyaluronan synthase gene and uses thereof
WO1999051265A1 (en) 1998-04-02 1999-10-14 Board Of Regents Of The Universtiy Of Oklahoma Nucleic acid encoding hyaluronan synthase and methods of use
WO2000027437A2 (en) 1998-11-11 2000-05-18 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Polymer grafting by polysaccharide synthases
RU2346049C2 (ru) 2001-12-21 2009-02-10 Новозимс Биополимер А/С Способ получения гиалуронана в рекомбинантной клетке-хозяине
EP2046969A2 (en) 2006-07-06 2009-04-15 Reliance Life Sciences Pvt., Ltd. Efficient process for purification of high molecular weight hyaluronic acid
WO2012032153A1 (en) 2010-09-09 2012-03-15 Fidia Farmaceutici S.P.A. "process for the production of hyaluronic acid in escherichia coli or bacillus megaterium"
WO2012032154A1 (en) * 2010-09-09 2012-03-15 Fidia Farmaceutici S.P.A. Process for the production of hyaluronic acid in escherichia coli or bacillus subtilis
RU2542387C1 (ru) * 2013-09-27 2015-02-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") БАКТЕРИЯ Bacillus subtilis, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ 5`-АМИНОИМИДАЗОЛ-4-КАРБОКСАМИДРИБОЗИД (АИКАР), И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА АИКАР ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТАКОЙ БАКТЕРИИ
EA032045B1 (ru) * 2009-08-10 2019-03-29 Лонца Аг ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОМОТОР manP ИЛИ manR ОПЕРОНА МАННОЗЫ

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008200910C1 (en) * 2001-12-21 2012-11-22 Novozymes A/S Methods for producing hyaluronan in a recombinant host cell
US20070259004A1 (en) * 2005-12-08 2007-11-08 Universitaet Bayreuth Expression vector for Bacillus species
DE102008052529A1 (de) * 2008-10-21 2010-04-22 Henkel Ag & Co. Kgaa Expressionsverstärkte Nukleinsäuren

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4801539A (en) 1984-05-25 1989-01-31 Shiseido Company Ltd. Fermentation method for producing hyaluronic acid
EP0694616A2 (en) 1994-07-26 1996-01-31 POLI INDUSTRIA CHIMICA S.p.A. Process for the preparation of hyaluronic acid by fermentation with streptococcus
WO1999023227A2 (en) 1997-10-31 1999-05-14 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Hyaluronan synthase gene and uses thereof
WO1999051265A1 (en) 1998-04-02 1999-10-14 Board Of Regents Of The Universtiy Of Oklahoma Nucleic acid encoding hyaluronan synthase and methods of use
WO2000027437A2 (en) 1998-11-11 2000-05-18 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Polymer grafting by polysaccharide synthases
RU2346049C2 (ru) 2001-12-21 2009-02-10 Новозимс Биополимер А/С Способ получения гиалуронана в рекомбинантной клетке-хозяине
US20140038235A1 (en) 2001-12-21 2014-02-06 Novozymes Biopharma Dk A/S Methods For Producing Hyaluronan In A Recombinant Host Cell
EP2046969A2 (en) 2006-07-06 2009-04-15 Reliance Life Sciences Pvt., Ltd. Efficient process for purification of high molecular weight hyaluronic acid
EA032045B1 (ru) * 2009-08-10 2019-03-29 Лонца Аг ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОМОТОР manP ИЛИ manR ОПЕРОНА МАННОЗЫ
WO2012032153A1 (en) 2010-09-09 2012-03-15 Fidia Farmaceutici S.P.A. "process for the production of hyaluronic acid in escherichia coli or bacillus megaterium"
WO2012032154A1 (en) * 2010-09-09 2012-03-15 Fidia Farmaceutici S.P.A. Process for the production of hyaluronic acid in escherichia coli or bacillus subtilis
RU2542387C1 (ru) * 2013-09-27 2015-02-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") БАКТЕРИЯ Bacillus subtilis, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ 5`-АМИНОИМИДАЗОЛ-4-КАРБОКСАМИДРИБОЗИД (АИКАР), И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА АИКАР ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТАКОЙ БАКТЕРИИ

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"prescription of the Spitsizeen environment", MOLBIOL.RU, 2 June 2004 (2004-06-02), XP055793069, Retrieved from the Internet <URL:http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=3779> [retrieved on 20201026] *
APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 84, 2009, pages 63 - 69
DEANGELIS, P. L., CELL. MOL. LIFE SCI, vol. 56, 1999, pages 670682
FEMS MICROBIOL. LETTERS, vol. 245, 2005, pages 315 - 319
GENOME BIOLOGY, vol. 5, 2004, pages 77
HILDEN I. ET AL: "TRICISTRONIC OPERON EXPRESSION OF THE GENES GCAD (TMS), WHICH ENCODES N-ACETYLGLUCOSAMINE 1-PHOSPHATE URIDYLTRANSFERASE, PRS, WHICH ENCODES PHOSPHORIBOSYL DIPHOSPHATE SYNTHETASE, AND CTC IN VEGETATIVE CELLS OF BACILLUS SUBTILIS.", JOURNAL OF BACTERIOLOGY (PRINT), AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 177., no. 24., 1 December 1995 (1995-12-01), US, pages 7280 - 7284., XP000647508, ISSN: 0021-9193, DOI: 10.1128/jb.177.24.7280-7284.1995 *
J. BACTERIOL., vol. 81, 1961, pages 741 - 746
MILLER, J. H.: "Experiments in Molecular Genetics", 1979, MIR
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 98, 2001, pages 4658 - 4663
See also references of EP4006156A4
T. BITTERH.M. MUIR, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 4, 1962, pages 330 - 334

Also Published As

Publication number Publication date
EP4006156A4 (en) 2023-08-02
EP4006156A1 (en) 2022-06-01
RU2719140C1 (ru) 2020-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002366711B2 (en) Methods for producing hyaluronan in a recombinant host cell
EP1987153B1 (en) Production of low molecular weight hyaluronic acid
US9695453B2 (en) Process for the production of hyaluronic acid in Escherichia coli or bacillus megaterium
US20050221446A1 (en) Methods for producing hyaluronic acid in a Bacillus cell
RU2719140C1 (ru) Бактерия рода bacillus, продуцирующая гиалуроновую кислоту, и способ получения гиалуроновой кислоты с использованием указанной бактерии
RU2723722C1 (ru) ТАНДЕМНЫЙ ПРОМОТОР, ФУНКЦИОНИРУЮЩИЙ В БАКТЕРИИ РОДА Bacillus, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ БАКТЕРИЯ РОДА Bacillus - ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ПРОМОТОР, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОЙ БАКТЕРИИ
EP2031053A1 (en) Production of HA
AU2008200910B2 (en) Methods for producing hyaluronan in a recombinant host cell
JP5796951B2 (ja) タンパク質又はポリペプチドの製造方法
CN111607548B (zh) 一种产甘露聚糖的重组大肠杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20847292

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020847292

Country of ref document: EP

Effective date: 20220228