BR112017013394B1

BR112017013394B1 - Método para fabricar proteína de interesse

Info

Publication number: BR112017013394B1
Application number: BR112017013394-6A
Authority: BR
Inventors: Philip BASSETT; Richard Davies; Elena GONZALEZ; Mark Pearcehiggins
Original assignee: Ucb Biopharma Sprl
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2024-02-06
Also published as: CN107108692B; SG11201704836XA; KR20170093984A; HRP20231408T1; CO2017006156A2; EP4253548A2; AU2015371346B2; AU2015371346A1; BR112017013394A2; US10358460B2; EA201791424A1; JP2018505693A; IL252696B; KR102533455B1; CN107108692A; CL2017001632A1; WO2016102383A1; SI3237432T1; PT3237432T; JP6807327B2

Abstract

fabricação de proteína. a presente invenção fornece um novo método para a fabricação de proteína em que a proteína é expressada em uma célula hospedeira, e em uma maneira mais específica se refere a um método para fabricar uma proteína que resulta em níveis reduzidos de impurezas relacionadas com produto.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a um método para fabricar uma proteína expressada em uma célula hospedeira; em um maneira mais específica a invenção se refere a um método para fabricar uma proteína que resulta em uma proteína com níveis reduzidos de impurezas relacionadas com produto.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] No campo dos produtos terapêuticos o uso de proteínas e anticorpos e moléculas derivadas de anticorpo em particular foi constantemente ganhando presença e importância, e, por conseguinte, a necessidade quanto a processos de fabricação controlada tem desenvolvido em paralelo. A comercialização de proteínas terapêuticas, requer que elas sejam produzidas em quantidades grandes. Para este propósito a proteína é frequentemente expressada em uma célula hospedeira e subsequentemente é recuperada e purificada, antes da sua preparação em uma forma administrável.

[0003] Dependendo da proteína a ser expressada a escolha da célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de mamífero, frequentemente uma célula CHO (Ovário do hamster chinês), ou uma célula hospedeira bacteriana. No primeiro caso, a proteína é tipicamente secretada no sobrenadante de cultura que é recuperada, e a solução é depois processada para a purificação de proteína.

[0004] Quando a célula hospedeira é uma célula procariótica Gram negativa, um sistema de expressão frequentemente preferido envolve a proteína recém sintetizada que acumula dentro e é isolada do espaço periplásmico. Neste caso, uma vez que o nível desejado de expressão de proteína foi obtido, são as células que são colhidas e processadas. A proteína é depois recuperada por meio de submeter as células colhidas a um processo de extração de proteína que envolve a liberação da proteína do periplasmo em solução e subsequente remoção dos fragmentos celulares e outras impurezas. Estas etapas de colher a célula para a liberação da proteína são tipicamente incluídas no que é denominada recuperação primária. A solução contendo proteína resultante é depois processada para a purificação da proteína. As células procarióticas Gram negativas preferidas usadas para a expressão periplásmica são geralmente cepas de Escherichia coli ou células de Pseudomonas fluorescens.

[0005] A recuperação da proteína heteróloga expressada na célula hospedeira procariótica durante a extração primária do espaço periplásmico tem sido frequentemente um desafio. A este respeito, diferentes métodos foram descritos na técnica anterior. Por exemplo, a US 5.655.866 descreve o uso de tratamento térmico para facilitar a isolação subsequente de fragmentos Fab’ funcionais de anticorpos. A WO 2006/054063 descreve a inclusão de um tratamento que não de lise em combinação com tratamento térmico no estágio de extração primária. A WO 2005/019466 descreve a inclusão de uma etapa de interrupção depois da fermentação mas antes da extração. A US 2013/0060009 descreve o ajuste do pH de amostras antes de passarem pelo tratamento térmico durante a etapa de extração.

[0006] Entretanto, um outro desafio significante é o alto nível de impurezas presentes depois da extração primária que aumenta a carga nas etapas de purificação subsequentes e a eficiência global do processo de purificação inteiro. Estas impurezas podem estar na forma de fragmentos celulares, proteínas da célula hospedeira (HCP), DNA, ou impurezas relacionadas com o produto tais como formas truncadas do produto expresso, agregados ou outras formas modificadas tais como desamidadas, isomerizadas, oxidadas ou outras formas conjugadas. Destes, os produtos de degradação da proteína recombinante, também denominadas de impurezas relacionadas com produto, são frequentemente os mais difíceis de remover durante o processo de extração térmica e recuperação primária dado que eles têm propriedades físico-químicas muito similares, tais como temperatura de fusão (Tm), com a proteína alvo.

[0007] Embora a solução de proteína resultante obtida depois da extração será depois processada para a purificação de proteína, o nível de pureza desta solução impacta com a eficiência e custos globais associados com as etapas de purificação, e portanto aqueles da produção de proteína terapêutica total. Este efeito se torna ainda mais evidente quando da consideração da fabricação de proteína em larga escala. Em particular, as impurezas relacionadas com produto têm um impacto sobre o perfil de qualidade do produto final, o controle do qual é particularmente relevante para uniformidade através de lotes diferentes.

[0008] Como tal permanece uma necessidade na técnica quanto a métodos que melhorem a remoção de impureza durante a extração da cultura de célula.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0009] Figura 1. Potencial redox e perfis de temperatura de extrações. Como pode ser observado, manter uma cobertura de nitrogênio durante a etapa de tratamento térmico mantém um uma medição do potencial de redox baixa o tempo todo, com um mínimo em torno de -435 mV e tipicamente -375 mV durante a contensão de temperatura a 59 °C. Um potencial redox similarmente baixo foi observado quando o nitrogênio foi espargido. Quando o tampão contendo células hospedeiras foi coberto com ar no lugar do nitrogênio, pode ser observado que os valores do potencial redox foram significantemente mais altos durante a extração da etapa de aquecimento, tornando positivo (tipicamente em torno de +45 mV) durante a contensão da temperatura a 59 °C. Um potencial redox similarmente alto foi observado quando o ar foi espargido. O espargimento gasoso foi mudado para cobrir parte do caminho através das extrações devido aos altos níveis de espumação observados.

[0010] Figura 2. Gel de SDS-PAGE de amostras após a extração. A linha M representa marcadores de peso molecular padrão (Mark 12, Invitrogen). A linha 1 é um padrão de referência Fab’ anti-TNF alfa. A linha 2 é um padrão DsbC (proteína isomerase ligada a dissulfeto). A linha 3 é uma amostra após a extração onde uma cobertura de nitrogênio foi aplicada durante a extração. A linha 4 é uma amostra após a extração onde uma cobertura de ar foi aplicada durante a extração. A linha 5 é uma amostra após a extração onde nitrogênio foi espargido através da amostra durante a extração. A linha 6 é uma amostra após a extração onde ar foi espargido através da amostra durante a extração. A figura mostra que na presença de nitrogênio, as condições redutoras durante a extração térmica são suficientes para permitir redução significante no nível de impurezas relacionadas com produto quando comparadas com as extrações realizada na presença de ar.

[0011] Figura 3. Fragmentos Fab’ totais expressos como % de todas as espécies relacionadas com produto como medido pela purificação de Proteína L a seguir da CEX HPLC. Um efeito claro de se ter uma cobertura de nitrogênio sobre a depuração de impurezas relacionadas com produto pode ser observado. A Extração #8, onde nenhuma cobertura de nitrogênio foi aplicada, teve níveis significantemente mais altos de impurezas relacionadas com produto. Por outro lado, a figura também sugere que a taxa de cobertura de nitrogênio teria um efeito sobre a depuração desta impureza, comparando as extrações 1 a 2, e 7 a 8.

[0012] Figura 4. Fragmentos Fab’ totais expressos como % de todas as espécies relacionadas com o produto como medidos pela purificação de Proteína L a seguir da CEX HPLC. Os resultados mostram mais uma vez o benefício da presença de nitrogênio, resultando em níveis significantemente reduzidos de impurezas relacionadas com o produto remanescentes depois da extração térmica. Um outro efeito benéfico é derivado do ajuste do pH realizado antes da extração térmica, visto que os níveis de impurezas relacionadas com produto parecem ser reduzidos ainda mais em comparação com os exemplos anteriores.

[0013] Figura 5. Medições do potencial redox do ponto final versus volume de enchimento de frasco agitado. Estes resultados demonstram que os frascos agitados que foram preparados na presença de uma cobertura de nitrogênio manteve um mais ambiente mais redutor no extrato do que os frascos que foram preparados na presença de ar. A figura também mostra que os frascos com um volume de enchimento maior foram mais redutores do que aqueles com um volume de enchimento menor, provavelmente devido a uma taxa mais lenta de oxidação do extrato devido à razão da área de superfície para o volume menor. Os frascos preparados em ar todos tiveram um valor do potencial redox positivo no ponto final, sem nenhuma correlação com o volume de enchimento.

[0014] Figura 6. Fragmentos Fab’ totais expressos como % de todas as espécies relacionadas com o produto como medido pela CEX HPLC a seguir da purificação da Proteína L. Estes resultados mostram que os frascos agitados que foram preparados sob nitrogênio tiveram níveis significantemente mais baixos de impurezas relacionadas com a pós extração de produto. Todos os frascos preparados com nitrogênio (faixa de potencial redox de ponto final -10 mV a -116 mV) demonstram níveis de impureza relacionadas com o produto significantemente mais baixo do que todos os frascos preparados em ar (faixa de potencial redox de ponto final +79 mV a +97 mV).

[0015] Figura 7. Efeito do pH e ambiente redutor sobre a Tm de fragmentos Fab’ purificados. A figura mostra os resultados para a determinação da estabilidade térmica para as duas espécies principais de impurezas relacionadas com produto. O potencial redox e a estabilidade térmica (temperatura de fusão) são mostradas estar correlacionadas; quanto mais baixo o potencial redox mais baixa a temperatura de fusão da proteína. Um efeito similar pode ser descrito para o pH quando ele se torna mais neutro. Ambas as variáveis tornariam as impurezas relacionadas com produto mais propensas para degradação, facilitando portanto a sua depuração.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0016] A presente invenção soluciona a necessidade acima identificada pelo fornecimento de um novo método para a fabricação de proteína em que a proteína é expressada em uma célula hospedeira. Em particular, a presente invenção fornece um método adequado para a fabricação industrial.

[0017] Em uma primeira forma de realização a invenção fornece um método para fabricar uma proteína de interesse em que a dita proteína é expressada em uma célula hospedeira, compreendendo - cultivar as ditas células hospedeiras sob condições tais que elas expressem a dita proteína, - coletar as células hospedeiras do fluido de cultura de célula, - adicionar tampão às células hospedeiras, e - submeter as células hospedeiras em tampão ao tratamento térmico em que o potencial redox do tampão é mantido abaixo de 0 mV durante o dito tratamento térmico.

[0018] Em uma forma de realização particular, as células hospedeiras são células procarióticas, tais como bactérias Gram negativas. Em uma outra forma de realização, as células hospedeiras são células de E. coli ou células de P. fluorescens. As células hospedeiras procarióticas para a expressão de proteína são bem conhecidas na técnica (Terpe, K. (2006). Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 72, 211-222). As células hospedeiras de acordo com a invenção incluem células recombinantes que foram geneticamente engenheiradas para produzir a proteína de interesse tal como um fragmento de anticorpo. As células hospedeiras de E. coli recombinantes podem ser derivadas de qualquer uma das cepas de E. coli adequadas incluindo de MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue e JM109. Um exemplo é a cepa W3110 da E. coli (ATCC 27,325) uma cepa hospedeira habitualmente usada para as fermentações de proteína recombinante. Fragmentos de anticorpo também podem ser produzidos cultivando-se cepas de E. coli modificadas, por exemplo mutantes metabólicos ou cepas da E. coli deficientes em protease, tais como divulgadas na WO 2011/086138, WO 2011/086139, WO 2011/086136 e WO 2013/007388 que são aqui incorporadas na sua totalidade.

[0019] Uma proteína de interesse que pode ser purificada de acordo com os métodos da presente invenção é tipicamente isolada do periplasmo da célula hospedeira de E. coli. Os métodos para alvejar proteínas para este compartimento são bem conhecidos na técnica (Makrides, S. C. (1996). Strategies for achieving high- level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol Rev 60, 512-538.). Os exemplos de sequências de sinal adequadas para direcionar proteínas para o periplasmo da E. coli incluem as sequências de sinal PhoA, OmpA, OmpT, LamB e OmpF da E. coli.

[0020] A expressão da proteína recombinante nas células hospedeiras da E. coli também podem estar sob o controle de um sistema indutível, por meio do qual a expressão do anticorpo recombinante na E. coli está sob o controle de um promotor indutível. Muitos promotores indutíveis adequados para o uso na E. coli são bem conhecidos na técnica e dependendo do promotor a expressão da proteína recombinante pode ser induzida variando-se fatores tais como temperatura ou a concentração de uma substância particular no meio de crescimento. Os exemplos de promotores indutíveis incluem os promotores lac, tac, e trc da E. coli que são indutíveis com lactose ou o análogo não hidrolisável da lactose, o isopropil-b-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG) e os promotores phoA, trp e araBAD que são induzidos pelo fosfato, triptofano e L-arabinose respectivamente. A expressão pode ser induzida, por exemplo, pela adição de um indutor ou uma mudança na temperatura onde a indução é dependente da temperatura. Onde a indução da expressão de proteína recombinante é obtida pela adição de um indutor à cultura o indutor pode ser adicionado por qualquer método adequado dependendo do sistema de fermentação e do indutor, por exemplo, por adições de lance único ou múltiplo ou por uma adição gradual de indutor através de uma alimentação. Será avaliado que pode haver uma demora entre a adição do indutor e a indução real da expressão de proteína por exemplo onde o indutor é lactose pode haver uma demora antes da indução da expressão de proteína ocorrer enquanto qualquer fonte de carbono pré-existente é utilizada antes da lactose.

[0021] Alternativamente, a proteína de interesse que pode ser purificada de acordo com os métodos da presente invenção é isolada do periplasmo de P. fluorescens. As sequências adequadas que direcionam as proteínas para o compartimento periplásmico em P. fluorescens incluem líderes de secreção tipo sec como foi descrito na técnica (D. M. Retallack, et al. Transport of heterologous proteins to the periplasmic space of Pseudomonas fluorescens using a variety of native signal sequences Biotechnol. Lett., 29 (2007), pp. 1483-1491). A expressão da proteína de interesse pode estar sob o controle de um sistema indutível, por meio do qual a expressão está sob o controle de um promoter indutível como descrito no parágrafo precedente. Os indutores bem conhecidos tais como IPTG podem ser usados neste contexto, alternativamente indutores tais como benzoato de antranilato que induzem os promotores Pben509 e Pben278, respectivamente foram descritos nos sistemas de expressão de P. fluorescens.

[0022] As culturas de célula hospedeira procariótica (fermentações) podem ser cultivadas em qualquer meio que sustentará o crescimento das células hospedeiras e a expressão da proteína recombinante. O meio pode ser qualquer meio quimicamente definido, tal como por exemplo, descrito para a E. coli em Durany O, et al. (2004). Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia coli. Process Biochem 39, 1677-1684.

[0023] A fermentação de células hospedeiras procarióticas pode ser realizada em qualquer sistema adequado, por exemplo no modo contínuo, de batelada ou lote alimentado dependendo da proteína e dos rendimentos requeridos. O modo de batelada pode ser usado com adições por lance de nutrientes ou indutores onde requerido. Alternativamente, uma cultura de lote alimentado pode ser usada e as culturas crescem na pré-indução no modo de batelada na taxa de crescimento específico máxima que pode ser sustentada usando os nutrientes inicialmente presentes no fermentador e um ou mais regimes de alimentação de nutriente usado para controlar a taxa de crescimento até que a fermentação esteja completa. O modo de lote alimentado também pode ser usado na pré-indução para controlar o metabolismo das células hospedeiras procarióticas e para permitir que densidades de célula mais altas sejam atingidas.

[0024] As células hospedeiras são depois coletadas do meio de fermentação, por exemplo, as células hospedeiras são coletadas da amostra pela centrifugação, filtração ou pela concentração.

[0025] Em uma forma de realização do método de acordo com a presente invenção a etapa de coleta de célula compreende uma etapa de centrifugação e recuperação de célula. Em uma forma de realização particular preferida da invenção, a dita etapa de centrifugação é a centrifugação contínua, a partir da qual uma pasta fluida de célula é recuperada.

[0026] Para os processos de cultura de célula hospedeira procariótica (por exemplo, E. coli) em que a proteína de interesse tal como um fragmento de anticorpo é encontrado no espaço periplásmico da célula hospedeira é requerido liberar a proteína da célula hospedeira. A liberação pode ser obtida por qualquer método adequado ou combinação de métodos tais como lise de célula pelo tratamento mecânico ou com pressão, tratamento de congelamento-descongelamento, choque osmótico, agentes de extração e/ou tratamento térmico. Tais métodos de extração para a liberação de proteína são bem conhecidos na técnica. No método da presente invenção, a extração de proteína é obtida por uma etapa de tratamento térmico, isto é mantendo a amostra em uma temperatura elevada durante um período definido.

[0027] De acordo com o método da presente invenção o tampão é adicionado às células coletadas do fluido de cultura de célula antes da etapa de tratamento térmico. Em uma forma de realização particular do método da invenção, o dito tampão é 100 mM de Tris e 10 mM de EDTA no pH 7,4, em uma outra forma de realização o dito tampão de extração é 75 mM de Tris e 7,5 mM de EDTA no pH 7,4, 200 mM de Tris e 20 mM de EDTA no pH 7,4, ou 300 mM de Tris e 30 mM de EDTA no pH 7,4. Em uma forma de realização da invenção o tampão tem um pH que garante que o pH da amostra é pH 6 a 9, por exemplo pH 6 a 8, antes da etapa de tratamento térmico como descrito na WO 2012/013930 que é aqui incorporada na sua totalidade. Preferivelmente o dito pH é de 6,5 a 8, pH 6,8 a 7,8, ou pH 7 a 7,6.

[0028] O técnico habilitado saberá de outros tampões adequados descritos na técnica para serem usados para a extração de proteína.

[0029] Em uma outra forma de realização alternativa o potencial redox do dito tampão é mantido abaixo de -100 mV, -200 mV, abaixo de -300 mV ou abaixo de -400 mV.

[0030] O potencial redox do ambiente é particularmente crítico para as dinâmicas das ligações de dissulfeto entre grupos tiol nos resíduos de cisteína presentes nas moléculas de proteína. Quando reduzidas, as ditas ligações de dissulfeto são rompidas liberando os grupos tiol (-SH) correspondentes. As moléculas de anticorpo têm várias ligações de dissulfeto, que são críticas para manter a sua estrutura, e por conseguinte, a sua atividade biológica. Algumas destas ligações de dissulfeto são mais acessíveis do que outras para reduzir e/ou oxidar as espécies presentes no ambiente dada a sua posição dentro da molécula, e consequentemente mais susceptíveis ao rompimento.

[0031] No contexto da presente invenção, as impurezas relacionadas com produto são de fato fragmentos da proteína de interesse e portanto menores e mais simples na estrutura. Sem desejar estar ligado pela teoria as ligações de cisteína dentro das ditas impurezas relacionadas com produto são mais acessíveis e portanto mais susceptíveis ao rompimento como uma consequência do potencial redox do ambiente.

[0032] Em uma segunda forma de realização do método da invenção o dito tratamento térmico é realizado em um recipiente e o dito potencial redox é mantido reduzindo-se a quantidade de oxigênio (O2) presente na fase gasosa no recipiente durante o tratamento térmico.

[0033] Geralmente existe um volume de ar no recipiente (aqui aludido como a fase gasosa) acima da amostra composta de tampão e células hospedeiras. Dentro do significado da presente invenção, reduzir a quantidade de oxigênio na fase gasosa, significa alterar a composição da dita fase gasosa em uma maneira tal que a mesma contenha menos oxigênio do que ar. Como é conhecido na técnica, ar tipicamente contém aproximadamente 21 % de oxigênio (volume).

[0034] De modo a manter o potencial redox abaixo de 0 mV de acordo com o método da invenção, um técnico habilitado estaria ciente de meios diferentes disponíveis para prevenir a oxidação da amostra de extração. Isto pode ser obtido pela remoção de oxigênio e outros gases oxidantes presentes na fase gasosa no recipiente, tipicamente pelo deslocamento com um outro gás inerte. O dito deslocamento pode ser obtido por meio de uma cobertura de nitrogênio (N2), isto é manter a amostra no recipiente em contato uma fase gasosa contendo N2, ou espargindo-se, isto é borbulhando ou passando, o gás inerte através da amostra no recipiente. Outros gases inertes que podem ser usados para manter um potencial redox de acordo com o método da invenção incluem argônio e hélio.

[0035] Alternativamente, existe uma escolha de agentes redutores disponíveis na técnica, que têm graus variáveis de concentração. Consequentemente um técnico habilitado escolheria o agente redutor mais apropriado dependendo do potencial redox desejado e do tempo durante o qual o mesmo deve ser mantido. Os agentes redutores conhecidos na técnica incluem mas não são limitados à glutationa, mercaptoetanol, ditiotreitol ou Tris(2-carboxietil)fosfino.

[0036] A cultura de células hospedeiras procarióticas pode ocorrer em qualquer recipiente adequado tal como um frasco agitado ou um fermentador dependendo da escala de produção requerida. Vários fermentadores em larga escala estão disponíveis com uma capacidade de mais do que 1.000 litros até cerca de 100.000 litros. Preferivelmente, fermentadores de 1.000 a 50.000 litros são usados, mais preferivelmente de 1.000 a 25.000 ou 1.000 a 20.000, 1.000 a 15.000, 1.000 a 10.000, 1.000 a 5.000, 20.000, 15.000, 12.000 10.000, 5000 ou 2000 litros. Os fermentadores em escala menor também podem ser usados com uma capacidade dentre 0,5 e 1.000 litros.

[0037] Em uma forma de realização preferida, a dita fase gasosa contém menos do que 20 %, 15 %, 12 %, 10 %, 8 %, 5 %, 2 % ou 1 % de oxigênio (volume) durante a etapa de tratamento térmico.

[0038] Em uma forma de realização preferida, o dito oxigênio é essencialmente excluído da fase gasosa durante a etapa de tratamento térmico.

[0039] Em uma terceira forma de realização do método da invenção, nitrogênio (N2) é adicionado à fase gasosa do recipiente.

[0040] Em uma quarta forma de realização do método da invenção a dita fase gasosa contém pelo menos 80 % de N2, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % de N2, pelo menos 95 % de N2 ou pelo menos 97 % ou 99 % de N2. Em uma outra forma de realização alternativa, a dita fase gasosa é essencialmente N2.

[0041] Tipicamente, o dito N2 é adicionado à fase gasosa do recipiente como uma cobertura e é mantida no topo livre do recipiente contendo o tampão e as células hospedeiras adicionando-se 100 % de gás N2ao topo livre com de 0,1 a 1 vvm (volume de gás por volume de líquido por minuto, isto é 1 L/min para um volume de extração de 1 L).

[0042] Em uma forma de realização particular a presente invenção se refere a um método para fabricar uma proteína de interesse em que a dita proteína é expressada em uma célula hospedeira, compreendendo - cultivar as ditas células hospedeiras sob condições tais que elas expressem a dita proteína, - coletar as células hospedeiras do fluido de cultura de célula, - adicionar tampão às células hospedeiras, e - submeter as células hospedeiras no tampão ao tratamento térmico em um recipiente em que a fase gasosa do recipiente é essencialmente N2.

[0043] Dependendo da configuração do recipiente, o dito N2 pode ser adicionado à fase gasosa do recipiente, em que o recipiente é subsequentemente selado, isto é isolando o interior do recipiente do lado de fora, deixando o N2 na fase gasosa durante o tratamento térmico. Alternativamente, um fluxo constante de N2 é aplicado através da fase gasosa do recipiente durante a etapa de tratamento térmico, por exemplo, para recipientes que não permitem a possibilidade de selagem do interior a partir do ambiente externo.

[0044] Em uma forma de realização o N2 é adicionado à ou introduzido na fase gasosa antes da etapa de tratamento térmico para garantir que o potencial redox seja mantido abaixo do valor desejado durante a etapa de tratamento térmico.

[0045] Em uma forma de realização particular, o método da invenção compreende: - cultivar as ditas células hospedeiras sob condições tais que expressem a proteína de interesse, - coletar as células hospedeiras do fluido de cultura de célula, - adicionar tampão às células hospedeiras em um recipiente, - adicionar N2 à fase gasosa do recipiente, - selar o dito recipiente; e - submeter as células hospedeiras em tampão ao tratamento térmico no recipiente em que o potencial redox do dito tampão é mantido abaixo de 0 mV durante o dito tratamento térmico.

[0046] Portanto em uma outra forma de realização do método da invenção, o dito N2 é introduzido como uma cobertura usando pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, pelo menos 99 % ou 100 % de N2.

[0047] Em uma forma de realização alternativa da invenção, o dito N2 é introduzido espargindo-se N2 através da tampão durante o tratamento térmico, preferivelmente espargindo-se N2 essencialmente puro.

[0048] Em uma quinta forma de realização da invenção, o dito N2 é adicionado ao recipiente como uma cobertura na fase gasosa do recipiente ou espargindo-se o N2 através do tampão.

[0049] O método de acordo com a invenção compreende uma etapa de tratamento térmico que torna possível obter uma amostra de proteína solúvel, corretamente dobrada e montada tal como um fragmento de anticorpo pela facilitação da remoção de outro material relacionado com a proteína.

[0050] A proteína que é “corretamente dobrada e montada” é mostrada pela presença de uma única faixa correspondendo ao peso molecular esperado para a cadeia de proteína montada na SDS-PAGE não redutores. Outro material relacionado com a proteína tipicamente será de fragmentos parcialmente degradados da proteína corretamente dobrada e montada.

[0051] A etapa de tratamento térmico no método da presente invenção é uma etapa de manter a temperatura da amostra em uma temperatura elevada desejada uma vez que esta temperatura elevada desejada foi atingida durante uma fase de aquecimento.

[0052] A etapa de tratamento térmico é realizada submetendo-se a amostra a uma temperatura elevada desejada. Mais preferivelmente, a etapa de tratamento térmico é realizada dentro da faixa de 30 °C a 70 °C. A temperatura pode ser selecionada como desejada e pode depender da estabilidade da proteína à purificação. Em uma outra forma de realização, a temperatura está dentro da faixa de 40 °C a 65 °C, ou preferivelmente dentro da faixa de 40 °C a 60 °C, mais preferivelmente dentro da faixa de 45 °C a 60 °C, ainda mais preferivelmente dentro da faixa de 50 °C a 60 °C e o mais preferivelmente de 55 °C a 60 °C, 58 °C a 60 °C ou 59 °C. Assim, as temperaturas mínimas são de 30 °C, 35 °C ou 40 °C e as temperaturas máximas 60 °C, 65 °C ou 70 °C.

[0053] Em uma sexta forma de realização do método da invenção, a dita etapa de tratamento térmico é realizada de 30 °C a 70 °C.

[0054] Em uma sétima forma de realização do método da invenção, a dita etapa de tratamento térmico é realizada de 55 °C a 65 °C.

[0055] A etapa de tratamento térmico é preferivelmente realizada durante um período prolongado de tempo. A duração do tratamento térmico está preferivelmente entre 1 e 24 horas, ou entre 1 e 18 horas, mais preferivelmente entre 4 e 18 horas, ainda mais preferivelmente entre 6 e 16 horas, e o mais preferivelmente entre 8 e 14 horas ou entre 8 e 12 horas, por exemplo 10 horas. Assim, o tempo mínimo para o tratamento térmico é de 1, 2 ou 3 horas e o máximo é de 20, 22 ou 24 horas.

[0056] Em uma oitava forma de realização do método da invenção, a etapa de tratamento térmico da sexta ou sétima formas de realização é mantida durante 1 hora a 18 horas.

[0057] Como um técnico habilitado sabe, geralmente existe uma relação inversamente proporcional entre os tempos de reação e as temperaturas, pela qual mais alta a temperatura na qual uma reação é realizada mais curto o tempo necessário para a reação ocorrer.

[0058] Em uma forma de realização particular, o tratamento térmico é realizado de 50 °C a 60 °C durante 10 a 16 horas, e mais preferivelmente a 59 °C durante 10 a 12 horas. Uma pessoa habilitada na técnica entenderá que as temperaturas e o tempo podem ser selecionados como satisfizer a amostra em questão e as características da proteína de interesse tais como um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[0059] Em uma outra forma de realização alternativa do método da invenção, a dita extração de proteína é realizada em uma temperatura de 58 °C a 60 °C durante um período de 8 a 12 horas.

[0060] A etapa de tratamento térmico é preferivelmente realizada com agitação da amostra tal como em uma batedeira ou conjunto agitador para operar em uma taxa de agitação adequada, tal como 200 rodadas por minuto (RPM). Entretanto, a taxa de agitação adequada variará dependendo da escala do método.

[0061] Em uma nona forma de realização do método da invenção, a amostra tem ou é ajustada a um pH de 6 a 9 antes da etapa de tratamento térmico. Em uma outra forma de realização particular do método da invenção, o pH da dita amostra é de 6,5 a 8, 6,5 a 7,5, ou 6,8 a 7,2 antes da etapa de tratamento térmico.

[0062] Em uma forma de realização particular, o pH da amostra é medido ou ajustado antes da etapa de tratamento térmico, para garantir que o pH da amostra durante a etapa de tratamento térmico seja de 5 a 9, preferivelmente o pH da amostra durante a etapa de tratamento térmico é de 6 a 7.

[0063] Em uma outra forma de realização o pH é ajustado com uma base tal como uma base inorgânica por exemplo hidróxido de sódio ou uma base orgânica tal como trietilamina ou trimetilamina ou base tris.

[0064] Qualquer agente adequado pode ser usado para ajustar o pH da amostra. O agente pode ser o tampão ou pode ser adicionado antes e/ou depois do tampão. Os agentes típicos que podem ser usados para ajustar o pH compreendem ou consistem de um ou mais dos seguintes: NaOH, NH4OH, ácido sulfúrico, EDTA, tampão Tris.

[0065] Em uma outra forma de realização particular, o pH da amostra é medido ou ajustado antes da etapa de tratamento térmico e antes da adição de um gás inerte tal como nitrogênio à fase gasosa do recipiente de modo a manter o potencial redox abaixo de 0 mV. Alternativamente, em uma outra forma de realização da invenção, o pH da amostra é medido e/ou ajustado antes da etapa de tratamento térmico e o gás inerte tal como nitrogênio é passado através da amostra durante a etapa de tratamento térmico.

[0066] As medições de pH aqui aludidas são geralmente normalizadas a 20 °C.

[0067] No contexto da presente invenção “antes da etapa de tratamento térmico” significa antes e incluindo o ponto no tempo no qual a amostra atinge a temperatura elevada desejada e a etapa de tratamento térmico (mantendo em uma temperatura elevada) começa. De modo a atingir a temperatura elevada desejada para a etapa de tratamento térmico a amostra é submetida a uma “fase de aquecimento” durante a qual a temperatura da amostra é elevada para a temperatura desejada. Em uma forma de realização, o método de acordo com a invenção compreende submeter a amostra a uma fase de aquecimento e uma etapa de tratamento térmico. Na forma de realização em que o método compreende submeter a amostra a uma fase de aquecimento e uma etapa de tratamento térmico, a amostra pode estar no nível de pH requerido antes do início da fase de aquecimento e/ou no nível de pH requerido durante a fase de aquecimento.

[0068] Em uma forma de realização particular, N2 é adicionado à fase gasosa do recipiente antes do início da fase de aquecimento. Preferivelmente a amostra está no nível de pH requerido antes da dita fase de aquecimento.

[0069] Em uma décima forma de realização do método da invenção, a proteína de interesse é uma proteína recombinante codificada em um vetor de expressão.

[0070] Em uma décima primeira forma de realização, o método de acordo com a oitava forma de realização da invenção, a proteína é um anticorpo recombinante.

[0071] Em uma décima segunda forma de realização o dito anticorpo recombinante é um fragmento de anticorpo recombinante. Existem muitos fragmentos de anticorpo recombinante conhecidos na técnica incluindo os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv e scFv. Alternativamente o anticorpo recombinante é selecionado de diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos de cadeia única, anticorpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos ou multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo ou anticorpos, incluindo mas não limitados a construções de Fab-Fv.

[0072] Em uma décima terceira forma de realização do método da invenção, o dito anticorpo recombinante ou fragmento de anticorpo recombinante especificamente se ligam ao TNF-alfa ou à CD154.

[0073] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para a fabricação de um anticorpo recombinante em que o dito anticorpo recombinante é expresso em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar as ditas células hospedeiras sob condições tais que elas expressem a dita proteína, coletar as células hospedeiras do fluido de cultura de célula, adicionar tampão às células hospedeiras, e submeter as células hospedeiras ao tratamento térmico para extrair o anticorpo recombinante das ditas células hospedeiras em um recipiente em que o potencial redox do dito tampão é mantido abaixo de 0 mV, abaixo de -100 mV, abaixo de -200 mV, abaixo de -300 mV ou abaixo de -400 mV, durante a dita extração.

[0074] Em uma outra forma de realização particular, a presente invenção fornece um método para a fabricação de um anticorpo recombinante em que o dito anticorpo recombinante é expresso em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar as ditas células hospedeiras sob condições tais que elas expressem a dita proteína, coletar as células hospedeiras do fluido de cultura de célula, adicionar tampão às células hospedeiras em um recipiente, adicionar N2 à fase gasosa do recipiente, submeter as células hospedeiras ao tratamento térmico, e recuperar a dita proteína.

[0075] Em uma outra forma de realização particular o método da invenção, fornece um método para a fabricação de um anticorpo recombinante em que o dito anticorpo recombinante é expresso em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar as ditas células hospedeiras sob condições tais que elas expressem a dita proteína, coletar as células hospedeiras do fluido de cultura de célula, adicionar tampão às células hospedeiras em um recipiente, adicionar N2 à fase gasosa do recipiente, submeter as células hospedeiras ao tratamento térmico, e recuperar a dita proteína; em que a dita proteína recuperada tem um nível mais baixo de impurezas relacionadas com produto quando comparada à proteína recuperada de um método de fabricação compreendendo um tratamento térmico realizado sem a presença de N2 na fase gasosa do recipiente.

[0076] O método de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais etapas adicionais, tais como procedimentos de purificação tais como filtração e/ou centrifugação. Também é incluída a cromatografia de leito fluidizado. Outros procedimentos de purificação preferidos incluem cromatografia de troca iônica, microfiltração, ultrafiltração, diafiltração, e captura de leito fixo e capture de leito expandido e combinações de qualquer um destes.

[0077] Os termos “anticorpo” ou “anticorpos” como aqui usados se referem a anticorpos monoclonais ou policlonais. Os termos “anticorpo” ou “anticorpos” como aqui usados incluem mas não são limitados aos anticorpos recombinantes que são gerados pelas tecnologias recombinantes como conhecidos na técnica. “Anticorpo” ou “anticorpos” incluem anticorpos de qualquer espécie, em particular de espécies mamíferas; tais como anticorpos humanos de qualquer isótipo, incluindo IgA1, IgA2, IgD, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE e IgM e variantes modificadas dos mesmos, anticorpos de primata não humano, por exemplo, de chimpanzé, babuíno, macaco rhesus ou cinomolgo; anticorpos de roedor, por exemplo, de camundongo, rato ou coelho; anticorpos de cabra ou cavalo; e anticorpos camelídeos (por exemplo, de camelos ou lhamas tais como Nanobodies®) e derivados dos mesmos; ou de espécies de ave tais como anticorpos de galinha ou de espécies de peixe tais como anticorpos de tubarão. O termo “anticorpo” ou “anticorpos” também se referem a anticorpos “quiméricos” em que uma primeira porção de pelo menos uma sequência de anticorpo de cadeia pesada e/ou leve é de uma primeira espécie e uma segunda porção da sequência de anticorpo de cadeia pesada e/ou leve é de uma segunda espécie. Os anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos “primatizados” compreendendo sequências de ligação de antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, tal como babuíno, macaco rhesus ou cinomolgo) e sequências da região constante humana. Os anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência derivada de anticorpos não humanos. Pela maior parte, os anticorpos humanizados são anticorpos humanos (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídas pelos resíduos de uma região hipervariável [ou região determinadora de complementaridade (CDR)] de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho, galinha ou primata não humano, tendo a especificidade, afinidade, e atividade desejadas. Na maioria dos casos os resíduos do anticorpo humano (receptor) fora da CDR; isto é na região de armação (FR), são adicionalmente substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. A humanização reduz a imunogenicidade de anticorpos não humanos nos seres humanos, facilitando assim a aplicação de anticorpos ao tratamento de doença humana. Anticorpos humanizados e várias tecnologias diferentes para gerá-los são bem conhecidos na técnica. O termo “anticorpo” ou “anticorpos” também se referem a anticorpos humanos, que podem ser gerados como uma alternativa para a humanização. Por exemplo, é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, na imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de anticorpos de murino endógenos. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união de cadeia pesada do anticorpo (JH) em camundongos mutantes quiméricos e da linha germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo de gene da imunoglobulina da linha germinativa humana em tais camundongos mutantes da linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos com especificidade contra um antígeno particular na imunização do animal transgênico que carrega os genes da imunoglobulina da linha germinativa humana com o dito antígeno. Tecnologias para produzir tais animais transgênicos e tecnologias para isolar e produzir os anticorpos humanos de tais animais transgênicos são conhecidas na técnica. Alternativamente, no animal transgênico; por exemplo, camundongo, apenas os genes da imunoglobulina que codificam as regiões variáveis do anticorpo de camundongo são substituídos com as sequências de gene da imunoglobulina variável humana correspondentes. Os genes da imunoglobulina da linha germinativa de camundongo que codificam as regiões constantes de anticorpo permanecem inalterados. Deste modo, as funções efetoras do anticorpo no sistema imune do camundongo transgênico e consequentemente o desenvolvimento de célula B são essencialmente inalterados, o que pode levar a uma resposta de anticorpo melhorada na inoculação antigênica in vivo. Uma vez que os genes que codificam um anticorpo de interesse particular foram isolados de tais animais transgênicos os genes que codificam as regiões constantes podem ser substituídos com genes da região constante humana de modo a se obter um anticorpo totalmente humano. Outros métodos para se obter anticorpos/fragmentos de anticorpo humanos in vitro são com base nas tecnologias de demonstração tais como a tecnologia de visualização de fago ou visualização ribossômica, em que as bibliotecas de DNA recombinantes são usadas que são geradas pelo menos em parte artificialmente ou a partir de repertórios do gene de domínio variável (V) da imunoglobulina de doadores. As tecnologias de visualização de fago e ribossoma para gerar anticorpos humanos são bem conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos também podem ser gerados a partir de células B humanas isoladas que são imunizadas ex vivo com um antígeno de interesse e subsequentemente fundidas para gerar hibridomas que podem ser depois triadas para o anticorpo humano ideal. O termo “anticorpo” ou “anticorpos” como aqui usados, também se referem a um anticorpo aglicosilado.

[0078] Em certas formas de realização desta invenção, os anticorpos são anticorpos que são modificados pela ligação covalente de porções funcionais tais como polímeros solúveis em água, tais como poli(etileno glicol), copolímeros de poli(etileno glicol) e poli(propileno glicol), carboximetil celulose, dextrano, poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidona) ou poli(prolina) -- todos dos quais são conhecidos exibir meias-vidas substancialmente mais longas no sangue a seguir da injeção intravenosa do que as das proteínas não modificadas correspondentes.

[0079] Em algumas formas de realização, os anticorpos da presente invenção são anticorpos ligados às porções funcionais tais como às porções de poli(etileno glicol) (PEG). Em uma forma de realização particular, o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas de PEG podem ser ligadas através de qualquer cadeia lateral de aminoácido disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxila ou carboxila livre. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser engenheirados no fragmento usando métodos de DNA recombinante (ver por exemplo a US 5.219.996; US 5.667.425; WO 98/25971).

[0080] Os termos “anticorpo” ou “anticorpos” como aqui usados não apenas se referem a anticorpos não truncados de qualquer espécie, incluindo de ser humano (por exemplo, IgG) e outras espécies de mamífero, mas também se refere a um fragmento de anticorpo. Um fragmento de um anticorpo compreende pelo menos um domínio de imunoglobulina de cadeia pesada ou leve como conhecido na técnica e se liga a um ou mais antígenos. Os exemplos de fragmentos de anticorpo de acordo com a invenção incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv e scFv; assim como diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, anticorpos de domínio (dAbs), tais como sdAbs, fragmentos VHH e VNAR, anticorpos de cadeia única, anticorpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos ou multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo ou anticorpos, incluindo mas não limitados às construções Fab-Fv ou Fab-Fv-Fv. Os fragmentos de anticorpo como definidos acima são conhecidos na técnica.

[0081] O termo “potencial redox” como aqui usado se refere à medida da tendência de uma espécie química adquirir elétrons e com isso ser reduzida. O potencial redox é medido em volts (V), ou milivolts (mV). Cada espécie tem o seu próprio potencial de redução intrínseco; quanto mais positivo o potencial, maior a afinidade da espécie para elétrons e tendência a ser reduzida.

[0082] Os termos “extração” ou “extração de proteína” como aqui usados se referem a remover a proteína expressada dentro de uma célula hospedeira da célula hospedeira. A extração pode envolver o rompimento da célula hospedeira e a isolação de fluido intracelular dos fragmentos celulares, ou a manipulação do hospedeiro para fabricar a membrana celular externa de bactérias Gram negativas ou outras células tendo uma membrana celular externa mal vedada de modo a liberar o fluido do espaço periplásmico de tais células.

EXEMPLOS Métodos Processo de fermentação A

[0083] A E. coli W3110 transfectada com um vetor de modo a expressar uma ligação de Fab’ especificamente ao TNF-alfa humano foi usada como célula hospedeira.

[0084] Um frasco de banco de célula congelado contendo estas células foi usado para inocular um frasco agitado (volume total de 700 ml) contendo 6x meio de extrato de peptona-levedura (6xP-Y) mais tetraciclina. Este frasco agitado foi incubado a 30 °C e 230 rpm. Na faixa OD requerida (OD600 = 2-3), o frasco agitado foi usado para inocular um fermentador de semente (volume total 10 L) contendo meio SM6 quimicamente definido (Popplewell et al. Expression of Antibody Fragments by Periplasmic Secretion in Escherichia coli; Methods in Molecular Biology, vol. 308: Therapeutic Proteins: Methods and Protocols; 2005) mais tetraciclina, com glicerol como a fonte de carbono. A cultura de célula dentro do fermentador de semente foi mantida a 30 °C, a concentração de oxigênio dissolvido (pO2) foi mantida a 30 % e o pH foi controlado a 7,0.

[0085] Na faixa OD requerida (OD600 = 30-37), a cultura de semente foi usada para inocular o fermentador de produção (volume total de 600 L) contendo meio quimicamente definido com glicerol como a fonte de carbono. O fermentador de produção foi inicialmente mantido a 30 °C, 30 % de pO2, e o pH foi controlado em 7,0, e as células cultivadas na fase de batelada até a indução. Durante a fase de batelada a temperatura foi reduzida para 25 °C e uma adição de MgSO4 foi feita para evitar depleção deste metabólito.

[0086] Em uma faixa OD específica (OD600 = 43-47), durante a qual a depleção de glicerol ocorre, uma adição de bolo de solução de lactose foi feita à cultura. A lactose seria depois utilizada pelas células como a fonte principal de carbono e também atuaria como um indutor da expressão de Fab’. A concentração de lactose foi mantida através da fase de indução via uma alimentação contínua e as células foram colhidas 30 horas após a indução.

Processo de fermentação B

[0087] Um frasco de banco de célula congelado contendo células hospedeiras MXE012 da E. coli que expressam Fab’ uma ligação de Fab’ especificamente ao TNF- alfa humano foi usada para inocular um frasco agitado (volume total de 700 ml) contendo 6x meio de extrato de peptona-levedura (6xP-Y) mais tetraciclina. Este frasco agitado foi incubado a 30 °C e 230 rpm. Na faixa OD requerida (OD600 = 2-3), o frasco agitado foi usado para inocular um fermentador de semente (volume total de 10 L) contendo meio MD quimicamente definido (Durany et al. 2004. Studies on the expression of recombinant fuculose-1-fosfate aldolase in Escherichia coli. Process Biochem 39: 1677-1684) mais tetraciclina, com glicerol como a fonte de carbono. A cultura de célula dentro do fermentador de semente foi mantida a 30 °C, a concentração de oxigênio dissolvido (pO2) foi mantida a 30 % e o pH foi controlado a 6,9.

[0088] Na faixa de OD requerida (OD600 = 30-37), a cultura de semente foi usada para inocular o fermentador de produção (volume total de 600 L) contendo meio quimicamente definido com glicerol como a fonte de carbono. O fermentador de produção foi inicialmente mantido a 30 °C, 30 % de pO2, com pH controlado no pH 6,9 e cultivadas na fase de batelada até que o glicerol fosse depletado. Durante este tempo uma adição de MgSO4 foi feita para evitar a depleção deste metabólito.

[0089] No final da fase de batelada, uma alimentação exponencial de glicerol foi trocada e a cultura foi alimentada com uma quantidade específica de glicerol para alcançar uma OD600 de aproximadamente 70 unidades. Neste ponto, a alimentação de glicerol foi trocada de uma alimentação exponencial para uma alimentação linear e a expressão de Fab’ foi induzida pela adição de IPTG (38,79 g/kg de cultura). As células foram colhidas 40 horas após a indução.

[0090] A cepa MXE012 da E. coli é um mutante metabólico da E. coli contendo a mutação sprH145A para o gene spr como descrito na WO 2011/086136 (aqui incorporada na sua totalidade).

Métodos de recuperação e extração

[0091] As células foram colhidas pela centrifugação contínua usando uma centrífuga de pilha de disco Westfalia PSC 5.

[0092] A pasta fluida de célula concentrada foi recolocada em suspensão de volta para a concentração de colheita de célula original em vasos de vidro de 2 L ou 5 L pela adição de água e tampão de extração no pH 7,4 a uma concentração de tampão de extração final de 10 mM de EDTA, 100 mM de Tris.

[0093] Onde requerido, as células recolocadas em suspensão foram ajustadas para o pH 7,2 pela adição de 2,5 M de base Tris ao tampão de extração antes da extração da proteína via uma etapa de aquecimento. Para a extração térmica, as células foram aquecidas a 59 °C por 10 horas. A temperatura e mistura foram mantidas usando unidades de controle Biostat BPlus (Sartorius) e o software Multiple Fermenter Control System (MFCS®).

Purificação da amostra

[0094] As espécies relacionadas com Fab’ foram purificadas a partir das amostras de extração para permitir a avaliação das impurezas relacionadas com produto. As amostras de extração foram primeiro clarificados pela centrifugação, coleta do sobrenadante clarificado e filtração através de um filtro de 0,2 μm. O sobrenadante clarificado foi depois carregado em colunas de Proteína L de 1 mL (Pierce #89928), lavado com uma concentração baixa de tampão de fosfato no pH 7,4 e eluído com um tampão de glicina no pH 2,8. Foi demonstrado que a resina de proteína L pôde capturar fragmentos Fab’ e que a recuperação foi linear e reprodutível dentro da faixa experimental.

Análise de amostra

[0095] As amostras purificadas foram analisadas e quantificadas pela cromatografia de troca de cátion. As amostras foram carregadas em uma coluna analítica Dionex Pro Pac SCX-10 (Thermo Scientific) e eluídas usando um gradiente salino. As proteínas eluídas foram monitoradas a 280 nm e os picos do cromatograma foram quantificados e interpretados de acordo com um procedimento padrão

Exemplo 1

[0096] A fermentação foi realizada de acordo com o processo B e a proteína foi extraída como descrito acima. O potencial redox foi medido durante o processo de extração nos recipientes usando sondas ORP (Potencial de Oxidação-Redução) (Broadley James Corporation, Irvine CA) e monitorado usando o software MFCS® (Sartorius, Betlehem PA).

[0097] De modo a avaliar o efeito de manter um ambiente redox reduzido, alguns recipientes de extração foram expostos ao nitrogênio e outros foram expostos ao ar durante a extração, também o gás foi espargido através da amostra dentro dos recipientes ou mantido como um fluxo de cobertura para o topo livre dos recipientes.

[0098] A Tabela 1 abaixo mostra um resumo das condições do fluxo de gás do recipiente. Todos os fluxos de gás foram mantidos em uma taxa de fluxo de 1 vvm (volume de gás por volume de líquido por minuto, isto é 1 L/min para uma extração de 1 L) usando 100 % de nitrogênio ou fornecimento de ar comprimido. Tabela 1.

[0099] As Figuras 1 e 2 mostram o redox correspondente e perfis de temperatura das extrações (figura 1) e um gel de SDS PAGE de amostras após a extração (figura 2).

[00100] Como pode ser derivado destas figuras, manter uma cobertura de nitrogênio durante a etapa de tratamento térmico mantém uma medição do potencial de redox baixa o tempo todo, com um mínimo em torno de -435 mV e tipicamente - 375 mV durante a temperatura de contensão a 59 °C. Um potencial redox similarmente baixo foi observado quando o nitrogênio foi espargido. Quando o tampão contendo células hospedeiras foi coberto com ar no lugar do nitrogênio, pôde ser observado que os valores do potencial redox foram significantemente mais altos durante a extração da etapa de aquecimento, tornando positivo (tipicamente em torno de +45 mV) durante a contensão da temperatura a 59 °C. Um potencial redox similarmente alto foi observado quando o ar foi espargido. O espargimento gasoso foi trocado para cobertura durante as extrações devido aos altos níveis de espumação observados.

[00101] A Figura 2 demonstra uma diferença significante no nível de impureza relacionada com o produto como medido pela SDS PAGE. A figura mostra que na presença de nitrogênio, as condições redutoras durante a extração térmica são suficientes para permitir redução significante no nível de impurezas relacionadas com produto quando comparadas com as extrações realizadas na presença de ar.

Exemplo 2

[00102] A fermentação de acordo com o processo A e extração subsequente foram realizadas como descritas acima. A taxa de fluxo de nitrogênio para o topo livre foi variada de 0,1 vvm a 1 vvm em combinação com agitação variada e volumes de enchimento de acordo com a Tabela 2. Tabela 2

[00103] Como pode ser observado na Figura 3, um efeito claro de se ter uma cobertura de nitrogênio na depuração de impurezas relacionadas com produto pode ser observado. A extração #8, onde nenhuma cobertura de nitrogênio foi aplicada, teve níveis significantemente mais altos de impurezas relacionadas com produto. Por outro lado, a figura também sugere que a taxa de cobertura de nitrogênio teria um efeito sobre a depuração desta impureza, comparando as extrações 1 a 2, e 7 a 8.

Exemplo 3

[00104] A fermentação de acordo com o processo A e a colheita de célula foram realizadas como descritas acima. As células hospedeiras recolocadas em suspensão foram ajustadas para o pH 7,2 pela adição de 2,5 M de base Tris ao tampão de extração. imediatamente antes da extração térmica. Esta extração térmica foi realizada na presença ou ausência de uma cobertura de nitrogênio. Onde aplicável, a cobertura de nitrogênio foi mantida pela gasificação do topo livre do recipiente a 1 vvm usando 100 % de nitrogênio.

[00105] Na Figura 4, as extrações 1 a 3 foram realizadas na presença de uma cobertura de nitrogênio ao passo que as extrações 4 a 6 foram cobertas com ar. Os resultados mostram mais uma vez o benefício da presença de nitrogênio, resultando em níveis significantemente reduzidos de impurezas relacionadas com o produto que permanecem depois da extração térmica. Um outro efeito benéfico é derivado do ajuste de pH realizado antes da extração térmica, visto que os níveis de impurezas relacionadas com produto parecem ser reduzidos ainda mais em comparação com os exemplos anteriores.

Exemplo 4

[00106] O efeito de extrair sob condições redutoras também foi analisado em uma escala menor, isto é usando frascos agitados.

[00107] 25 a 100 mL de cultura de célula induzida por proteína foram colhidos e recolocados em suspensão em frascos Erlenmeyer de 250 mL pela adição de água e 3x tampão de extração (pH 7,4) a uma concentração final de tampão de extração de 1x (10 mM de EDTA, 100 mM de Tris). Os frascos tiveram um selo de tampão e foram feitos de policarbonato para minimizar a permeabilidade de oxigênio dentro do frasco. A cobertura de nitrogênio foi adicionada à fase gasosa dos frascos usando um saco de luvas descartável (Aldrich AtmosBag, cat #Z530220) com um fluxo contínuo de nitrogênio através do saco de luvas. Os frascos foram selados antes de serem removidos do saco de luvas e realizando a extração térmica. As amostras também foram preparadas na bancada (com ar como uma cobertura na fase gasosa dos frascos) para comparação. A extração térmica foi realizada a 60 °C por 10 h em um incubador de frasco agitado (New Brunswick Innova42). O potencial redox foi medido em cada frasco após a extração usando sondas Broadley James ORP. A etapa de tratamento térmico também foi realizada em volumes de enchimento do frasco diferentes para avaliar o efeito das razões de área de superfície para volume diferentes sobre a extração de proteína. A Tabela 3 resume as condições experimentais testadas. Tabela 3.

[00108] A Figura 5 demonstra que os frascos agitados que foram preparados na presença de uma cobertura de nitrogênio mantiveram um ambiente mais redutor no extrato do que os frascos que foram preparados na presença de ar. A figura também mostra que os frascos com um volume de enchimento maior foram mais redutores do que aqueles com um volume de enchimento menor, provavelmente devido a uma taxa mais lenta de oxidação do extrato devido à razão de área de superfície para volume menor. Os frascos preparados em ar todos tiveram um valor de potencial redox no ponto final positivo, sem nenhuma correlação com o volume de enchimento.

[00109] A Figura 6 mostra que os frascos agitados que foram preparados sob nitrogênio tiveram níveis significantemente mais baixos de impurezas relacionadas com produto após a extração. Todos os frascos preparados com nitrogênio (faixa de potencial redox de ponto final -10 mV a -116 mV) demonstraram níveis de impureza relacionada com produto significantemente mais baixos do que todos os frascos preparados em ar (faixa de potencial redox de ponto final +79 mV a +97 mV).

Exemplo 5

[00110] A ligação de Fab’ especificamente ao TNF-alfa humano tem uma temperatura de fusão (Tm) mais alta do que HCPs (proteínas de célula hospedeira), um traço que é explorado durante a etapa de tratamento térmico. O aquecimento desnatura uma quantidade significante de HCPs e impurezas relacionadas com produto fazendo com que se agreguem e sejam depurados durante as etapas de extração. Entretanto, como descrito nos exemplos precedentes a depuração destas impurezas é enormemente melhorada quando uma cobertura de nitrogênio é aplicada, dado o potencial redox reduzido. Acredita-se que o ambiente redutor facilite a depuração das impurezas devido à redução da ligação intracadeia nestas espécies durante o aquecimento, o que resultaria em uma diminuição da temperatura de fusão nas impurezas.

[00111] De modo a confirmar o acima, a temperatura de fusão das duas espécies principais de impurezas relacionadas com produto foi medida sob condições não redutoras e redutoras. Estas condições redutoras foram obtidas usando-se TCEP- HCL (cloridreto de Tris (2-carboxietil) fosfino), para imitar o ambiente criado pela cobertura de nitrogênio realizada durante a extração.

[00112] As medições foram realizadas usando um ensaio de Thermofluor, com base no uso de um fluoróforo hidrofóbico que se liga à proteína contanto que algumas ou todas de suas áreas hidrofóbicas estejam expostas. Neste caso particular, o fluoróforo foi SYPRO orange (concentração de 5000X em DMSO; Life Technologies S-6650). Isto permite o processo de desdobramento seja monitorado sob condições desnaturantes (por exemplo, aumentando as temperaturas) medindo-se a fluorescência emitida pelo corante quando o mesmo está ligado à proteína, usando um sistema de PCR em tempo real (sistema de PCR em tempo real rápido 7900HT, da Life Technologies). As amostras são incubadas em temperaturas crescentes (de 25 °C a 99 °C com uma contensão de 30 segundos e um aumento de 0,5 °C) e as emissões de fluorescência registradas. Os dados são plotados e o ponto de fusão da proteína determinado encontrando-se o ponto de inflexão da inclinação.

[00113] Neste caso as duas impurezas purificadas relacionadas com produto foram medidas em tampão de citrato-fosfato pH 5,0 e 7,0 e solução salina de tampão de fosfato pH 7,4. Duas concentrações diferentes de TCEP-HCL foram usadas para se obter uma razão molar de agente redutor:proteína de 2:1 e 10:1, e uma amostra sem nenhum TCEP-HCL foi conduzida lado a lado como um controle.

[00114] A Figura 7 mostra os resultados para a determinação da estabilidade térmica para as duas espécies principais de impurezas relacionadas com produto. O potencial redox e a estabilidade térmica (temperatura de fusão) são mostradas se correlacionar; quanto mais baixo o potencial redox mais baixa a temperatura de fusão da proteína. Um efeito similar pode ser descrito para o pH quando ele se torna mais neutro. Ambas as variáveis tornariam as impurezas relacionadas com produto mais propensas à degradação, portanto facilitando a sua depuração.

Conclusões

[00115] No geral, os dados demonstram a importância de se manter um ambiente redutor (potencial redox baixo) durante a etapa de aquecimento para permitir uma redução significante nos níveis de impurezas relacionadas com produto durante a extração da proteína. Além disso os dados demonstram que este ambiente redutor é viabilizado através da aplicação de uma cobertura de nitrogênio e que quando não há nenhuma cobertura de nitrogênio, o potencial redox do ambiente é significantemente menos redutor resultando em níveis mais altos de impurezas relacionadas com produto.

Claims

1. Método para fabricar uma proteína de interesse em que a dita proteína é expressada em uma célula hospedeira bacteriana, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a) cultivar as ditas células hospedeiras sob condições tais que elas expressem a dita proteína, b) coletar as células hospedeiras do fluido de cultura de célula, c) adicionar tampão às ditas células hospedeiras, e d) submeter as células hospedeiras ao tratamento térmico realizao a 30oC a 70oC, em que o potencial redox do dito tampão é mantido abaixo de -0 mV durante o dito tratamento térmico, em que a dita proteína de interesse é um anticorpo recombinante ou um fragmento de anticorpo recombinante.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico é realizado em um recipiente e o dito potencial redox é mantido reduzindo-se a quantidade de oxigênio (O2) presente na fase gasosa no recipiente durante a extração da proteína.

3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que nitrogênio (N2) é adicionado à fase gasosa do recipiente.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita fase gasosa contém pelo menos 50 % de N2.

5. Método de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o dito N2 é adicionado ao recipiente como uma cobertura na fase gasosa do recipiente ou espargindo-se o N2 através da amostra.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de tratamento térmico é realizada de 55 °C a 65 °C.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a dita temperatura é mantida durante 1 a 18 horas.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o pH do tampão a seguir da adição às células hospedeiras e antes do tratamento térmico é medido.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o pH do tampão é ou é ajustado a um pH de 6 a 9.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína recombinante codificada em um vetor de expressão.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo recombinante ou fragmento de anticorpo recombinante especificamente se ligam ao TNF-alfa ou CD154.