ES2346673T3 - Procedimiento para obtener anticuerpos. - Google Patents
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Abstract
Un método para la preparación de moléculas de anticuerpos recombinantes que comprende cultivar una muestra de célula hospedadora transformada con un vector de expresión que codifica una molécula de anticuerpo recombinante y someter dicha muestra de célula hospedadora a una etapa de tratamiento térmico, caracterizada porque dicha muestra se somete a una etapa de tratamiento no lisante a presión antes de someterse a un aumento de temperatura dentro del intervalo de 30ºC a 70ºC durante un periodo de hasta 24 horas.
Description
Procedimiento para obtener anticuerpos.
La presente invención se refiere a métodos para
aumentar los rendimientos en la producción y aislamiento de
anticuerpos funcionales recombinantes, y en particular de
anticuerpos terapéuticos. Los métodos se particularmente adecuados
para la fabricación industrial a gran escala de anticuerpos
terapéuticos.
Se han desarrollado rápidamente técnicas de ADN
recombinante y son particularmente útiles en la producción de
anticuerpo, en particular de anticuerpos terapéuticos. Los sistemas
para la expresión de genes recombinantes son bien conocidos por los
expertos en este campo en cuestión. Estos incluyen la expresión en
células de mamífero, células de insecto, células micóticas, células
bacterianas y animales y plantas transgénicos. La elección del
sistema de expresión depende de las características de la proteína
codificada, por ejemplo las modificaciones tras la traducción.
Otras consideraciones incluyen el tiempo y, en particular, el coste
implicado en la producción de la cantidad deseada de material de la
calidad requerida. Estas últimas consideraciones son particularmente
importantes en la producción de anticuerpos terapéuticos de la
calidad requerida para la aprobación reglamentaria y en las
cantidades necesarias para el tratamiento de un gran número de
pacientes.
El sistema más ampliamente utilizado para la
producción de proteínas recombinantes se basa en la expresión en
Escherichia coli (E. coli). Un problema específico
encontrado con la utilización de E. coli es la dificultad de
producir material de la calidad requerida en cantidades necesarias
para la terapia. En particular, el tiempo y los costes implicados
pueden ser prohibitivos. Un problema específico a destacar es la
pérdida incurrida en el rendimiento de anticuerpos durante la
extracción de los anticuerpos de E. coli. Un método que
estudia parcialmente este último problema y que permite la
producción de anticuerpo aceptable para uso terapéutico se describe
en el documento US 5.665.866. Este método implica la utilización del
tratamiento térmico para facilitar el aislamiento posterior de
fragmentos Fab funcionales de anticuerpos a partir de anticuerpos
no funcionales,realizándose el tratamiento térmico en cualquier
momento durante la fermentación o el cultivo, o en cualquier etapa
durante la extracción y purificación de los anticuerpos. A elevadas
temperaturas superiores a la temperatura ambiente, los anticuerpos
funcionales son extraordinariamente estables, mientras que muchas
otras proteínas incluyendo las proteínas de la célula hospedadora y
especies exentas de cadenas ligera y pesada y fragmentos no
funcionales de anticuerpo, forman precipitados y/o aglomerados que
se separan fácilmente del anticuerpo funcional durante los
procedimientos de purificación primaria tales como filtración o
centrifugación o cromatografía en lecho fluidizado. Aunque,
proporcionalmente, los costes de purificación son una fracción del
coste total de un producto de anticuerpo terapéutico, la proporción
del coste de purificación aumentará más a medida que los costes de
producción aguas arriba sean más económicos. Así, las mejoras en la
recuperación y purificación de anticuerpos conducirán a costes de
producción más hacia abajo con independencia de los medios de
producción (Humphreys & Glover, Curr. Opin. Drug Discovery
& Development, 2001,4:172-185). Por
consiguiente, hay necesidad de métodos que introduzcan ahorros de
tiempo y/o de costes en la producción de anticuerpos terapéuticos
y, en particular, en la purificación, por ejemplo aumentando la
recuperación de productos y/o mejorando la calidad de la corriente
del producto.
Bajo rendimiento en el producto por fermentación
o cultivo es con frecuencia un problema específico observado en la
etapa de extracción primaria; la expresión de anticuerpos es alta
dentro de las células pero un alto porcentaje de recuperación en la
etapa de extracción primaria es extraordinariamente difícil de
conseguir. El documento US 5.665.866 describe el aumento de
rendimientos de la purificación inicial por inclusión de una etapa
de tratamiento térmico que ayuda al proceso de purificación
eliminando el anticuerpo no funcional.
El documento WO 2005019466 (publicado después de
la fecha de prioridad de esta solicitud) describe un aumento en el
rendimiento de proteínas recombinantes por la inclusión de una etapa
de interrupción después de la fermentación pero antes del
tratamiento aguas abajo.
El documento US 5.380.826 se refiere a la
destrucción de células microbianas y a la extracción de componentes
extracelulares sometiendo las células a tratamiento con un
disolvente a una presión crítica y manteniendo una temperatura
crítica en el intervalo 0 a 100ºC, seguida de un repentino alivio de
la presión produciendo de este modo una caída de presión, que
permite la recogida de algunas proteínas o ácidos nucleicos
liberados.
Esta invención descrita en la presente memoria
se basa en la sorprendente e inesperada observación de que el
tratamiento no lisante en combinación con el tratamiento térmico,
produce un aumento en el rendimiento del anticuerpo funcional en la
etapa de extracción primaria de hasta 50%; es decir, el rendimiento
del anticuerpo funcional aumenta por encima del tratamiento térmico
solo. Esto permite ahorros enormemente beneficiosos en tiempo y
costes de producción de cantidades de anticuerpos funcionales de
calidad terapéutica.
Por consiguiente, se proporciona un método para
la preparación de moléculas de anticuerpos recombinantes que
comprende cultivar una muestra de célula hospedadora transformada
con un vector de expresión que codifica una molécula de anticuerpo
recombinante y someter dicha muestra de célula hospedadora a una
etapa de tratamiento térmico, caracterizada porque dicha muestra se
somete a una etapa de tratamiento no lisante a presión antes de
someterse a un aumento de temperatura dentro del intervalo de 30ºC a
70ºC durante un periodo de hasta 24 horas.
\newpage
En un ejemplo preferido, la molécula de
anticuerpo recombinante es parte al menos de una cadena ligera de
anticuerpos y es parte al menos de una cadena pesada de anticuerpos
de modo que al menos alguna de las moléculas de anticuerpo de la
cadena ligera y pesada expresadas son capaces de combinarse para
formar un anticuerpo funcional.
La invención también proporciona un método para
aumentar el rendimiento de moléculas de anticuerpos funcionales
aisladas de una muestra que comprende moléculas de anticuerpos
funcionales y moléculas de anticuerpos no funcionales, cuyo método
comprende someter la muestra a un aumento de temperatura dentro del
intervalo de 30ºC a 70ºC durante un periodo de hasta 24 horas, en
el que la muestra se somete a una etapa de tratamiento no lisante
antes de someterse al aumento de temperatura. Utilizando los
métodos de la invención se consigue, por consiguiente, un aumento
de rendimiento de los anticuerpos funcionales aislados u
obtenidos.
En particular, el método permite un aumento en
los rendimientos en el anticuerpo funcional aislado en un intervalo
de temperaturas y condiciones de tratamiento, que pueden variarse
según se requiera, y son comprendidos por un experto en la materia,
al tener en cuenta las características particulares del anticuerpo
funcional producido y el sistema de expresión que se utiliza.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"anticuerpo funcional" comprende las moléculas de anticuerpo
que conservan la capacidad de reconocer o unirse específicamente al
antígeno contra el que fueron producidos (antígeno afín). La
producción de un anticuerpo funcional se demuestra por la presencia
de una sola banda en SDS-PAGE no reductora
correspondiente al peso molecular esperado del anticuerpo, o por
ensayo de enlace directo utilizando BIACore u otros métodos
conocidos por el experto en la materia, por ejemplo pero sin
limitarse a, ELISA. Los anticuerpos no funcionales comprenden
fragmentos que no reconocen su antígeno afín, e incluyen anticuerpos
incorrectamente plegados o incorrectamente ensamblados, cadenas
pesadas y ligeras libres, y fragmentos de los mismos, incluyendo
fragmentos parcialmente degradados de anticuerpos que no reconocen
ni se unen a su antígeno afín.
En los métodos de la invención una muestra puede
ser el producto de una fermentación (o cultivo), por ejemplo pero
sin limitación, una fermentación que comprende bacterias,
especialmente bacterias gram-negativas, o levadura,
un cultivo celular, por ejemplo pero sin limitación, un cultivo
celular de mamífero o insecto. Aún más preferentemente, la muestra
es el producto de una fermentación que comprende E. coli que
expresa un anticuerpo recombinante, en el que dichos anticuerpos
pueden ser anticuerpos funcionales y no funcionales. Si se desea,
las células hospedadoras pueden someterse a recolección en el medio
de fermentación, p. ej. pueden recogerse células hospedadoras de la
muestra por centrifugación, filtración o por concentración. En
particular, los métodos de la invención son adecuados para la
preparación a gran escala industrial de anticuerpos de calidad
terapéutica.
Una ventaja más de utilizar tratamiento no
lisante en los métodos de la invención además del sorprendente
aumento en el rendimiento del anticuerpo funcional conseguido, es la
facilidad de manipulación de la muestra a gran escala. La lisis
produce un aumento de viscosidad que puede producir problemas en el
tratamiento aguas abajo y purificación del anticuerpo funcional. En
particular, la lisis de las células hospedadoras produce la
liberación de proteínas de la célula hospedadora que hacen la
purificación más costosa y que exige más tiempo a medida que pueden
ser necesarias más etapas de purificación y/o se necesiten mayores
cantidades de materiales de cromatografía para conseguir la pureza
requerida. La liberación sustancial de ADN de la célula hospedadora
aumenta la viscosidad de la muestra produciendo dificultades de
filtración y centrifugación que es la causa principal de la pérdida
de proteínas durante la clarificación. Una muestra lisada (es decir,
que contiene proteínas y ADN de células hospedadoras) pueden
también producir el bloqueo de materiales cromatográficos.
En la invención descrita en la presente memoria,
el tratamiento no lisante comprende cualquier tratamiento que no
produce lisis de una proporción sustancial de las bacterias, células
de mamífero, levaduras, células de insecto o de otro organismo
utilizado para la expresión del anticuerpo recombinante, p. ej.
E. coli. En una realización aún más preferida, el
tratamiento no lisante comprende el tratamiento a presión.
Alternativamente, el tratamiento no lisante comprende una etapa de
de agitación o mezclado con preacondicionamiento. Una "proporción
sustancial" incluye una proporción del 80% o más de los
organismos en una fermentación o cultivo presente en forma intacta,
más preferiblemente más del 85%, aún más preferiblemente más del
90%, y aún más preferiblemente 95% o más que está intacta.
La lisis puede considerarse de cualquier manera
conocida en la técnica, incluyendo: la visión al microscopio,
análisis por selección de células activadas por fluorescencia (FACS)
y análisis de proteínas totales frente a proteínas en el
sobrenadante y/o en un sedimento organismos (células). En una
realización, la lisis puede interpretarse después del tratamiento
no lisante comparando la proteína total en una muestra antes y
después del tratamiento. Si un tratamiento está produciendo lisis,
la proteína total presente en el sobrenadante de la muestra tratada
aumentaría en comparación con la proteína total presente en dicha
muestra sin tratar, por ejemplo determinada utilizando un análisis
de Bradford. En una realización preferida, se realiza el análisis
FACS en el que la muestra se marca con un colorante fluorescente
seguido de tratamiento no lisante y análisis FACS. Aún más
preferentemente, el análisis FACS se realiza antes del tratamiento
proporcionando un valor de referencia para comparación.
Así, el tratamiento no lisante puede incluir
preacondicionamiento mediante resuspensión suave durante un periodo
de tiempo, por ejemplo mediante agitación o mezclado, o mediante
resuspensión manual como por ejemplo pipeteando, en, p. ej.
un tampón. En una realización, el preacondicionamiento se realiza
durante entre 1 hora y 24 horas, preferiblemente entre 1 hora y 20
horas, más preferiblemente entre 2 horas y 18 horas, 4 horas y 16
horas, 6 horas y 16 horas y aún más preferentemente durante 12, 14 o
16 horas. Así, el tiempo mínimo para el preacondicionamiento es de
1, 2 o 4 horas y el máximo es de 16, 18 o 24 horas. El
preacondicionamiento puede realizarse por rotación de 50 a 250 rpm,
preferiblemente de 60 rpm a 100 rpm y aún más preferiblemente
durante 14 o 16 horas. Durante el preacondicionamiento las células
se mantienen a una temperatura dentro del intervalo de 4ºC a 30ºC,
más preferiblemente entre 4ºC y 20ºC y aún más preferiblemente a
temperatura ambiente.
En una realización preferida, el tratamiento no
lisante comprende el someter las células hospedadoras a presiones
aumentadas, por ejemplo utilizando una cafetera francesa o
descompresión de nitrógeno. En un ejemplo específico, la muestra es
el producto de una fermentación de E. coli, expresando dicha
E. coli un anticuerpo recombinante, que se somete a
tratamiento a presión en una cafetera francesa. Las presiones pueden
oscilar desde 51,7 bar (750 psi) más o menos hasta 344,5 bar (5000
psi) más o menos. En un realización, el tratamiento a presión se
realiza a 68,9 bar (1000 psi), o 86,1 bar (1250 psi), 103,3 bar
(1500 psi), 120,6 bar (1750 psi), 137,8 bar (2000 psi), 155,0 (2250
psi), 172,2 bar (2500 psi), 189,5 bar (2750 psi), 206,6 bar (3000
psi), 223,9 bar (3250 psi), 241,2 bar (3500 psi), 275,6 bar (4000
psi), 292,8 bar (4250 psi), 310,0 bar (4500 psi) o 327,3 bar (4750
psi). Más preferiblemente, el tratamiento a presión se realiza entre
68,9 bar (1000 psi) y 206,6 bar (3000 psi) y aún más
preferiblemente a 137,8 bar (2000 psi). El tratamiento a presión que
es sustancialmente no lisante (es decir que produce menos del 20%
de lisis) puede determinarse por simple experimentación dependiendo
del tampón, del tipo de células que comprende la muestra y de la
presión.
Así, se proporciona un método para la
preparación de moléculas de anticuerpos recombinantes que comprende
cultivar una muestra de célula hospedadora transformada con un
vector de expresión que codifica una molécula de anticuerpo
recombinante y someter dicha muestra a tratamiento a presión, según
la presente invención. Además, se proporciona un método para
aumentar el rendimiento de moléculas de anticuerpos funcionales
aisladas de una muestra, comprendiendo dicha muestra moléculas
solubles, de anticuerpos funcionales, y moléculas de anticuerpos no
funcionales, cuyo método comprende someter la muestra a un aumento
de temperatura dentro del intervalo de 30ºC a 70ºC durante un
periodo de hasta 24 horas, en el que la muestra se somete a una
etapa de tratamiento no lisante que comprende someter la muestra a
presiones aumentadas antes de someterla a un aumento de
temperatura.
Además se proporciona un método según la
presente invención para la preparación de moléculas de anticuerpos
recombinantes que comprende cultivar una muestra de célula
hospedadora transformada con un vector de expresión que codifica
una molécula de anticuerpo recombinante y someter dicha muestra a
tratamiento de preacondicionamiento con agitación. La invención
proporciona además un método para aumentar el rendimiento de
moléculas de anticuerpos funcionales aisladas de una muestra,
comprendiendo dicha muestra moléculas solubles, de anticuerpos
funcionales, y moléculas de anticuerpos no funcionales, cuyo método
comprende someter la muestra a un aumento de temperatura dentro del
intervalo de 30ºC a 70ºC durante un periodo de hasta 24 horas,
caracterizado dicho método porque la muestra se somete a una etapa
de tratamiento no lisante que comprende preacondicionar la muestra
antes de someter la muestra a un aumento de temperatura.
Preferiblemente, el tratamiento no lisante comprende
preacondicionamiento por agitación durante 14 o 16 horas.
Preferiblemente, las células hospedadoras se
recogen de una fermentación o cultivo, p. ej. por centrifugación, y
se ponen en suspensión en una solución tamponada utilizando sales
tamponadas tal como, pero no limitadas a, Tris, acetato o fosfato.
El pH de la solución puede estar, por ejemplo, entre pH 2 y pH 10 y
estará aún más preferiblemente entre pH 6 y pH 8. En una
realización, el pH es 6,8 o dentro del intervalo de 0,1 unidad de
pH 6,8. Un tampón aún más preferido es el tampón Tris, pH 7,4 que
puede opcionalmente comprender además EDTA, por ejemplo pero sin
limitación, Tris, 100 mM, pH 7,4 que contiene EDTA 10 mM. Las
células hospedadoras se ponen en suspensión preferiblemente en el
último tampón antes de someterse a una etapa de tratamiento no
lisante. El tratamiento no lisante puede realizarse en el caldo de
cultivo o medio de cultivo como para la fermentación dependiendo
del anticuerpo que se está purificando, por ejemplo
preacondicionamiento en caldo de cultivo. Por lo tanto, en un
ejemplo, el aumento de rendimiento por preacondicionamiento en caldo
de cultivo varía dependiendo del anticuerpo que es expresado por la
célula hospedadora. El experto puede determinar experimentalmente
si el preacondicionamiento en el caldo de cultivo es adecuado para
cualquier anticuerpo específico. Aún más preferiblemente, el
tratamiento no lisante se realiza en un tampón como se describió
anteriormente.
En una realización aún más preferida, los
métodos de la invención se realizan utilizando una muestra de
fermentación de E. coli que expresa un anticuerpo
recombinante. La muestra comprende tampón Tris/EDTA entre pH 6 y pH
8, preferiblemente pH 7,4, más preferiblemente a pH 6,8, y se somete
a tratamiento a presión en una cafetera francesa a 137,8 bar (2000
psi).
Aún más preferiblemente, las etapas de
tratamiento térmico se realizan dentro del intervalo de 30ºC a 70ºC.
La temperatura puede seleccionarse como se desee y puede depender
de la estabilidad del anticuerpo para purificación. En otra
realización, la temperatura está dentro del intervalo 40ºC a 65ºC, o
preferiblemente dentro del intervalo 40ºC a 60ºC, más
preferiblemente dentro del intervalo 45ºC a 60ºC, aún más
preferiblemente dentro del intervalo 50ºC a 60ºC y aún más
preferiblemente de 55ºC a 60ºC. Así, las temperaturas mínimas son
30ºC, 35ºC o 40ºC y las temperaturas máximas 60ºC, 65ºC o 70ºC. La
duración del tratamiento térmico es preferiblemente de entre 1 y 24
horas, más preferiblemente de entre 4 y 18 horas, aún más
preferiblemente de entre 6 y 16 horas y aún más preferiblemente
entre 10 y 14 horas, por ejemplo 12 horas. Así, el tiempo mínimo
para el tratamiento térmico es de 1, 2 o 3 horas y el máximo es de
20, 22 o 24 horas.
\newpage
En una realización específica, el tratamiento
térmico se realiza de 50ºC a 60ºC durante 12 a 16 horas, y más
preferiblemente a 50ºC durante 14 horas. Un experto en la materia
entenderá que las temperaturas y el tiempo pueden seleccionarse
como conviene a la muestra en cuestión y a las características del
anticuerpo que se produce.
La preparación del anticuerpo puede comprender
además procedimientos de purificación primaria tales como filtración
y/o centrifugación. Además se incluye cromatografía en lecho
fluidizado. Los procedimientos de purificación aguas abajo
preferidos incluyen cromatografía de intercambio iónico,
microfiltración, ultrafiltración, diafiltración y captura en lecho
fijo, captura en lecho expandido y combinaciones de cualquiera de
éstas.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"anticuerpos" incluyen fragmentos funcionalmente activos,
derivados o análogos y puede ser, pero no se limitan a, anticuerpos
policlonales, monoclonales, bi-, tri- o tetravalentes, anticuerpos
humanizados o híbridos, anticuerpos monocatenarios, tales como los
fragmentos Fv monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos Fab' y
Fab'_{2}, anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-Id) y fragmentos de unión al epítopo de
cualquiera de los anteriores. Estos anticuerpos y sus fragmentos
pueden ser naturales, humanizados, híbridos o anticuerpos
injertados a CDR y pueden utilizarse técnicas convencionales de
biología molecular para modificar, añadir o eliminar aminoácidos o
dominios según se desee. Los anticuerpos humanizados son moléculas
de anticuerpo procedentes de una especie no humana que tienen una o
más regiones determinantes de la complementariedad (RDC)
procedentes de una especie no humana, y una región marco procedente
de una molécula de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, el
documento US 5.585.089). Las moléculas de anticuerpo purificadas que
utilizan los métodos de la invención pueden ser de cualquier clase
(por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase de molécula de
inmunoglobulina.
Los métodos para crear estas moléculas de
anticuerpo son bien conocidos en la técnica (véanse por ejemplo,
Shrader et al., documento WO 92/02551; Ward et al.,
1989, Nature, 341:544; Orlandi et al., 1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833; Riechmann et al., 1988,
Nature, 322:323; Bird et al., 1988, Science,
242:423; Queen et al., documento US 5.585.089; Adair,
documento WO 91/09967; Mountain y Adair, 1992, Biotechnol.
Genet. Eng. Rev., 10:1-142; Verma et al.,
1998, Journal of Immunological Methods,
216:165-181).
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales por
cualquier método conocido en la técnica, tal como la técnica de
hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature,
256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de
hibridoma de linfocito B humano (Kozbor et al., 1983,
Immunology Today, 4:72), y la técnica de
hibridoma-EBV (Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, págs. 77-96, Alan R.
Liss, Inc., 1985).
Los anticuerpos híbridos son aquellos
anticuerpos codificados por genes de inmunoglobulina que se han
modificado genéticamente de forma que los genes de la cadena ligera
y pesada están compuestos de segmentos de genes de inmunoglobulina
que pertenecen a diferentes especies. Es probable que estos
anticuerpos híbridos sean menos antigénicos. Pueden prepararse
anticuerpos bivalentes por los métodos conocidos en la técnica
(Milstein et al., 1983, Nature,
305:537-539; documento WO 93/08829; Traunecker et
al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659). Los
anticuerpos Bi-, tri- y tetra-valentes pueden
comprender múltiples especificidades o pueden ser monoespecíficos
(véase, por ejemplo, el documento WO 92/22853).
Pueden generarse también secuencias de
anticuerpos utilizando métodos de anticuerpos de linfocitos
individuales basados en la clonación molecular y en la expresión de
ADNc de la región variable de inmunoglobulinas generada a partir de
linfocitos individuales que se seleccionaron para la producción de
anticuerpos específicos, tales como los descritos por Babcook, J.
et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93(15):7843-7848, y en el documento WO
92/02551. Estos últimos métodos se basan en el aislamiento de
células productoras de anticuerpos individuales que a continuación
se expanden de manera clonal seguido de la detección sistemática de
estos clones que están produciendo un anticuerpo que reconoce su
antígeno afín, y, si se desea, la posterior identificación de la
secuencia de sus genes variables en la cadena pesada (V_{H}) y
ligera (V_{L}). Alternativamente, las células productoras de
anticuerpos que reconocen su antígeno afín pueden cultivarse
conjuntamente seguido de la detección sistemática.
Los anticuerpos preparados utilizando los
métodos de la invención son los anticuerpos más preferiblemente
humanizados que pueden estar unidos a toxinas, fármacos, compuestos
citotóxicos o polímeros u otros compuestos que prolongan la vida
media del anticuerpo cuando se administran a un paciente.
Los métodos para la expresión de proteínas
recombinantes son bien conocidos en la técnica. Ejemplos apropiados
de células hospedadoras para la expresión de moléculas de
anticuerpos recombinantes incluyen bacterias tales como las
bacterias gram positivas o gram negativas, p. ej. E. coli, o
células de levadura, p. ej. S. cerevisiae, o células de
mamífero, p. ej. células de CHO y estirpes celulares de
mieloma o hibridoma, p. ej. células de NSO. Aún más
preferiblemente, en los métodos de la invención, se produce un
anticuerpo recombinante en las bacterias, p. ej. en E.
coli (véase Venna et al., 1988, J. Immunol.
Methods 216:165-i 81; Simmons et al.,
2002, J. Immunol. Methods 263:133-147).
Las células hospedadoras de E. coli
pueden ser cepas naturales de E. coli o cepas mutadas capaces
de producir proteínas recombinantes. Ejemplos de cepas de E.
coli hospedadoras específicas incluyen MC4100, TG1, TG2, DHB4,
DH5\alpha, DH1, BL21, K12, XL1 Blue y JM109. Los ejemplos incluyen
también cepas modificadas de E. coli, por ejemplo mutantes
metabólicos y cepas carentes en proteasa. Un hospedador de E.
coli preferido es E. coli W3110 (ATCC 27,325) cepa
hospedadora utilizada generalmente para fermentaciones de proteínas
recombinantes. El anticuerpo recombinante producido utilizando los
métodos de la presente invención se expresa por lo general en el
periplasma de la célula hospedadora de E. coli o en el
sobrenadante del cultivo de células hospedadoras, dependiendo de la
naturaleza de la proteína y de la escala de producción. Los métodos
para dirigir las proteínas a estos compartimentos son bien conocidos
en la técnica, para un estudio véase Makrides, Microbiological
Reviews, 1996, 60, 512-538. Ejemplos de
secuencias señal adecuadas para dirigir proteínas al periplasma de
E. coli incluyen las secuencias señal PhoA, OmpA, OmpT, LamB
y OmpF de E. coli. Las proteínas se pueden dirigir al
sobrenadante contando con las rutas secretoras naturales o mediante
la inducción de la fuga limitada de la membrana externa para
producir ejemplos de secreción de proteínas entre los que están la
utilización del pelB principal, la proteína A principal, la
coexpresión de la proteína de liberación de bacteriocina, la
proteína de liberación de bacteriocina inducida por mitomicina
junto con la adición de glicina al medio de cultivo y la coexpresión
del gen kil para la permeabilización de la membrana. Aún más
preferiblemente, en los métodos de la invención, la proteína
recombinante se expresa en el periplasma del hospedador E.
coli.
La expresión de la proteína recombinante en las
células hospedadoras E. coli puede estar también bajo el
control de un sistema inducible, mediante el cual la expresión del
anticuerpo recombinante en E. coli está bajo el control de
un activador inducible. En la técnica son muy conocidos muchos
activadores inducibles adecuados para su utilización en E.
coli y dependiendo del activador, la expresión de la proteína
recombinante puede ser inducida por varios factores tal como la
temperatura o la concentración de una sustancia específica en el
medio de cultivo (Baneyx, Current Opinion in Biotechnology,
1999, 10:411-421; Goldstein y Doi, 1995,
Biotechnol. Annu. Rev., 105-128). Ejemplos de
activadores inducibles comprenden los activadores lac, tac y
trc de E. coli que son inducibles con lactosa o el
análogo de lactosa no hidrolizable,
isopropil-\beta-D-1-tiogalactopiranósido
(IPTG) y los activadores phoA, trp y araBAD que son
inducidos por fosfato, triptófano y L-arabinosa
respectivamente. La expresión puede inducirse, por ejemplo, por la
adición de un inductor o por una cambio en la temperatura en la que
la inducción depende de la temperatura. Cuando la inducción de la
expresión de la proteína recombinante se consigue mediante la
adición de un inductor al cultivo, el inductor puede añadirse por
cualquier método apropiado dependiendo del sistema de fermentación y
del inductor, por ejemplo, por una o múltiples adiciones por
inyección o mediante una adición gradual de inductor con un
alimento. Se valorará que pueda haber un retraso entre la adición
del inductor y la inducción real de la expresión proteica, por
ejemplo, cuando el inductor es la lactosa puede haber un retraso
antes que ocurra la inducción de la expresión proteica mientras que
se utilice cualquier fuente de carbono preexistente antes de la
lactosa.
Los cultivos (fermentaciones) de células
hospedadoras de E. coli pueden cultivarse en cualquier medio
que soporte el cultivo de E. coli y la expresión de la
proteína recombinante. El medio puede ser cualquier medio
químicamente definido, tales como los proporcionados en Pirt S. J.
(1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell
Scientific Publications, con modificaciones cuando proceda para
controlar la velocidad de crecimiento como se describe en la
presente memoria. Un ejemplo de ejemplo un medio adecuado es
"SM6E" como se describe en Humphreys et al., 2002,
Protein Expression and Purification, 26:309-320.
El cultivo de las células hospedadoras de E.
coli puede tener lugar en cualquier recipiente adecuado tal
como un matraz con agitador o un fermentador dependiendo de la
escala de producción requerida. Están disponibles varios
fermentadores a gran escala con una capacidad de más de 1.000 litres
hasta aproximadamente 100.000 litros. Preferiblemente, se utilizan
fermentadores de 1.000 a 50.000 litros, más preferiblemente de 1.000
a 10.000 o 12.000 litros. Pueden utilizarse también fermentadores a
escala más pequeña con una capacidad de entre 0,5 y 1.000
litros.
La fermentación de E. coli puede
realizarse en cualquier sistema adecuado, por ejemplo en modo
continuo, por lotes o semicontinuo (Thiry & Cingolani, 2002,
Trends in Biotechnology, 20:103-105)
dependiendo de la proteína y los rendimientos requeridos. El modo
por lotes puede utilizarse con adiciones por inyección de
nutrientes o inductores cuando se requiera. Alternativamente, puede
utilizarse un cultivo semicontinuo y las cultivos desarrollados en
modo pre-inducción por lotes a la velocidad máxima
de crecimiento específico que puede mantenerse utilizando los
nutrientes inicialmente presentes en el fermentador y uno o más
regímenes de alimentos nutrientes utilizados para controlar la
velocidad de crecimiento hasta que termina la fermentación. Puede
utilizarse también pre-inducción en modo
semicontinuo para controlar el metabolismo de las células
hospedadoras de E. coli y para permitir que se alcancen
mayores densidades celulares (Lee, 1996, Tibtech,
14:98-105).
Las características preferidas de cada
realización de la invención son como para cada una de las demás
realizaciones mutatis mutandis. Todas las publicaciones,
incluyendo, pero sin estar limitadas a, las patentes y solicitudes
de patente citadas en esta memoria se incorporan en la presente
memoria por referencia como si cada publicación individual
estuviera específica e individualmente indicada para ser incorporada
por referencia en la presente memoria como si estuviera expuesta en
su totalidad.
La invención se describirá a continuación
haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que son meramente
ilustrativos y no deberían considerarse de ninguna manera que
limitan el alcance de la presente invención.
La Figura 1 es un histograma que muestra el
efecto del tratamiento (agitación) de preacondicionamiento sobre el
rendimiento del anticuerpo funcional A. La duración del
preacondicionamiento se muestra en horas. Las cifras encima de cada
barra indican el rendimiento del anticuerpo funcional A en mg/litro
de resuspensión clarificada.
La Figura 2 es un histograma que muestra el
efecto del tratamiento a presión sobre el rendimiento del anticuerpo
funcional A: La barra 1 es una referencia sin tratamiento a
presión; las barras 2, 3, 4 y 5 representan tratamientos a 34,5 bar
(500 psi), 68,9 bar (1000 psi), 137,8 bar (2000 psi) y 275,6 bar
(4000 psi), respectivamente.
Las Figuras 3a) y b) son histogramas que
muestran el efecto del tratamiento a presión y del
preacondicionamiento sobre el rendimiento del anticuerpo funcional
B a 60ºC (Panel 3a) y 30ºC (Panel 3b): En cada caso la barra 1 es
una referencia sin tratamiento no lisante; las barras 2, 3 y 4
representan tratamientos a 68,9 bar (1000 psi), 137,8 bar (2000
psi), y 275,6 bar (4000 psi), respectivamente. Las barras 5 y 6
representan 24 horas de tratamiento de preacondicionamiento en
Tris/EDTA a temperatura ambiente (barra 5) o 4ºC (barra 6). Las
cifras encima de cada barra indican el rendimiento del anticuerpo
funcional B en mg/litro de resuspensión clarificada. Todos los
experimentos se realizaron por duplicado.
Las Figuras 4a) y b) son histogramas con panel
a) que muestra el efecto del tratamiento a presión sobre el
rendimiento del anticuerpo funcional C después de la extracción a
60ºC expresada en gramos de Fab' por litro y panel b) que muestra
la proteína total presente en el extracto clarificado después del
tratamiento térmico. En el panel a), las cifras encima de cada
barra indican el rendimiento del anticuerpo funcional A en g/litro
de resuspensión clarificada.
La Figura 5 es un histograma que muestra el
efecto del tratamiento a presión sobre la lisis celular utilizando
el análisis FACS de E. coli en presencia de yoduro de
propidio.
(a) El anticuerpo A (un Fab') se expresó en
células W3110 de E. coli utilizando el vector pTT0D con ADN
que codifica el anticuerpo A insertado. La fermentación (en DD53) se
realizó a 25ºC hasta que la D.O._{600} fue 111,6 y estaba lista
para la recolección. Se centrifugaron alícuotas de 50 ml del cultivo
de la recolección a temperatura ambiente y los sedimentos celulares
se volvieron a poner en suspensión en 5ml de sobrenadante de
cultivo más 29 ml de H_{2}O y 5 ml de Tris 1 M, pH 7,4 que
contenía EDTA 100 mM. Los sedimentos celulares resuspendidos se
sometieron a agitación de preacondicionamiento a 60 rpm durante los
tiempos indicados en la Figura 1. Después del preacondicionamiento
los sedimentos celulares resuspendidos se sometieron a tratamiento
térmico a 50ºC con agitación a 170 rpm durante 14 horas. Después del
tratamiento térmico, los sedimentos celulares resuspendidos se
clarificaron por centrifugación a 4200 rpm en una centrifugadora
Beckman J.6 durante 30 min. a 4ºC. En el sobrenadante que contenía
funcional anticuerpo A se analizó el Fab' utilizando el análisis
HPLC de la proteína G en tampón fosfato 20 mM. El anticuerpo A se
eluyó utilizando un gradiente de pH desde pH 7,4 en inyección,
reduciendo hasta pH 2,5. Los rendimientos en anticuerpo funcional se
calcularon por comparación con una concentración patrón de
Fab'.
Puede observarse un aumento en el rendimiento
del anticuerpo funcional en cualquier momento de la agitación de
preacondicionamiento en comparación con falta de agitación de
preacondicionamiento (Figura 1). Se consiguió un aumento en el
rendimiento del anticuerpo funcional A de alrededor del 30% en
cualquier punto de tiempo mediante la utilización de este
tratamiento no lisante.
(b) El anticuerpo B (un Fab') se expresó en
células W3110 de E. coli utilizando el vector pTT0D con ADN
que codifica el anticuerpo B insertado como se describió
anteriormente. Se centrifugaron alícuotas de 50 ml de cultivo
recogido a temperatura ambiente y los sedimentos celulares se
volvieron a poner en suspensión en 5 ml de sobrenadante de cultivo
más 29 ml de H_{2}O y 5 ml de Tris 1 M, pH 7,4 que contenía EDTA
100 mM antes de someterse a preacondicionamiento por agitación a 60
rpm a temperatura ambiente o 4ºC durante 24 horas (véanse las
Figuras 3a y b). El tratamiento térmico y la clarificación se
realizaron como se describió anteriormente pero a las temperaturas
indicadas en la leyenda de las Figuras 3a y 3b.
Puede observarse un aumento en el rendimiento en
anticuerpo funcional a temperatura ambiente y a 4ºC para estas
resuspensiones en Tris/EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
(a) El anticuerpo A se expresó en E. coli
como se describe en el Ejemplo 1. Se prepararon sedimentos celulares
resuspendidos en sobrenadante de cultivo, H_{2}O y Tris/EDTA,
como en el Ejemplo 1, antes de ser sometidos a tratamiento a
presión a varias presiones utilizando una cafetera francesa. Se
realizó el tratamiento térmico y se calcularon los rendimientos en
anticuerpo funcional como se describe en el Ejemplo 1.
Puede observarse un aumento en el rendimiento en
anticuerpo funcional a todas las presiones excepto a 34,5 bar (500
psi) en comparación con falta de presión (Figure 2). Se consiguió un
aumento en el rendimiento del anticuerpo funcional A mediante la
utilización de este tratamiento no lisante, particularmente a 68,9
bar (1000 psi) y 137,8 bar (2000 psi). A 275,6 bar (4000 psi) era
evidente alguna lisis celular pero ésta no era sustancial (es
decir, menos del 20%).
(b) El anticuerpo B (un Fab') se expresó en
células W3110 de E. coli utilizando el vector pTT0D con ADN
que codifica el anticuerpo B insertado. Se realizó la fermentación y
se prepararon sedimentos celulares resuspendidos en sobrenadante de
cultivo, H_{2}O y Tris/EDTA, según se describe en el Ejemplo 1
antes de someterse a tratamiento a presión a varias presiones
utilizando una cafetera francesa. El tratamiento térmico se realizó
a (i) 30ºC (Figura 3a) o (ii) 60ºC (Figura 3b) con agitación a 170
rpm durante 14 horas. Después del tratamiento térmico, la
resuspensión celular se clarificó por centrifugación y se calcularon
los rendimientos en anticuerpo funcional según se describe en el
Ejemplo 1.
Se consiguió un aumento en el rendimiento de
anticuerpo funcional B mediante la utilización de este tratamiento
no lisante, particularmente a t 68,9 bar (1000 psi) y 137,8 (2000
psi) pero no a 34,5 bar (500 psi) (Figuras 3a y 3b). A 275,6 bar
(4000 psi) era evidente alguna lisis celular pero ésta no era
sustancial.
(c) El anticuerpo C (un Fab') se expresó en
células W3110 de E. coli utilizando el vector pTT0D con ADN
que codifica el anticuerpo C insertado. Se realizó la fermentación y
se prepararon sedimentos celulares resuspendidos en sobrenadante de
cultivo, H_{2}O y Tris/EDTA, según se describe en el Ejemplo 1
antes de someterse a tratamiento a presión a varias presiones
utilizando una cafetera francesa. El tratamiento térmico se realizó
a 60ºC (Figura 4) con agitación a 170 rpm durante 14 horas. Después
del tratamiento térmico, la resuspensión celular se clarificó por
centrifugación y se calcularon los rendimientos en anticuerpo
funcional según se describe en el Ejemplo 1.
Un aumento en el rendimiento de anticuerpo
funcional puede observarse a presiones suaves de entre 68,9 bar
(1000 psi) y 275,6 bar (4000 psi) en comparación con la falta de
presión (Figura 4a) mientras que puede observarse un aumento muy
pequeño en proteína total (Fab' más cualquiera de las proteínas de
la célula hospedadora), medida por el análisis de Bradford, (Figura
4b). Este resultado se confirma por análisis
SDS-PAGE del extracto clarificado (no mostrado).
Estos resultados indican que no se produjo lisis sustancial de
células hospedadoras a presiones comprendidas entre 68,9 bar (1000
psi) y 275,6 bar (4000 psi). De este modo, se consiguió un aumento
en el rendimiento del anticuerpo funcional C después de tratamiento
térmico a 60ºC mediante la utilización de este tratamiento no
lisante.
(d) El anticuerpo D (un Fab') se expresó en
células W3110 de E. coli utilizando el vector pTT0D con ADN
que codifica el anticuerpo D insertado. Se realizó la fermentación y
se recogió por centrifugación. La suspensión celular resuspendida
se preparó en tampón de extracción (Tris 100 mM/EDTA 10 mM, pH 7,4)
hasta el volumen original y se sometió a tratamiento a presión a
varias presiones mediante un homogeneizador MG (de un solo paso).
El tratamiento térmico se realizó a 60ºC con agitación a 170 rpm
durante 14 horas. Después del tratamiento térmico, la resuspensión
celular se clarificó por centrifugación y se calcularon los
rendimientos en anticuerpo funcional según se describe en el
Ejemplo 1.
Un aumento en el rendimiento de anticuerpo
funcional puede observarse a presiones suaves comprendidas entre
68,9 bar (1000 psi) y 275,6 bar (4000 psi) en comparación con la
falta de presión (Figura a) mientras que puede observarse (Tabla 1)
un aumento muy pequeño en proteína total (Fab' más cualquiera de las
proteínas de la célula hospedadora), medida por el análisis de
Bradford.
El anticuerpo A (un Fab') se expresó en células
W3110 de E. coli utilizando el vector pTT0D con ADN que
codifica el anticuerpo A insertado. La suspensión celular se volvió
a poner en suspensión en tampón de extracción tris/EDTA hasta
volumen original, según se describe en el Ejemplo 1, y se pasó a
través de un homogeneizador MG (de un solo paso) a varias presiones
(véase la Figura 5). Las corrientes alimenticias procedentes del
homogeneizador se recogieron y se diluyeron hasta una D.O._{600}
de 0,2 en solución salina tamponada con fosfato. Se añadieron (2
\mul) de yoduro de propidio (200 \mug/ml), un colorante
fluorescente, a cada muestra (500 \mul). El yoduro de propidio se
une al ADN pero no puede atravesar una membrana citoplásmica
intacta. Se evaluó cada reacción utilizando un Becton Dickinson
FACSCalibur para determinar las células lisadas y sin lisar. El
cultivo recogido y las referencias 0 psi se incluyeron e indican
las células intactas totales antes del tratamiento a presión. Los
datos mostrados en la Figura 5 indican que el tratamiento a presión
hasta e incluyendo 275,6 bar (4000 psi) no produce lisis celular en
comparación con el cultivo recogido y la referencia 0 psi. En
cambio, el aumento de la presión a 551,2 bar (8000 psi) produce un
aumento de absorción de yoduro de propidio y, por tanto, alguna
lisis celular.
Claims (7)
1. Un método para la preparación de moléculas de
anticuerpos recombinantes que comprende cultivar una muestra de
célula hospedadora transformada con un vector de expresión que
codifica una molécula de anticuerpo recombinante y someter dicha
muestra de célula hospedadora a una etapa de tratamiento térmico,
caracterizada porque dicha muestra se somete a una etapa de
tratamiento no lisante a presión antes de someterse a un aumento de
temperatura dentro del intervalo de 30ºC a 70ºC durante un periodo
de hasta 24 horas.
2. El método según la reivindicación 1 en el que
el anticuerpo está humanizado, es híbrido o injertado con CDR.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en
el que el anticuerpo es un fragmento Fv, Fab, Fab',
F(ab')_{2} monocatenario o un fragmento de unión al
epítopo de éste.
4. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el tratamiento a
presión se realiza entre 51,7 bar (750 psi) y 344,7 bar (5000
psi).
5. El método según la reivindicación 4, en el
que el tratamiento a presión se realiza entre 68,9 bar (1000 psi) y
275,8 bar (4000 psi).
6. El método según la reivindicación 5, en el
que el tratamiento a presión se realiza a 137,9 bar (2000 psi).
7. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que además comprende al menos una etapa
de purificación, realizándose dicha etapa de purificación después
de la etapa de tratamiento térmico.
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