ES2339352T3 - Metodos para producir proteinas recombinantes. - Google Patents
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Abstract
Un método para seleccionar una tasa de crecimiento para controlar la distribución de una proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma en cultivos de células hospedantes de E. coli de modo que la distribución de la proteína recombinante sea más adecuada para la recuperación primaria de la proteína recombinante, en la que la expresión de la proteína recombinante por dichas células está bajo el control de un sistema inducible, cuyo método comprende: a) proporcionar un cultivo de células hospedantes de E. coli b) cambiar la tasa de crecimiento de las células hospedantes de E. coli tal que la tasa de crecimiento esté en el intervalo de 0,0005 a 0,04/h. c) inducir la expresión de la proteína recombinante en la que las etapas (b) y (c) pueden ser realizadas en cualquier orden o simultáneamente; y subsiguientemente d) determinar el rendimiento de proteína recombinante en el sobrenadante de cultivo y el periplasma de las células hospedantes de E. coli e) comparar el rendimiento determinado en la etapa (d) con el rendimiento determinado cuando al menos una otra tasa de crecimiento ha sido usada en la etapa (b) f) seleccionar una tasa de crecimiento a partir de la comparación hecha en la etapa (e) en la que la distribución de la proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma es más adecuado para la recuperación primaria de la proteína recombinante.
Description
Métodos para producir proteínas
recombinantes.
El presente invento se refiere generalmente a
métodos para producir proteínas recombinantes en cultivos de
células hospedantes de Escherichia coli y más específicamente
proporciona un método para controlar la partición de dichas
proteínas entre el periplasma de las células hospedantes de E.
coli y el sobrenadante del cultivo.
E. coli es un sistema ampliamente usado y
muy conveniente para la producción de proteínas recombinantes. Las
ventajas de este sistema comprenden la facilidad de la manipulación
génica, la disponibilidad de reactivos que incluyen los vectores de
expresión génica, la facilidad de producir cantidades de proteína,
la velocidad y la alta adaptabilidad del sistema para expresa una
amplia variedad de proteínas. Para una revisión véase Bañéis,
Current Opinión in Biotehcnology, 1999, 10, 411-421.
E. coli es ahora ampliamente usada para la producción a gran
escala de proteínas terapéuticas tales como insulina, hormona de
crecimiento y antibióticos (Swartz, Current Opinion in
Biotechnology, 2001, 12, 195-201; Humphreys y
Glover, Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2001, 4,
172-185; Verma y otros, Journal of Immunological
Methods, 1998, 216, 165-181; Simmons y otros,
Journal of Immunological Methods, 2002, 263,
133-147.
La expresión de cualquier gen externo en E.
coli comienza con la inserción de una copia de cADN del gen en
un vector de expresión. Muchas formas del vector de expresión están
disponibles. Tales vectores comprenden normalmente un origen de
replicación del ADN plasmídico, un marcador de selección por
antibióticos y un promotor y terminador transcripcional separado
por un sitio de clonaje múltiple (casete de expresión) y una
secuencia de ADN que codifica al menos un sitio de unión al
ribosoma. La transcripción del gen externo es normalmente
controlada por un promotor regulable, que permite que el crecimiento
celular se separe del producto de síntesis resultante en mayores
cantidades que si la proteína estuviera expresada de modo
constitutivo. Un rendimiento máximo de la proteína puede ser
logrado determinado el punto óptimo durante la fermentación para la
expresión a ser inducida, típicamente una vez que las células han
sido hechas crecer a una alta densidad celular.
Proteínas recombinantes expresadas en E.
coli pueden ser producidas en el citoplasma, o secretadas en el
periplasma o el sobrenadante dependiendo de la naturaleza de la
proteína y sus requerimientos de plegamientos (Makrides,
Microbiological Reviews, 1996, 60, 512-538). Por
ejemplo, las proteínas pueden ser dirigidas al periplasma vía una
secuencia señal y la expresión en el periplasma puede ofrecer varias
ventajas sobre la expresión en el citoplasma, incluyendo números
bajos de proteínas de las células hospedantes, menor degradación de
la proteína recombinante y un entorno oxidante que facilita el
plegamiento proteico adecuado.
Mientras que el rendimiento proteico durante la
fermentación es un factor esencial que influyen en el coste de
producción de proteínas recombinantes en E. coli, el coste
del procesamiento aguas abajo (DSP) de la proteína producida es
también importante a la hora de determinar el coste final de los
bienes. El término DSP comprende todas las etapas que siguen a la
fermentación de E. coli que da como resultado un proteína
funcional purificada final. Dependiendo de la localización celular
de la proteína recombinante producida, estas etapas pueden incluir
típicamente las etapas de recuperación primaria tal como
centrifugación, filtración, extracción y
concentración/diafiltración seguida por una o más etapas de
purificación. Maximizar la eficacia de estas etapas para obtener un
alto rendimiento de proteína funcional es clave para minimizar
costes durante la producción a gran escala de proteínas
recombinantes. La naturaleza de las primeras etapas de recuperación
usadas durante DSP afectaran al rendimiento y calidad de la proteína
recombinante obtenida y dependerá de varios factores incluyendo, la
escala de producción, la naturaleza de la proteína y su localización
celular al final de la fermentación. Por ejemplo, una consideración
importante para las proteínas recombinantes producidas en el
periplasma es el nivel de escapes de la proteína recombinante en el
sobrenadante, ya que un nivel natural de escapes tiene lugar
durante la fermentación y esto puede tener efectos perjudiciales en
el rendimiento y calidad de la proteína recombinante obtenida a
partir del periplasma. Shokri y otros, 2002, Applied Microbiology
and Biotechnology, 58, 3, 386-392 describe el efecto
de la tasa de crecimiento en los escapes de una proteína
recombinante de E. coli. Las tasas de crecimiento ensayadas
estuvieron en el intervalo de 0,05/h-0,6/h. los
escapes de proteínas periplasmáticas en el medio se encontró que
tenían un valor óptimo a 0,3/h.
En los casos en que niveles elevados de proteína
recombinante se escapan en el sobrenadante, la viscosidad del
sobrenadante aumenta, haciendo la recuperación primaria de las
células mediante centrifugación o filtración mas difícil y por
tanto reduciendo el rendimiento de proteínas obtenidas a partir del
periplasma. Las células en sí mismas son también menos robustas
durante la centrifugación y son más susceptibles de lisarse dando
como resultado un daño a la proteína y aumentando los niveles de
proteínas en el sobrenadante reduciendo de nuevo el rendimiento. Un
problema adicional es que la calidad de la proteína recuperada del
periplasma durante la extracción puede también ser reducida por la
contaminación con una proteína recombinante a partir del
sobrenadante que puede no plegarse correctamente o puede estar
parcialmente degradada.
Es por lo tanto deseable mejorar la eficacia de
la recuperación primaria de las proteínas recombinante y por tanto
mejorar el rendimiento final y calidad de la proteína funcional
obtenida controlando la distribución de las proteínas recombinantes
entre el periplasma y el sobrenadante.
En el presente invento, los autores han sido
capaces de demostrar que es posible controlar la distribución de
las proteínas recombinantes entre el sobrenadante y el periplasma en
los cultivos de células hospedantes de E. coli ajustando la
tasa de crecimiento de células hospedantes de E. coli.
Seleccionando una tasa de crecimiento adecuada basado en la
distribución de la proteína entre el sobrenadante y el periplasma y
no necesariamente en el rendimiento solo, la calidad y/o
rendimiento proteico puede ser aumentado.
Así, según el presente invento, se proporciona
un método para seleccionar una tasa de crecimiento para controlar
la distribución de una proteína recombinante entre el sobrenadante y
el periplasma en cultivos de células hospedantes de E. coli
de tal modo que la distribución de la proteína recombinante se
ajusta más a la recuperación primaria de la proteína recombinante,
mientras que la expresión de la proteína recombinante por dichas
células está bajo el control de un sistema inducible, método que
comprende:
- a)
- proporcionar un cultivo de células hospedantes de E. coli
- b)
- cambiar la tasa de crecimiento de las células hospedantes de E. coli de tal modo que la tasa de crecimiento está en el intervalo de 0,0005 a 0,04/h
- c)
- inducir la expresión de la proteína recombinante en el que las etapas (b) y (c) pueden ser realizadas en cualquier orden o simultáneamente; y subsiguientemente
- d)
- determinar el rendimiento de proteína recombinante en el cultivo sobrenadante y el periplasma de la célula hospedante de E. coli
- e)
- comparar el rendimiento determinado en la etapa (d) con el rendimiento determinado cuando al menos otra tasa de crecimiento ha sido usada en la etapa (b)
- f)
- seleccionar una tasa de crecimiento a partir de la comparación hecha en la etapa (e), en la que la distribución de la proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma es más adecuada para la recuperación primaria de la proteína recombinante.
La proteína recombinante para usar en el
presente invento puede ser cualquier péptido, polipéptido o proteína
que tenga más de alrededor de 10 aminoácidos. La proteína puede ser
derivada de cualquier fuente incluyendo bacterias pero más
particularmente a partir de fuentes mamíferas. En un ejemplo la
proteína recombinante es un anticuerpo. El término
"anticuerpo" como se usa aquí se refiere a cualquier molécula
de inmunoglobulina de cualquier clase tal como IgG, IgE, IgM, IgD e
IgA por ejemplo un miembro de la casa IgG, por ejemplo IgG1 y
también cualquier fragmento de inmunoglobulina que se une al
antígeno, tal como los fragmentos Fv, Fab, Fab'y F(ab')2, y
cualquier derivado de los mismos tales como fragmentos de la cadena
Fv única. Estos anticuerpos y sus fragmentos pueden estar presentes
de manera natural, anticuerpos humanizados, quiméricos o injertos
de CDR (regiones que determinan la complementariedad) Y técnicas de
biología molecular estándar pueden ser usadas para modificar,
añadir o delecionar aminoácidos o dominios según se desee. Los
métodos para crear estas moléculas de anticuerpo son bien conocidos
en la técnica (véase por ejemplo, Shrader, y otros, documento de
patente WO 92/02551; Ward y otros, 1989, Nature, 341, 544; Orlando
y otros, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833; Riechmann y
otros, 1988, Nature 322, 323; Bird y otros, 1988, Science, 242, 423;
Queen y otros, documento de patente norteamericana US 5. 585, 089;
Adair, documento de patente WO 91/09967; Mountain y Adair, 1992,
Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10, 1-142; Verma y
otros, 1998, Journal of Immunological Methods, 216,
165-181).
Las células hospedantes de E. coli para
su uso en el presente invento pueden estar presentes de manera
natural como cepas de E. coli o cepas mutadas capaces de
producir proteínas recombinantes. Ejemplos de cepas de E.
coli hospedantes específicas incluyen MC4100, TG1, TG1, DHB4,
DH5\alpha, DH1, BL21, XL1Blue y JM109. Ejemplos también incluyen
cepas de E. coli modificadas, por ejemplo mutantes
metabólicos y cepas deficientes en proteasas. Una cepa de E.
coli hospedante preferida es E. coli W3110 (ATCC 27.325)
una cepa hospedante comúnmente usada para las fermentaciones de
proteínas recombinantes.
La proteína recombinante del presente invento
está típicamente expresada bien en el periplasma de las células
hospedantes de E. coli o en el sobrenadante del cultivo de
las células hospedantes, dependiendo de la naturaleza de la
proteína y de la escala de producción. Los métodos para dirigir
proteínas a estos compartimentos son bien conocidos en el técnica,
para una revisión veáse Makrides, Microbiological Reviews, 1996, 60,
512-538. Ejemplos de secuencias señal adecuadas
para dirigir proteínas al periplasma de E coli incluyen las
secuencias señal de E. coli PhoA, OmpA, OmpT, LamB OmpF.
Las proteínas pueden ser dirigidas al sobrenadante dependiendo de
las rutas secretoras naturales o mediante la inducción del escape
limitado de la membrana externa para causar una secreción proteica
ejemplos de los cuales son el uso de la secuencia pelB líder,
la proteína A líder, la coexpresión de la proteína de liberación de
bacteriocina, la proteína de expresión de bacteriocina inducida por
mitomicina junto con la adición de la glicina al medio de cultivo y
la expresión del gen kil para la permeabilización de
membrana.
En el presente invento la expresión de la
proteína recombinante en las células hospedantes de E. coli
está bajo el control de un sistema inducible. El término "sistema
inducible" Como se usa aquí se refiere a un sistema de expresión
inducible mediante el cual la expresión de la proteína recombinante
en E. coli está bajo el control de un promotor inducible.
Muchos promotores inducibles adecuados para el uso en E.
coli son bien conocidos en la técnica y dependiendo del
promotor, la expresión de la proteína recombinante puede ser
inducida por factores variables tales como la temperatura o la
concentración de un sustancia particular en el medio de crecimiento
(Bañéis, supra; Goldstein y Doi, 1995, Biotechnol. Anu. Rev.
105-128). Ejemplos de promotores inducibles
incluyen los promotores de E. coli lac, tac, y
trp que son inducibles con lactosa o el análogo de lactosa
no hidrolizable,
isopropil-\beta-D-1-tiogalactopiranósido
(IPTG) y los promotores phoA, trp y araBAD que
son inducidos por el fosfato, triptófano y
L-arabinosa respectivamente.
El término "induciendo la expresión" como
se usa aquí se refiere al punto en el que la inducción es iniciada,
por ejemplo, la adición de un inductor o un cambio en temperatura en
el que la inducción es dependiente de la temperatura. Cuando la
inducción de la expresión de la proteína recombinante es lograda
mediante la adición de un inductor al cultivo, el inductor puede
ser añadido mediante cualquier método adecuado dependiendo del
sistema de fermentación y el inductor, por ejemplo, mediante adición
de un única o múltiples dosis o mediante la adición gradual del
inductor a través de un alimentador. Se apreciará que puede haber un
retraso entre la adición del inductor y la inducción actual de la
proteína de expresión por ejemplo en el que el inductor es lactosa
puede haber un retraso antes de que la inducción de la proteína de
expresión tenga lugar mientras que cualquier fuente de carbono
preexistente es utilizada antes que lactosa.
Los cultivos de células hospedante de E.
coli del presente invento pueden ser cultivados en cualquier
medio que permita el crecimiento de E. coli y la expresión de
proteínas recombinantes. El medio puede ser cualquier medio
químicamente definido, tal como los proporcionados en Pirt S. J.
(1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell
Scientific Publications, con modificaciones en las que sea apropiado
el control de la tasa de crecimiento como se describe aquí. Un
ejemplo de un medio adecuado es "SM6E" como se describe por
Humphreys y otros, 2002, Protein Expression and Purification, 26,
309-320.
Cultivar las células hospedante de E.
coli puede tener lugar en cualquier contenedor adecuado tal como
un frasco de agitación o un fermentador dependiendo de la escala de
producción requerida. Diversos fermentadores a gran escala están
disponibles con una capacidad mayor de 1000 litros hasta alrededor
de 100.000 litros. Preferiblemente, fermentadores de 1000 a 50.000
litros son usados, más preferiblemente 1.000 a 10.000 litros.
Fermentadores de menor escala también pueden ser usados con una
capacidad de entre 0,5 y 1000 litros.
La fermentación de E. coli puede ser
realizada en cualquier sistema adecuado, por ejemplo, en modo
continuado, en lote o en lote alimentado (Thiry y Cingolani, 2002,
Trends in Biotechnology, 20, 103-105) dependiendo de
la proteína y de los rendimientos requeridos. El modo en lotes
puede ser usado con adiciones rápidas de nutrientes o inductores en
los casos en que sea requerido. Alternativamente, un cultivo
alimentado en lotes puede ser usado y por ejemplo, los cultivos ser
hechos crecer en modo de lotes con preinducción a la tasa de
crecimiento específica máxima que puede ser sostenida usando los
nutrientes presentes inicialmente en el fermentador y uno o más
regímenes de alimentación de nutrientes usados para controlar la
tasa de crecimiento post-inducción hasta que la
fermentación sea completa. El modo de alimentación en lotes puede
también ser usado con pre-inducción para controla
el metabolismo de las células de E. coli hospedantes y para
permitir que se alcancen densidades celulares (Lee, 1996, Tibtech,
14-98-105).
En el presente invento las células son hechas
crecer a cualquier tasa de crecimiento adecuada previo a la
inducción de la proteína de expresión. Para lograr una tasa elevada
de crecimiento las células hospedantes de E. coli son
típicamente hechas crecer en cultivos en los que los niveles de
nutrientes, fuentes de carbono, temperatura y condiciones oxidantes
permiten tal crecimiento. Preferiblemente las células hospedantes
de E. coli en el presente invento son hechas crecer en
condiciones de nutrientes ilimitados a tasas de crecimiento
elevadas para obtener una densidad celular elevada previamente a la
inducción de la expresión de proteínas recombinantes. El
crecimiento puede ser medido de varias maneras diferentes, la más
común de las cuales es medir el aumento en la densidad celular
midiendo el aumento en la densidad óptica a 600 nm a lo largo del
tiempo. La tasa de crecimiento específica puede ser determinada
representado el logaritmo natural de las medidas de DO_{600}
versus tiempo. Las medidas de crecimiento pueden ser tomadas a lo
largo del cultivo, por ejemplo, mediante medidas en línea o tomando
muestras de los cultivos a intervalos de tiempo regulares durante
la fermentación Preferiblemente una densidad celular elevada es
obtenida antes de que la expresión de la proteína recombinante sea
inducida. Ejemplo de densidades adecuadas a las que la expresión de
la proteína puede ser inducida oscilan desde alrededor de 60 a
alrededor de 100 DO_{600}.
En la etapa (b) del método del presente invento
la tasa de crecimiento cambia comparada con la tasa de crecimiento
en los cultivos de E. coli proporcionados en la etapa (a) del
método. El cambio en la tasa de crecimiento en la etapas (b) puede
tener lugar en cualquier tiempo antes de la inducción de la
expresión de la proteína en la etapa (c), al mismo tiempo que la
inducción de la expresión de la proteína o después de la inducción
de la expresión de la proteína. En un ejemplo, en el que la tasa de
crecimiento cambiantes de la etapa (c) los cultivos son hechos
crecer a tasas de crecimiento elevadas en la etapas (a) del método
hasta que una densidad celular elevada es alcanzada tras lo cual la
tasa de crecimiento cambia y la expresión de la proteína inducida
una vez que el cambio en la tasa de crecimiento deseada ha sido
observada. En uno de tales ejemplos, la tasa de crecimiento cambia
de entre alrededor de 1 y alrededor de 3 horas antes de la inducción
de la expresión de la proteína. En otro ejemplo los cultivos son
hechos crecer a una tasa de crecimiento elevado en la etapa (a) del
método y las etapas (b) y (c) tiene lugar simultáneamente, es decir,
a aproximadamente el mismo tiempo tal que la tasa de crecimiento es
cambiada en el punto de inducción.
La tasa de crecimiento de las células
hospedantes de E. coli pueden ser controladas mediante muchos
métodos diferentes bien conocidos en la técnica dependiendo del
sistema de fermentación (véase, por ejemplo Lee 1996, Tibtech,
14-98-105). Métodos adecuados para
controlar la tasa de crecimiento incluyen cambios en la temperatura,
niveles de oxígeno disponibles y niveles de nutrientes. Cambios en
la temperatura apropiados, niveles de oxígeno o concentraciones de
nutrientes requeridas para lograr una tasa de crecimiento específico
pueden ser determinadas empíricamente por un profesional experto en
la técnica ensayando un intervalo de concentraciones y midiendo el
efecto en la tasa de crecimiento. En un ejemplo, la concentración de
nutrientes tales como nitrógeno y fosfato presentes al inicio de la
fermentación puede ser usada para controlar la tasa de crecimiento
dependido del punto durante la inducción, al que el nutriente es
deplecionado. En un ejemplo particular del presente invento la
fuente de nutrientes que controla la tasa de crecimiento es el
fosfato. Concentraciones de fosfato adecuadas son proporcionadas en
los ejemplos aquí y son conocidos en la técnica (Véase por ejemplo,
Pirt, S. J. (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation,
Blackwell Scientific Publications): ejemplos de concentraciones de
fosfato adecuadas presente en la fermentación de partida incluyen
aquellos en el intervalo de 25 a 40 mM. Así, en un ejemplo del
presente invento la tasa de crecimiento en la etapa (b) es cambiada
ajustando el nivel de fosfato disponible a las células al principio
de la fermentación. En otro ejemplo, la tasa de crecimiento puede
ser ajustada cambiando la concentración de nutrientes tales como
carbono o nitrógeno añadido al cultivo por ejemplo vía un
alimentador o a través de adiciones rápidas.
En otro ejemplo del presente invento, la tasa de
crecimiento en la etapa (b) es cambiada ajustando los niveles de
carbono disponibles a las células hospedantes de E. coli. El
nivel de fuente de carbono disponible en las células puede ser
aumentado o disminuido para lograr el cambio requerido en la tasa de
crecimiento. Preferiblemente la tasa de crecimiento es controlada
ajustando la tasa de alimentación de la fuente de carbono en el
cultivo. El término "fuente de carbono" como se usa aquí se
refiere a la fuente de carbono que está disponible como una fuente
de energía para E. coli durante el crecimiento e incluyen
azúcares tales como glucosa, lactosas, sacarosa y fructosa y otras
fuentes de carbono tal como glicerol, succinato y lactato. En una
realización preferida del presente invento la fuente de carbono es
glicerol. Preferiblemente las células hospedantes son cultivadas en
un fermentador alimentado en lotes y la fuente de carbono es
glicerol proporcionado a cualquier tasa de alimentación adecuada
para proporcionar la tasa de crecimiento requerido. Las tasas de
alimentación de glicerol adecuadas son bien conocidas en la técnica
e incluyen las descritas en los ejemplos proporcionados aquí.
Ejemplos de tasas de alimentación de glicerol adecuadas incluyen
aquellas en el intervalo de desde 0,5 a 11 ml/h.
El término "distribución" como se usa aquí
se refiere a la distribución de proteína recombinante entre el
periplasma de las células hospedantes de E. coli y el
sobrenadante en el que son hechas crecer. Para determinar la
distribución de la proteína recombinante el rendimiento en el
periplasma y el sobrenadante es determinado en la etapa (d) del
método. El rendimiento puede ser determinado tomando muestras a
intervalos de tiempo adecuados a través del cultivo de las células
hospedantes de E. coli, por ejemplo alrededor de cada
2-4 horas, o alternativamente en el punto de
recogida, por ejemplo alrededor de 24 a 36 horas tras la inducción.
Muchos métodos de cuantificación de proteínas son conocidos en le
técnica e incluyen métodos tales como electroforesis en gel, HPLC,
cromatografía y métodos de inmunodetección tales como transferencia
Western y ELISA. Por ejemplo las concentraciones de Fab' en los
extractos periplasmáticos y sobrenadante de cultivo pueden ser
determinadas mediante ELISA de ensamblaje de Fab' como se describe
en Humphreys y otros, 2002. Protein Expression and Purification,
26, 309-320.
En el método del presente invento el rendimiento
de la proteína recombinante en el sobrenadante y el periplasma de
las células hospedante de E. coli en dos o más tasas de
crecimiento diferentes en la etapa (b) son comparadas en la etapa
(e) del método para encontrar la tasa de crecimiento que tiene como
resultado una distribución que es más adecuada a la recuperación
primaria del producto proteico. Preferiblemente los rendimientos
comparados en la etapa (e) son determinadas en la etapa (d) a
aproximadamente el mismo tiempo tras la inducción para cada tasa de
crecimiento. Se apreciará que esto no puede ser siempre posible,
especialmente para cultivos hechos crecer a tasas de crecimiento
mayores en el que la biomasa máxima es alcanzada más pronto que en
los cultivos hechos crecer a tasas de crecimiento más bajas.
El cambio en la tasa de crecimiento en la etapa
(b) del método puede ser un aumento o una disminución en la tasa de
crecimiento. El cultivo proporcionado en la etapa (a) puede ser
hecho crecer a cualquier tasa de crecimiento adecuada bien en
condiciones de nutrientes ilimitadas o de nutrientes limitados.
Preferiblemente el cultivo proporcionado en le etapa (a) es hecho
crecer en condiciones de nutrientes ilimitados a la máxima tasa de
crecimiento específica en esas condiciones. En un ejemplo la tasa de
crecimiento de las células hospedantes de E. coli en la
etapa (a) es entre alrededor de 0,1 a 0,25/h, preferiblemente entre
0,13 y 0,22/h. Preferiblemente la tasa de crecimiento es reducida
en la etapa (b) del método. La tasa de crecimiento puede ser
reducida a cualquier tasa adecuada en el intervalo de 0,00005 a
0,04/h. Tasas de crecimiento adecuadas pueden ser identificadas
empíricamente ensayando al menos dos tasa de crecimiento diferentes
y comparándolas a la etapa (e) del método. Cada tasa de crecimiento
puede ser ensayada en dos o más cultivos separados hechos crecer en
paralelo y/o en sucesión. En un ejemplo, al menos dos cultivos son
hechos crecer simultáneamente usando una tasa de crecimiento
diferente en cada cultivo en la etapa (b). En otro ejemplo al menos
dos cultivos son hechos crecer secuencialmente usando una tasa de
crecimiento diferente en cada cultivo en la etapa (b).
Alternativamente dos o más tasas de crecimiento diferentes pueden
ser ensayadas en un cultivo único llevando a cabo las etapas (a) a
(d) usando una tasa de crecimiento en la etapa (b) y luego llevando
a cabo las etapas (b) y (d) al menos una vez mas variando la tasa
de crecimiento en la etapa (b) cada vez. Se apreciará que si no se
identifica una tasa de crecimiento adecuada en la etapa (e) del
método, entones tasas de crecimiento adicionales pueden ser
ensayadas repitiendo las etapas (a) a (d) del método. Típicamente
un intervalo de las tasas de crecimiento diferentes serán ensayadas
en el intervalo de 0,0005 a 0,04/h. En el primer ejemplo el
intervalo de las diferentes tasa de crecimiento ensayadas pueden
abarcar un amplio intervalo de tasa de crecimiento altas y bajas que
pueden ser subsiguientemente estrechadas si se requiere repitiendo
las etapas (a) a (d) del método usando un intervalo más estrecho de
las tasas de crecimiento en la etapa (b). Tasas de crecimiento
adecuadas para ensayar en el primer ejemplo pueden por ejemplos ser
entre alrededor de 2 y alrededor de 200 veces menores que la tasa de
crecimiento en las condiciones de nutrientes ilimitados. En un
ejemplo la tasa de crecimiento está entre alrededor de 5 y
alrededor de 200 veces menos que la tasa de crecimiento en
condiciones de nutrientes ilimitados. Alternativamente, en el
primer ejemplo el intervalo de tasas de crecimiento diferentes
pueden ser un intervalo estrecho por ejemplo de tasas de
crecimiento elevadas o bajas que pueden ser subsiguientemente
ampliadas si se requiere repitiendo las etapas (a) a (d) del método
usando un intervalo más amplio de las tasas de crecimiento en la
etapa (b). Tasas de crecimiento adecuadas para ensayar en el primer
caso pueden ser por ejemplo entre alrededor de 2 y alrededor de 50
veces menos que la tasa de crecimiento en condiciones de nutrientes
ilimitados o entre alrededor de 100 a alrededor de 200 veces menos.
En un ejemplo la tasa de crecimiento está entre alrededor de 5 y
alrededor de 20 veces menos que la tasa de crecimiento en
condiciones de nutrientes ilimitados. Condiciones de crecimiento
adecuadas en la etapa (b) están en el intervalo de 0,0005 a
0,04/h.
Una vez que la distribución de la proteína
recombinante a dos o mas tasas de crecimiento diferentes han sido
comparadas la tasa de crecimiento más adecuada para la primera
recuperación de la proteína recombinante es seleccionada en la
etapa (f) del método. El término "recuperación primaria" como
se usa aquí se refiere a las etapas iniciales de recuperación
requeridas para producir un sobrenadante libre de células o extracto
periplasmático adecuado para las etapas de purificación
subsiguientes. Ejemplos de etapas de recuperación primaria
incluyen, centrifugación, filtración, extracción o lisis celular
homogenización, concentración, diafiltración y adsorción en lecho
expandido. La tasa de crecimiento más adecuada a la recuperación
primaria de la proteína será la tasa de crecimiento que da como
resultado un mejor rendimiento y/o calidad de proteína tras una o
más etapas de recuperación primaria. El término "calidad" como
se usa aquí se refiere a la integridad de la proteína obtenida,
bien esté intacta y/o correctamente plegada. De modo importante la
tasa de crecimiento más adecuada puede no ser la tasa de
crecimiento que da como resultado la mejor distribución de la
proteína entre el periplasma y el sobrenadante que dará como
resultado una mejor calidad proteica y/o mayores rendimiento tras
una o más etapas de recuperación primaria. Por lo tanto, la tasa de
crecimiento seleccionada en la etapa (f) puede ser un equilibrio
entre el rendimiento proteico durante el cultivo y el rendimiento
final y calidad de la proteína finalmente recuperada.
En un ejemplo la proteína recombinante puede ser
expresada en el periplasma de las células hospedantes de E.
coli ya que éstas son más fáciles de manipular a gran escala que
el sobrenadante. La primera etapa de recuperación requerida es la
recuperación de las células hospedantes del medio de cultivo bien
mediante centrifugación o filtración. Para proteínas producidas en
el periplasma una consideración importante es el nivel de escape de
la proteína recombinante en el sobrenadante ya que esto puede tener
efectos perjudiciales para la recuperación primaria y la calidad de
la proteína periplasmática. La proteína aumentada presente en el
sobrenadante aumenta la viscosidad del sobrenadante haciendo la
recogida de las células mediante centrifugación o filtración más
difícil y reduciendo el rendimiento de proteína periplasmática. Las
células en sí mismas son también menos robustas durante la
centrifugación y más susceptibles de ser lisadas dando como
resultado el daño a la proteína recombinante y aumentando aún más
la viscosidad del sobrenadante debido a la liberación de la
proteína, el ADN y los lípidos, lo cual de nuevo reduce el
rendimiento de la proteína recombinante en el periplasma. La calida
de la proteína recombinante recuperada a partir del periplasma puede
también ser reducida por la contaminación con la proteína
recombinante a partir del sobrenadante que puede ser parcialmente
degradada o no plegada correctamente. En estos cultivos es
importante por lo tanto mantener los niveles de proteína
recombinante bajos en el sobrenadante para aumentar la calidad y/o
rendimiento de la proteína recombinante tras la recuperación
primaria. Es este ejemplo el rendimiento final y/o calidad de la
proteína recombinante obtenida tras la recuperación primaria puede
ser mejorada seleccionando una tasa de crecimiento en la que el
nivel de proteína recombinante en el sobrenadante sea baja aún si el
rendimiento de la proteína recombinante en el periplasma es más
bajo que a otras tasas de crecimiento en las que los niveles de
proteína recombinante en el sobrenadante son mayores. Por lo tanto,
para las proteínas producidas en el periplasma en el método del
presente invento se prefiere que la tasa de crecimiento seleccionada
en la etapa (f) sea una tasa de crecimiento en la que más del 55%
de proteína es expresada en el periplasma y menos del 45% de la
proteína está en el sobrenadante. Preferiblemente, más del 80% de
la proteína producida mediante las células hospedantes es expresada
en el periplasma y menos del 20% en el sobrenadante. En un ejemplo,
más del 90% de la proteína producida por las células hospedantes es
expresada en el periplasma y menos del 10% está en el sobrenadante.
En otro ejemplo, más del 95% de la proteína producida por las
células hospedantes está expresada en el periplasma y menos del 5%
está en el sobrenadante.
En otro ejemplo la proteína puede ser porducida
en el sobrenadante. La proteína puede ser más fácil de purificar
dado que no se requiere ninguna etapa de extracción y que habrá
menos proteínas hospedantes presentes en el medio. La calidad de la
proteína puede también ser mejor ya que habrá menos proteólisis y
puede haber un plegamiento de la proteína mejorado. Para proteínas
producidas en el sobrenadante es importante que la cantidad de
proteína recombinante expresada por las células hospedantes y
secretadas al sobrenadante está maximizado. Para determinar si toda
la proteína recombinante producida por las células hospedantes está
siendo secretada en el sobrenadante es importante medir también los
niveles de proteína recombinante en el periplasma. Si estos son
todavía altos puede ser posible, usando el método del presente
invento, ajustar la distribución de la proteína recombinante para
que aumente el rendimiento del sobrenadante aún más. Como resultado,
para proteínas producida en el sobrenadante en el método del
presente invento es preferido que la tasa de crecimiento
seleccionada en la etapa (f) sea una tasa de crecimiento a la cual
más del 55% de la proteína esté expresada en el sobrenadante y menos
del 45% de la proteína esté en el periplasma. Preferiblemente, más
del 80% de la proteína recombinante producida por las células
hospedantes es producida en el sobrenadante y menos del 20% en el
periplasma. En un ejemplo, más del 90% de la proteína producida por
las células hospedantes es en el sobrenadante y menos del 10% es
en el periplasma. En otro ejemplo, más del 95% de la proteína
producida por las células hospedantes es en el sobrenadante y menos
del 5% es en el periplasma.
Habiendo identificado una tasa de crecimiento
adecuada en el etapa (f) del método, la misma tasa de crecimiento
puede ser usada durante las fermentaciones subsiguientes de las
células hospedantes de E. coli para asegurar que la
distribución deseada de la proteína recombinante entre el
sobrenadante y el periplamsa sea alcanzada. Estas fermentaciones
subsiguientes pueden estar en la misma escala o en una escala
diferente que la usada en el método descrito anteriormente. Por
ejemplo, las células de E. coli hospedantes puede ser
fermentadas a una escala menor para determinar la tasa de
crecimiento más adecuada a la recuperación primaria de la proteína
y después en fermentaciones subsiguientes las células hospedantes
pueden ser fermentadas a gran escala para producir grandes
cantidades de la proteína recombinante usando la tasa de crecimiento
seleccionada en el etapa (f).
La proteína recombinante producida por el método
del presente invento puede ser subsiguientemente purificada tras la
recuperación primaria. Las etapas de recuperación primaria usadas
dependerán de la localización celular de la proteína recombinante
en un extremo de la fermentación. Por ejemplo, proteínas expresadas
en el periplasma pueden ser recuperadas dentro de las células
hospedantes mediante centrifugación o filtración. La proteína puede
entonces ser extraída desde dentro de las células usando métodos
tales como tratamiento por calor (véase por ejemplo el documento de
patente norteamericana 5.665.866) o extracción mecánica. Las
proteínas expresadas en el sobrenadante pueden ser recuperadas
usando métodos tales como adsorción en lecho expandido o
centrifugación o filtración para eliminar las células seguido por,
por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico o de afinidad para
capturar la proteína. La proteína desde bien el extracto
periplasmático o el sobrenadante puede ser subsiguientemente
purificada usando uno cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica dependiendo de la naturaleza de la proteína recombinante y
sus propiedades físicas tales como tamaños, hidrofobicidad y punto
isoeléctrico. Tales métodos pueden incluir, cromatografía de
exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbico, de
intercambio iónico, cromatografía de afinidad y HPLC de fase
inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente invento será ahora descrito sólo por
medio de ejemplos, a los que se hace referencia:
Figura 1. Perfil de crecimiento de E.
coli a un intervalo de tasas de alimentación de glicerol.
Figura 2. Tasa de crecimiento
post-inducción de E. coli a un intervalo de
tasas de alimentación de glicerol.
Figura 3. Distribución de Fab'A entre el
periplasma y el sobrenadante en cultivos de E. coli hechos
crecer a un intervalo de tasas de alimentación de glicerol
Figura 4. Perfil de crecimiento de E.
coli a un intervalo de concentraciones de fosfato
inorgánico.
Figura 5. Tasa de crecimiento
post-inducción de E. coli a un intervalo de
concentraciones de fosfato inorgánico
Figura 6. Distribución de Fab'B entre el
periplasma y el sobrenadante en cultivos de E. coli hechos
crecer a un intervalo de concentraciones de fosfato inorgánico.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepa y plásmido. La cepa usada en este
trabajo fue Escherichia coli W3110 (TCC 27325) transformada
con un plásmido que confiere resistencia a tetraciclina y lleva
genes que codifican para los componentes polipeptídicos de la
cadena ligera y pesada del fragmento de Fab', Fab'A. Cada
polipéptido está precedido por el péptido líder OmpA de E.
coli. La inducción de la expresión desde un promotor tac
único da como resultado la síntesis y secreción de los polipéptidos
de la cadena ligera y pesada en el periplasma en el que una porción
de los polipéptidos se pliega y se ensambla para formar Fab'.
\vskip1.000000\baselineskip
El medio de crecimiento de la fermentación fue
basado en el medio SM6E (descrito en Humphreys y otros, 2002,
Protein Expression and Purification, 26, 309-320)
con 3,86 g/l NaH_{2}PO_{4}. H_{2}O y 112 g/l de glicerol.
\vskip1.000000\baselineskip
Inóculo. Cultivos de inóculo fueron
hechos crecer en el mismo medio suplementado con 10 \mug/ml de
tetraciclina. Los cultivos fueron incubados a 30ºC con agitación
durante aproximadamente 22 horas.
\newpage
Fermentación. Fermentadores (2,5 litros
de volumen total) fueron seleccionados con un cultivo de inóculo a
0,3-0,5 DO_{600}. Las temperaturas fueron
mantenidas a 30ºC durante la fase de crecimiento y fueron reducidas
a 25ºC previamente a la inducción. La concentración de oxígeno
disuelta fue mantenida por encima de 30% de saturación de aire
mediante una agitación variable y flujo de aire. El pH del cultivo
fue controlado a 7,0 mediante valoración automática con 15% (v/v)
NH_{4}OH y 10% (v/v) conc. H_{2}SO_{4}. La formación de
espuma fue controlada mediante la adición de 10% (v/v) de disolución
Struktol J673 (Schill y Seilacher).
Un número de adiciones fueron hechas a
diferentes etapas de la fermentación. Cuando la concentración de
biomasa alcanzó aproximadamente 40 DO_{600}, las sales de
magnesio y NaH_{2}PO_{4}. H_{2}O fueron añadidas. Adiciones
adicionales de NaH_{2}PO_{4}. H_{2}O fueron hechas previamente
a y durante la fase de inducción para asegurar que el fosfato fue
mantenido en exceso. Cuando el glicerol presente al principio de la
fermentación había sido deplecionado (aproximadamente 75
DO_{600}) una alimentación contínua de 80% (p/p) de glicerol fue
aplicada a tasas que oscilan desde 0,5 hasta 10,9 ml/h. Al mismo
punto en la fermentación una alimentación de IPTG fue aplicada a
una tasa de 1 ml/h durante 36 horas de tal modo que la concentración
final de IPTG en el fermentador a este punto de tiempo fue 0,5 mM:
el comienzo de la alimentación de IPTG fue tomada como inicio de la
inducción. Las fermentaciones fueron típicamente hechas correr
durante 70-73 horas a las tasas de alimentación de
glicerol más bajas (0,5-2,5 ml/h) y
50-60 h a las tasas de alimentación de glicerol
mayores (5,4-10,9 ml/h).
Medidas de concentración de biomasa y tasa de
crecimiento. La concentración de biomasa fue determinada
midiendo la densidad óptica de cultivos a 600 nm. La tasa de
crecimiento (\mu) está relacionada con el cambio en la
concentración de biomasa a lo largo del tiempo, así:
LnX_{t} =
LnX_{o} + \mu
t
En la que X_{o} es la concentración de biomasa
original, X_{t} es la concentración de biomasa tras un intervalo
de tiempo, t. Así, una gráfica de LnX_{t} frente a t para un
cultivo en lotes da una línea recta de pendiente igual a \mu
(unidad por hora). Sin embargo, la aplicación de una alimentación
limitante lineal de glicerol a un cultivo en lotes da como
resultado una tasa de crecimiento disminuyente debido al aumento en
la biomasa y al volumen de cultivo. Por lo tanto, una tasa de
crecimiento promedio durante el período de inducción fue
determinado representando LnDO_{600} frente a tiempo. La pendiente
de una línea de mejor ajuste (por el método de los mínimos
cuadrados) fue determinada para dar una tasa de crecimiento promedio
a lo largo del tiempo de alimentación.
Extracción periplasmática. Las células
fueron recogidas de muestras de cultivo mediante centrifugación. La
fracción sobrenadante fue retenida (a -20ºC) para un análisis
posterior. La fracción del precipitado celular fue resuspendida al
volumen de cultivo original en tampón de extracción (100 mM
Tris-HCl, 10 mM EDTA; pH 7,4). Tras la incubación a
60ºC durante aproximadamente 16 horas el extracto fue clarificado
mediante centrifugación y la fracción sobrenadante retenida (a
-20ºC) para análisis.
Cuantificación de Fab'. Las
concentraciones de Fab' en los extractos periplasmáticos y
sobrenadantes de cultivo fueron determinadas mediante ELISA de
ensamblaje de Fab' como se describió en Humphreys y otros, 2002,
Protein Expression and Purification, 26,
309-320.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fermentaciones Fab'A fueron llevadas a cabo
en condiciones en las el crecimiento era ilimitado la preinducción
y el crecimiento tuvieron lugar a la tasa específica máxima
(\mu_{max}) pero fue subsiguientemente restringida
postinducción (Fig. 1). La tasa de crecimiento post inducción fue
controlada mediante la alimentación limitada de un nutriente
(glicerol) al cultivo en lotes a un intervalo de caudal. Los
caudales de glicerol fueron seleccionados para dar un intervalo de
velocidad de crecimiento ascendente de aproximadamente 0/h. La Fig.
2 y la Tabla 1 muestran el promedio real de la tasa de crecimiento
sobre el período de inducción para un intervalo de tasas de
alimentación del glicerol. El aumento de la tasa de alimentación del
glicerol dio como resultado un aumento en el promedio de la tasa de
crecimiento del cultivo como se pretendía.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las fermentaciones fueron recogidas
aproximadamente 36 horas después de la inducción a unas tasas de
alimentación de glicerol bajas (0,5-2,5 ml/h) y
alrededor de 24 horas después de la inducción a unas tasas de
alimentación del glicerol altas (5,4-10,9 ml/h) y
la concentración Fab' en los extractos periplasmáticos y los
sobrenadantes de cultivo determinados por ELISA de ensamblaje de
Fab'. La Fig. 3 muestra la concentración Fab' y la distribución
relativa entre el periplasma y el medio de cultivo. Una tasas de
crecimiento óptima para la concentración de Fab' se demostró que
era aproximadamente 0,0075/h. Se observó una tendencia general en la
que el título Fab' en el cultivo sobrenadante incrementó al
aumentar la tasa de crecimiento. De este modo la velocidad de
crecimiento seleccionada para el rendimiento de la fermentación
óptima, el rendimiento Fab' y la compatibilidad con la recuperación
primaria reflejará un balance entre el rendimiento máximo y la
distribución óptima del Fab'. En el ejemplo citado, una tasa de
alimentación del glicerol de 1,6 ml/h (tasa de crecimiento
\sim0,0071/h) fue seleccionada para un aumento en la escala de la
fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepa y plásmido. La cepa usada en este
trabajo fue Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) transformada
con un plásmido que confiere resistencia a la tetraciclina y que
transporta genes que codifican para los componentes polipéptidos de
la cadena ligera y pesada del fragmento Fab', Fab'B. La inducción de
la expresión de un promotor tac simple da como resultado la
síntesis y secreción de los polipéptidos de la cadena ligera y
pesada en el periplasma en los que una porción de los polipéptidos
se pliegan y se ensamblan para formar el Fab'.
\newpage
El medio de crecimiento de la fermentación se
basó en el medio SM6E (descrito en Humphreys y otros, 2002,
Protein Expression and Purification, 26, 309-320)
con las concentraciones de NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O dadas en la
Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Inóculo. Los cultivos de inóculo
crecieron en el mismo medio con la concentración apropiada de
NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O (véase la Tabla 2) y suplementados con
10 \mug/ml de tetraciclina. Los cultivos fueron incubados a 30ºC
con agitación durante aproximadamente 19-26
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Fermentación. Los fermentadores (volumen
total 2,5 litros) fueron sembrados con cultivo de inóculo a
0,3-0,5 OD_{600}. La temperatura se mantuvo a
30ºC durante la fase de crecimiento y se redujo a 27ºC antes de la
inducción. La concentración de oxígeno disuelta se mantuvo a una
saturación de aire de alrededor del 30% por agitación variable y
flujo de aire. El pH del cultivo fue controlado a 7,0 por valoración
automática con 15% de NH_{4}OH_{4} (v/v) y 10% de
H_{2}SO_{4} concentrado (v/v). La formación de espuma fue
controlada mediante la adición de 10% de disolución
Mazu (v/v).
Mazu (v/v).
Un número de adiciones fueron hechas en
diferentes estados de la fermentación. El glicerol se añadió a la
fermentación como 2 alícuotas de 45 ml de una disolución al 80%
(p/p), una adición de una concentración de biomasa de 20 OD_{600}
y la otra de 40 OD_{600}. Cuando la concentración de biomasa
alcanzó aproximadamente el 40 OD_{600}, las sales de calcio y
magnesio fueron también añadidas. La lactosa (60 ml de una
disolución al 50% (p/p) fue añadida a 60 OD_{600} y sirvió como
un inductor y fuente de carbono durante la fase de inducción. La
inducción tuvo lugar tras la depleción del glicerol (alrededor de
entre 75 y 90 OD_{600}) como se marca por un aumento en la
concentración del oxígeno disuelto. Adiciones adicionales de lactosa
fueron hechas según se requería para mantener la concentración en
el fermentador entre 0 y 55 g/l. Una adición adicional de magnesio
fue hecha entre 0 y 2 horas después de la inducción. Las
fermentaciones fueron realizadas típicamente durante
56-61 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis de las fermentaciones. Las
extracciones periplasmáticas, las medidas de la biomasa y las
cuantificaciones del Fab' fueron hechas como se describe
previamente (Ejemplo 1).
\newpage
El crecimiento de los cultivos de fermentación
después de la inducción fue controlado por la variación de la
cantidad de fosfato (NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O) mientras se
mantuvieron todos los otros nutrientes iniciales constantes (Fig.
4). La velocidad de crecimiento durante cada fermentación fue
determinada para el período de inducción en el que la biomasa
aumentó (Fig. 5 y Tabla 3).
El aumento en la concentración de fosfato dio
como resultado un aumento en la tasa de crecimiento por encima de
estos períodos de inducción. Las concentraciones de fosfato fueron
seleccionadas para deplecionar en diversos puntos relativos a la
inducción (ligeramente antes de la inducción, por ejemplo 26,9 mM, a
diversos puntos después de la inducción). El punto (concentración
biomasa) en el que tiene lugar la inducción está relacionado con la
concentración del glicerol inicial. La cantidad del fosfato
requerido para soportar el crecimiento de la biomasa de inducción
deseada fue calculada basada en los datos del coeficiente del
rendimiento de la biomasa para proporcionar el fosfato inorgánico
en Pirt, S. J (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation,
Blackwell Scientific Publications. La concentración de fosfato
óptima para el rendimiento del Fab' y la distribución fue
determinada empíricamente como se describe aquí.
Las fermentaciones fueron recogidas
28-31 horas después de la inducción y la
concentración de Fab' en los extractos periplasmáticos y los
sobrenadantes del cultivo determinada por el ELISA de ensamblaje de
Fab'. La Fig. 6 muestra la concentración del Fab' de tanto el
sobrenadante como el periplasma del cultivo en el momento de la
recogida. Se observó una tendencia general en la que la
concentración del Fab' en el sobrenadante de cultivo aumentó con la
concentración del fosfato. El intervalo óptimo del fosfato para una
recuperación primaria a larga escala usando la extracción
periplasmática y los métodos de centrifugación/filtración fue de
29,8 mM.
Claims (20)
1. Un método para seleccionar una tasa de
crecimiento para controlar la distribución de una proteína
recombinante entre el sobrenadante y el periplasma en cultivos de
células hospedantes de E. coli de modo que la distribución
de la proteína recombinante sea más adecuada para la recuperación
primaria de la proteína recombinante, en la que la expresión de la
proteína recombinante por dichas células está bajo el control de un
sistema inducible, cuyo método comprende:
- a)
- proporcionar un cultivo de células hospedantes de E. coli
- b)
- cambiar la tasa de crecimiento de las células hospedantes de E. coli tal que la tasa de crecimiento esté en el intervalo de 0,0005 a 0,04/h.
- c)
- inducir la expresión de la proteína recombinante en la que las etapas (b) y (c) pueden ser realizadas en cualquier orden o simultáneamente; y subsiguientemente
- d)
- determinar el rendimiento de proteína recombinante en el sobrenadante de cultivo y el periplasma de las células hospedantes de E. coli
- e)
- comparar el rendimiento determinado en la etapa (d) con el rendimiento determinado cuando al menos una otra tasa de crecimiento ha sido usada en la etapa (b)
- f)
- seleccionar una tasa de crecimiento a partir de la comparación hecha en la etapa (e) en la que la distribución de la proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma es más adecuado para la recuperación primaria de la proteína recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método según la reivindicación 1, en el
que los rendimientos comparados en la etapa (e) son de al menos dos
cultivos hechos crecer simultáneamente usado una tasa de crecimiento
diferente en cada cultivo en la etapa (b).
3. El método según la reivindicación 1, en el
que los rendimientos comparados en el etapa (e) son de al menos dos
cultivos hechos crecer secuencialmente usando una tasa de
crecimiento diferente en cada cultivo en la etapa (b).
4. El método según la reivindicación 1, en el
que los rendimientos comparados en la etapa (e) son de un cultivo
hecho crecer a al menos dos tasa de crecimiento diferentes llevando
a cabo etapas (a) a (d) usando una tasa de crecimiento en la etapa
(b) y luego llevando a cabo las etapas (b) y (d) al menos una vez
más variando la tasa de crecimiento en la etapa (b) cada vez.
5. El método según las reivindicaciones 1 a 4,
en el que la tasa de crecimiento en la etapa (b) es reducida.
6. El método según las reivindicaciones 1 a 5 en
el que cambiando la tasa de crecimiento de las células hospedantes
de E. coli en la etapa (b) comprende ajustar el nivel de
carbono disponible en las células.
7. El método de la reivindicación 6, en el que
la fuente de carbono es seleccionada de glucosa, lactosa, sacarosa,
fructosa, glicerol, succinato y lactato.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
la fuente de carbono es glicerol.
9. El método según las reivindicaciones 1 a 8,
en el que cambiando la tasa de crecimiento de las células
hospedantes de E. coli en la etapa (b) comprende ajustar el
nivel de fosfato disponible a las células.
10. El método según las reivindicaciones 1 a 9,
en el que cambiando la tasa de crecimiento de las células
hospedantes de E. coli en la etapa (b) comprende ajustar el
nivel de oxígeno disponible a las células.
11. El método según las reivindicaciones 1 a 10,
en el que la proteína recombinante es dirigida al periplasma.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
la tasa de crecimiento seleccionada en la etapa (f) es una tasa de
crecimiento en la que más del 80% de la proteína recombinante
producida por las células hospedantes está expresada en el
periplasma.
13. El método según las reivindicaciones 1 a 10,
en el que la proteína recombinante es dirigida al sobrenadante.
14. El método de la reivindicación 13, en el que
la tasa de crecimiento seleccionada en al etapa (f) es una tasa de
crecimiento en la que más del 80% de la proteína recombinante
producida por las células hospedantes es producida en el
sobrenadante.
\newpage
15. El método según las reivindicaciones
1-14, en el que el sistema inducible comprende un
promotor derivado de lac.
16. El método de la reivindicación 15, en el que
el promotor derivado de lac es lac, tac o trc.
17. El método según las reivindicaciones 15 ó
16, en el que el promotor es inducido con lactosa o IPTG.
18. El método según las reivindicaciones
1-17, en el que la proteína recombinante es un
anticuerpo o un fragmento del mismo.
19. El método según la reivindicación 18, en el
que el anticuerpo es una IgG.
20. El método según la reivindicación 18, en el
que el fragmento es un Fab, Fab', F(ab')_{2} o scFv.
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