CN1849389A - 生成重组蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了控制重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞培养物的上清和周质之间分配的方法，其中所述细胞的重组蛋白质表达受可诱导系统的控制，该方法包括：a)提供大肠杆菌宿主细胞培养物，b)改变大肠杆菌宿主细胞的生长速率，c)诱导重组蛋白质的表达，其中步骤(b)和(c)可以按任何顺序先后或同时进行；以及随后d)测定培养上清和大肠杆菌宿主细胞周质中的重组蛋白质产量，e)将步骤(d)测定的产量与步骤(b)中使用至少一个另外的生长速率所测定的产量相比较，f)通过步骤(e)的比较来选择生长速率，使重组蛋白质在上清和周质之间的分配最适于初步回收该重组蛋白质。

Description

生成重组蛋白质的方法
本发明一般涉及在大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细胞培养物中生成重组蛋白质的方法，更具体提供了控制所述蛋白质在大肠杆菌宿主细胞周质及培养上清之间分配的方法。
大肠杆菌是用于生成重组蛋白质的应用广泛、方便的系统。该系统的优点包括易于基因操作、试剂(包括基因表达载体)易于获得、易于生成大量蛋白质、系统表达多种蛋白质快速并具有高度适应性。综述参见Baneyx，Current Opinion in Biotechnology，1999，10，411-421。大肠杆菌现今广泛用于大规模生产治疗性蛋白质，例如胰岛素、生长激素和抗体(Swartz，Current Opinion in Biotechnology，2001，12，195-201；Humphreys和Glover，Current Opinion in DrugDiscovery and Development，2001，4，172-185；Verma等，Journalof Immunological Methods，1998，216，165-181；Simmons等，Journal of Immunological Methods，2002，263，133-147)。
任何外源基因在大肠杆菌中的表达均开始于将该基因的cDNA拷贝插入表达载体。可以利用多种形式的表达载体。此类载体通常包含质粒来源的DNA复制子、抗生素选择性标志以及由多克隆位点分隔开的启动子和转录终止子(表达盒)连同编码至少一个核糖体结合位点的DNA序列。外源基因的转录通常由受调节的启动子控制，可使细胞生长与产物合成分开，由此较蛋白质持续表达得到更高的产量。通过确定发酵过程中诱导表达的最佳时间，一般是细胞生长到高细胞密度时，可以获得蛋白质最大产量。
根据蛋白质的性质及其折叠需求，大肠杆菌表达的重组蛋白质可以在胞浆中生成、或分泌到周质或上清(Makrides，MicrobiologicalReviews，1996，60，512-538)。例如，蛋白质可以通过信号序列靶向到周质，在周质中表达较之胞浆表达具有若干优点，包括宿主细胞蛋白质较少、重组蛋白质降解较弱以及氧化环境有利于蛋白质正确折叠。
尽管蛋白质的发酵产量是影响大肠杆菌重组蛋白质生产成本的关键因素，所生成蛋白质的下游加工(downstream processing，DSP)费用在决定产物的最终成本中也很重要。术语DSP包含大肠杆菌发酵后得到最终纯化的功能性蛋白质的所有步骤。根据所生成的重组蛋白质的细胞定位，这些步骤一般可能包括初步回收步骤，诸如离心、过滤、提取以及浓缩/透析步骤，然后是一步或多步纯化步骤。最大化上述步骤的效率，以获得高产量的功能性蛋白质，是重组蛋白质大规模生产最小化成本的关键。DSP中所用初步回收步骤的特性会影响所得重组蛋白质的产量和质量，这取决于包括生产规模、蛋白质性质及其在发酵末期的细胞定位等若干因素。例如，在周质中生成重组蛋白质要着重考虑该重组蛋白质泄漏(leakage)到上清中的水平，由于发酵中存在一定水平的泄漏，这对从周质中所获重组蛋白质的产量和质量产生有害影响。如果高水平的重组蛋白质泄漏到上清中，则上清的粘性增加，这使通过离心或过滤初步回收细胞变得更为困难，从而降低从周质中所获蛋白质的产量。细胞自身在离心过程中也较不强壮，更有可能裂解而破坏蛋白质，并再度增加上清中的蛋白质水平而降低产量。另一困难在于，由于污染了来自上清的可能未正确折叠或部分降解的重组蛋白质，也可能降低提取过程中从周质回收的蛋白质质量。
因此希望通过控制重组蛋白质在周质和上清之间的分配，来提高重组蛋白质的初步回收效率，从而提高获得的功能性蛋白质的最终产量和质量。
在本发明中，我们已经能够证明，通过调节大肠杆菌宿主细胞的生长速率，有可能控制重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞培养物的上清和周质之间的分配。根据蛋白质在上清和周质之间的分配而不必只是根据产量来选择合适的生长速率，可以提高所生成的蛋白质的质量和/或产量。
因此本发明提供了控制重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞培养物的上清和周质之间分配的方法，其中所述细胞的重组蛋白质表达受可诱导系统的控制，该方法包括：
a)提供大肠杆菌宿主细胞培养物
b)改变大肠杆菌宿主细胞的生长速率
c)诱导重组蛋白质的表达
其中步骤(b)和(c)可以按任何顺序或同时进行；以及随后
d)测定培养上清和大肠杆菌宿主细胞周质中的重组蛋白质产量
e)将步骤(d)测定的产量与步骤(b)中采用至少一个另外的生长速率所测定的产量相比较
f)通过步骤(e)的比较来选择生长速率，使重组蛋白质在上清和周质之间的分配最适于初步回收该重组蛋白质。
本发明所用重组蛋白质可能是具有多于大约10个氨基酸的任何肽、多肽或蛋白质。该蛋白质可能来自任何来源，包括细菌，但更特别来自哺乳动物来源。在一个实施例中，该重组蛋白质是抗体。此处所用术语“抗体”是指诸如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA的任何类型免疫球蛋白分子，例如IgG类型的成员，如IgG1，也指任何抗原结合免疫球蛋白片段，诸如Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段，及其任何衍生物，诸如单链Fv片段。上述抗体及其片段可能是天然存在、人源化、嵌合或CDR移植抗体，可能使用标准的分子生物学技术来随意修饰、添加或缺失氨基酸或结构域。制备这些抗体分子的方法为本领域公知(参见例如Shrader等，WO 92/02551；Ward等，1989，Nature，341，544；Orlandi等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，3833；Riechmann等，1988，Nature，322，323；Bird等，1988，Science，242，423；Queen等，US 5,585,089；Adair，WO91/09967；Mountain和Adair，1992，Biotechnol.Genet.Eng.Rev，10，1-142；Verma等，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)。
本发明使用的大肠杆菌宿主细胞可能是能够生成重组蛋白质的天然存在的大肠杆菌菌株或突变菌株。特定宿主大肠杆菌菌株的例子包括MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、XL1Blue和JM109。例子还包括修饰的大肠杆菌菌株，例如代谢突变体和蛋白酶缺陷菌株。一个优选的大肠杆菌菌株是大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)，这是供重组蛋白质发酵的常用宿主菌株。
本发明的重组蛋白质一般在大肠杆菌宿主细胞的周质或宿主细胞培养上清中表达，这取决于该蛋白质的特性及生产规模。将蛋白质靶向这些区室的方法为本领域公知，综述参见Makrides，Microbiological Reviews，1996，60，512-538。指导蛋白质到达大肠杆菌周质的合适信号序列的例子包括大肠杆菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信号序列。蛋白质可能依赖天然分泌途径或通过诱导外膜的有限泄漏而致蛋白质分泌，从而靶向上清，其例子包括使用pelB前导序列、蛋白质A前导序列、共表达细菌素(bacteriocin)释放蛋白质、丝裂霉素(mitomycin)诱导的细菌素释放蛋白质连同在培养基中加入甘氨酸以及共表达kil基因使膜通透化。
本发明中重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞中的表达受可诱导系统的控制。此处所用术语“可诱导系统”是指可诱导的表达系统，其中该重组蛋白质在大肠杆菌中的表达受可诱导启动子的控制。许多适用大肠杆菌使用的可诱导启动子为本领域公知，重组蛋白质的表达视启动子而定，可由多种因素诱导，诸如温度或生长培养基中特定物质的浓度(Baneyx，上文；Goldstein和Doi，1995，Biotechnol.Annu.Rev，105-128)。可诱导启动子的例子包括可由乳糖或非水解性乳糖类似物、异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的大肠杆菌lac、tac和trc启动子，以及可由磷酸盐、色氨酸和L-阿拉伯糖分别诱导的pho A，trp和araBAD启动子。
此处所用术语“诱导表达”是指开始诱导的时刻，例如通过添加诱导剂或改变温度(若为温度依赖性诱导)。在培养物中添加诱导剂进行重组蛋白质的诱导表达时，可能利用任何适当方法添加诱导剂，这取决于发酵系统和诱导剂，例如一次或多次快速添加(shotaddition)，或通过供料逐渐添加诱导剂。应当理解，添加诱导剂与实际诱导蛋白质表达之间可能有延迟，例如当诱导剂是乳糖时，会在乳糖之前利用现存的任何碳源，因而在蛋白质表达诱导发生前可能存在延迟。
本发明的大肠杆菌宿主细胞培养物可能在支持大肠杆菌生长及重组蛋白质表达的任何培养基中培养。培养基可能是任何化学培养基，例如Pirt S.J.(1975)Principles of Microbe and Cell Cultivation，Blackwell Scientific Publications中提供的培养基，为适合此处所述控制生长速率而做些改变。合适培养基的例子有SM6E，由Humphreys等，2002，Protein Expression and Purification，26，309-320所述。
可以在任何适当容器中培养大肠杆菌宿主细胞，诸如摇瓶或发酵罐，这取决于所需生成规模。可利用容量大于1,000升直至约100,000升的多种大规模发酵罐。优选使用1,000-50,000升发酵罐，更优选1,000-10,000升。还可能使用容量0.5-1,000升的较小发酵罐。
大肠杆菌发酵可能在任何适当系统中进行，例如连续、分批或补料-分批模式(Thiry和Cingolani，2002，Trends in Biotechnology，20，103-105)，取决于蛋白质及所需要的产量。分批模式可能用于按需快速添加营养物或诱导剂。或者可能使用补料-分批培养，例如，在诱导前，培养物按使用发酵罐中最初存在的营养物所能维持的最大特定生长速率以分批模式生长，并在诱导后使用一个或多个营养物补料程序来控制生长速率，直至发酵完成。也可在诱导前使用补料-分批模式来控制大肠杆菌宿主细胞的代谢，并使其达到较高的细胞密度(Lee，1996，Tibtech，14，98-105)。
本发明中细胞在蛋白质诱导表达之前以任何适当生长速率生长。为达到高生长速率，大肠杆菌宿主细胞一般在营养物水平、碳源、温度和氧条件支持这样生长的培养中生长。本发明的大肠杆菌宿主细胞优选以高生长速率生长于营养非限制性条件下，以便在诱导重组蛋白质表达之前获得高细胞密度。可以用若干不同方式测定生长，最常用的是通过测定600nm光密度随时间的增加来测定细胞密度的增加。通过OD600测量值的自然对数对时间作图，可以测定特定的生长速率。可以在整个培养过程中进行生长的测定，例如，通过在线测量或在发酵过程中每隔一定时间从培养物中取样。优选在诱导重组蛋白质表达之前达到高细胞密度。可诱导蛋白质表达的合适密度的例子介于约60-100 OD600。
在本发明方法的步骤(b)中，其生长速率对比该方法步骤(a)所提供的大肠杆菌生长速率而变化。步骤(b)中生长速率的改变可能在步骤(c)诱导蛋白质表达之前、与诱导蛋白质表达同时或诱导蛋白质表达之后的任何时刻进行。在一个实施例中，于步骤(c)之前改变生长速率，在该方法的步骤(a)中培养物以高生长速率生长，直至达到高细胞密度，然后改变生长速率，一旦观察到所要求的生长速率变化，便诱导蛋白质表达。在一个所述实施例中，于诱导蛋白质表达前约1-3小时改变生长速率。在另一实施例中，培养物在该方法的步骤(a)中以高速率生长，在该方法的步骤(c)中诱导蛋白质表达，然后在该方法的步骤(b)中改变生长速率。在一个所述实施例中，于步骤(c)之后约1-3小时改变生长速率。在另一实施例中，细胞在该方法的步骤(a)中以高速率生长，而步骤(b)和步骤(c)同步进行，即几乎同时，以便就在要诱导时改变生长速率。
可能利用本领域公知的许多不同方法，根据发酵系统来控制大肠杆菌宿主细胞的生长速率(参见例如Lee 1996，Tibtech，14，98-105)。控制生长速率的合适方法包括改变温度、可利用的氧水平及营养物水平。本领域技术人员通过测试多个浓度并测量对生长速率的作用，能够实验确定为达到特定的生长速率所需的适当温度变化、氧水平或营养物浓度。在一个实施例中，可以利用发酵开始时存在的营养物诸如氮和磷酸盐的浓度，根据诱导过程中营养物耗尽的时刻，来控制生长速率。在本发明的一个特定实施例中，控制生长速率的营养源是磷酸盐。此处实施例提供了合适的磷酸盐浓度，并为本领域已知(参见例如Pirt，S.J.(1975)Principles of Microbe and CellCultivation，Blackwell Scientific Publications)。发酵开始时存在的合适磷酸盐浓度的例子包括25-40mM。因此在本发明一个实施例中，通过在发酵开始时调节细胞可利用的磷酸盐水平，来改变步骤(b)中的生长速率。在另一实施例中，可能通过改变例如经补料或快速添加(shot addition)而加入培养物中的营养物诸如碳或氮的浓度，来调节生长速率。
在本发明另一个实施例中，通过调节大肠杆菌宿主细胞可利用的碳水平，来改变步骤(b)中的生长速率。可能提高或降低细胞可利用的碳源水平，以实现所需的生长速率变化。优选通过调节加入培养物中的碳源的补料速率，来控制生长速率。此处所用术语“碳源”是指在生长期间可为大肠杆菌用作能源的碳源，包括糖诸如葡萄糖、乳糖、蔗糖和果糖以及其它碳源诸如甘油、琥珀酸和乳酸。在本发明的一个优选实施方案中，碳源是甘油。宿主细胞优选于补料-分批发酵罐中培养，并且碳源是按适当的补料速率供给的甘油，以提供所需的生长速率。适当的甘油补料速率为本领域公知并包括此处提供的实施例中所述速率。适当的甘油补料速率包括0.5-11ml/h。
此处所用术语“分配”是指重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞周质及其所生长的上清之间的分布。在本方法步骤(d)中测定周质和上清中的产量，以确定重组蛋白质的分配。可在大肠杆菌宿主细胞整个培养期间按合适的时间间隔(例如约每2-4小时)取样，或者在收获的时候(例如诱导后约24-36小时)取样，测定产量。许多蛋白质定量方法为本领域公知，包括诸如凝胶电泳、HPLC、层析方法以及免疫检测方法诸如western印迹和ELISA。例如，可以按Humphreys等，2002，Protein Expression and Purification，26，309-320所述，利用Fab′装配ELISA测定周质提取物和培养上清中的Fab′浓度。
在本发明方法的步骤(e)中，将步骤(b)中按照两种或多种不同生长速率生长的大肠杆菌宿主细胞的上清和周质中的重组蛋白质产量做比较，以便找到一个生长速率，可以得到最适于初步回收该蛋白质产物的分配。优选在步骤(d)中，于每一生长速率诱导后大约相同时间，测定步骤(e)中所要比较的产量。应当理解，这未必总是可能的，尤其对于按较高生长速率生长的培养物而言，比按较低生长速率生长的培养物更早达到最大生物量。
本方法步骤(b)中的生长速率变化可能是提高或降低生长速率。步骤(a)中所提供的培养物可能在营养非限制性或营养限制性条件下，按任何适宜的生长速率生长。步骤(a)所提供的培养物优选在营养非限制性条件下，按该条件下可能的最大特定生长速率生长。在一个实施例中，步骤(a)中大肠杆菌宿主细胞的生长速率介于约0.1-0.25/h，优选介于0.13-0.22/h。优选生长速率在本方法步骤(b)中降低。生长速率可能降至高于0/h的任何可能的生长速率，优选介于0/h和步骤(a)所提供的生长速率之间。通过测试至少两个不同的生长速率并在本方法步骤(e)中做比较，可经验地确定合适的生长速率。每一生长速率可在平行和/或连续生长的两个或多个单独培养物中进行测试。在一个实施例中，步骤(b)中的每次培养均有利用不同生长速率同时生长的至少两个培养物。在另一实施例中，步骤(b)中的每次培养均有利用不同生长速率先后生长的至少两个培养物。或者，利用步骤(b)中的一个生长速率完成步骤(a)-(d)，然后每次改变步骤(b)中的生长速率，至少再一次完成步骤(b)和(d)，从而可在单一培养中测试两个或多个不同的生长速率。应当理解，如果本方法步骤(e)未能确定合适的生长速率，则可重复本方法的步骤(a)-(d)来测试其它的生长速率。通常测试介于0/h与步骤(a)中培养物生长速率之间的一系列不同生长速率。首次测试的不同生长速率的范围可能跨越高、低生长速率的很大范围，如果需要，随后可通过在步骤(b)中使用较窄的生长速率范围来重复本方法步骤(a)-(d)，从而缩小其范围。例如，供首次测试的合适生长速率可能比营养非限制性条件下的生长速率低约2-约200倍。在一个实施例中，生长速率比营养非限制性条件下的生长速率低约5-约200倍。或者，首次测试的不同生长速率的范围可能是例如高或低生长速率的很窄范围，如果需要，随后可通过在步骤(b)中使用较宽的生长速率范围来重复本方法步骤(a)-(d)，从而拓宽其范围。例如，供首次测试的合适生长速率可能比营养非限制性条件下的生长速率低约2-约50倍或低约100-约200倍。在一个实施例中，生长速率比营养非限制性条件下的生长速率低约5-约20倍。步骤(b)中的合适生长速率可能包括0.0005-0.04/h范围内的生长速率。
一旦比较了重组蛋白质在两个或多个不同生长速率的分配，便在本方法步骤(f)中选择最适于初步回收该重组蛋白质的生长速率。此处所用术语“初步回收”是指制备适于后续纯化步骤的无细胞上清或周质提取物所需的最初回收步骤。初步回收步骤的例子包括离心、过滤、细胞提取或裂解、匀浆化、浓缩、透析以及扩张床吸附。最适于蛋白质初步回收的生长速率即为经一步或多步初步回收步骤后可得到最佳蛋白质产量和/或质量的生长速率。此处所用术语“质量”是指所得蛋白质的完整性(integrity)，其是否完整和/或正确折叠。重要的是，最合适的生长速率可能不是在大肠杆菌宿主细胞培养物中产生重组蛋白质最大产量的生长速率，而可能是导致蛋白质在周质和上清之间最佳分配的生长速率，从而在经过一个或多个初步回收步骤后将会得到较好质量和/或较高产量的蛋白质。因此，步骤(f)所选择的生长速率可能是培养过程中的蛋白质产量与最后回收的蛋白质最终产量和质量之间的权衡。
在一个实施例中，重组蛋白质可能表达于大肠杆菌宿主细胞的周质，因为这比上清更易于大规模处理。所需的第一个初步纯化步骤是利用离心或过滤从培养基中回收宿主细胞。对于周质中生成的蛋白质而言，一个重要考虑是泄漏到上清中的重组蛋白质水平，因为这对周质蛋白质的初步回收及质量有坏影响。上清中增加的蛋白质提高了上清的粘性，致使通过离心或过滤回收细胞变得更为困难并降低周质蛋白质的产量。细胞自身在离心过程中也较不强壮，更有可能裂解而导致重组蛋白质破坏，并进一步因蛋白质、DNA和脂质释放而增加上清粘性，从而再度降低周质中重组蛋白质的产量。也可能因污染了上清中可能部分降解或未正确折叠的重组蛋白质而降低从周质中回收的重组蛋白质的质量。因此在这些培养物中，重要的是保持上清中重组蛋白质水平低，以提高初步回收后重组蛋白质的质量和/或产量。在此实施例中，通过选择上清中重组蛋白质水平低时的生长速率，即使周质中重组蛋白质的产量比上清中重组蛋白质水平较高时的其它生长速率时要低，也可能提高初步回收后所得重组蛋白质的终产量和/或质量。因此，本发明方法对于周质中生成的蛋白质，优选步骤(f)选择的生长速率使超过55％的蛋白质在周质中表达，而少于45％的蛋白质在上清中表达。优选宿主细胞所生成的蛋白质超过80％在周质中表达，而少于20％在上清中表达。在一个实施例中，宿主细胞所生成的蛋白质超过90％在周质中表达，而少于10％在上清中表达。在另一实施例中，宿主细胞所生成的蛋白质超过95％在周质中表达，而少于5％在上清中表达。
在另一实施例中，可在上清中生成蛋白质。考虑到不需提取步骤以及培养基中存在的宿主蛋白质较少，可能更容易纯化蛋白质。由于蛋白质降解较少并可能改善蛋白质的折叠，蛋白质的质量也可能较好。对于上清中生成的蛋白质，重要的是使宿主细胞表达并分泌到上清中的重组蛋白质的量最大化。为确定是否宿主细胞所生成的所有重组蛋白质都分泌到上清中，重要的是也测定周质中的重组蛋白质水平。如果仍然较高，则可利用本发明方法来调节该重组蛋白质的分配，以进一步提高上清中的产量。因此，本发明方法对于上清中生成的蛋白质，优选步骤(f)中选择的生长速率使超过55％的蛋白质在上清中表达，而少于45％的蛋白质在周质中表达。优选宿主细胞所生成的蛋白质超过80％在上清中表达，而少于20％在周质中表达。在另一个实施例中，宿主细胞所生成的蛋白质超过90％在上清中表达，而少于10％在周质中表达。在另一实施例中，宿主细胞所生成的蛋白质超过95％在上清中表达，而周质中少于5％。
确定了本方法步骤(f)的合适生长速率后，则可在大肠杆菌宿主细胞后续发酵过程中使用相同的生长速率，确保重组蛋白质在上清和周质之间达到所需分配。本发明因而还提供了在大肠杆菌宿主细胞培养物中生成重组蛋白质的方法，其中所述细胞的重组蛋白质表达受可诱导系统的控制，并且该重组蛋白质在上清和周质之间的分配最适于初步回收该重组蛋白质，所述方法包括大肠杆菌宿主细胞按上述方法步骤(f)所选定的生长速率生长。后续发酵可能与上述方法所用的规模相同或不同。例如，可能小规模发酵大肠杆菌宿主细胞，来确定最适于初步回收蛋白质的生长速率，然后在后续发酵中使用步骤(f)选定的生长速率大规模发酵宿主细胞，以生成大量重组蛋白质。
本发明方法所生成的重组蛋白质可经初步回收，随后纯化。所用初步回收步骤取决于发酵末期的重组蛋白质定位。例如，周质中表达的蛋白质可通过离心或过滤从宿主细胞中回收。然后可以使用诸如热处理(参见例如US 5,665,866)或机械提取方法从细胞内提取蛋白质。回收上清中表达的蛋白质可使用诸如扩张床吸附或离心或过滤方法去除细胞，然后通过例如离子交换或亲和层析捕获蛋白质。然后可根据重组蛋白质的特性及其物理性质诸如大小、疏水性和等电点，使用本领域已知的任何方法来纯化周质提取物或上清中的蛋白质。所述方法可能包括分子大小排阻层析、疏水性相互作用层析、离子交换、亲和层析和反相HPLC。因此本发明另一方面提供了在大肠杆菌宿主细胞培养物中生成重组蛋白质的方法，其中所述细胞的重组蛋白质表达受可诱导系统的控制，并且该重组蛋白质在上清和周质之间的分配最适于初步回收该重组蛋白质，所述方法包括大肠杆菌宿主细胞按上述方法步骤(f)所选定的生长速率生长，然后纯化该重组蛋白质。
实施例
现仅通过实施例描述本发明，并参考：
图1.一系列甘油补料速率下的大肠杆菌生长曲线
图2.一系列甘油补料速率下的大肠杆菌诱导后生长速率
图3.一系列甘油补料速率下生长的大肠杆菌培养物周质和上清之间的Fab′A分配
图4.一系列无机磷酸盐浓度下的大肠杆菌生长曲线
图5.一系列无机磷酸盐浓度下的大肠杆菌诱导后生长速率
图6.一系列无机磷酸盐浓度下生长的大肠杆菌培养物周质和上清之间的Fab′B分配
实施例1
使用有限甘油补料控制诱导后生长，来优化Fab′A的分配及产量
材料和方法
菌株和质粒。本工作中所用菌株是经质粒转化的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)，该质粒提供四环素抗性并带有编码Fab′片段Fab′A的轻、重链多肽成分的基因。每一多肽前置有大肠杆菌OmpA前导肽。由单个tac启动子诱导表达，使轻、重链多肽合成并分泌到周质，在此部分多肽折叠并装配成Fab′。
生长培养基
发酵生长培养基是基于含3.86g/l NaH2PO4.H2O和112g/l甘油的SM6E培养基(Humphreys等，2002，Protein Expression andPurification，26，309-320所述)。
种菌.种菌培养物在添加10μg/ml四环素的相同培养基中生长。培养物于30℃搅拌温育约22小时。
发酵.将0.3-0.5 OD600的种菌培养物接种到发酵罐中(总体积2.5升)。在生长期保持温度30℃，诱导前降到25℃。通过不同的搅拌和气流保持溶氧浓度大于30％空气饱和度。通过15％(v/v)NH4OH和10％(v/v)浓度的H2SO4自动滴定，来控制培养物pH为7.0。加入10％(v/v)Struktol J673溶液(Schill and Seilacher)来控制发泡。
在发酵不同阶段加入若干添加剂。生物量浓度达到约40 OD600时，加入镁盐和NaH2PO4.H2O。在诱导期之前及期间再次加入NaH2PO4.H2O，确保磷酸盐保持过量。当发酵开始时存在的甘油耗尽后(约75 OD600)，按0.5-10.9ml/h的速率连续补料80％(w/w)甘油。在发酵同时按1ml/h速率补料IPTG 36小时，使此时发酵罐中IPTG终浓度为0.5mM。启动IPTG补料即视为诱导开始。发酵一般在较低甘油补料速率下(0.5-2.5ml/h)进行70-73小时，在较高甘油补料速率下(5.4-10.9ml/h)进行50-60小时。
测定生物量浓度(Biomass concentration)及生长速率。通过测量培养物600nm的光密度来测定生物量浓度。生长速率(μ)与生物量浓度随时间的变化相关，即：
                 LnXt＝LnX0+μt
其中X0是初始生物量浓度，Xt是时间间隔t之后的生物量浓度。因此，分批培养物的LnXt对t作图得到斜率为μ(单位/小时)的直线。然而，给予分批培养物线性限制性的甘油补料，会由于生物量及培养体积的增加而导致生长速率下降。因此，通过LnOD600对时间作图，可确定诱导期间的平均生长速率。(按最小拉丁方法(the least squaresmethod))测定最佳拟和的直线斜率，得到整个补料期间的平均生长速率。
周质提取.从培养物样品中离心收集细胞。保留上清部分(-20℃)供进一步分析。细胞沉淀部分重悬于原始培养体积的提取缓冲液(100mM Tris-HCl，10mM EDTA；pH 7.4)。在60℃温育约16小时后，通过离心澄清提取物，保留上清部分(-20℃)供进一步分析。
Fab′定量.可以按Humphreys等，2002，Protein Expression andPurification，26，309-320所述，利用Fab′装配ELISA(assemblyELISA)测定周质提取物和培养上清中的Fab′浓度。
结果
诱导前生长无限制，按最大特定速率(μmax)生长，但接下来在诱导后受限制，在此条件下进行Fab′A发酵(图1)。按一系列流速对分批培养物给予营养物(甘油)限制性补料，从而控制诱导后的生长速率。选择可以达到一系列超过约0/h生长速率的甘油流速。图2和表1显示在一系列甘油补料速率下，整个诱导期间的实际平均生长速率。提高甘油补料速率引起培养物所希望的平均生长速率增加。
表1.一系列甘油补料速率下生长的大肠杆菌培养物的平均生长速率。
  培养物   补料速率(ml/h)   生长速率/h
  FM291   0.5   -0.0008
  FM292   1.0   0.0044
  FM294   1.1   0.0033
  FM295   1.6   0.0071
  FM296   2.1   0.0075
  FM297   2.5   0.0092
  FM288   5.44   0.0289
  FM289   10.88   0.0374
低甘油补料速率下(0.5-2.5ml/h)诱导后约36小时以及高甘油补料速率下(5.4-10.9ml/h)诱导后约24小时收获发酵物，利用Fab′装配ELISA测定周质提取物及培养上清的Fab′浓度。图3显示Fab′浓度以及在周质和培养上清之间的相对分布。发现对于Fab′滴度的最适生长速率约为0.0075/h。观察到一般趋势，即培养上清中Fab′滴度随生长速率增加而增加。因此，为优化发酵效能、Fab′产量以及初步回收适合性而选择的生长速率应反映最大产量与最佳Fab′分布之间的平衡。在所述实施例中，选择甘油补料速率1.6ml/h(生长速率～0.0071/h)用于发酵放大。
实施例2
通过改变磷酸盐浓度以控制诱导后生长速率，来优化Fab′B的分布及产量
材料和方法
菌株和质粒.本工作中所用菌株是经质粒转化的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)，该质粒提供四环素抗性并带有编码Fab′片段Fab′B的轻、重链多肽成分的基因。由单个tac启动子诱导表达，使轻、重链多肽合成并分泌到周质，在此部分多肽折叠并装配成Fab′。
生长培养基.
发酵生长培养基是基于含表2所示浓度的NaH2PO4.H2O的SM6E培养基(Humphreys等，2002，Protein Expression and Purification，26，309-320所述)。
表2.Fab′B发酵所用NaH2PO4.H2O的量及浓度
  发酵批次号   加入的NaH2PO4.H2O(g/l)   NaH2PO4.H2O浓度(mM)
  DG32   3.71   26.9
  DG33   3.91   28.3
  DG34   4.11   29.8
  DG35   4.31   31.2
  DG31   4.52   32.7
  DG36   4.91   35.6
种菌.种菌培养物在含合适浓度NaH2PO4.H2O(参见表2)并添加10μg/ml四环素的相同培养基中生长。培养物于30℃振摇温育约19-26小时。
发酵.将0.3-0.5 OD600的种菌培养物接种到发酵罐中(总体积2.5升)。在生长期保持温度30℃，诱导前降到27℃。通过不同的搅拌和气流保持溶氧浓度大于30％空气饱和度。通过15％(v/v)NH4OH和10％(v/v)浓度的H2SO4自动滴定，来控制培养物pH为7.0。加入10％(v/v)Mazu溶液来控制发泡。
在发酵不同阶段加入多种添加剂。在发酵中按2×45ml等份的80％(w/w)溶液加入甘油，一次在生物量浓度为20 OD600时添加，另一次在40 OD600时。生物量浓度达到约40 OD600时，再加入镁盐和钙盐。在60 OD600时加入乳糖(60ml 50％(w/w)溶液)，作为诱导期间的诱导剂和碳源。甘油耗尽后发生诱导(约75-90 OD600)，其标志是溶氧浓度增加。按照需要另外加入乳糖，以保持发酵罐中浓度为0-55g/l。诱导后0-2小时另外加入镁。发酵一般进行56-61小时。
发酵分析.如前所述(实施例1)测定周质提取物的生物量并定量Fab′。
结果
通过改变磷酸盐(NaH2PO4.H2O)的量而保持所有其它初始营养物恒定，来控制诱导后发酵培养物的生长(图4)。在生物量增加的诱导期间，测定每次发酵的生长速率(图5和表3)。
表3.一系列磷酸盐浓度下生长的大肠杆菌培养物的平均生长速率。
  发酵批次号   磷酸盐浓度mM   生长速率/h
  DG32   26.9   0.0124
  DG33   28.3   0.014
  DG34   29.8   0.0178
  DG35   31.2   0.0191
  DG31   32.7   0.0321
  DG36   35.6   0.0337
增加磷酸盐浓度导致整个诱导期间的生长速率增加。选择磷酸盐浓度以便在诱导的不同时间点耗尽(诱导稍前，例如26.9mM，至诱导后不同时间点)。发生诱导的时刻(生物量浓度)与起始甘油浓度有关。根据Pirt，S.J.(1975)Principles of Microbe and CellCultivation，Blackwell Scientific Publications提供的无机磷酸盐生物量产量系数数据，计算支持生长至要求的诱导生物量所需磷酸盐数量。如此处所述，经验地确定适于Fab′产量及分布的最适磷酸盐浓度。
诱导后28-31小时收获发酵物，通过Fab′装配ELISA测定周质提取物及培养上清的Fab′浓度。图6显示收获时周质和培养上清的Fab′浓度。观察到一般趋势，即培养上清中Fab′浓度随磷酸盐浓度增加而增加。使用周质提取物及离心/过滤方法大规模初步纯化的最适磷酸盐范围是29.8mM。

Claims (22)

1.控制重组蛋白质在大肠杆菌宿主细胞培养物的上清和周质之间分配的方法，其中所述细胞的重组蛋白质表达受可诱导系统的控制，该方法包括：
a)提供大肠杆菌宿主细胞培养物
b)改变大肠杆菌宿主细胞的生长速率
c)诱导重组蛋白质的表达
其中步骤(b)和(c)可以按任何顺序或同时进行；以及随后
d)测定培养上清和大肠杆菌宿主细胞周质中的重组蛋白质产量
e)将步骤(d)测定的产量与步骤(b)中采用至少一个另外的生长速率所测定的产量相比较
f)通过步骤(e)的比较来选择生长速率，使重组蛋白质在上清和周质之间的分配最适于初步回收该重组蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中步骤(e)所比较的产量是来自步骤(b)中各培养物采用不同生长速率而同时生长的至少两个培养物。
3.权利要求1的方法，其中步骤(e)所比较的产量是来自步骤(b)中各培养物采用不同生长速率而先后生长的至少两个培养物。
4.权利要求1的方法，其中步骤(e)所比较的产量是来自按至少两种不同生长速率生长的一个培养物，即在步骤(b)中采用一种生长速率完成步骤(a)-(d)，然后每次改变步骤(b)的生长速率，再至少进行一次步骤(b)和(d)。
5.权利要求1-4的方法，其中降低步骤(b)的生长速率。
6.权利要求1-5的方法，其中改变步骤(b)中大肠杆菌宿主细胞生长速率包括调节细胞可利用的碳水平。
7.权利要求6的方法，其中碳源选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘油、琥珀酸和乳酸。
8.权利要求7的方法，其中碳源是甘油。
9.权利要求1-8的方法，其中改变步骤(b)中大肠杆菌宿主细胞生长速率包括调节细胞可利用的磷酸盐水平。
10.权利要求1-9的方法，其中改变步骤(b)中大肠杆菌宿主细胞生长速率包括调节细胞可利用的氧水平。
11.权利要求1-10的方法，其中重组蛋白质靶向周质。
12.权利要求11的方法，其中步骤(f)所选择的生长速率是使宿主细胞生成的重组蛋白质80％以上在周质中表达。
13.权利要求1-10的方法，其中重组蛋白质靶向上清。
14.权利要求13的方法，其中步骤(f)所选择的生长速率是使宿主细胞生成的重组蛋白质80％以上在上清中生成。
15.权利要求1-14的方法，其中该可诱导系统包含1ac衍生的启动子。
16.权利要求15的方法，其中1ac衍生的启动子是1ac、tac或trc。
17.权利要求15或16的方法，其中该启动子由乳糖或IPTG诱导。
18.权利要求1-17的方法，其中该重组蛋白质是抗体或其片段。
19.权利要求18的抗体，其中该抗体是IgG。
20.权利要求18的抗体片段，其中该片段是Fab、Fab′、F(ab′)2或scFv。
21.在大肠杆菌宿主细胞培养物中生成重组蛋白质的方法，其中所述细胞的重组蛋白质表达受可诱导系统的控制，并且该重组蛋白质在上清和周质之间的分配最适于初步回收该重组蛋白质，所述方法包括大肠杆菌宿主细胞按权利要求1中步骤(f)所选定的生长速率生长。
22.权利要求21的方法，其中所生成的重组蛋白质随后被纯化。
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