CN1040459C - 以醋酸浓度作为指标的培养方法 - Google Patents

以醋酸浓度作为指标的培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1040459C
CN1040459C CN88101483A CN88101483A CN1040459C CN 1040459 C CN1040459 C CN 1040459C CN 88101483 A CN88101483 A CN 88101483A CN 88101483 A CN88101483 A CN 88101483A CN 1040459 C CN1040459 C CN 1040459C
Authority
CN
China
Prior art keywords
metabolite
nutrient solution
acetate concentration
acetic acid
production method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CN88101483A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1036034A (zh
Inventor
清水範夫
福园真一
藤森清
西村信子
绪田原蓉二
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi Plant Technologies Ltd
Original Assignee
Hitachi Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi Ltd filed Critical Hitachi Ltd
Publication of CN1036034A publication Critical patent/CN1036034A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1040459C publication Critical patent/CN1040459C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

在为生产代谢物而培养微生物或动、植物细胞的方法中，通过监测培养液中的醋酸盐浓度，并调节该微生物或动、植物细胞对培养液中的醋酸盐的同化作用而使醋酸盐浓度控制在设定值以下，从而能进行高密度培养、达到高菌体回收率并提高目的产物产量。本发明还涉及适于进行上述培养的培养装置，该装置包括进行培养的培养槽、培养液中醋酸盐浓度分析装置、贮存基质的基质槽、用于添加基质的流量可变式基质进料装置、以及根据来自分析装置的信号控制来自基质进料装置之基质流量的信号输出控制装置。

Description

以醋酸浓度作为指标的培养方法
本发明是涉及培养微生物或动物及植物细胞的方法，特别是涉及用重组微生物生产酶和生物活性物质时，为了提高目的产物的生产效率，监测醋酸浓度以培养微生物和动植物细胞的方法及其装置。
以前一直是通过培养微生物和动植物细胞，特别是通过培养重组的微生物，来生产作为其代谢物的抗菌素、氨基酸、酶以及激素等生物活性物质。这种培养方法多半是只将培养基和种子细胞放入培养槽内进行分批培养，所以生产效率较低。为了提高生产效率，于是采用了在培养过程中添加基质或诱导剂的培养方法。但是应该在什么时机添加上述物质却是个很大的问题，因为不知道该时机的明确标志。在别的方面，我们虽然知道培养面包酵母时根据呼吸商来检测乙醇的生成，然后添加基质的方法〔特开昭57-36983号、58-87584号)，但这是为了获得菌体本身所进行的培养，与生产代谢物完全不同。
另外，虽然添加了基质，在培养过程中仍然存在细胞增殖速度降低的现象。对此，人们认为这是由于培养液中积存增殖抑制物质所造成的。可是人们又很缺乏有关这种抑制物质的实际知识，所以从这一点上来看，要想达到高效率的培养也是相当困难的。由于这种增殖抑制物不是特定的，因此，为了将其除去则要间断或连续的将培养液抽出，通过离心分离回收菌体细胞，然后再装入培养槽中进行培养。对于这种方法人们虽然已经掌握，但这是以酵母作为对象所采用的工序，是为了大量生产细胞本身，不是为了使细胞生产目的产物而采用方法。
以上所列举的现有技术，由于没能考虑到对所加基质和增殖抑制物的监测，因此存在者难以以高效率的进行细胞增殖并生产其代谢物质的问题。
本发明之目的是提供在培养微生物或动植物细胞、特别是培养重组微生物时，根据培养液中的醋酸浓度监测代谢物产生的培养方法及其装置。
总的说来，本发明的一个方面是关于培养微生物或动植物细胞以产物代谢产物的方法，包括监测培养液中的醋酸浓度并通过调节该微生物或动植物细胞对培养液中醋酸的同化，将该醋酸浓皮调整在设定值或以下。
本发明的第二个方面是涉及培养装置，该装置包括施行培养的培养槽、分析培养液中醋酸浓度的分析装置、贮存基质的基质槽、添加基质的流量可变式基质添加装置，以及根据该分析装置的信号来控制该基质添加装置的基质流量的信号输出控制装置。
附图的简要说明：
图1为本发明之培养装置的一实施例的概图。
图2为表示用重组的大肠杆菌进行分批进料培养之结果的线形图。
图3为表示培养液中醋酸浓度和比生长速率之间关系的一例线形图。
图4为表示培养液中醋酸浓度与β-gal生产量之间关系的一例线形图。
图5为表示重组大肠杆菌的醋酸同化的一例线形图。
图6为在图5的各种条件下，以培养时间和菌体浓度之间的关系表示菌体增殖的线形图。
图7～9为按照本发明以醋酸浓度作为指标的重组大肠杆菌的分批进料培养结果之一例线形图。
图10为表示比较实施例中之培养结果的线形图。
以下对本发明的方法和装置作具体说明。其中培养携带已连接了trp(色氨酸)启动子及β-gal(β-半乳糖苷酶)基因之杂合质粒pTREZI的大肠杆菌HB101〔pTREZI〕菌株(已依照布达佩斯条约委托FRI保藏，保藏登记号为FERM BP-815)。但是本发明不只限于此。
杂合质粒pTREZI的trp启动子部分是含有大肠杆菌的trp启动子一操纵子和trp-L(前导肽基因)以及Trp-E(邻氨基苯甲酸合成酶)末端部分的约500bp DNA片段，它被插入在pBR 322质粒的EcoRI位点。另一方面，β-gal基因是由pMC1403〔J.Bacteriol.，第143卷，第971～980页(1980)〕中切掉的6.2kb大小的片段，并插入在trp启动子的EcoRI位点和pBR322的SalI位点之间。这样，杂合质粒pTREZI的β-gal基因即处在trp启动子的控制之下。
含有trp启动子的杂合质粒，在培养过程中通过添加3-β吲哚丙烯酸(以下简称IA)来判明基因的表达〔Nature，笫291卷、第503～506页(1981)〕。这是因为控制基因复制的阻遏物通过IA的作用而失活、进而通过RNA聚合酶开始合成mRNA的缘故。
本发明人使用能生产β-半乳糖苷酶(β-gal)的重组大肠杆菌作为模型，就高效率生产β-gal的培养方法进行了许多研究，结果以成功地获得菌体高效率的增殖和高效率地生产目的产物而完成了本发明。
图2显示使用重组大肠杆菌进行分批进料培养的一个例子。亦即，将该分批进料培养结果以座标图表示，显示培养时间(小时、横座标)与菌体浓度(g/l)、β-gal量(U/ml)以及葡萄糖浓度(g/l)〔纵座标〕之间的关系。
培养是以溶解氧浓度的上升作为指标、添加作为基质的葡萄糖和含有酪蛋白氨基酸的培养基进行的。在第18小时，菌体浓度达到13g/l，此后菌体停止增殖。为了诱导β-gal的产生，虽然在第32小时添加了诱导剂IA和作为营养素的酪蛋白氨基酸，但未能诱导出β-gal的产生。可以推断，细胞停止增殖以及β-gal未能被诱导产生，可能是由于在培养液上清中存在抑制菌体繁殖和β-gal产生的物质。
于是，收集菌体停止繁殖后、培养第19小时的培养液上清，并使用超滤膜和离子交换树脂从中分离抑制菌体增殖的物质。对此分离液、用细管式等速电泳分析装置进行有机酸的分析。结果发现醋酸呈高浓度的蓄积，浓度达33g/l。于是将相应量的醋酸盐〔由于pH的调节，醋酸在培养液中一般以醋酸盐的形式存在〕添加在新鲜培养基中进行培养，结果菌体增殖受到了抑制(参见图3)。据此可以判明，参与抑制菌体增殖的物质是醋酸。另外，就基因表达(β-gal产生)来说，也获得与抑制菌体增殖大致相同的结果(参见图4)。图3是图解显示重组大肠杆菌培养液中的醋酸浓度(g/l、横座标)与其比生长速度(l/小时纵座标)之间的关系；图4则是图解显示培养液中的醋酸浓度(g/l，横座标)与β-gal生产量U/ml，纵座标)之间的关系。
进而使用气相色谱法分析培养液上清也确认抑制物质是醋酸。
根据上述结果，从培养液中蓄积的醋酸抑制了菌体增殖这一事实出发，本发明人考虑到以醋酸浓度作为指标，通过添加基质可能会提高菌体的增殖效率。为此须除去在培养液中所蓄积的醋酸。本发明人决定通过使菌体同化醋酸来除掉之。于是，在培养液中添加相当于醋酸浓度为0～10g/l的醋酸，然后研究重组菌同化醋酸的可能性。如图5所示，由于在培养液中添加了葡萄糖1g/l所以在培养初期培养液中的醋酸浓度升高，但是以后，醋酸的浓度便逐渐下降。这一变化表明，培养液中的醋酸盐被菌体细胞同化了。该时菌体浓度随着时间所发生的变化如图6所示。即：图5是重组大肠杆菌同化醋酸的一个例子，图解显示培养时间(小时，横座标)和醋酸浓度(g/l)、纵座标)之间的关系。图中，醋酸初始浓度以g/l为单位，白圈为0g/l，黑圈为1g/l，白三角为5g/l，黑三角为10g/l。图6是在图5的各种条件下，以培养时间(小时，横座标)与菌体浓度(OD550nm纵座标)之间的关系图解显示菌体增殖的座标图。如图6所表明的那样，菌体的浓度因细胞同化醋酸，而比不添加醋酸时有所增加。
这些结果表明，通过抑制基质的添加量来控制菌体对醋酸的同化，即控制醋酸浓度，是一种方便、有效而优越的方法。
基于上述结果，本发明人已发现对培养液中的醋酸盐浓度进行监测，当醋酸浓度高于设定值时，通过减少基质添加量或中止添加基质使菌体同化醋酸盐而降低醋酸浓度，而当醋酸浓度比设定值低时，贝重新添加基质以调节其浓度是一种很有利的方法。
从图3的结果可以了解到，本发明之培养液中的醋酸浓度应控制在15g/l或更少，更好是在5g/l或更少。再者，作为控制基质添加的设定值，醋酸的浓度不仅限于设定在5g/l，而且例如设定在1～3g/l的范围内也是可行的。
此外，在通过添加诱导剂使基因表达时，同菌体增殖时的情况一样，培养液中的醋酸浓度也表现出对基因表达的抑制作用(图4)。因此在使基因表达的场合下，醋酸的浓度也应在15g/l或15g/L以下，最好在5g/l以下。
在本发明中，通过将培养液上清导入细管式等速电泳装置、气相色谱仪、液相色谱仪以及质谱仪等，便可迅速而准确地检测醋酸。
作为用于本发明的细胞，除前述之重组大肠杆菌之外，还可以是酵母、枯草杆菌和放线菌等微生物、动物细胞及植物细胞、或者这些微生物及动植物细胞的重组体等其生长可受到醋酸抑制的细胞。但是，只要细胞具有同化醋酸的能力，均适用于本发明。
为控制微生物或动植物细胞对醋酸的同体所添加的基质一般为营养素，包括作为氨基酸混合物的酪蛋白氨基酸、氨基酸、葡萄糖及酵母浸膏等。
另外，为了诱导酶或生物活性物质等目的产物的生产，采取以下措施是很有效果的，即当细胞是重组大肠杆菌时，在trp启动子的情况下，应在不含抑制基因表达之色氨酸或只含低浓度色氨酸的培养基中进行培养；而在Iac启动子和tac启动子的情况下，应添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，另外对于PL启动子，应使培养液的温度升高。这些诱导剂或诱导条件，也能适用于除大肠杆菌以外的其它重组微生物。作为诱导目的产物产生时所添加的营养素，以作为氨基酸混合物的酪蛋白氨基酸、氨基酸、葡萄糖及酵母浸膏等的效果为好。
在已概略说明过的本发明的培养装置中，于醋酸浓度分析装置的前面还可提供一个样品制备装置，以配制适合于分析装置的收集的培养液样品，但该装置并非绝对必要。
另外，合适的基质添加装置是带泵的。
其它尚备有连结各装置的导管及原料供给设备等。
以下通过实施例对本发明作进一步地具体说明，但本发明不只限定于这些实施例。
实施例1
图1示出本发明培养装置的一个实施例的概要图。
图1中，符号1表示培养槽，2表示搅拌装置，3表示基质槽，4表示用于添加基质的泵，5表示样品调制装置，6表示醋酸浓度分析装置，7表示控制用电子计算机，8-16表示导管。
装有由培养基和微生物组成的培养液的培养槽1中，容纳一个配有电机M的搅拌器2的揽拌部分。空气通过管路8导入与之相连的培养槽1的底部，废气排出管路9接在培养槽1的上端。在培养槽1的测面连接有与培养液相接的培养液抽出管路11。通过导管11将样品制备装置5与醋酸浓度分析装置6相连接。在培养槽1的上部，通过基质添加管路10，将流量可变式的基质进料泵4同基质槽3相连接。控制电子计算机7接在醋酸盐浓度分析装置6和基质进料泵4上。
在样品制备装置5中装有菌体分离装置和样品溶液酸化装置。在醋酸浓度分析装置6中装有质谱分析仪或气相色谱仪。
以下说明本实施例的操作。在培养槽1内，微生物和由基质槽3供给的基质以及来自导管8的空气通过搅拌装置2进行搅拌，使微生物得以生长。培养液通过导管11抽出，在样品制备装置5中除去菌体并在酸的作用下便样品酸化，然后导入醋酸浓度分析装置。在醋酸浓度分析装置6中装有气相色谱分析仪时，样品可以其酸性溶液状态使用，而装有质谱分析计时，则提供通过空气气泡而气化的醋酸用于分析。将醋酸浓度分析装置6分析出来的培养液中的醋酸浓度值输入控制用电子计算机7，并与设定值进行比较。醋酸浓度值比设定值高时，信号送入基质进料泵，以停止进料或减缓基质进料速度，从而控制基质添加置。另一方面，当醋酸浓度比设定值低时，贝将开始添加或加快基质进料速度的信号送入基质进料泵，从而控制基质添加量。若按以上方法控制基质添加量，就能将培养液中的醋酸浓度控制在设定值以下，并可将菌体的增殖速度维持在高水平。
参考例
大肠杆菌HB101〔pTREZ1〕菌株的制备
(1)pTREZ1的构建
将约3μg的pTRE.1〔Gene，29，pp.41-49(1984)〕和pMC1403〔J.Bacteriol，Vol143，pp.971-980(1980)〕用限制性切酶EcoRI和SalI各25单位切割后，进行琼脂糖凝胶电泳并回收DNA片段。把回收的DNA的2片段在TEN缓冲液(0.02M Tris-HCl，1mM EDTA，0.02MNaCl，pH8.0)中溶解后，用2.5单位T4 DNA连接酶(总体积50μl)连结之。
上述之构建请参考Journal of Fermentationtechnology，Vol，65，No.1，pp7-10(1987)。
(2)将pTREZI导入大肠杆菌HB101菌株内
(a)感受态细胞的制备
用大肠杆菌HB101〔Molecular Cloning’ALaboratory Manual，p.504，Cold SpringHarbor Laboratory，1982〕的保存菌株，将一白金耳的该菌株接种于10ml的L培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，10g氯化钠，0.8g葡萄糖，1L自来水，pH7.2)上，在37℃下振荡培养过夜。取此培养液0.1ml接种于10ml的L培养基上，在37℃下振荡2小时，之后以5,000rpm离心10分钟分离并收集菌体细胞。将细胞悬浮在0.1M NaCl，5mM MgCl2，5MTris-HCl缓冲液(pH7.6，0℃)中，之后在4℃下再以5,000rpm离心5分钟收集细菌。将菌体再次放在上述缓冲液中悬浮并收集菌体。再将菌体悬浮在0.1M CaCl2，0.25M KCl，5mM MgCl2，5mMTris-HCl缓冲液(pH7.6，0℃)4ml中，然后放在冰中静置25分钟。经过5,000rpm离心5分钟分离并收集细菌之后，悬浮在上述CaCl2缓冲液0.4ml中，即得到感受态细胞。
(b)导入大肠杆菌
在0.2ml感受态细胞中添加上述为构建pTREZI而制备的反应液25μl，在0℃下静置60分钟。将此溶液加在1.8ml的L培养基中，在37℃下振荡1小时之后，加入氨苄青霉素50μg/ml并取0.1ml涂布在琼脂平皿上。在37℃下培养过夜之后，采取平皿上出现的菌落，即得到大肠杆菌HB101〔pTREZI〕菌株。
实施例2
用气相色谱分析装置监测菌体培养液中的醋酸，并控制基质添加量使培养液中的醋酸浓度在2g/l以下。还要在培养基中添加色氨酸，以便抑制trp启动子对细胞增殖的影响。
细胞：携带杂合质粒pTREZI的大肠杆菌HB101〔pTREZI〕菌株。
初始培养基：M9-酪蛋白氨基酸培养基；其中含有1gNH4Cl，6g Na2HPO4，3g KH2PO4，5gNaCl，0.1g MgSO4·7H2O，15mgCaCl2·2H2O，0.1g盐酸硫胺素，0.1g脯氨酸，0.01g色氨酸，5g葡萄糖，2.5g酪蛋白氨基酸，1.5g酵母浸膏，1l蒸馏水，pH为7.0。在本培养基中，为了仅使携带杂合质粒的大肠杆菌生长，还要添加50mg/l的氨苄青霉素(Ap)。
基质添加用培养基：葡萄糖200g，脯氨酸4g，酪蛋白氨基酸100g，酵母浸膏60g，色氨酸0.4g，Ap 1g，蒸馏水1l，pH为7.0。
培养条件：将携带杂合质粒的大肠杆菌接种在4个装有50ml M9-酪蛋白氨基酸培养基的500ml振动培养瓶中，用振动器，以振幅为7cm、振动频率为115次/分钟，37℃下培养过夜。将该种子菌液200ml接种于装有M9-酪蛋白氨基酸培养基的5l发酵罐中，以2l初始培养液体积，在37℃和pH为7.0以及通气量为2l/分钟的条件下开始培养。将培养上清液导入充填了PEG600+Fulsin p(GasukuroKogyo生产)的气相色谱分析装置中测定培养液中的醋酸浓度，当醋酸浓度达到2g/l时中止基质进料。
结果：结果示于图7中。即图7是图解显示培养时间(h.横座标)和醋酸浓度(g/l)、菌体浓度(g/l)、β-gal产量(U/ml)以及进料速度(ml/分钟)(纵座标)之间的关系，以其作为本实施例所得培养结果的一个例子。
如图7所示，由于添加基质而生成醋酸，而一旦停止添加基质，醋酸就会被细胞同化，培养液中的醋酸浓度即降低。由于像这样将培养液中的醋酸浓度控制在低水平进行培养，培养到笫30小时其菌体细胞浓度即可达29g/l的高密度。为了抑制trp启动子的作用，在进料用培养基中添加色氨酸，从而当培养到第22小时时就能抑制β-gal的产生。但是，在笫22小时以后由于色氨酸浓度降低而失去抑制作用，以致再次开始生成β-gal，最终使β-gal的产生量达到104U/ml。本实施例中是通过色氨酸浓度降低而解除抑制作用以致生成β-gal的，而添加作为诱导剂的IA也能开始生产β-gal。如上所述，通过降低培养液中的醋酸浓度，使细胞浓度达到29g/l的高密度，并可使菌体细胞的收率维持在0.57g细胞/g葡萄糖的高水平。
实施例3
由气相色谱分析装置监测菌体培养液中的醋酸，并控制基质的添加量以使培养液中的醋酸浓度在2g/l以下。不向培养基中添加色氨酸，并在菌体增殖同时产生β-gal。
除了使用不添加色氨酸的培养基外，进行分批进料培养时使用的菌株，培养条件等均与实施例2相同。
结果：以和图7同样的关系将培养结果之一例示于图8中。
如图8所示，与菌体增殖同步产生β-gal。培养到第30小时菌体细胞浓度即达到36g/l的高密度，菌体收率为0.54g细胞/g葡萄糖。但是，此时β-gal的产生量是59U/ml比实施例1中的数值低。
实施例4
用气相色谱分析装置监测菌体培养液中的醋酸，并控制基质进料量使培养液中的醋酸浓度在2g/l以下。培养前期将色氨酸加到进料培养基中，以抑制β-gal的产生，培养后期则使用不含色氨酸的进料培养基，进行β-gal生产。
初始培养基和培养前期使用的进料培养基与实施例1相同，而培养后期使用的进料培养基则是从实施例1的进料培养基中除去酵母浸膏和色氨酸后得到的培养基。除上述的培养基外，分批进料培养中使用的菌株、培养条件均与实施例2相同。
结果：以图7的同样关系将培养结果之一例示于图9。
如图9所示，培养到第12小时时要用不含色氨酸的进料培养基开始给料，β-gal生产急剧开始并产生出70U/ml的β-gal。菌体细胞浓度为18.6g/l，菌体收率为0.52g细胞/g葡萄糖。
对照例1
除按实施例2和3所述添加基质以使培养液中的葡萄糖浓度在1g/l以下的低浓度外，不采取其他任何抑制醋酸酸生成的措施。
分批进料培养中使用的菌株，培养条件均与实施例2相同。
结果：以与图7同样关系将培养结果之一例示于图10中。
如图10所示，与菌体增殖同步生成醋酸盐，在培养到第20小时当醋酸浓度达21g/l时菌体停止增殖。此时的菌体细胞浓度为21g/l，但菌体收率很低，仅为0.36g细胞/g葡萄糖，生产效率很差，而且β-gal的产量也极低，为8U/ml。
如上所述，按照本发明，由于可抑制培养液中的醋酸浓度，从而在较容易地达到高菌体回收率和目的产物的高产量方面显示出显著效果。例如，在生产β-gal时，可以进行25g/l以上的高密度培养，能达到0.5g细胞/g葡萄糖以上的高菌体回收率和50U/ml以上的高β-gal产量。
本发明例中用菌株Escherichia coli HB101/pTREZ1已于1991年6月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M91049。

Claims (13)

1.对能产生醋酸而受醋酸抑制并可同化醋酸的大肠杆菌进行培养而生产除醋酸以外的代谢物的方法，其中包括：
将营养基质供给培养液中，并对培养液中的大肠杆菌进行培养而产生所说醋酸和所说代谢物，
在培养过程中监测培养液中醋酸浓度，
在醋酸浓度高于设定值时减少或不连续供给营养基质以使大肠杆菌同化醋酸而降低培养液中的醋酸浓度并在醋酸浓度低于设定值时增加或再供给营养基质，从而将培养液中的醋酸浓度控制在设定值以下，所说醋酸浓度设定值为不高于5g/l，和
回收所说代谢物。
2.根据权利要求1所述的代谢物生产方法，其中所说营养基质为选自氨基酸，葡萄糖及酵母浸膏中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的代谢物生产方法，其中所说代谢物为生物活性物质。
4.根据权利要求1所述的代谢物生产方法，其中所说代谢物为酶。
5.对受产生的醋酸抑制并可同化醋酸的基因重组大肠杆菌进行培养而生产除醋酸以外的代谢物的方法，其中包括
将营养基质供给培养液中并对能产生所说醋酸和所说代谢物的大肠杆菌进行培养，
在培养过程中监测培养液中醋酸浓度，
将培养液中的醋酸浓度控制在不高于5g/l的设定值以下，其中在醋酸浓度高于所说设定值时减少或不连续供给营养基质以使大肠杆菌同化醋酸而降低培养液中的醋酸浓度并在醋酸浓度低于设定值时增加或再供给营养基质，和
回收所说代谢物。
6.根据权利要求5所述的代谢物生产方法，其中添加诱导剂产生代谢物。
7.根据权利要求6所述的代谢物生产方法，其中诱导剂作用于基因重组大肠杆菌携带的表达载体中的启动子。
8.根据权利要求7所述的代谢物生产方法，其中所说基因重组大肠杆菌携带的表达载体中的启动子为色氨酸启动子。
9.根据权利要求8所述的代谢物生产方法，其中在启动子为色氨酸启动子时用3-β-吲哚丙烯酸作诱导剂。
10.根据权利要求5所述的代谢物生产方法，其中在基因重组大肠杆菌为含有色氨酸启动子的大肠杆菌时用不含色氨酸的培养液或色氨酸浓度低的培养液。
11.根据权利要求5所述的代谢物生产方法，其中所说营养基质为选自氨基酸，葡萄糖和酵母浸膏中的至少一种。
12.根据权利要求5所述的代谢物生产方法，其中所说代谢物为生物活性物质。
13.根据权利要求5所述的代谢物生产方法，其中所说代谢物为酶。
CN88101483A 1987-03-23 1988-03-22 以醋酸浓度作为指标的培养方法 Expired - Lifetime CN1040459C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP62065710A JP2676511B2 (ja) 1987-03-23 1987-03-23 酢酸を指標とした培養方法及びその装置
JP65710/87 1987-03-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1036034A CN1036034A (zh) 1989-10-04
CN1040459C true CN1040459C (zh) 1998-10-28

Family

ID=13294845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN88101483A Expired - Lifetime CN1040459C (zh) 1987-03-23 1988-03-22 以醋酸浓度作为指标的培养方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US5139938A (zh)
EP (1) EP0283726B1 (zh)
JP (1) JP2676511B2 (zh)
KR (1) KR900007630B1 (zh)
CN (1) CN1040459C (zh)
DE (1) DE3871573T2 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2686108B2 (ja) * 1988-10-07 1997-12-08 株式会社日立製作所 微生物の流加培養方法及び装置
KR0132666B1 (en) * 1989-03-14 1998-04-14 Hitachi Kk Method for controlling cultivation conditions for animal cells
DK0889949T3 (da) * 1996-03-13 2003-09-22 Delta Biotechnology Ltd Fermenteringskontrol
US8039243B2 (en) 2002-01-23 2011-10-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Insertion sequence-free bacteria
US8765408B2 (en) 2002-01-23 2014-07-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Prophage element-free bacteria
US8119365B2 (en) 2002-01-23 2012-02-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Insertion sequence-free bacteria
US6989265B2 (en) 2002-01-23 2006-01-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Bacteria with reduced genome
JP4463198B2 (ja) * 2003-03-05 2010-05-12 財団法人化学及血清療法研究所 大腸菌における異種蛋白質の製造方法
WO2005087940A1 (en) * 2004-03-11 2005-09-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Genetically altered microorganisms with modified metabolism
US7842479B2 (en) * 2004-05-21 2010-11-30 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods for altering acetic acid production and enhancing cell death in bacteria
KR100813028B1 (ko) * 2007-01-02 2008-03-14 (주)상록이티씨 하ㆍ폐수 중의 질소성분 제거와 동시에 악취 저감을 위한 미생물 배양 공급기
JP4883067B2 (ja) 2008-09-29 2012-02-22 株式会社日立プラントテクノロジー 培養装置及び培養方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5329985A (en) * 1976-08-27 1978-03-20 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd High concentration culturing of yeast
JPS5736983A (ja) * 1980-08-15 1982-02-27 Oriental Yeast Co Ltd Toryukabaiyonyorupankobonoseizoho
JPS5878584A (ja) * 1981-11-04 1983-05-12 Hitachi Ltd 培養基質の流加制御方法
JPS60224484A (ja) * 1984-04-23 1985-11-08 Nakano Vinegar Co Ltd 食酢の製造法およびその装置
DE3585176D1 (de) * 1984-06-22 1992-02-27 Hitachi Ltd Verfahren zum kontrollieren der zuechtung von rekombinanten.
JPH078231B2 (ja) * 1985-03-25 1995-02-01 株式会社日立製作所 培養制御方法及び培養制御装置
JPH07110232B2 (ja) * 1985-10-14 1995-11-29 株式会社日立製作所 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置

Also Published As

Publication number Publication date
EP0283726A1 (en) 1988-09-28
KR880011323A (ko) 1988-10-27
JPS63233780A (ja) 1988-09-29
JP2676511B2 (ja) 1997-11-17
CN1036034A (zh) 1989-10-04
US5139938A (en) 1992-08-18
DE3871573T2 (de) 1993-01-21
KR900007630B1 (ko) 1990-10-17
EP0283726B1 (en) 1992-06-03
DE3871573D1 (de) 1992-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1040459C (zh) 以醋酸浓度作为指标的培养方法
RU2008152445A (ru) Процесс периодической ферментации с подпиткой при высокой плотности клеток для получения рекомбинантного белка
CN100582220C (zh) 含有与色氨酸的生物合成有关的突变基因的大肠杆菌突变体和用所述突变体生产色氨酸的方法
CN101307301A (zh) L-色氨酸基因工程菌及其生产l-色氨酸的方法
KR101194942B1 (ko) 유기성폐기물의 미세조류배양에 의한 바이오가스, 지용성물질 및 미세조류의 생산 방법 및 장치
CN86101928A (zh) 控制培养的方法及其设备
CN103865869B (zh) 一株产α-酮基丁酸的基因工程菌及其应用
KR890004020B1 (ko) 재조합균세포의 배양방법
CN1849389A (zh) 生成重组蛋白质的方法
CN1844357A (zh) 谷氨酸棒杆菌突变株及在发酵法生产l－色氨酸中的应用
CN103087998A (zh) 冬虫夏草合成十六烷基-辅酶a的酶、基因及其应用
CN110358685A (zh) 一种土著氮转化微生物富集培养的方法及其治理的应用
AU775301B2 (en) Method for increasing the yield of recombinant proteins in microbial fermentation processes
CN1156180A (zh) 用大肠杆菌生产色氨酸
CN1504575A (zh) 以左旋阿拉伯糖诱导t7表达系统的控制方法
CN1158388C (zh) 连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法
CN1504574A (zh) 以热诱导方式来控制t7表达系统
KR100251284B1 (ko) 2단계 반복식 유가 배양에 의해 과립구 콜로니 자극인자의 발현을 향상시키는 방법
CN108148122A (zh) 一种利用微萍作为生物反应器表达鱼类抗病原菌蛋白疫苗的方法
KR102106479B1 (ko) 아네우리니바실러스 미굴라너스(aneurinibacillus migulanus) 균주 및 이의 용도
CN1215173C (zh) 受环境溶氧浓度调控的大肠杆菌外源基因表达系统
CN1166857A (zh) 有机酸的产生被阻抑了的新的大肠杆菌突变株
CN116286915A (zh) 一种重组霉菌毒素降解蛋白及其制备方法和应用
MX2023001270A (es) Proceso de fermentacion industrial para bacillus mediante el uso de recoleccion parcial.
CN102978177A (zh) 冬虫夏草合成代谢二十碳五烯酸的△-5-脱氢酶、基因及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: HITACHI PLANT TECHNOLOGIES, LTD.

Free format text: FORMER OWNER: HITACHI CO., LTD.

Effective date: 20061020

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20061020

Address after: Tokyo, Japan, Japan

Patentee after: Hitachi Plant Technologies Ltd.

Address before: Tokyo, Japan

Patentee before: Hitachi Ltd.

C17 Cessation of patent right
CX01 Expiry of patent term