ES2965032T3

ES2965032T3 - Fabricación de proteínas

Info

Publication number: ES2965032T3
Application number: ES15813441T
Authority: ES
Inventors: Philip Bassett; Richard Davies; Elena Gonzalez; Mark Pearce-Higgins
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2024-04-10
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: US20170362272A1; JP2018505693A; DK3237432T3; CO2017006156A2; AU2015371346B2; EP4253548A2; BR112017013394B1; BR112017013394A2; EP4253548A3; MX2017007684A; SI3237432T1; IL252696B; PL3237432T3; LT3237432T; KR102533455B1; CL2017001632A1; WO2016102383A1; PT3237432T; CA2969889A1; MY180732A

Abstract

La presente invención proporciona un método novedoso para la fabricación de proteínas en el que la proteína se expresa en una célula huésped y, de manera más específica, se refiere a un método para fabricar una proteína que da como resultado niveles reducidos de impurezas relacionadas con el producto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Fabricación de proteínas

Campo de la invención

La presente descripción se refiere, en general, a un método para fabricar una proteína expresada en una célula huésped; de una manera más específica, la descripción se refiere a un método para fabricar una proteína que da como resultado una proteína con niveles reducidos de impurezas relacionadas con el producto. En particular, la invención se refiere a un método para fabricar un anticuerpo recombinante expresado en una célula huésped procariótica, en donde la extracción del anticuerpo se realiza en condiciones de agotamiento del oxígeno.

Antecedentes de la invención

En el campo de la terapéutica el uso de proteínas y anticuerpos y, en particular, de moléculas derivadas de anticuerpos, ha ido ganando presencia e importancia constantemente y, en consecuencia, se ha desarrollado paralelamente la necesidad de procesos de fabricación controlados. La comercialización de proteínas terapéuticas requiere que se produzcan en grandes cantidades. Para este fin, la proteína se expresa frecuentemente en una célula huésped y, posteriormente, se recupera y purifica, antes de su preparación en una forma administrable.

Dependiendo de la proteína que se va a expresar, la elección de la célula huésped puede ser una célula huésped de mamífero, frecuentemente una célula CHO (ovario de hámster chino), o una célula huésped bacteriana. En el primer caso, la proteína normalmente se secreta en el sobrenadante del cultivo que se recupera y luego la disolución se procesa para la purificación de proteínas.

Cuando la célula huésped es una célula procariótica Gram negativa, un sistema de expresión frecuentemente preferido implica que la proteína recién sintetizada se acumule dentro del espacio periplásmico y se aísle del mismo. En este caso, una vez que se ha alcanzado el nivel deseado de expresión de proteínas, son las células las que se recogen y procesan. Luego, la proteína se recupera sometiendo las células recogidas a un proceso de extracción de proteínas que implica liberar la proteína del periplasma en disolución y la posterior eliminación de restos celulares y otras impurezas. Estas etapas desde la recogida de las células hasta la liberación de las proteínas generalmente se incluyen en lo que se denomina recuperación primaria. La disolución resultante que contiene proteínas se procesa luego para la purificación de proteínas. Las células procarióticas Gram negativas preferidas utilizadas para la expresión periplásmica son generalmente cepas deEscherichia colio células dePseudomonas fluorescens.

La recuperación de la proteína heteróloga expresada en la célula huésped procariótica durante la extracción primaria del espacio periplásmico ha sido a menudo un desafío. A este respecto, en la técnica anterior se han descrito diferentes métodos. Por ejemplo, el documento US 5.655.866 describe el uso de tratamiento térmico para facilitar el aislamiento posterior de fragmentos Fab' funcionales de anticuerpos. El documento WO 2006/054063 describe la inclusión de un tratamiento sin lisis en combinación con un tratamiento térmico en la etapa de extracción primaria. El documento WO 2005/019466 describe la inclusión de una etapa de interrupción después de la fermentación pero antes de la extracción. El documento US 2013/0060009 describe el ajuste del pH de las muestras antes de someterse a un tratamiento térmico durante la etapa de extracción.

Sin embargo, otro desafío importante es el alto nivel de impurezas presentes después de la extracción primaria, lo que aumenta la carga de las etapas de purificación posteriores y la eficiencia general de todo el proceso de purificación. Estas impurezas pueden estar en forma de restos celulares, proteínas de la célula huésped (HCP), ADN o impurezas relacionadas con el producto, tales como formas truncadas del producto expresado, agregados u otras formas modificadas, tales como formas desamidadas, isomerizadas, oxidadas u otras formas conjugadas. De estos, los productos de degradación de proteínas recombinantes, también denominados impurezas relacionadas con el producto, suelen ser los más difíciles de eliminar durante el proceso de extracción térmica y recuperación primaria, dado que tienen propiedades físico-químicas muy similares, tales como la temperatura de fusión (Tm), a la proteína diana.

Aunque la disolución de proteína resultante obtenida después de la extracción se procesará luego para la purificación de proteínas, el nivel de pureza de esta disolución a afecta la eficiencia general y los costos asociados a las etapas de purificación y, por lo tanto, a la producción total de proteínas terapéuticas. Este efecto se vuelve aún más evidente cuando se considera la fabricación de proteínas a gran escala. En particular, las impurezas relacionadas con el producto tienen un impacto sobre el perfil de calidad del producto final, cuyo control es particularmente relevante para la consistencia entre diferentes lotes.

Como tal, sigue existiendo una necesidad en la técnica de métodos que mejoren la eliminación de impurezas durante la extracción de proteínas del cultivo celular.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Perfiles de temperatura y potencial redox de las extracciones. Como se puede observar, mantener una capa superpuesta de nitrógeno durante la etapa de tratamiento térmico mantiene una medición de potencial redox baja en todo momento, con un mínimo de alrededor de -435 mV y normalmente -375 mV durante el mantenimiento de la temperatura a 59°C. Se observó un potencial redox igualmente bajo cuando se roció nitrógeno. Cuando el tampón que contenía las células huésped se cubrió con aire en lugar de nitrógeno, se puede observar que los valores del potencial redox fueron significativamente más altos durante la etapa de extracción térmica, volviéndose positivos (normalmente alrededor de 45 mV) durante el mantenimiento de la temperatura a 59°C. Se observó un potencial redox igualmente alto cuando se roció el aire. El rociado gaseoso se cambió a capa superpuesta a mitad de las extracciones debido a los altos niveles de formación de espuma observados.

Figura 2. Gel SDS-PE de muestras posteriores a la extracción. El carril M representa marcadores estándar de peso molecular (Mark 12, Invitrogen). El carril 1 es un patrón de referencia Fab' alfa anti-TNF. El carril 2 es un patrón de DsbC (proteína isomerasa con enlace disulfuro). El carril 3 es una muestra posterior a la extracción donde se aplicó una capa superpuesta de nitrógeno durante la extracción. El carril 4 es una muestra posterior a la extracción donde se aplicó una capa de aire durante la extracción. El carril 5 es una muestra posterior a la extracción donde se roció nitrógeno a través de la muestra durante la extracción. El carril 6 es una muestra posterior a la extracción donde se roció aire a través de la muestra durante la extracción. La figura muestra que en presencia de nitrógeno, las condiciones reductoras durante la extracción térmica son suficientes para permitir una reducción significativa en el nivel de impurezas relacionadas con el producto en comparación con las extracciones realizadas en presencia de aire.

Figura 3. Fragmentos Fab' totales expresados como % de todas las especies relacionadas con el producto, medidas mediante HPLC CEX después de la purificación de la proteína L. Se puede observar un efecto claro de tener una capa superpuesta de nitrógeno sobre la eliminación de impurezas relacionadas con el producto. La extracción n.° 8, en la que no se aplicó ninguna capa superpuesta de nitrógeno, tuvo niveles significativamente más altos de impurezas relacionadas con el producto. Por otro lado, la figura también sugiere que la tasa de superposición de nitrógeno podría tener un efecto en la eliminación de esta impureza, comparando las extracciones 1 con 2 y 7 con 8.

Figura 4. Fragmentos Fab' totales expresados como % de todas las especies relacionadas con el producto, medidas mediante HPLC CEX después de la purificación de la proteína L. Los resultados muestran nuevamente el beneficio de la presencia de nitrógeno, lo que da como resultado niveles significativamente reducidos de impurezas relacionadas con el producto que quedan después de la extracción térmica. Otro efecto beneficioso se deriva del ajuste del pH realizado antes de la extracción térmica, ya que los niveles de impurezas relacionadas con el producto parecen reducirse aún más en comparación con los ejemplos anteriores.

Figura 5. Medición del potencial Redox de punto final frente al volumen de llenado del matraz agitado. Estos resultados demuestran que los matraces de agitación que se prepararon en presencia de una capa superpuesta de nitrógeno mantuvieron un entorno más reductor en el extracto que los matraces que se prepararon en presencia de aire. La figura también muestra que los matraces con un volumen de llenado mayor fueron más reductores que aquellos con un volumen de llenado menor, probablemente debido a una tasa de oxidación más lenta del extracto debido a la menor razón entre área superficial y volumen. Todos los matraces preparados en aire tenían un valor de potencial redox de punto final positivo, sin correlación con el volumen de llenado.

Figura 6. Fragmentos Fab' totales expresados como % de todas las especies relacionadas con el producto, medidas mediante HPLC CEX después de la purificación de la proteína L. Estos resultados muestran que los matraces de agitación que se prepararon en atmósfera de nitrógeno tenían niveles significativamente más bajos de impurezas relacionadas con el producto después de la extracción. Todos los matraces preparados con nitrógeno (intervalo de potencial redox de punto final: -10 mV a -116 mV) demuestran niveles de impureza relacionados con el producto significativamente más bajos que todos los matraces preparados en aire (intervalo de potencial redox de punto final: 79 mV a 97 mV).

Figura 7. Efecto del pH y el entorno reductor sobre la Tm de fragmentos Fab' purificados. La figura muestra los resultados para la determinación de la estabilidad térmica de las dos especies principales de impurezas relacionadas con el producto. Se ha demostrado que el potencial redox y la estabilidad térmica (temperatura de fusión) están correlacionados; cuanto menor es el potencial redox, menor es la temperatura de fusión de la proteína. Se puede describir un efecto similar para el pH cuando se vuelve más neutro. Ambas variables harían que las impurezas relacionadas con el producto fueran más propensas a la degradación, facilitando así su eliminación.

Descripción detallada de la invención

La presente descripción resuelve la necesidad identificada anteriormente proporcionando un nuevo método para la fabricación de proteínas en donde la proteína se expresa en una célula huésped. En particular, la presente invención proporciona un método adecuado para la fabricación industrial.

En una primera realización, la invención proporciona un método para fabricar una proteína de interés en donde dicha proteína se expresa en una célula huésped procariótica, que comprende

• cultivar dichas células huésped en condiciones tales que expresen dicha proteína,

• recoger las células huésped del líquido de cultivo celular,

• añadir tampón a las células huésped, y

• someter las células huésped en tampón a un tratamiento térmico realizado entre 30°C y 70°C, en donde el potencial redox del tampón se mantiene por debajo de 0 mV durante dicho tratamiento térmico,

en donde dicha proteína de interés es un anticuerpo recombinante o un fragmento de anticuerpo recombinante.

En una realización particular, las células huésped son células procarióticas, tales como bacterias gramnegativas. En otra realización, las células huésped son células deE. colio células deP. fluorescens.Las células huésped procarióticas para la expresión de proteínas son bien conocidas en la técnica (Terpe, K. (2006). Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 72, 211-222.). Las células huésped según la invención incluyen células recombinantes que han sido modificadas genéticamente para producir la proteína de interés, tal como un fragmento de anticuerpo. Las células huésped deE. colirecombinantes pueden derivarse de cualquier cepa deE. coliadecuada incluidas MC4100, TG1, TG2, D<h>B4, DH5a, DH1, BL21, K12, XL1 Blue y JM109. Un ejemplo es la cepa deE. coliW3110 (ATCC 27,325) una cepa huésped comúnmente utilizada para fermentaciones de proteínas recombinantes. También se pueden producir fragmentos de anticuerpos cultivando cepas deE. colimodificadas, por ejemplo mutantes metabólicos o cepas deE. colideficientes en proteasas, como las descritas en los documentos WO 2011/086138, WO 2011/086139, WO 2011/086136 y WO 2013/007388 que se incorporan en la presente memoria en su totalidad.

Una proteína de interés que puede purificarse de acuerdo con los métodos de la presente invención se aísla normalmente del periplasma de la célula huésped deE. coli.Los métodos para dirigir proteínas a este compartimento son bien conocidos en la técnica (Makrides, SC (1996). Strategies for achieving a high level of gene expression in Escherichia coli. Microbiol Rev 60, 512-538.). Ejemplos de secuencias señal adecuadas para dirigir proteínas al periplasma deE. coliincluyen las secuencias señal deE. coliPhoA, OmpA, OmpT, LamB y OmpF.

La expresión de la proteína recombinante en las células huésped deE. colitambién pueden estar bajo el control de un sistema inducible, mediante el cual la expresión del anticuerpo recombinante enE. coliestá bajo el control de un promotor inducible. Muchos promotores inducibles adecuados para su uso enE. colison bien conocidos en la técnica y, dependiendo del promotor, la expresión de la proteína recombinante puede inducirse mediante factores variables tales como la temperatura o la concentración de una sustancia particular en el medio de crecimiento. Ejemplos de promotores inducibles incluyen los promotores deE. colilac, tac y trc que son inducibles con lactosa o el análogo de lactosa no hidrolizable, isopropil-b-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y los promotores phoA, trp y araBAD que son inducidos por fosfato, triptófano y L-arabinosa respectivamente. La expresión puede inducirse, por ejemplo, mediante la adición de un inductor o un cambio de temperatura, donde la inducción depende de la temperatura. Cuando la inducción de la expresión de proteínas recombinantes se logra mediante la adición de un inductor al cultivo, el inductor puede añadirse mediante cualquier método adecuado dependiendo del sistema de fermentación y del inductor, por ejemplo, mediante adiciones únicas o múltiples o mediante una adición gradual de inductor a través de una alimentación. Se apreciará que puede haber un retraso entre la adición del inductor y la inducción real de la expresión de proteínas, por ejemplo, cuando el inductor es lactosa, puede haber un retraso antes de que se produzca la inducción de la expresión de proteínas mientras se utiliza cualquier fuente de carbono preexistente antes que la lactosa.

Alternativamente, la proteína de interés que puede purificarse de acuerdo con los métodos de la presente invención se aísla del periplasma deP. fluorescens.Secuencias adecuadas que dirigen proteínas al compartimento periplásmico enP. fluorescensincluyen líderes de secreción de tipo sec como se han descrito en la técnica (DM Retallack, et al. Transport of heterologous proteins to the periplasmic space of Pseudomonas fluorescens using a variety of native signal sequences Biotechnol. Lett., 29 (2007), págs. 1483-1491). La expresión de la proteína de interés puede estar bajo el control de un sistema inducible, por lo que la expresión está bajo el control de un promotor inducible como se describe en el párrafo anterior. En este contexto se pueden usar inductores bien conocidos tales como IPTG; alternativamente, se han descrito inductores tales como benzoato de antranilato que inducen los promotores Pben509 y Pben278, respectivamente, en los sistemas de expresión deP. fluorescens.

Los cultivos de células huésped procarióticas (fermentaciones) se pueden cultivar en cualquier medio que admita el crecimiento de las células huésped y la expresión de la proteína recombinante. El medio puede ser cualquier medio químicamente definido, tal como, por ejemplo, el descrito paraE. colien Durany O, et al. (2004). Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia coli. Process Biochem 39, 1677-1684.

La fermentación de células huésped procarióticas se puede realizar en cualquier sistema adecuado, por ejemplo en modo continuo, discontinuo o de alimentación discontinua, dependiendo de la proteína y los rendimientos requeridos. El modo discontinuo se puede utilizar con adiciones de nutrientes o inductores cuando sea necesario. Alternativamente, se puede usar un cultivo discontinuo alimentado y los cultivos se cultivan en modo de preinducción por lotes a la tasa de crecimiento específica máxima que se puede sostener usando los nutrientes inicialmente presentes en el fermentador y uno o más regímenes de alimentación de nutrientes usados para controlar la velocidad de crecimiento hasta que se complete la fermentación. El modo de alimentación discontinua también se puede utilizar antes de la inducción para controlar el metabolismo de las células huésped procarióticas y permitir que se alcancen densidades celulares más altas.

A continuación, las células huésped se recogen del medio de fermentación, p. ej., las células huésped se recogen de la muestra mediante centrifugación, filtración o concentración.

En una realización del método según la presente invención, la etapa de recogida de células comprende una etapa de centrifugación y recuperación de células. En una realización particular preferida de la invención, dicha etapa de centrifugación es una centrifugación continua, de la cual se recupera una suspensión celular.

Para procesos de cultivo de células huésped procarióticas (p. ej.,E. coli)en donde la proteína de interés, tal como un fragmento de anticuerpo, se encuentra en el espacio periplásmico de la célula huésped y se requiere que libere la proteína de la célula huésped. La liberación se puede lograr mediante cualquier método adecuado o combinación de métodos tales como lisis celular mediante tratamiento mecánico o por presión, tratamiento de congelacióndescongelación, choque osmótico, agentes de extracción y/o tratamiento térmico. Dichos métodos de extracción para la liberación de proteínas son bien conocidos en la técnica. En el método de la presente invención, la extracción de proteínas se logra mediante una etapa de tratamiento térmico, es decir, manteniendo la muestra a una temperatura elevada durante un período definido.

Según el método de la presente invención, se añade tampón a las células recogidas del fluido de cultivo celular antes de la etapa de tratamiento térmico. En una realización particular del método de la invención, dicho tampón es Tris 100 mM y EDTA 10 mM a pH 7,4, en una realización adicional dicho tampón de extracción es Tris 75 mM y EDTA 7,5 mM a pH 7,4, Tris 200 mM y 20 mM. EDTA a pH 7,4, o Tris 300 mM y EDTA 30 mM a pH 7,4. En una realización de la invención, el tampón tiene un pH que garantiza que el pH de la muestra sea de 6 a 9, por ejemplo de 6 a 8, antes de la etapa de tratamiento térmico como se describe en el documento WO 2012/013930 que se incorpora en la presente memoria en su totalidad. Preferiblemente dicho pH es de 6,5 a 8, pH de 6,8 a 7,8 o pH de 7 a 7,6.

El experto conocerá otros tampones adecuados descritos en la técnica para su uso en la extracción de proteínas.

En otra realización alternativa, el potencial redox de dicho tampón se mantiene por debajo de -100 mV, -200 mV, por debajo de -300 mV o por debajo de -400 mV.

El potencial redox del medio ambiente es particularmente crítico para la dinámica de los enlaces disulfuro entre los grupos tiol en los residuos de cisteína presentes en las moléculas de proteínas. Cuando se reducen, dichos enlaces disulfuro se rompen liberando los correspondientes grupos tiol (-SH). Las moléculas de anticuerpo tienen varios enlaces disulfuro, que son fundamentales para mantener su estructura y, por tanto, su actividad biológica. Algunos de estos enlaces disulfuro son más accesibles que otros a las especies reductoras y/u oxidantes presentes en el medio ambiente dada su posición dentro de la molécula y, en consecuencia, más susceptibles a su alteración.

En el contexto de la presente invención, las impurezas relacionadas con el producto son de hecho fragmentos de la proteína de interés y, por tanto, de estructura más pequeña y simple. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, los enlaces de cisteína dentro de dichas impurezas relacionadas con el producto son más accesibles y, por lo tanto, más susceptibles a la alteración como consecuencia del potencial redox del medio ambiente.

En una segunda realización del método de la invención dicho tratamiento térmico se realiza en un recipiente y dicho potencial redox se mantiene reduciendo la cantidad de oxígeno (O<2>) presente en fase gaseosa en el recipiente durante el tratamiento térmico.

Generalmente hay un volumen de aire en el recipiente (denominado en la presente memoria fase gaseosa) encima de la muestra compuesta de tampón y células huésped. En el sentido de la presente invención, reducir la cantidad de oxígeno en la fase gaseosa significa alterar la composición de dicha fase gaseosa de manera que contenga menos oxígeno que el aire. Como se sabe en la técnica, el aire normalmente contiene aproximadamente un 21% de oxígeno (volumen).

Para mantener el potencial redox por debajo de 0 mV según el método de la invención, un experto en la técnica conocería diferentes medios disponibles para evitar la oxidación de la muestra de extracción. Esto se puede lograr eliminando el oxígeno y otros gases oxidantes presentes en la fase gaseosa del recipiente, normalmente mediante desplazamiento con otro gas inerte. Dicho desplazamiento podrá conseguirse mediante una capa superpuesta de nitrógeno (N<2>), es decir, manteniendo la muestra en el recipiente en contacto a N<2>que contiene la fase gaseosa, o rociando, es decir, burbujeando o haciendo pasar, el gas inerte a través de la muestra hacia el recipiente. Otros gases inertes que pueden usarse para mantener un potencial redox según el método de la invención incluyen argón y helio.

Alternativamente, existe una variedad de agentes reductores disponibles en la técnica, que tienen distintos grados de resistencia. En consecuencia, un experto elegiría el agente reductor más apropiado dependiendo del potencial redox deseado y del tiempo durante el cual debería mantenerse. Los agentes reductores conocidos en la técnica incluyen, aunque sin que ello pretenda ser limitante, glutatión, mercaptoetanol, ditiotreitol o tris(2-carboxietil)fosfina.

El cultivo de las células huéspedprocarióticaspuede tener lugar en cualquier recipiente adecuado, tal como un matraz de agitación o un fermentador, dependiendo de la escala de producción requerida. Hay disponibles varios fermentadores a gran escala con una capacidad de más de 1.000 litros hasta aproximadamente 100.000 litros. Preferiblemente, se usan fermentadores de 1.000 a 50.000 litros, más preferiblemente de 1.000 a 25.000 o de 1.000 a 20.000, de 1.000 a 15.000, de 1.000 a 10.000, de 1.000 a 5.000, 20.000, 15.000, 12.000 10.000, 5000 o 2000 litros. También se pueden utilizar termentadores de menor escala con una capacidad de entre 0,5 y 1.000 litros.

En una realización preterida, dicha tase gaseosa contiene menos del 20%, 15%, 12%, 10%, 8%, 5%, 2% o 1% de oxígeno (volumen) durante la etapa de tratamiento térmico.

En una realización preterida, dicho oxígeno se excluye esencialmente de la tase gaseosa durante la etapa de tratamiento térmico.

En una tercera realización del método de la invención, se añade nitrógeno (N<2>) a la tase gaseosa del recipiente. En una cuarta realización del método de la invención dicha tase gaseosa contiene al menos 80% de N<2>, al menos 85%, al menos 90% de N<2>, al menos 95% de N<2>o al menos 97% o 99% de N<2>. En una realización alternativa adicional, dicha tase gaseosa es esencialmente N<2>.

Normalmente, dicho N<2>se añade a la tase gaseosa del recipiente como una capa superpuesta y se mantiene en el espacio de cabeza del recipiente que contiene el tampón y las células huésped añadiendo 100% de N<2>gas al espacio de cabeza con de 0,1 a 1 vvm (volumen de gas por volumen de líquido por minuto, es decir, 1 l/min para un volumen de extracción de 1 l).

En una realización particular, la presente invención se retiere a un método para tabricar una proteína de interés en donde dicha proteína se expresa en una célula huésped procariótica, que comprende

• recoger las células huésped del líquido de cultivo celular,

• añadir tampón a las células huésped, y

• someter las células huésped en tampón a un tratamiento térmico realizado entre 30°C y 70°C en un recipiente en donde la tase gaseosa del recipiente es esencialmente N<2>.

Dependiendo de la contiguración del recipiente, dicho N<2>se puede añadir a la tase gaseosa del recipiente, en donde el recipiente se sella posteriormente, es decir, aislando el interior del recipiente del exterior, dejando el N<2>en tase gaseosa durante el tratamiento térmico. Alternativamente, un tlujo constante de N<2>se aplica a través de la tase gaseosa del recipiente durante la etapa de tratamiento térmico, p.ej. para recipientes que no permiten la posibilidad de sellar el interior del entorno exterior.

En una realización el N<2>se añade o se introduce en la tase gaseosa antes de la etapa de tratamiento térmico para garantizar que el potencial redox se mantenga por debajo del valor deseado durante la etapa de tratamiento térmico. En una realización particular, el método de la invención comprende:

• cultivar dichas células huésped procarióticas en condiciones tales que expresen la proteína de interés, • recoger las células huésped del líquido de cultivo celular,

• añadir tampón a las células huésped en un recipiente,

• añadir N<2>a la tase gaseosa del recipiente,

• sellar dicho recipiente; y

• someter las células huésped en el tampón a un tratamiento térmico realizado entre 30°C y 70°C en el recipiente en donde el potencial redox de dicho tampón se mantiene por debajo de 0 mV durante dicho tratamiento térmico.

Por lo tanto, en una realización adicional del método de la invención, dicho N<2>se introduce como una capa superpuesta usando al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% o 100% de N<2>. En una realización alternativa de la invención, dicho N<2>se introduce rociando N<2>a través del tampón durante el tratamiento térmico, preteriblemente rociando N<2>esencialmente puro.

En una quinta realización de la invención, dicho N<2>se añade al recipiente como una capa superpuesta en la tase gaseosa del recipiente o rociando el N<2>a través del tampón.

El método según la invención comprende una etapa de tratamiento térmico que permite obtener una muestra de proteína soluble, correctamente plegada y ensamblada, como por ejemplo un tragmento de anticuerpo, tacilitando la eliminación de otro material relacionado con la proteína.

La proteína que está "correctamente plegada y ensamblada" se muestra por la presencia de una única banda correspondiente al peso molecular esperado para la cadena proteica ensamblada en SDS-PE no reductora. Otro material relacionado con proteínas normalmente serán fragmentos parcialmente degradados de proteínas correctamente plegadas y ensambladas.

La etapa de tratamiento térmico en el método de la presente invención es una etapa de mantener la temperatura de la muestra a una temperatura elevada deseada una vez que se ha alcanzado esta temperatura elevada deseada durante una fase de calentamiento.

La etapa de tratamiento térmico se realiza sometiendo la muestra a una temperatura elevada deseada. Más preferiblemente, la etapa de tratamiento térmico se realiza dentro del intervalo de 30°C a 70°C. La temperatura se puede seleccionar según se desee y puede depender de la estabilidad de la proteína para la purificación. En otra realización, la temperatura está dentro del intervalo de 40°C a 65°C, o preferiblemente dentro del intervalo de 40°C a 60°C, más preferiblemente dentro del intervalo de 45°C a 60°C, incluso más preferiblemente dentro del intervalo de 50°C a 60°C y lo más preferiblemente de 55°C a 60°C, de 58°C a 60°C o 59°C. Así, las temperaturas mínimas son 30°C, 35°C o 40°C y las máximas 60°C, 65°C o 70°C.

En una sexta realización del método de la invención, dicha etapa de tratamiento térmico se realiza entre 30°C y 70°C.

En una séptima realización del método de la invención, dicha etapa de tratamiento térmico se realiza entre 55°C y 65°C.

La etapa de tratamiento térmico se lleva a cabo preferiblemente durante un período de tiempo prolongado. La duración del tratamiento térmico es preferiblemente entre 1 y 24 horas, o entre 1 y 18 horas, más preferiblemente entre 4 y 18 horas, incluso más preferiblemente entre 6 y 16 horas, y lo más preferiblemente entre 8 y 14 horas o entre 8 y 12. horas, por ejemplo 10 horas. Así, el tiempo mínimo de tratamiento térmico es de 1,2 o 3 horas y el máximo de 20, 22 o 24 horas.

En una octava realización del método de la invención, la etapa de tratamiento térmico de la sexta o séptima realización se mantiene durante 1 hora a 18 horas.

Como sabe un experto en la técnica, generalmente existe una razón inversamente proporcional entre los tiempos de reacción y las temperaturas, por lo que cuanto mayor es la temperatura a la que se realiza una reacción, más corto es el tiempo necesario para que tenga lugar la reacción.

En una realización particular, el tratamiento térmico se realiza de 50°C a 60°C durante 10 a 16 horas, y más preferiblemente a 59°C durante 10 a 12 horas. Un experto en la técnica entenderá que las temperaturas y el tiempo se pueden seleccionar según convenga a la muestra en cuestión y a las características de la proteína de interés, como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

En una realización alternativa adicional del método de la invención, dicha extracción de proteínas se realiza a una temperatura de 58°C a 60°C durante un período de 8 a 12 horas.

La etapa de tratamiento térmico se lleva a cabo preferentemente con agitación de la muestra tal como en un agitador o agitador configurado para funcionar a una velocidad de agitación adecuada, tal como 200 vueltas por minuto (RPM). Sin embargo, la velocidad de agitación adecuada variará dependiendo de la escala del método.

En una novena realización del método de la invención, la muestra tiene o se ajusta a un pH de 6 a 9 antes de la etapa de tratamiento térmico. En una realización particular adicional del método de la invención, el pH de dicha muestra es de 6,5 a 8, de 6,5 a 7,5 o de 6,8 a 7,2 antes de la etapa de tratamiento térmico.

En una realización particular, el pH de la muestra se mide o ajusta antes de la etapa de tratamiento térmico, para garantizar que el pH de la muestra durante la etapa de tratamiento térmico sea de 5 a 9, preferiblemente el pH de la muestra durante la etapa de tratamiento térmico sea 6 a 7.

En una realización adicional, el pH se ajusta con una base tal como una base inorgánica, por ejemplo hidróxido de sodio, o una base orgánica tal como trietilamina o trimetilamina o base tris.

Puede usarse cualquier agente adecuado para ajustar el pH de la muestra. El agente puede ser el tampón o puede añadirse antes y/o después del tampón. Los agentes típicos que se pueden usar para ajustar el pH comprenden o consisten en uno o más de los siguientes: NaOH, NH<4>OH, ácido sulfúrico, EDTA, tampón Tris.

En una realización particular adicional, el pH de la muestra se mide o ajusta antes de la etapa de tratamiento térmico y antes de la adición de un gas inerte tal como nitrógeno a la fase gaseosa del recipiente para mantener el potencial redox por debajo de 0 mV. Alternativamente, en otra realización de la invención, el pH de la muestra se mide y/o ajusta antes de la etapa de tratamiento térmico y el gas inerte tal como nitrógeno se hace pasar a través de la muestra durante la etapa de tratamiento térmico.

Las mediciones de pH a las que se hace referencia en este documento generalmente están normalizadas a 20°C.

En el contexto de la presente invención "antes de la etapa de tratamiento térmico" significa antes e incluyendo el momento en el que la muestra alcanza la temperatura elevada deseada y comienza la etapa de tratamiento térmico (mantenimiento a una temperatura elevada). Para alcanzar la temperatura elevada deseada para la etapa de tratamiento térmico, la muestra se somete a una "fase de calentamiento" durante la cual la temperatura de la muestra se eleva hasta la temperatura deseada. En una realización, el método según la invención comprende someter la muestra a una fase de calentamiento y una etapa de tratamiento térmico. En la realización en la que el método comprende someter la muestra a una fase de calentamiento y una etapa de tratamiento térmico, la muestra puede estar al nivel de pH requerido antes del inicio de la fase de calentamiento y/o al nivel de pH requerido durante la fase de calentamiento.

En una realización particular, se añade N<2>a la fase gaseosa del recipiente antes del inicio de la fase de calentamiento. Preferiblemente, la muestra está al nivel de pH requerido antes de dicha fase de calentamiento.

En una décima realización del método de la invención, la proteína de interés es una proteína recombinante codificada en un vector de expresión.

En una undécima realización, el método según la octava realización de la invención, la proteína es un anticuerpo recombinante.

En una duodécima realización, dicho anticuerpo recombinante es un fragmento de anticuerpo recombinante. Hay muchos fragmentos de anticuerpos recombinantes conocidos en la técnica, incluidos Fab, Fab', F(ab')<2>y fragmentos Fv y scFv. Alternativamente, el anticuerpo recombinante se selecciona de diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos o multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos o anticuerpos, que incluyen, aunque sin que ello pretenda ser limitante, construcciones Fab-Fv.

En una decimotercera realización del método de la invención, dicho anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo recombinante se une específicamente a TNF-alfa o a CD154.

En una realización, la presente invención proporciona un método para la fabricación de un anticuerpo recombinante en el que dicho anticuerpo recombinante se expresa en una célula huésped procariótica, que comprende cultivar dichas células huésped en condiciones tales que expresen dicha proteína, recoger las células huésped de la célula fluido de cultivo, añadir tampón a las células huésped y someter las células huésped a tratamiento térmico para extraer el anticuerpo recombinante de dichas células huésped en un recipiente en el que el potencial redox de dicho tampón se mantiene por debajo de 0 mV, por debajo de -100 mV, por debajo de - 200 mV, por debajo de -300 mV o por debajo de -400 mV, durante dicha extracción.

En otra realización particular, la presente invención proporciona un método para la fabricación de un anticuerpo recombinante en el que dicho anticuerpo recombinante se expresa en una célula huésped procariótica, que comprende cultivar dichas células huésped en condiciones tales que expresen dicha proteína, recoger las células huésped del líquido de cultivo celular, añadir tampón a las células huésped en un recipiente, añadir N<2>a la fase gaseosa del recipiente, someter las células huésped a un tratamiento térmico, y recuperar dicha proteína.

En otra realización particular, el método de la invención proporciona un método para la fabricación de un anticuerpo recombinante en el que dicho anticuerpo recombinante se expresa en una célula huésped procariótica, que comprende cultivar dichas células huésped en condiciones tales que expresen dicha proteína, recoger las células huésped del líquido de cultivo celular, añadir tampón a las células huésped en un recipiente, añadir N<2>a la fase gaseosa del recipiente, someter las células huésped a un tratamiento térmico, y recuperar dicha proteína; en donde dicha proteína recuperada tiene un nivel más bajo de impurezas relacionadas con el producto en comparación con la proteína recuperada de un método de fabricación que comprende un tratamiento térmico realizado sin la presencia de N<2>en la fase gaseosa del recipiente.

El método según la presente invención puede comprender una o más etapas adicionales, tales como procedimientos de purificación tales como filtración y/o centrifugación. También se incluye cromatografía en lecho fluidizado. Los procedimientos de purificación adicionales preferidos incluyen cromatografía de intercambio iónico, microfiltración, ultrafiltración, diafiltración y captura en lecho fijo y captura en lecho expandido y combinaciones de cualquiera de estos.

El término "anticuerpo" o "anticuerpos" como se usa en la presente memoria se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales. El término "anticuerpo" o "anticuerpos" como se usa en la presente memoria incluye, aunque sin que ello pretenda ser limitante, anticuerpos recombinantes que se generan mediante tecnologías recombinantes como se conoce en la técnica. El "anticuerpo" o "anticuerpos" incluyen anticuerpos de cualquier especie, en particular de especies de mamíferos; tal como anticuerpos humanos de cualquier isotipo, incluidos IgA<1>, IgA<2>, IgD, IgG<1>, IgG<2>a, IgG<2>b, IgG3, IgG4 IgE e IgM y sus variantes modificadas, anticuerpos de primates no humanos, p. ej., del chimpancé, babuino, mono rhesus o mono cynomolgus; anticuerpos de roedores, p. ej., de ratón, rata o conejo; anticuerpos de cabra o caballo; y anticuerpos de camélidos (p. ej., de camellos o llamas tales como Nanobodies™) y derivados de los mismos; o de especies de aves como anticuerpos de pollo o de especies de peces como anticuerpos de tiburón. El término "anticuerpo" o "anticuerpos" también se refiere a anticuerpos "quiméricos" en los que una primera parte de al menos una secuencia de anticuerpo de cadena pesada y/o ligera es de una primera especie y una segunda parte de la cadena pesada y/o ligera es de una primera especie. La secuencia del anticuerpo es de una segunda especie. Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del Viejo Mundo, tal como babuino, rhesus o mono cynomolgus) y secuencias de región constante humana. Los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia derivada de anticuerpos no humanos. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable [o región determinante de la complementariedad (CDR)] de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo, pollo o primate no humano, que tenga la especificidad, afinidad y actividad deseadas. En la mayoría de los casos, residuos del anticuerpo humano (receptor) fuera de la CDR; es decir, en la región marco (FR), se reemplazan adicionalmente por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento de los anticuerpos. La humanización reduce la inmunogenicidad de los anticuerpos no humanos en humanos, facilitando así la aplicación de anticuerpos al tratamiento de enfermedades humanas. Los anticuerpos humanizados y varias tecnologías diferentes para generarlos son bien conocidos en la técnica. El término "anticuerpo" o "anticuerpos" también se refiere a anticuerpos humanos, que pueden generarse como alternativa a la humanización. Por ejemplo, es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de anticuerpos murinos endógenos. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos.

La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos con especificidad contra un antígeno particular tras la inmunización del animal transgénico que porta los genes de inmunoglobulina de línea germinal humana con dicho antígeno. Se conocen en la técnica tecnologías para producir dichos animales transgénicos y tecnologías para aislar y producir anticuerpos humanos a partir de dichos animales transgénicos. Alternativamente, en el animal transgénico; p. ej. ratón, sólo los genes de inmunoglobulina que codifican las regiones variables del anticuerpo de ratón se reemplazan con las correspondientes secuencias de genes de inmunoglobulina variable humana. Los genes de inmunoglobulina de la línea germinal de ratón que codifican las regiones constantes del anticuerpo permanecen sin cambios. De esta manera, el anticuerpo efector funciona en el sistema inmunológico del ratón transgénico y, en consecuencia, el desarrollo de las células B permanece esencialmente sin cambios, lo que puede conducir a una respuesta de anticuerpos mejorada tras el desafío antigénicoin vivo.Una vez que los genes que codifican un anticuerpo particular de interés se han aislado de dichos animales transgénicos, los genes que codifican las regiones constantes se pueden reemplazar con genes de regiones constantes humanas para obtener un anticuerpo completamente humano. Otros métodos para obtener anticuerpos/fragmentos de anticuerpos humanosin vitrose basan en tecnologías de presentación tales como presentación en fagos o tecnología de presentación en ribosomas, en las que se utilizan bibliotecas de ADN recombinante que se generan al menos en parte artificialmente o a partir de repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina de los donantes. Las tecnologías de presentación en fagos y ribosomas para generar anticuerpos humanos son bien conocidas en la técnica. También se pueden generar anticuerpos humanos a partir de células B humanas aisladas que se inmunizanex vivocon un antígeno de interés y posteriormente se fusionan para generar hibridomas que luego pueden seleccionarse para detectar el anticuerpo humano óptimo. El término "anticuerpo" o "anticuerpos", como se usa en la presente memoria, también se refiere a un anticuerpo aglicosilado.

En determinadas realizaciones de esta invención, los anticuerpos son anticuerpos que se modifican mediante unión covalente de restos funcionales tales como polímeros solubles en agua, tales como poli(etilenglicol), copolímeros de poli(etilenglicol) y poli(propilenglicol), carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, poli(vinilpirrolidona) o poli(prolina), todos los cuales se sabe que presentan vidas medias en la sangre sustancialmente más largas después de la inyección intravenosa que las correspondientes proteínas no modificadas.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos unidos a restos funcionales tales como restos de poli(etilenglicol) (PEG). En una realización particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG pueden unirse a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional de aminoácido terminal ubicado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo. Tales aminoácidos pueden ocurrir naturalmente en el fragmento de anticuerpo o pueden diseñarse en el fragmento usando métodos de ADN recombinante (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.219.996; US 5.667.425; WO 98/25971).

El término "anticuerpo" o "anticuerpos", tal como se utiliza en la presente memoria, no sólo se refiere a anticuerpos no truncados de cualquier especie, incluidos los humanos (por ejemplo, IgG) y otras especies de mamíferos, sino que también se refiere a un fragmento de anticuerpo. Un fragmento de un anticuerpo comprende al menos un dominio de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera como se conoce en la técnica y se une a uno o más antígenos. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos según la invención incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv y scFv; así como diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio (dAbs), tales como fragmentos sdAbs, VhH y V<nar>, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos o multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos o anticuerpos, incluyendo, aunque sin que ello pretenda ser limitante, construcciones Fab-Fv o Fab-Fv-Fv. Los fragmentos de anticuerpos como se han definido anteriormente son conocidos en la técnica.

El término "potencial redox" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la medida de la tendencia de una especie química a adquirir electrones y, por tanto, reducirse. El potencial redox se mide en voltios (V) o milivoltios (mV). Cada especie tiene su propio potencial de reducción intrínseco; cuanto más positivo es el potencial, mayor es la afinidad de la especie por los electrones y su tendencia a reducirse.

El término "extracción" o "extracción de proteínas" como se usa en la presente memoria se refiere a eliminar de la célula huésped la proteína expresada dentro de una célula huésped. La extracción puede implicar la alteración de la célula huésped y el aislamiento del líquido intracelular de los restos celulares, o la manipulación del huésped para hacer que la membrana celular externa de bacterias gramnegativas u otras células que tienen una membrana celular externa tenga fugas para liberar el líquido del espacio periplásmico de dichas células.

Ejemplos

Métodos

Proceso de fermentación A

Se utilizaronE. colicomo células huésped W3110 transfectadas con un vector para expresar una unión de Fab' específicamente al TNF-alfa humano.

Se usó un vial de banco de células congelado que contenía estas células para inocular un matraz agitado (700 ml de volumen total) que contenía medio de peptona-extracto de levadura 6x (6xP-Y) más tetraciclina. Este matraz agitado se incubó a 30°C y 230 rpm. En el intervalo de DO requerido (OD600 = 2-3), el matraz de agitación se usó para inocular un fermentador de semillas (volumen total de 10 l) que contenía medio SM6 químicamente definido (Popplewell et al. Expression of Antibody Fragments by Periplasmic Secretion in Escherichia coli; Methods in Molecular Biology, vol.

308: Therapeutic Proteins: Methods and Protocols; 2005) más tetraciclina, con glicerol como fuente de carbono. El cultivo celular dentro del fermentador de semillas se mantuvo a 30°C, la concentración de oxígeno disuelto (pO<2>) se mantuvo al 30% y el pH se controló a 7,0.

En el intervalo de DO requerido (OD600 = 30-37), el cultivo de siembra se usó para inocular el fermentador de producción (600 l de volumen total) que contenía medios químicamente definidos con glicerol como fuente de carbono. El fermentador de producción se mantuvo inicialmente a 30°C, 30% pO<2>y el pH se controló a 7,0 y las células se cultivaron en fase discontinua hasta la inducción. Durante la fase discontinua, la temperatura se redujo a 25°C y se realizó una adición de MgSO4 para evitar el agotamiento de este metabolito.

En un intervalo de DO específico (OD600 = 43-47), durante el cual se produce el agotamiento del glicerol, se realizó una adición en bolo de disolución de lactosa al cultivo. Las células utilizarían entonces la lactosa como principal fuente de carbono y también actuarían como inductor de la expresión de Fab’. La concentración de lactosa se mantuvo durante la fase de inducción mediante una alimentación continua y las células se recogieron 30 horas después de la inducción.

Proceso de fermentación B

Se usó un vial de banco de células congelado que contenía células huésped MXE012 deE. coliFab' que expresaban una unión de Fab' específicamente al TNF-alfa humano para inocular un matraz agitado (700 ml de volumen total) que contenía 6x medio de peptona-extracto de levadura (6xP-Y) más tetraciclina. Este matraz agitado se incubó a 30°C y 230 rpm. En el intervalo de DO requerido (OD600 = 2-3), el matraz de agitación se usó para inocular un fermentador de semillas (volumen total de 10 l) que contenía medio MD químicamente definido (Durany et al. 2004. Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia coli. Process Biochem 39:1677-1684 más tetraciclina, con glicerol como fuente de carbono. El cultivo celular dentro del fermentador de semillas se mantuvo a 30°C, la concentración de oxígeno disuelto (pO<2>) se mantuvo al 30% y el pH se controló a 6,9.

En el intervalo de DO requerido (OD600 = 30-37), el cultivo de siembra se usó para inocular el fermentador de producción (600 l de volumen total) que contenía medios químicamente definidos con glicerol como fuente de carbono. El fermentador de producción se mantuvo inicialmente a 30°C, 30% pO<2>, con pH controlado a pH 6,9 y cultivado en fase discontinua hasta que se agotó el glicerol. Durante este tiempo se realizó una adición de MgSO4 para evitar el agotamiento de este metabolito.

Al final de la fase discontinua, se encendió una alimentación exponencial de glicerol y se alimentó el cultivo con una cantidad específica de glicerol para lograr una DO600 de aproximadamente 70 unidades. En este punto, la alimentación de glicerol se cambió de una alimentación exponencial a una alimentación lineal y se indujo la expresión de Fab' mediante la adición de IPTG (38,79 g/kg de cultivo). Las células se recogieron 40 horas después de la inducción.

La cepa MXE012 deE. colies un mutante metabólico deE. colique contiene la mutación sprH145A en el gen spr como se describe en el documento WO 2011/086136 (incorporado en la presente memoria en su totalidad).

Métodos de recuperación y extracción

Las células se recogieron mediante centrifugación continua utilizando una centrífuga de discos Westfalia PSC 5. La suspensión celular concentrada se resuspendió nuevamente a la concentración original de recogida de células en recipientes de vidrio de 2 l o 5 l mediante la adición de agua y tampón de extracción a pH 7,4 hasta una concentración final del tampón de extracción de EDTA 10 mM, Tris 100 mM.

Cuando fue necesario, las células resuspendidas se ajustaron a pH 7,2 mediante la adición de base Tris 2,5 M al tampón de extracción, antes de la extracción de proteínas mediante una etapa térmica. Para la extracción térmica, las células se calentaron a 59°C durante 10 horas. La temperatura y la mezcla se mantuvieron utilizando unidades de control Biostat BPlus (Sartorius) y el software del Sistema de control de fermentadores múltiples (MFCSO).

Purificación de muestras

Se purificaron especies relacionadas con Fab' a partir de muestras de extracción para permitir la evaluación de impurezas relacionadas con el producto. Las muestras de extracción se clarificaron primero mediante centrifugación, recogida del sobrenadante clarificado y filtración a través de un filtro de 0,2 pm. Luego se cargó el sobrenadante clarificado en columnas de proteína L de 1 ml (Pierce #89928), se lavó con un tampón de fosfato de baja concentración a pH 7,4 y se eluyó con un tampón de glicina a pH 2,8. Se demostró que la resina Proteína L podía capturar fragmentos Fab' y que la recuperación era lineal y reproducible dentro del intervalo experimental.

Análisis de muestras

Las muestras purificadas se analizaron y cuantificaron mediante cromatografía de intercambio catiónico. Las muestras se cargaron en una columna analítica Dionex Pro Pac SCX-10 (Thermo Scientific) y se eluyeron usando un gradiente de sal. Las proteínas eluidas se controlaron a 280 nm y los picos del cromatograma se cuantificaron e interpretaron según un procedimiento convencional.

Ejemplo 1

La fermentación se llevó a cabo según el proceso B y la proteína se extrajo como se ha descrito anteriormente. El potencial redox se midió durante el proceso de extracción en los recipientes usando sondas ORP (potencial de oxidación-reducción) (Broadley James Corporation, Irvine CA) y se monitoreó usando el software MFCS® (Sartorius, Bethlehem PA).

Para evaluar el efecto de mantener un entorno redox reducido, algunos recipientes de extracción se expusieron a nitrógeno y otros al aire durante la extracción; además, el gas se roció a través de la muestra hacia los recipientes o se mantuvo como un flujo superpuesto al espacio de cabeza de los recipientes.

La Tabla 1 a continuación muestra un resumen de las condiciones de flujo de gas del recipiente. Todos los flujos de gas se mantuvieron a un caudal de 1 vvm (volumen de gas por volumen de líquido por minuto, es decir, 1 litro/min para una extracción de 1 litro) utilizando suministro de 100% de nitrógeno o aire comprimido.

Tabla 1.

Las Figuras 1 y 2 muestran los perfiles redox y de temperatura correspondientes de las extracciones (figura 1) y un gel SDS PAGE de muestras posteriores a la extracción (figura 2).

Como se puede deducir de estas figuras, mantener una capa superpuesta de nitrógeno durante la etapa de tratamiento térmico mantiene una medición de potencial redox bajo en todo momento, con un mínimo de alrededor de -435 mV y normalmente -375 mV durante el mantenimiento de la temperatura a 59°C. Se observó un potencial redox igualmente bajo cuando se roció nitrógeno. Cuando el tampón que contenía las células huésped se cubrió con aire en lugar de nitrógeno, se puede observar que los valores del potencial redox fueron significativamente más altos durante la extracción en la etapa térmica, volviéndose positivos (normalmente alrededor de 45 mV) durante el mantenimiento de la temperatura a 59°C. Se observó un potencial redox igualmente alto cuando se roció el aire. El rociado gaseoso se cambió a capa superpuesta a mitad de las extracciones debido a los altos niveles de formación de espuma observados.

La figura 2 demuestra una diferencia significativa en el nivel de impureza relacionada con el producto medido por SDS PAGE. La figura muestra que en presencia de nitrógeno, las condiciones reductoras durante la extracción térmica son suficientes para permitir una reducción significativa en el nivel de impurezas relacionadas con el producto en comparación con las extracciones realizadas en presencia de aire.

Ejemplo 2

La fermentación según el proceso A y la posterior extracción se realizaron como se ha descrito anteriormente. El caudal de nitrógeno al espacio de cabeza se varió de 0,1 vvm a 1 vvm en combinación con volúmenes variados de agitación y llenado de acuerdo con la Tabla 2.

Tabla 2

Como se puede ver en la Figura 3, se puede observar un efecto claro de tener una capa superpuesta de nitrógeno en la eliminación de impurezas relacionadas con el producto. La extracción n.° 8, en la que no se aplicó ninguna capa superpuesta de nitrógeno, tuvo niveles significativamente más altos de impurezas relacionadas con el producto. Por otro lado, la figura también sugiere que la tasa de superposición de nitrógeno podría tener un efecto sobre la eliminación de esta impureza, comparando las extracciones 1 con 2 y 7 con 8.

Ejemplo 3

La fermentación según el proceso A y la recogida de células se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente. Las células huésped resuspendidas se ajustaron a pH 7,2 mediante la adición de base Tris 2,5 M al tampón de extracción inmediatamente antes de la extracción térmica. Esta extracción térmica se realizó en presencia o ausencia de una capa superpuesta de nitrógeno. Cuando correspondía, la capa superpuesta de nitrógeno se mantuvo gasificando el espacio de cabeza del recipiente a 1 vvm usando 100% de nitrógeno.

En la Figura 4, las extracciones 1 a 3 se realizaron en presencia de una capa superpuesta de nitrógeno, mientras que las extracciones 4 a 6 se cubrieron con aire. Los resultados muestran nuevamente el beneficio de la presencia de nitrógeno, lo que da como resultado niveles significativamente reducidos de impurezas relacionadas con el producto que quedan después de la extracción térmica. Otro efecto beneficioso se deriva del ajuste del pH realizado antes de la extracción térmica, ya que los niveles de impurezas relacionadas con el producto parecen reducirse aún más en comparación con los ejemplos anteriores.

Ejemplo 4

El efecto de la extracción en condiciones reductoras también se analizó a menor escala, es decir, utilizando matraces agitados.

Se recogieron 25-100 ml de cultivo celular inducido por proteínas y se resuspendieron en matraces Erlenmeyer de 250 ml mediante la adición de agua y tampón de extracción 3x (pH 7,4) hasta una concentración final de tampón de extracción 1x (EDTA 10 mM, Tris 100 mM). Los matraces tenían un sello de tapón y estaban hechos de policarbonato para minimizar la permeabilidad del oxígeno al interior del matraz. La capa superpuesta de nitrógeno se añadió a la fase gaseosa de los matraces utilizando una bolsa de manipulación con guantes desechable (Aldrich AtmosBag, n.° de catálogo Z530220) con un flujo continuo de nitrógeno a través de la bolsa de manipulación con guantes. Los matraces se sellaron antes de sacarlos de la bolsa de manipulación con guantes y realizar la extracción térmica. También se prepararon muestras en la mesa de trabajo (con aire como capa superpuesta en la fase gaseosa de los matraces) para comparar. La extracción térmica se llevó a cabo a 60°C durante 10 h en una incubadora de matraz agitado (New Brunswick Innova42). El potencial redox se midió en cada matraz después de la extracción utilizando sondas ORP de Broadley James. La etapa de tratamiento térmico también se llevó a cabo en diferentes volúmenes de llenado de matraces para evaluar el efecto de diferentes proporciones de superficie a volumen en la extracción de proteínas. La Tabla 3 resume las condiciones experimentales ensayadas.

Tabla 3.

La figura 5 demuestra que los matraces de agitación que se prepararon en presencia de una capa superpuesta de nitrógeno mantuvieron un entorno más reductor en el extracto que los matraces que se prepararon en presencia de aire. La figura también muestra que los matraces con un volumen de llenado mayor fueron más reductores que aquellos con un volumen de llenado menor, probablemente debido a una tasa de oxidación más lenta del extracto debido a la menor razón entre área superficial y volumen. Todos los matraces preparados en aire tenían un valor de potencial redox de punto final positivo, sin correlación con el volumen de llenado.

La figura 6 muestra que los matraces de agitación que se prepararon en atmósfera de nitrógeno tenían niveles significativamente más bajos de impurezas relacionadas con el producto después de la extracción. Todos los matraces preparados con nitrógeno (intervalo de potencial redox de punto final: -10 mV a -116 mV) demuestran niveles de impureza relacionados con el producto significativamente más bajos que todos los matraces preparados en aire (intervalo de potencial redox de punto final: 79 mV a 97 mV).

Ejemplo 5

La unión de Fab' específicamente al TNF-alfa humano tiene una temperatura de fusión (Tm) más alta que las HCP (proteínas de la célula huésped), una característica que se aprovecha durante la etapa de tratamiento térmico. El calentamiento desnaturaliza una cantidad significativa de HCP e impurezas relacionadas con el producto, lo que hace que se añadan y se eliminen durante las etapas de extracción. Sin embargo, como se describe en los ejemplos anteriores, la eliminación de estas impurezas mejora enormemente cuando se aplica una capa superpuesta de nitrógeno, dado el potencial redox reducido. Se cree que el entorno reductor facilita la eliminación de las impurezas debido a la reducción del enlace intracadena en estas especies durante el calentamiento, lo que daría como resultado una disminución de la temperatura de fusión de las impurezas.

Para confirmar lo anterior, se midió la temperatura de fusión de las dos especies principales de impurezas relacionadas con el producto en condiciones reductoras y no reductoras. Estas condiciones reductoras se lograron utilizando TCEP-HCL (clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina), para imitar el entorno creado por la capa superpuesta de nitrógeno realizada durante la extracción.

Las mediciones se realizaron utilizando un ensayo Thermofluor, basado en el uso de un fluoróforo hidrófobo que se une a la proteína siempre que algunas o todas sus áreas hidrofóbicas estén expuestas. En este caso particular, el fluoróforo era SYPRO naranja (concentración de 5000X en DMSO; Life Technologies S-6650). Esto permite monitorear el proceso de desarrollo en condiciones desnaturalizantes (por ejemplo, aumento de temperatura) midiendo la fluorescencia emitida por el tinte cuando se une a la proteína, utilizando un sistema de PCR en tiempo real (7900HTfast real-time PCR system,de Life Tecnologías). Las muestras se incuban a temperaturas crecientes (de 25°C a 99°C con una retención de 30 segundos y un incremento de 0,5°C) y se registra la emisión de fluorescencia. Se trazan los datos y se determina el punto de fusión de la proteína encontrando el punto de inflexión de la pendiente.

En este caso, las dos impurezas relacionadas con el producto purificado se midieron en tampón citrato-fosfato a pH 5,0 y 7,0 y disolución salina tamponada con fosfato a pH 7,4. Se usaron dos concentraciones diferentes de TCEP-HCL para lograr un agente reductor: razón molar de proteína de 2:1 y 10:1, y se procesó una muestra sin TCEP-HCL como control.

La figura 7 muestra los resultados para la determinación de la estabilidad térmica de las dos especies principales de impurezas relacionadas con el producto. Se ha demostrado que el potencial redox y la estabilidad térmica (temperatura de fusión) están correlacionados; cuanto menor es el potencial redox, menor es la temperatura de fusión de la proteína. Se puede describir un efecto similar para el pH cuando se vuelve más neutro. Ambas variables harían que las impurezas relacionadas con el producto fueran más propensas a la degradación, facilitando así su eliminación.

Conclusiones

En general, los datos demuestran la importancia de mantener un entorno reductor (bajo potencial redox) durante la etapa de calentamiento para permitir una reducción significativa en los niveles de impurezas relacionadas con el producto durante la extracción de proteínas. Además, los datos demuestran que este entorno reductor se habilita mediante la aplicación de una capa superpuesta de nitrógeno y que cuando no hay una capa superpuesta de nitrógeno, el potencial redox del entorno es significativamente menor, lo que da como resultado niveles más altos de impurezas relacionadas con el producto.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para fabricar una proteína de interés en donde dicha proteína se expresa en una célula huésped procariótica, que comprende:

a) cultivar dichas células huésped en condiciones tales que expresen dicha proteína,

b) recoger las células huésped del fluido de cultivo celular,

c) añadir tampón a dichas células huésped, y

d) someter las células huésped a un tratamiento térmico realizado de 30°C a 70°C, en donde el potencial redox de dicho tampón se mantiene por debajo de 0 mV durante dicho tratamiento térmico, en donde dicha proteína de interés es un anticuerpo recombinante o un fragmento de anticuerpo recombinante.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde el tratamiento térmico se realiza en un recipiente y dicho potencial redox se mantiene reduciendo la cantidad de oxígeno (O<2>) presente en la fase gaseosa en el recipiente durante la extracción de proteínas.

3. Un método según la reivindicación 1 o 2, en donde el nitrógeno (N<2>) se añade a la fase gaseosa del recipiente.

4. Un método según la reivindicación 3, en donde dicha fase gaseosa contiene al menos 50% de N<2>.

5. Un método según la reivindicación 3 o 4, en donde dicho N<2>se añade al recipiente como una capa superpuesta en la fase gaseosa del recipiente o rociando el N<2>a través de la muestra.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha etapa de tratamiento térmico se realiza entre 55°C y 65°C.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha temperatura se mantiene durante 1 a 18 horas.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se mide el pH del tampón después de la adición a las células huésped y antes del tratamiento térmico.

9. Un método según la reivindicación 8, en donde el pH del tampón es o se ajusta a un pH de 6 a 9.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína es una proteína recombinante codificada en un vector de expresión.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho fragmento de anticuerpo recombinante es un Fab'.

12. Un método según cualquier reivindicación anterior, en donde dicho anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo recombinante se une específicamente a TNF-alfa o CD154.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas células huésped son células de E. coli.

14. Un método según la reivindicación 13, en donde dicha proteína de interés se expresa en el espacio periplásmico de las células de E. coli.