BR112019024390A2

BR112019024390A2 - métodos de cultura celular

Info

Publication number: BR112019024390A2
Application number: BR112019024390-9A
Authority: BR
Inventors: Bassem Ben Yahia; Laetitia Malphettes; Nadine Kochanowski; Gill Renner; Sandrine Durran; Andrew Jeffrey Yates
Original assignee: Ucb Biopharma Sprl
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2018-05-29
Publication date: 2020-07-14
Also published as: JP7406593B2; JP2020521490A; GB201708655D0; CN110741077A; CA3065661A1; HRP20240585T1; RU2019143742A3; KR20200012972A; CO2019012871A2; RU2758674C2; RU2019143742A; MY193535A; JP2022153421A; EP3630946C0; AU2018276376B2; KR20240096888A; CL2019003459A1; US20200239923A1; JP7460370B2; MX2019014140A

Abstract

A presente invenção refere-se ao uso de quantidades limitadas de cisteína e triptofano no meio de cultura de células durante a produção de proteínas recombinantes, e em particular anticorpos. As proteínas e anticorpos produzidos sob tais condições controladas exibem heterogeneidade reduzida, em particular heterogeneidade de variantes de carga reduzida.

Description

“MÉTODOS DE CULTURA CELULAR” CAMPO DE INVENÇÃO

[0001] A presente invenção pertence ao campo da fabricação de proteínas recombinantes, particularmente anticorpos. Mais especificamente, refere-se a métodos de cultura de células para expressar proteínas com heterogeneidade reduzida durante a fabricação em escala comercial.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O desenvolvimento de proteínas recombinantes como proteínas terapêuticas, como anticorpos terapêuticos, requer a produção das proteínas recombinantes em escala industrial. Para o conseguir, podem ser usados diferentes sistemas de expressão, tanto procarióticos como eucarióticos. Nas últimas duas décadas, no entanto, a maioria das proteínas terapêuticas aprovadas como terapêuticas foi fabricada através de culturas de células de mamíferos e esse sistema permanece o sistema de expressão preferido para produzir grande quantidade de polipeptídeos recombinantes para uso humano.

[0003] As culturas de células de mamíferos, no entanto, apresentam desafios significativos. O título da proteína recombinante produzida é geralmente muito baixo em comparação com outros sistemas de produção eucariótica, como os baseados em leveduras e células de insetos.

[0004] Nos últimos 30 anos, muito esforço foi dedicado ao estabelecimento dos parâmetros básicos da cultura de células e expressão de polipeptídeos recombinantes, com muito foco da pesquisa dedicada a alcançar o crescimento celular ideal através de alterações na composição dos meios de cultura de células (ver, por exemplo, Hecklau C et al. J Biotech 218 (2016) 53-63; Zang Li. et al. Anal. Chem 83 (2011) 5.422-5.430) e condições operacionais e desenvolvimento de grandes biorreatores.

[0005] Embora o rendimento ainda seja um aspecto muito importante da cultura de células de mamíferos, nos últimos anos, o foco mudou no controle da qualidade do produto e da consistência do processo em todos os estágios de desenvolvimento e escala de produção. As proteínas terapêuticas produzidas por cultura de células de mamíferos exibem níveis variados de heterogeneidade. Essa heterogeneidade inclui, sem limitação, diferentes padrões de glicosilação, diferenças resultantes de desamidação ou oxidação, diferentes variantes de carga ou tamanho. A heterogeneidade das proteínas recombinantes também pode levar a diferenças na cor do produto, por exemplo, entre diferentes lotes da mesma proteína fabricada pelo mesmo processo de fabricação. Essa heterogeneidade e, em particular, diferenças na cor da proteína recombinante de interesse, tornam-se mais aparentes quando as proteínas terapêuticas são formuladas em altas concentrações. Nos últimos anos, tem havido uma tendência constante para a entrega subcutânea de proteínas terapêuticas, o que requer a formulação de proteínas terapêuticas em altas concentrações. Altas concentrações foram associadas a níveis crescentes de agregados (Purdie J., et al. Biotechnology Progress, 2016, 32, 998-1.008). Variantes de carga aumentadas, como níveis aumentados de espécies ácidas, podem afetar a estabilidade da proteína (Banks DD, et al. Jornal de ciências farmacêuticas, 2009, 98, 4501-10) enquanto a cor da proteína terapêutica concentrada pode ser mais intensa.

[0006] Condições de cultura de células, como a composição do meio (Kshirsagar R., et al. Biotechnology and Bioengineering, 109: 10, 2.523-2.532 (2012), US 2013/0281355; WO 2013/158275) e as condições de crescimento, incluindo pH e temperatura (US 8.765.413), demonstraram impactar os atributos de qualidade das proteínas terapêuticas. No entanto, permanece a necessidade de fornecer métodos de cultura de células melhorados para a produção de proteínas terapêuticas e, em particular, anticorpos terapêuticos com mínima heterogeneidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] A presente invenção aborda a necessidade acima identificada, reduzindo a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano no meio de cultura de células durante a fase de produção das proteínas recombinantes.

[0008] As seguintes modalidades específicas são descritas a seguir numeradas a seguir:

[0009] Modalidade 1: Um processo para a produção de uma proteína recombinante, que compreende:

a. cultivar células hospedeiras com capacidade de produzir uma proteína recombinante em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que a proteína recombinante é produzida pelas células, em que, durante a dita fase de produção, a cultura é suplementada com e cisteína ou cistina até uma quantidade total de 10% em peso a 30% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida; e/ou e triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 35% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, c. e, opcionalmente, recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células.

[0010] Modalidade 2. O processo de acordo com a Modalidade 1, em que a cultura é suplementada com cisteína ou cistina até uma quantidade total de 12% em peso a 28% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 12% em peso a 25% em peso, por exemplo, de 12% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

[0011] Modalidade 3. O processo de acordo com a Modalidade 1 ou 2, em que a cultura é suplementada com triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 30% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 8% em peso a 25% em peso, por exemplo, de 8% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

[0012] Modalidade 4. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 12 g/(107? células), como de 2,9 a 7 g/(10"? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(10? células), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção.

[0013] Modalidade 5. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a quantidade total de triptofano fornecida durante o processo é de 2,5 a 7 g/(10? células), como de 2,5 a 3,5 g/(107? células/I), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção.

[0014] Modalidade 1a: Um processo para a produção de uma proteína recombinante que compreende: a. cultivar células hospedeiras com capacidade de produzir uma proteína recombinante em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que a proteína recombinante é produzida pelas células, em que, durante a dita fase de produção, a cultura é suplementada com * cisteína ou cistina até uma quantidade total de 10% em peso a 30% em peso da quantidade total de proteína recombinante produzida; e/ou * triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 35% em peso da quantidade total de proteína recombinante produzida, c. e, opcionalmente, recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células.

[0015] Modalidade 2a. O processo de acordo com a Modalidade 1, em que a cultura é suplementada com cisteína ou cistina até uma quantidade total de 12% em peso a 28% em peso da quantidade total de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 12% em peso a 25% em peso, por exemplo, de 12% em peso a 20% em peso da quantidade total de proteína recombinante produzida.

[0016] Modalidade 3a. O processo de acordo com a Modalidade 1 ou 2, em que a cultura é suplementada com triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 30% em peso da quantidade total de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 8% em peso a 25% em peso, por exemplo, de 8% em peso a 20% em peso da quantidade total de proteína recombinante produzida.

[0017] Modalidade 4a. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 12 g/(10"? células), como de 2,9 a 7 g/(10"? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(107? células), em que células se refere à contagem de células viável integral no final da fase de produção.

[0018] Modalidade 5a. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a quantidade total de triptofano fornecida durante o processo é de 2,5 a 7 gl(10*? células), como de 2,5 a 3,5 g/(10"? células/l), em que células se refere à contagem de células viável integral no final da fase de produção.

[0019] Modalidade 6. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano na cultura é alcançada pela adição de cisteína ou cistina e/ou triptofano ao meio de cultura celular: a. no início da fase de produção, b. uma vez ou várias vezes em qualquer momento durante a fase de produção, c. através da adição contínua durante a fase de produção, ou d. em qualquer combinação de a., b.ec.

[0020] Modalidade 7. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o processo é um processo em batelada, como um processo em batelada alimentada.

[0021] Modalidade 8. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que cisteína ou cistina e/ou triptofano são fornecidos por adição diária durante a fase de produção.

[0022] Modalidade 9. O processo de acordo com a Modalidade 8, em que cisteína ou cistina é depletada na cultura antes da adição de cisteína ou cistina no dia seguinte, por exemplo, reduzindo a adição de cisteína ou cistina a um nível entre 5,6 e 7 g/(10? células), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção.

[0023] Modalidade 9a. O processo de acordo com a Modalidade 8, em que cisteína ou cistina é depletada na cultura antes da adição de cisteína ou cistina no dia seguinte, por exemplo, reduzindo a adição de cisteína ou cistina a um nível entre 5,6 e 7 g/(10"? células), em que células se refere à contagem de células viável integral no final da fase de produção.

[0024] Modalidade 10. O processo de acordo com a Modalidade 8 ou 9, em que durante o estágio final da produção, ou seja, quando as células já atingiram a densidade celular máxima viável, o triptofano é empobrecido na cultura antes que o triptofano seja adicionado no dia seguinte

[0025] Modalidade 11. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,9 g/l a qualquer momento da fase de produção, de preferência em que a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não exceda 0,3 g/l em nenhum momento da fase de produção.

[0026] Modalidade 12. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a concentração de triptofano no meio de cultura de células não excede 0,6 g/| a qualquer momento da fase de produção, preferencialmente em que a concentração de triptofano no meio de cultura de células não excede 0,3 g/|l a qualquer momento da fase de produção.

[0027] Modalidade 13. O processo, em que a fase de produção é realizada por pelo menos 7 dias, preferencialmente pelo menos 14 dias.

[0028] Modalidade 14. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que, a qualquer momento, durante a 2º metade da fase de produção: * a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e/ou e a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

[0029] Modalidade 15. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a qualquer momento da fase de produção: e a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e/ou e a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

[0030] Modalidade 14a. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que, a qualquer momento, durante a 2º metade da fase de produção: e a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade de proteína recombinante produzida; e/ou e a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade de proteína recombinante produzida.

[0031] Modalidade 15a. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a qualquer momento da fase de produção: * a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade de proteína recombinante produzida; e/ou * a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade de proteína recombinante produzida.

[0032] Modalidade 16. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que as células hospedeiras são células de mamíferos, preferencialmente células CHO.

[0033] Modalidade 17. O processo de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a proteína recombinante é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0034] Modalidade 18. O processo de acordo com a Modalidade 17, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é: 1) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que a. compreende CDR-H1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 1; CDR-H2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 2; CDR-H3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 3; CDR-L1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 4; CDR-L2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 5 e CDR-L3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 6; ou b. compreende uma região variável leve que possui a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada que possui a sequência definida na SEQ ID NO: 8; ou c. compreende uma região variável leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência como definida na SEQ ID NO: 8; d. compreende uma região variável leve que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 11; ou e. e compreende uma região variável leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade para a sequência como definida na SEQ ID NO: 11; ou 2) um anticorpo que compreende uma cadeia leve com a sequência definida na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada com a sequência definida na SEQ ID NO: 10; ou 3) um anticorpo que compreende uma cadeia leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência, conforme definido na SEQ ID NO: 10.

[0035] Modalidade 19. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que a fase de produção é realizada em um biorreator, de preferência com um volume igual ou superior a 50 |, igual ou superior a 100 |, igual ou superior a 500 |, igual ou superior a 1.000 |, igual ou superior a 2.000 |, igual ou superior a 5.000 |, igual ou superior a 10.000 | ou igual ou superior a 20.000 |.

[0036] Modalidade 20. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o processo compreende a etapa de recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células e uma etapa adicional de purificação da proteína recombinante.

[0037] Modalidade 21. O processo de acordo com a Modalidade 20, em que a purificação compreende cromatografia de proteína A.

[0038] Modalidade 22. O processo de acordo com a Modalidade 20 ou 21, compreendendo ainda a etapa de formulação da proteína recombinante purificada.

[0039] Modalidade 23. O processo de acordo com a Modalidade 22, em que a proteína recombinante é formulada em uma formulação líquida compreendendo um ou mais aminoácidos e um tensoativo.

[0040] Modalidade 24. O processo de acordo com a Modalidade 23, em que a formulação compreende histidina e/ou prolina.

[0041] Modalidade 25. O processo de acordo com a Modalidade 24, em que a formulação compreende histidina em uma concentração de 5 mM a 100 mM, por exemplo, uma concentração de 10 mM a 50 mM e/ou prolina em uma concentração de 100 mM a 500 mM, a um pH entre 5 e 7,4, como entre 5 e 6,5, por exemplo, entre 5e6.

[0042] Modalidade 26. O processo de acordo com a Modalidade 25, em que a formulação compreende histidina em uma concentração de 30 mM e prolina em uma concentração de 250 mM, a um pH entre 5,2 e 6,0, preferencialmente cerca de 5,6.

[0043] Modalidade 27. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades 23 a 26, em que o tensoativo é o polissorbato 80, de preferência em uma concentração de 0,001% a 0,1% (em p/v), por exemplo, 0,005% a 0,1%, como 0,01% a 0,1%, por exemplo, 0,01% a 0,05%, como 0,03%.

[0044] Modalidade 28. O processamento de acordo com qualquer uma das Modalidades 23 a 27, em que a proteína recombinante é um anticorpo e o anticorpo é formulado em uma concentração de 10 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 20 mg/ml a 250 mg/ml, como como 50 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 120 mg/ml a 160 mg/ml, como cerca de 140 mg/ml.

[0045] Modalidade 29. O processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores, em que o processo reduz a heterogeneidade das proteínas recombinantes produzidas, em que a dita redução de heterogeneidade compreende reduzir: a. heterogeneidade de carga, preferencialmente grupo de pico ácido (APG); e/ou b. oxidação de aminoácidos, isomerização, fragmentação, outros adutos covalentes glicação, desamidação, cisteinilação; e/ou c. cor ou intensidade da cor, por exemplo, entre diferentes lotes da proteína recombinante; e/ou d. espécies de alto peso molecular (HMWS); e/ou e. e instabilidade proteica recombinante.

[0046] Modalidade 30. O processo para a produção de uma proteína recombinante que compreende: a. cultivar células hospedeiras com capacidade de produzir uma proteína recombinante em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que a proteína recombinante é produzida pelas células e o meio de cultura de células é suplementado com cisteína ou cistina e/ou triptofano, em que .º a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 7 g/(107? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(10"? células), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção e/ou .º a quantidade total de triptofano fornecida durante o processo é de 2,5 a 3,5 g/(107? células), em que as células se referem à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção, c. e, opcionalmente, recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células.

[0047] Modalidade 30a. O processo para a produção de uma proteína recombinante que compreende: a. cultivar células hospedeiras com capacidade de produzir uma proteína recombinante em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que a proteína recombinante é produzida pelas células e o meio de cultura de células é suplementado com cisteína ou cistina e/ou triptofano, em que * a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 7 g/(10? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(10"? células), em que células se refere à contagem de células viável integral no final da fase de produção e/ou * a quantidade total de triptofano fornecida durante o processo é de 2,5 a 3,5 g/(107? células), em que células se refere à contagem de células viável integral no final da fase de produção, c. e, opcionalmente, recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células.

[0048] Modalidade 31. O processo de acordo com a Modalidade 30, em que o processo tem uma ou mais das características adicionais recitadas em qualquer uma das Modalidades 2 a 29.

[0049] Modalidade 32. Um método para reduzir a heterogeneidade da população de proteínas recombinantes em um lote produzido na fase de produção por células hospedeiras recombinantes que compreende limitar a quantidade total de a. cisteína ou cistina e/ou b. triptofano presente no meio de cultura de células durante a fase de produção da proteína recombinante.

[0050] Modalidade 33. O método de acordo com a Modalidade 32, em que o processo tem uma ou mais das características adicionais recitadas em qualquer uma das Modalidades 2 a 29.

[0051] Modalidade 34. Uma preparação de proteína recombinante obtenível ou obtida pelo processo de acordo com qualquer uma das Modalidades anteriores.

[0052] Modalidade 35. Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo, em que a composição tem uma ou mais das características adicionais recitadas em qualquer uma das Modalidades 23 a 28, de preferência em que o anticorpo é o anticorpo recitado na Modalidade 18.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0053] Figura 1: descrição da análise computacional para medir a quantidade total de aminoácidos cisteína ou cistina e triptofano adicionados ao longo da fase de produção realizada em um biorreator por porcentagem em peso da proteína recombinante produzida.

[0054] Figura 2: impacto da quantidade total adicionada de triptofano e cisteína ou cistina% em peso (g/g) do mAb1 total produzido no b*valor normalizado para 40 mg/ml (a) e variante do grupo de pico ácido (APG) (b), respectivamente. As concentrações máximas de triptofano e cisteína ou cistina não afetam o b*valor (c) ou a APG% (d).

[0055] Figura 3: impacto da quantidade total adicionada de triptofano e cisteína ou cistina% em peso do peso total de MAb1 produzido (9/g) no b*valor normalizado para 40 mg/ml (a) e variante do grupo de pico ácido (APG) (b), respectivamente, e falta de correlação para concentrações máximas de cisteína ou cistina (c) e triptofano (d) na APG.

[0056] Figura 4: modelo de regressão linear múltipla da variante do grupo de pico ácido (APG) do anticorpo monoclonal recombinante mAb1 como uma função do percentual em peso adicionado de quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano do mAb1 total produzido (g/g).

[0057] Figura 5: modelo de regressão linear múltipla da principal variante do grupo de pico do anticorpo monoclonal recombinante mAb1 em função da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada em percentual em peso da quantidade total de MAb1 recombinante produzido (9/g).

[0058] Figura 6: modelo de regressão linear múltipla da variante da espécie de alto peso molecular (HMWS) do anticorpo monoclonal recombinante mAb1 em função da quantidade total de cisteína ou cistina adicionada em percentual em peso do mAb1 recombinante total produzido (g/g).

[0059] Figura 7: modelo de regressão linear múltipla do b*valor normalizado para variante de 40 mg/ml do anticorpo monoclonal recombinante mAb1 em função da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado em percentual em peso do total de MAb1 recombinante produzido (9/g).

[0060] Figura 8: gráficos de contorno do impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionados em percentual em peso do mAb1 recombinante total produzido (g/g) em (a) espécies de alto peso molecular (HMWS) e (b) b*valor normalizado para 40 mg/ml (c) grupo de pico ácido (APG) e (d) principais variantes do grupo de pico. O quadrado tracejado da linha preta corresponde à quantidade total ideal de cisteína ou cistina e triptofano adicionada% em peso do mAb1 recombinante total produzido (g/g) a fim de reduzir o valor de APG, HMWS, b*valor normalizado para 40 mg/ml e aumentar o pico principal variante do grupo que corresponde a uma quantidade adicionada de 12,06 e 28,03% em peso de mAb1 total (g/g) produzido para cisteína ou cistina e entre 8,84 e 32,06% em peso de mAb1 total (g/g) produzido para triptofano.

[0061] Figura 9: o impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionou% em peso do peso do volume de cultura de células (CSV) na contagem de células viáveis integrais (IVCC) normalizadas no CSV. Um modelo de regressão linear múltipla do IVCC cumulativo normalizado para o CSV em função da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada em percentual em peso do CSV é mostrado em (a). A plotagem do contorno do impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada em percentual em peso do CSV no IVCC cumulativo normalizado ao CSV é mostrada em (b).

[0062] Figura 10: impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado ao meio de cultura de células durante a fase de produção em percentual em peso de CSV na titulação final de MAb1 medido pelo método HPLC (mAb HPLC). Um modelo de regressão linear múltipla do título final de mAb1 HPLC como uma função da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada em percentual em peso de CSV é mostrado em (a). A representação gráfica do contorno da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada em percentual em peso de CSV na titulação final de MAb HPLC é mostrada em (b).

[0063] Figura 11: plotagem de contorno do impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e de triptofano ao meio de cultura celular durante a fase de produção por IVCC*10-"2 no final da fase de produção em IVCC para a produção de 14 dias é mostrado em (a). Plotagem de contorno que mostra o impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e de triptofano ao meio de cultura celular durante a fase de produção por IVCC*10-"? no final da fase de produção em título final mAb HPLC é mostrado em (b). Descrição da análise computacional para medir a quantidade de amino ácidos cisteína ou cistina e de triptofano adicionado durante a fase de produção realizada em um biorreator por IVCC*10-? no final da fase de produção é mostrado em (c).

[0064] Figura 12: plotagem de contorno do impacto das concentrações máximas de cisteína ou cistina e triptofano atingidas no meio de cultura de células ao longo da fase de produção em IVCC normalizado para o CSV.

[0065] Figura 13: quantidade total de cisteína ou cisteína adicionada e Quantidade total de cisteína ou cisteína adicionada por IVCC para as condições descritas na Tabela 6.

[0066] Figura 14: impacto da depleção de cisteína ou cistina no crescimento celular e no título de mAb. O perfil de concentração celular viável (VCC) (a), os títulos de mAb (b) e as concentrações de Cys antes da adição de ração (c) são mostrados em função de três condições experimentais: sem depleção de cisteína ou cistina durante a fase de produção [Sem depleção - (34,35 g/l Cys na alimentação)] e duas condições com depleção diária de cisteína ou cistina, começando no dia 6 até o final da produção em batelada e com concentração de Cys na alimentação de 17,17 gle 6,87 gl.

[0067] Figura 15: o impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionou% em peso do anticorpo recombinante total produzido em peso em (a) APG e b*valor normalizado para 40 mg/ml da variante para mAb2; (b) na variante APG para mAb3 e (c) em APG, BPG (Basic Peak Group) e variantes do grupo principal para mMAbA.

[0068] Figura 16: o impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionou% em peso do mMAb1, mAb2, mAb3 e mAb4 recombinante total, que produziu peso no APG. Em (a), a variante APG de mAb1, mAb2, mAb3 e mAb4 foi plotada contra a quantidade total de cisteína ou cistina adicionada em percentual em peso do total de MAb1, mAb2, mAb3 e mAb4 recombinante total produzido em peso. Em (b), um modelo de regressão linear múltiplo da variante APG do anticorpo monocional recombinante mAb1, mAb2 e mAb3 e o anticorpo multiespecífico recombinante mAb4 foram plotados em função da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada em percentual em peso da massa total MAb recombinante produzido em peso.

[0069] Figura 17: a equação foi desenvolvida para prever o nível do grupo de pico ácido (APG) com base nos dados de uma linha celular DG44 CHO que expressa anticorpos mAb1 (Tabelas 3).

[0070] Figura 18: comparação do nível experimental do grupo de pico ácido (APG) (APG esp) com o nível previsto de APG (APG prev) de uma linha celular DG44 CHO que expressa anticorpos mAb1. Os dados foram gerados no processo de produção de perfusão usando a tecnologia de Fluxo Tangencial Alternado (ATF) em biorreatores de 21. A previsão do APG foi baseada na equação da figura 17.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0071] A invenção é baseada na constatação de que, limitando a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano usada no meio de cultura de células durante a fase de produção em um processo de fabricação de uma proteína recombinante, a heterogeneidade das proteínas recombinantes produzidas é reduzida. Portanto, a presente invenção ensina o uso de uma quantidade limitada de cisteína ou cistina e/ou triptofano no meio de cultura de células para reduzir a heterogeneidade de um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, expresso no meio.

[0072] A heterogeneidade reduzida é preferencialmente em relação a: a. carga, preferencialmente heterogeneidade do grupo de pico ácido (APG); e/ou b. oxidação de aminoácidos, isomerização, fragmentação, outros adutos covalentes glicação, desamidação, cisteinilação; e/ou c. cor ou intensidade da cor (b*valor normalizado para 40 mg/ml); e/ou d. formação de espécies de alto peso molecular (HMWS); e/ou e. e instabilidade proteica recombinante e/ou f. combinações dos mesmos.

[0073] O termo “heterogeneidade”, conforme usado aqui, se refere a diferenças entre moléculas individuais, por exemplo, proteínas recombinantes, em uma população de moléculas produzidas pelo mesmo processo de fabricação ou dentro do mesmo lote de fabricação. A heterogeneidade pode resultar de modificações incompletas ou não homogêneas das proteínas recombinantes, por exemplo, devido a modificações pós-traducionais da proteína expressa. Tais modificações podem ser o resultado de reações de desaminação e/ou reações de oxidação e/ou adição covalente de pequenas moléculas, como reações de glicação e/ou reações de isomerização e/ou reações de fragmentação e/ou outras reações e também incluem variação nos padrões de glicação A manifestação quimio-física de tal heterogeneidade leva a várias características nas preparações proteicas recombinantes resultantes que incluem, sem limitação, perfil de variante de carga, intensidade de cor ou intensidade de cor e perfil de peso molecular.

[0074] O termo “fase de produção” de acordo com a presente invenção compreende o estágio de cultura celular durante o processo de fabricação de uma proteína recombinante quando as células expressam (isto é, produzem) a proteína recombinante (ou proteínas recombinantes). A fase de produção começa quando o título do produto desejado é aumentado e termina com a coleta das células ou do fluido ou sobrenadante da cultura celular. Tipicamente, no início da fase de produção, a cultura celular é transferida para um biorreator. A coleta é a etapa durante a qual o fluido da cultura de células é removido do vaso de produção, por exemplo, para que a proteína recombinante, por exemplo, o anticorpo recombinante, seja recuperada e purificada nas etapas subsequentes. O termo “peso inicial da cultura de células”, quando usado aqui, se refere ao peso da cultura no início da fase de produção, tipicamente o peso após a inoculação do biorreator.

[0075] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um processo para a produção de uma proteína recombinante que compreende: a. cultivar células hospedeiras com capacidade de produzir uma proteína recombinante em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que a proteína recombinante é produzida pelas células, em que, durante a dita fase de produção, a cultura é suplementada com a. cisteína ou cistina até uma quantidade total de 10% em peso a 30% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida; e/ou b. triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 35% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, e, opcionalmente, recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células.

[0076] Como será evidente a partir da descrição da invenção a seguir, a cultura é suplementada com cisteína ou cistina e/ou triptofano; essa suplementação pode ser realizada com:

1. cisteína; ou

2. cistina; ou

3. cisteína e cistina; ou

4. cisteína e triptofano; ou

5. cistina e triptofano; ou

6. cisteína, cistina e triptofano; ou

7. triptofano.

[0077] Quando usadas neste documento, as expressões “quantidade total de cisteína ou cistina” ou “cisteína ou cistina até uma quantidade total” referem-se a a) a quantidade total de cisteína isolada se nenhuma cistina for usada para o processo, b) a quantidade total de cistina isolada se não houver cisteína usada para o processo ou c) a quantidade total de cisteína + cistina se ambos os compostos forem usados para o processo. A cisteína e a cistina no meio de cultura de células estão em equilíbrio constante, em que duas moléculas de cisteína se oxidam em uma molécula de cistina e reduzem de volta a duas moléculas de cisteína.

[0078] A quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano pode ser expressa aqui como uma porcentagem da quantidade total de proteína recombinante produzida. O termo “% em peso”, conforme usado aqui, se refere à porcentagem de peso. “Total” se refere à quantidade total determinada no final da fase de produção, ou seja, a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano adicionada ao longo da fase de produção e a quantidade total de proteína recombinante produzida ao longo de a fase de produção, em que a quantidade total de proteína recombinante produzida é medida no final da fase de produção.

[0079] A Figura 1 mostra como é calculada a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano por% em peso de proteína recombinante produzida. A quantidade total de cisteína ou cistina ou triptofano adicionada é calculada em função da taxa de alimentação (ou volume de alimentação) e da concentração de cisteína ou cistina ou triptofano nessa alimentação e a concentração de cisteína ou cistina ou triptofano no meio em que a alimentação é adicionada por volume de alimentação adicionada (Figura 1, A). A quantidade de proteína recombinante produzida é calculada em função do volume final do meio de cultura de células e do título final da proteína recombinante (Figura 1, B). A razão desses dois parâmetros calculados é a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano adicionado por quantidade de proteína recombinante produzida (Figura 1, C).

[0080] As células hospedeiras podem inicialmente (na etapa a.) ser cultivadas em um meio de cultura de células que pode ou não incluir já cisteína ou cistina e triptofano. Se o meio de cultura de células já incluir uma quantidade inicial de cisteína ou cistina e/ou triptofano, a quantidade total incluirá essa quantidade inicial.

[0081] Em uma modalidade do processo da invenção, a cultura é suplementada com cisteína ou cistina até uma quantidade total de 12,06% em peso a 28,03% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 12% em peso a 28% em peso, por exemplo, de 12% em peso a 25% em peso, como de 12% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

[0082] Em outra modalidade do processo da invenção, em que a cultura é suplementada com triptofano até uma quantidade total de 8,84% em peso a 32,06% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 8% em percentual em peso a 30% em peso, por exemplo, de 8% em peso a 25% em peso, como de 8% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

[0083] Alternativamente, a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano pode ser expressa como a quantidade total adicionada durante o processo em relação à contagem de células viável integral no final da fase de produção. Em uma modalidade, a quantidade total de cisteína e/ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 12 g/(107? células), como de 2,9 a 7 g/(10? células), por exemplo, de 5,6 a 7 gl(107? células), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção. Em outra modalidade, a quantidade total de triptofano fornecida durante o processo é de 2,5 a 7 g/(10"? células), como de 2,5 a 3,5 g/(107? células/I), em que células se refere à viabilidade integral esperada contagem de células no final da fase de produção.

[0084] Deve ser entendido que o versado saberia como medir a quantidade de cisteína ou cistina e/ou triptofano adicionada e/ou presente em uma cultura de células em uma fase específica, como a fase de produção. Por exemplo, isso pode ser feito como descrito nos Exemplos aqui. Do mesmo modo, o versado saberia como medir a quantidade total de proteína recombinante produzida por uma cultura de células e, consequentemente, aplicar os ensinamentos da presente invenção para alcançar o efeito técnico desejado. Por exemplo, isso pode ser feito conforme descrito nos Exemplos deste documento, como o uso de um analisador de modelo ForteBio Octet (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) ou cromatografia líquida de alta pressão da proteína A (HPLC) com amostras de sobrenadante de cultura de células que foram armazenados a -80 ºC antes da análise.

[0085] Para projetar um processo de acordo com a invenção, em que as quantidades de cisteína ou cistina e/ou triptofano por quantidade total esperada de proteína recombinante produzida são mantidas dentro de certos intervalos, pode ser necessário realizar uma ou mais experiências iniciais para determinar a níveis aproximados de proteína recombinante produzida por células hospedeiras particulares sob condições de cultura específicas. Uma vez conhecidos os níveis totais aproximados de proteína recombinante produzida, um processo de acordo com a invenção pode ser projetado em que as quantidades de cisteína ou cistina e/ou triptofano por quantidade total esperada de proteína recombinante produzida são mantidas dentro dos limites especificados.

[0086] Várias estratégias podem ser empregues para atingir a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano no meio de cultura de células durante a fase de produção. Em uma modalidade, a quantidade total pode ser alcançada adicionando cisteína ou cistina e/ou triptofano logo no início da fase de produção, por exemplo, apenas uma vez ou como já incluído no meio de cultura de células de produção. Em outra modalidade, a quantidade total pode ser alcançada pela soma de adições, por exemplo, adição diária ou adição contínua, durante a fase de produção. Em ainda outra modalidade, a quantidade total pode ser alcançada por uma combinação da concentração inicial de cisteína/cisteína e/ou triptofano no fluido de cultura de células no início da fase de produção e por meio de adições.

[0087] Por conseguinte, em uma modalidade do processo da invenção, a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano no meio de cultura de células é atingida pela adição de cisteína ou cistina e/ou triptofano ao meio de cultura de células: a. no início da fase de produção, b. uma vez ou várias vezes em qualquer momento durante a fase de produção, c. através da adição contínua durante a fase de produção, ou d. em qualquer combinação de a., b.ec.

[0088] Em uma modalidade preferencial, a cisteína ou cistina e/ou triptofano são adicionadas no início da fase de produção e adicionadas através de adições diárias de bolus durante a fase de produção. Preferencialmente, a fase de produção dura pelo menos 7 dias, com mais preferência por mais de 7 dias, como 10 dias, com mais preferência por 14 ou mais dias.

[0089] Em uma modalidade preferencial, a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,9 g/l em qualquer momento durante a fase de produção, preferencialmente a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,3 g/l em qualquer momento durante a fase de produção.

[0090] Além disso, em uma modalidade preferencial, a concentração de triptofano no meio de cultura de células não excede 0,6 g/l em qualquer momento durante a fase de produção, preferencialmente a concentração de triptofano no meio de cultura de células não excede 0,3 g/l em qualquer momento durante a fase de produção.

[0091] Em uma modalidade, cisteína ou cistina são adicionadas diariamente ao meio de cultura de células e, no dia 6, a cisteína ou cistina no meio de cultura de células aumenta uma concentração máxima de 0,3 g/l, e do dia 7 ao 14 a cisteína ou cistina em o meio de cultura celular aumenta para uma concentração máxima de 0,9 gl.

[0092] Em algumas modalidades, as quantidades de cisteína ou cistina e/ou triptofano não estão apenas dentro dos intervalos especificados quando calculadas durante toda a fase de produção no final da fase de produção, mas também a qualquer momento durante partes da fase de produção ou mesmo a qualquer momento durante toda a fase de produção. Assim, em uma modalidade, a qualquer momento da 2º metade da fase de produção (por exemplo, dias 7 a 14 de uma fase de produção de 14 dias): + a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e/ou * a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

[0093] Em outra modalidade, a qualquer momento da fase de produção: + a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e/ou * a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

[0094] Quando cisteína ou cistina é fornecida às células através de adições diárias, a cisteína ou cistina pode ser depletada na cultura antes da próxima adição diária ser fornecida. Em uma modalidade, cisteína ou cistina é depletada na cultura antes da adição de cisteína ou cistina no dia seguinte, por exemplo, reduzindo a adição de cisteína ou cistina a um nível entre 5,6 e 7 g/[10"? células) Em uma segunda modalidade, o triptofano é empobrecido na cultura durante a cultura celular durante o estágio final da produção, isto é, quando as células já atingiram a densidade celular viável máxima, por exemplo, iniciando a depleção no dia 8 ou posterior em uma fase de produção de 14 dias.

[0095] Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que, apesar da cisteíina ou cistina estar depletada, as células na fase de produção não permaneçam privadas de cisteína ou cistina, mas a hipótese é de que possuem um mecanismo interno destinado a armazenar a cisteína ou cistina disponibilizada no meio de cultura de células, por adição, como um metabólito inativo, que pode ser convertido em cisteína ou cistina quando ocorre a depleção.

[0096] Em um outro aspecto independente, a invenção se refere a um processo para a produção de uma proteína recombinante que compreende: a. cultivar células hospedeiras com capacidade de produzir uma proteína recombinante em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que a proteína recombinante é produzida pelas células e o meio de cultura de células é suplementado com cisteína ou cistina e/ou triptofano, em que * a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 7 g/(107? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(10"? células), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção e/ou e a quantidade total de triptofano fornecida durante o processo é de 2,5 a 3,5 g/(107? células), em que as células se referem à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção, c. e, opcionalmente, recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células.

[0097] Em uma modalidade desse processo, o meio de cultura de células é suplementado com cisteína ou cistina até uma quantidade total de 12% em peso a 28% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 12% em percentual em peso a 25% em peso, por exemplo, de 12% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

[0098] Em outra modalidade desse processo, o meio de cultura de células é suplementado com triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 30% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 8% em peso a 25% em peso, por exemplo, de 8% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

[0099] Em outra modalidade desse processo, a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano no meio de cultura de células é atingida pela adição de cisteína ou cistina e/ou triptofano ao meio de cultura de células: a. no início da fase de produção, b. uma vez ou várias vezes em qualquer momento durante a fase de produção, c. através da adição contínua durante a fase de produção, ou d. em qualquer combinação de a., b. ec.

[0100] Em outra modalidade desse processo, o processo é um processo em batelada, como um processo em batelada alimentada. Em outra modalidade desse processo, a cisteína ou cistina e/ou triptofano são fornecidas por adição diária durante a fase de produção.

[0101] Em outra modalidade desse processo, a cisteína ou cistina é depletada no meio de cultura de células antes da adição de cisteína ou cistina no dia seguinte, por exemplo, reduzindo a adição de cisteína ou cistina a um nível entre 5,6 e 7 g/[10"? células].

[0102] Em outra forma de realização desse processo, durante o estágio final de produção, isto é, quando as células já atingiram a densidade celular máxima viável, o triptofano é depletado no meio de cultura celular antes do triptofano ser adicionado no dia seguinte.

[0103] Em outra modalidade desse processo, a concentração de cisteína ou cistina na cultura de células não excede 0,9 g/| a qualquer momento durante a fase de produção, preferencialmente em que a concentração de cisteína ou cistina na cultura de células não excede 0,3 g/| a qualquer momento da fase de produção.

[0104] Em outra modalidade desse processo, a concentração de triptofano na cultura de células não excede 0,6 g/l! em qualquer momento durante a fase de produção, de preferência em que a concentração de triptofano na cultura de células não excede 0,3 g/| em qualquer momento durante a fase de produção.

[0105] Em outra modalidade desse processo, a fase de produção é realizada por pelo menos 7 dias, preferencialmente pelo menos 14 dias.

[0106] Em uma modalidade desse processo, a qualquer momento durante a 2º metade da fase de produção: a. a quantidade de cisteína ou cistina no meio de cultura de células é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e/ou b. a quantidade de triptofano no meio de cultura de células é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

[0107] Em outra modalidade desse processo, a qualquer momento da fase de produção: a. a quantidade de cisteína ou cistina é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e/ou b. a quantidade de triptofano é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

[0108] Em outra forma de realização desse processo, as células hospedeiras são células de mamífero, de preferência células CHO.

[0109] Em outra modalidade desse processo, a proteína recombinante é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno.

[0110] Em outra modalidade desse processo, a fase de produção é realizada em um biorreator, de preferência com um volume igual ou superior a 50 L, igual ou superior a 100 L, igual ou superior a 500 L, igual ou superior a 1.000 L, igual ou superior a 2.000 L, igual ou superior a 5.000 L, igual ou superior a 10.000 L ou igual ou superior a 20.000 L.

[0111] Em uma modalidade desse processo, o processo compreende a etapa de recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células e uma etapa adicional de purificação da proteína recombinante.

[0112] Em uma outra modalidade desse processo, a purificação compreende cromatografia de proteína A.

[0113] Em uma outra modalidade desse processo, o processo compreende ainda a etapa de formulação da proteína recombinante purificada.

[0114] Em uma modalidade desse processo, a proteína recombinante é formulada em uma formulação líquida compreendendo um ou mais aminoácidos e um tensoativo.

[0115] Em uma outra modalidade desse processo, a formulação compreende histidina e/ou prolina.

[0116] Em uma modalidade ainda mais adicional desse processo, a formulação compreende histidina em uma concentração de 5 mM a 100 mM, por exemplo, uma concentração de 10 mM a 50 mM e/ou prolina em uma concentração de 100 mM a 500 mM, a um pH entre 5 e 7,4, como entre 5 e 6,5, por exemplo, entre 5 e 6, como entre 5,5e 6.

[0117] Em uma modalidade ainda mais adicional desse processo, a formulação compreende histidina em uma concentração de 30 mM e prolihna em uma concentração de 250 mM, a um pH entre 5,2 e 6,0, como cerca de 5,6.

[0118] Em outra modalidade desse processo, o tensoativo é o polissorbato 80, de preferência em uma concentração de 0,001% a 0,1% (em p/v), por exemplo, 0,005% a 0,1%, como 0,01% a 0,1%, por exemplo, 0,01% a 0,05%, como 0,03%.

[0119] Em uma modalidade ainda mais adicional desse processo, a proteína recombinante é um anticorpo e o anticorpo é formulado em uma concentração de 10 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 20 mg/ml a 250 mg/ml, como 50 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 120 mg/ml a 160 mg/ml, como cerca de 140 mg/ml.

[0120] Em outra modalidade desse processo, o processo reduz a heterogeneidade das proteínas recombinantes produzidas, em que a dita redução de heterogeneidade compreende reduzir: a. heterogeneidade de carga, preferencialmente grupo de pico ácido (APG); e/ou b. oxidação de aminoácidos, isomerização, fragmentação, outros adutos covalentes glicação, desamidação, cisteinilação; e/ou c. cor ou intensidade da cor, por exemplo, entre diferentes lotes da proteína recombinante; e/ou d. espécies de alto peso molecular (HMWS); e/ou e. e instabilidade proteica recombinante.

[0121] Em um outro aspecto independente, a invenção se refere a um método para reduzir a heterogeneidade da população de proteínas recombinantes em um lote produzido na fase de produção por células hospedeiras recombinantes, que compreende limitar a quantidade total de a. cisteína ou cistina e/ou b. triptofano presente no meio de cultura de células durante a fase de produção da proteína recombinante.

[0122] Em uma modalidade, o método compreende: a. cultivar células hospedeiras com capacidade de produzir uma proteína recombinante em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que a proteína recombinante é produzida pelas células, em que, durante a dita fase de produção, a cultura é suplementada com e cisteína ou cistina até uma quantidade total de 10% em peso a 30% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida; e/ou * triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 35% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, e, opcionalmente, recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células.

[0123] Em uma modalidade do método, a cultura é suplementada com cisteína ou cistina até uma quantidade total de 12% em peso a 28% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 12% em peso a 25% em peso, por exemplo, de 12% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

[0124] Em outra modalidade do método, a cultura é suplementada com triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 30% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 8% em peso a 25% em percentual em peso, por exemplo, de 8% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

[0125] Em outra modalidade do método, a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 12 g/(107? células), como de 2,9 a 7 g/(10'? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(107? células), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção. .

[0126] Em outra modalidade do método, a quantidade total de triptofano fornecida durante o processo é de 2,5 a 7 g/(10"? células), como de 2,5 a 3,5 g/(10? células/l), em que células se refere à contagem de células viáveis integrais esperada no final da fase de produção.

[0127] Em outra modalidade do método, a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano no meio de cultura de células é atingida pela adição de cisteína ou cistina e/ou triptofano ao meio de cultura de células: a. no início da fase de produção, b. uma vez ou várias vezes em qualquer momento durante a fase de produção, c. através da adição contínua durante a fase de produção, ou d. em qualquer combinação de a., b. ec.

[0128] Em outra modalidade do método, o processo é um processo em batelada, como um processo em batelada alimentada.

[0129] Em outra modalidade do método, cisteína ou cistina e/ou triptofano são fornecidos por adição diária durante a fase de produção.

[0130] Em outra modalidade do método, cisteína ou cistina é depletada no meio de cultura de células antes da adição de cisteína ou cistina no dia seguinte, por exemplo, reduzindo a adição de cisteína ou cistina a um nível entre 5,6 e 7 g/[10"? células].

[0131] Em outra forma de realização do método, durante o estágio final da produção, isto é, quando as células já atingiram a densidade celular máxima viável, o triptofano é depletado no meio de cultura celular antes do triptofano ser adicionado no dia seguinte.

[0132] Em outra modalidade do método, a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,9 g/l a qualquer momento da fase de produção, preferencialmente em que a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,3 g/l a qualquer momento durante a fase de produção.

[0133] Em outra modalidade do método, a concentração de triptofano no meio de cultura de células não excede 0,6 g/l em qualquer momento durante a fase de produção, preferencialmente em que a concentração de triptofano no meio de cultura de células não excede 0,3 g/| em qualquer ponto de tempo durante a fase de produção.

[0134] Em outra modalidade do método, a fase de produção é realizada por pelo menos 7 dias, preferencialmente pelo menos 14 dias.

[0135] Em outra forma de realização do método, a qualquer ponto de tempo durante a metade 2º da fase de produção: e a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e/ou *e a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

[0136] Em outra modalidade do método, a qualquer momento da fase de produção: * a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e/ou * a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

[0137] Em outra modalidade do método, as células hospedeiras são células de mamífero, preferencialmente células CHO.

[0138] Em outra modalidade do método, a proteína recombinante é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno.

[0139] Em outra modalidade do método, a fase de produção é realizada em um biorreator, de preferência com um volume igual ou superior a 50 L, igual ou superior a 100 L, igual ou superior a 500 L, igual ou superior a 1.000 L, igual ou superior a 2.000 L, igual ou superior a 5.000 L, igual ou superior a 10.000 L ou igual ou superior a

20.000 L.

[0140] Em uma modalidade deste método, o método compreende a etapa de recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células e uma etapa adicional de purificação da proteína recombinante.

[0141] Em uma outra modalidade deste método, a purificação compreende cromatografia de proteína A.

[0142] Em uma modalidade adicional deste método, o método compreende ainda a etapa de formulação da proteína recombinante purificada.

[0143] Em uma modalidade deste método, a proteína recombinante é formulada em uma formulação líquida compreendendo um ou mais aminoácidos e um tensoativo.

[0144] Em uma outra modalidade deste método, a formulação compreende histidina e/ou prolina.

[0145] Em uma modalidade ainda mais adicional deste método, a formulação compreende histidina em uma concentração de 5 mM a 100 mM, por exemplo, uma concentração de 10 mM a 50 mM e/ou prolina em uma concentração de 100 mM a 500 mM, a um pH entre 5 e 7,4, como entre 5 e 6,5, por exemplo, entre 5 e 6, como entre 5,5e 6.

[0146] Em uma modalidade ainda mais adicional deste método, a formulação compreende histidina em uma concentração de 30 mM e prolihna em uma concentração de 250 mM, a um pH entre 5,2 e 6,0, como cerca de 5,6.

[0147] Em outra modalidade deste método, o tensoativo é o polissorbato 80, preferencialmente em uma concentração de 0,001% a 0,1% (em p/v), por exemplo, 0,005% a 0,1%, como 0,01% a 0,1%, por exemplo, 0,01% a 0,05%, como 0,03%.

[0148] Em uma modalidade ainda mais adicional deste método, a proteína recombinante é um anticorpo e o anticorpo é formulado em uma concentração de 10 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 20 mg/ml a 250 mg/ml, como 50 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 120 mg/ml a 160 mg/ml, como cerca de 140 mg/ml.

[0149] Em outra modalidade do método, o método reduz a heterogeneidade das proteínas recombinantes produzidas, em que a dita redução de heterogeneidade compreende reduzir: a. heterogeneidade de carga, preferencialmente grupo de pico ácido (APG); e/ou b. oxidação de aminoácidos, isomerização, fragmentação, outros adutos covalentes glicação, desamidação, cisteinilação; e/ou c. cor ou intensidade da cor, por exemplo, entre diferentes lotes da proteína recombinante; e/ou d. espécies de alto peso molecular (HMWS); e/ou e. instabilidade proteica recombinante.

[0150] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma preparação de proteína recombinante obtenível ou obtida pelo processo de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a preparação é uma preparação em massa. Em outras modalidades, por exemplo, quando o processo compreende etapas adicionais de formulação do produto proteico, a preparação obtida é uma preparação formulada de proteína, por exemplo, uma preparação adequada para administração a um paciente.

[0151] As proteínas recombinantes, de preferência os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, na dita preparação assim obtida, exibem heterogeneidade reduzida em relação às mesmas proteínas recombinantes obtidas com o mesmo processo, mas em que a quantidade total de cisteína ou cistina e/ou triptofano durante a fase de produção não é limitado como descrito na presente invenção.

[0152] Ainda em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo, em que a composição é uma composição de formulação líquida de um ou mais aminoácidos e um tensoativo.

[0153] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende histidina e/ou prolina.

[0154] Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica compreende histidina e/ou prolina.

[0155] Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende histidina em uma concentração de 5 mM a 100 mM, por exemplo, uma concentração de 10 mM a 50 mM e/ou prolina em uma concentração de 100 mM a 500 mM, a um pH entre 5 e 7,4, como entre 5 e 6,5, por exemplo, entre 5 e 6, como entre 5,5 e 6.

[0156] Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende histidina em uma concentração de 30 mM e prolina em uma concentração de 250 mM, a um pH entre 5,2 e 6,0, como cerca de 5,6.

[0157] Em uma modalidade adicional da composição farmacêutica, o tensoativo é o polissorbato 80, preferencialmente em uma concentração de 0,001% a 0,1% (em p/v), por exemplo, 0,005% a 0,1%, como 0,01% a 0,1%, por exemplo, 0,01% a 0,05%, como 0,03%.

[0158] Em uma modalidade adicional da composição farmacêutica, o anticorpo é formulado em uma concentração de 10 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 20 mg/ml a 250 mg/ml, como 50 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 120 mg/ml a 160 mg/ml, como cerca de 140 mg/ml.

[0159] Em uma modalidade adicional da composição farmacêutica, o anticorpo é 1) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que a. compreende CDR-H1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 1; CDR-H2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 2; CDR-H3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 3; CDR-L1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 4; CDR-L2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 5 e CDR-L3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 6; ou b. compreende uma região variável leve que possui a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada que possui a sequência definida na SEQ ID NO: 8; ou c. compreende uma região variável leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência como definida na SEQ ID NO: 8;

d. compreende uma região variável leve que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 11; ou e. e compreende uma região variável leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade para a sequência como definida na SEQ ID NO: 11; ou 2) um anticorpo que compreende uma cadeia leve com a sequência definida na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada com a sequência definida na SEQ ID NO: 10; ou 3) um anticorpo que compreende uma cadeia leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência, conforme definido na SEQ ID NO: 10. Células hospedeiras e condições de cultura

[0160] A proteína recombinante, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode, de preferência, ser produzido por cultura de células hospedeiras de mamífero, com mais preferência células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[0161] O termo “cultura de células” ou suas variações gramaticais inclui, mas não se limita a, uma pluralidade de células hospedeiras, preferencialmente células hospedeiras de mamíferos, adequadamente projetadas e/ou manipuladas para expressar (por exemplo, produzir) uma ou mais proteínas recombinantes mantidas ou cultivadas em meio de cultura celular por um período de tempo específico, por exemplo, a fase de produção.

[0162] Células de mamíferos, e em particular células CHO, podem ser cultivadas em qualquer meio que suporte seu crescimento e expressão da proteína recombinante, de preferência o meio é um meio isento de produtos derivados de animais, como soro e peptona. Existem diferentes meios de cultura de células disponíveis para o versado na técnica, cada meio compreendendo diferentes combinações de vitaminas, aminoácidos, hormônios, fatores de crescimento, íons, tampões, nucleosídeos, glicose ou uma fonte de energia equivalente, presente em concentrações apropriadas para permitir crescimento celular e produção de proteínas. Meios adequados foram, por exemplo, descritos nos documentos WO98/08934 e US2006/0148074 (ambos aqui incorporados na sua totalidade). Outros meios adequados comercialmente disponíveis que podem ser usados na presente invenção ou modificados para atender aos requisitos de cisteína/cisteína e/ou triptofano incluem o meio AMpliCHO CD, meio Dynamis'Y, sistema Fed-batch EX-CELL º Advanced" CHO, CD FortiCHO Meio'!Y“, meio CP OptiCHOTY, meio essencial mínimo (MEM), meio BalanCD º CHO Growth A, meio ActiPro!Y, meio Eagle modificado por DMEM — Dulbecco e meio RPMI-1640,

[0163] A cultura de células pode ocorrer em qualquer recipiente adequado, como um balão de agitação ou um biorreator, que pode ou não ser operado no modo de lote alimentado, dependendo da escala de produção necessária. Esses biorreatores podem ser reatores de tanque agitado ou de elevação de ar. Vários biorreatores de grande escala estão disponíveis com uma capacidade de mais de 1.000 | a 50.000 |, preferencialmente entre 5.000 | e 20.000 | ou 10.000 |. Como alternativa, também podem ser usados biorreatores de escala menor, como entre 2 | e 100 | para fabricar um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[0164] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, independentemente de onde seja realizada qualquer fase anterior (isto é, uma fase de expansão), a fase de produção é realizada em um biorreator ou em qualquer outro recipiente de cultura de suspensão, como balão de agitação ou balão rotativo. A fase de produção é operada preferencialmente no modo de batelada, mas qualquer outro modo, como batelada, perfusão ou quimiostato, pode ser usado como uma alternativa. Nos casos de uma perfusão ou quimiostato, as proporções das quantidades totais de cisteína ou cisteína e/ou triptofano usadas são calculadas de acordo com a taxa de fluxo de perfusão versus a taxa de remoção da proteína recombinante produzida a partir do vaso de produção.

[0165] Em uma modalidade, o processo compreende a etapa de recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células e uma etapa adicional de purificação da proteína recombinante.

[0166] Em uma outra modalidade, a purificação compreende cromatografia de proteína A.

[0167] Em uma modalidade adicional, o processo compreende ainda a etapa de formulação da proteína recombinante purificada.

[0168] Em uma modalidade, a proteína recombinante é formulada em uma formulação líquida compreendendo um ou mais aminoácidos e um tensoativo.

[0169] Em uma outra modalidade, a formulação compreende histidina e/ou prolina.

[0170] Em uma modalidade ainda mais adicional, a formulação compreende histidina em uma concentração de 5 mM a 100 mM, por exemplo, uma concentração de 10 mM a 50 mM e/ou prolina em uma concentração de 100 mM a 500 mM, a um pH entre 5 e 7,4, como entre 5 e 6,5, por exemplo, entre 5 e 6, como entre 5,5 e 6.

[0171] Em uma modalidade ainda mais adicional, a formulação compreende histidina em uma concentração de 30 mM e prolina em uma concentração de 250 mM, a um pH entre 5,2 e 6,0, como cerca de 5,6.

[0172] Em outra modalidade, o tensoativo é o polissorbato 80, de preferência em uma concentração de 0,001% a 0,1% (em p/v), por exemplo, 0,005% a 0,1%, como 0,01% a 0,1%, por exemplo, 0,01% a 0,05%, como 0,03%.

[0173] Em uma modalidade ainda mais adicional, a proteína recombinante é um anticorpo e o anticorpo é formulado em uma concentração de 10 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 20 mg/ml a 250 mg/ml, como 50 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 120 mg/ml a 160 mg/ml, como cerca de 140 mg/ml.

[0174] A proteína recombinante, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, é tipicamente encontrada no sobrenadante de uma cultura de células de mamíferos, tipicamente uma cultura de células CHO. Para células hospedeiras CHO, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é secretado no sobrenadante e o referido sobrenadante pode ser coletado por métodos conhecidos na técnica, tipicamente por centrifugação.

Proteínas recombinantes que podem ser produzidas usando o processo da invenção

[0175] O processo da invenção pode ser usado para produzir qualquer tipo de polipeptídeo ou proteína recombinante, incluindo, por exemplo, peptídeos ou proteínas maiores com estrutura terciária significativa, bem como, por exemplo, glicoproteínas e proteínas multiméricas. Contudo, de preferência, a proteína recombinante produzida no processo de acordo com a invenção é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno. O termo “anticorpo” ou “anticorpos”, conforme aqui usado, inclui, por exemplo, anticorpos monoclonais e policlonais, bem como anticorpos monoespecíficos e multiespecíficos, como biespecíficos.

[0176] “Anticorpo” ou “anticorpos” incluem anticorpos de qualquer espécie, em particular de espécies de mamíferos, tipicamente com duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, anticorpos humanos de qualquer isótipo, incluindo IgA, IgA>2, IgD, IgG, IgG2a, I9G2r, I9G3, IgG1 IgE e IgM e suas variantes modificadas, anticorpos de primatas não humanos, por exemplo, de chimpanzé, babuíno, macaco rhesus ou cinomolgo, anticorpos de roedores, por exemplo, de camundongo, rato ou coelho; anticorpos de cabra ou cavalo e seus derivados, ou de espécies de aves como anticorpos de galinha ou de espécies de peixes como anticorpos de tubarão. O termo “anticorpo” ou “anticorpos” também se refere a anticorpos “quiméricos” nos quais uma primeira porção de pelo menos uma sequência de anticorpos de cadeia pesada e/ou leve é de uma primeira espécie e uma segunda porção da cadeia pesada e/ou leve sequência de anticorpos é de uma segunda espécie. Os anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos “primatizados” compreendendo sequências de ligação a antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, macaco do Velho Mundo, como macaco babuíno, rhesus ou cinomolgo) e sequências de região constante humana. Anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência derivada de anticorpos não humanos. Na maior parte, os anticorpos humanizados são anticorpos humanos (anticorpo receptor) nos quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável ou região determinante da complementaridade (CDR) de uma espécie não humana (anticorpo doador), como como rato, rato, coelho,

galinha ou primata não humano, com a especificidade, afinidade e atividade desejadas.

Na maioria dos casos, resíduos do anticorpo humano (receptor) fora da CDR; isto é, na região da estrutura (FR), são adicionalmente substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes.

Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador.

Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo.

A humanização reduz a imunogenicidade de anticorpos não humanos em humanos, facilitando a aplicação de anticorpos ao tratamento de doenças humanas.

Anticorpos humanizados e várias tecnologias diferentes para gerá- los são bem conhecidos na técnica.

O termo “anticorpo” ou “anticorpos” também se refere a anticorpos humanos, que podem ser gerados como uma alternativa à humanização.

Por exemplo, é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de anticorpos murinos endógenos.

Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união da cadeia pesada (JH) do anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e da linha germinativa resulta em inibição completa da produção de anticorpos endógenos.

A transferência da matriz de genes da imunoglobulina da linha germinativa humana nesses camundongos mutantes da linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos com especificidade contra um antígeno específico após a imunização do animal transgênico portador dos genes da imunoglobulina da linha germinativa humana com o referido antígeno.

As tecnologias para produzir esses animais transgênicos e as tecnologias para isolar e produzir os anticorpos humanos desses animais transgênicos são conhecidas na técnica.

Alternativamente, no animal transgênico; por exemplo, camundongo, apenas os genes da imunoglobulina que codificam para as regiões variáveis do anticorpo do camundongo são substituídos pelas sequências correspondentes dos genes da imunoglobulina variável humana.

Os genes da imunoglobulina da linha germinativa do rato que codificam para as regiões constantes do anticorpo permanecem inalterados.

Deste modo, o efetor de anticorpo funciona no sistema imunológico do camundongo transgênico e, consequentemente,

o desenvolvimento da célula B é essencialmente inalterado, o que pode levar a uma resposta melhorada do anticorpo por desafio antigênico in vivo. Uma vez que os genes que codificam para um anticorpo particular de interesse tenham sido isolados desses animais transgênicos, os genes que codificam para as regiões constantes podem ser substituídos por genes da região constante humana, a fim de obter um anticorpo totalmente humano. O termo “anticorpo” ou “anticorpos”, conforme usado aqui, também se refere a um anticorpo aglicosilado.

[0177] O termo “fragmento de ligação ao antígeno do mesmo” ou variações gramaticais do mesmo, conforme aqui usado, se refere a um fragmento de anticorpo. Um fragmento de um anticorpo compreende pelo menos um domínio de imunoglobulina da cadeia pesada ou leve, como conhecido na técnica e se liga a um ou mais antígenos. Exemplos de fragmentos de anticorpo de acordo com a invenção incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')) e Fv e scFv; bem como diabéticos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, anticorpos de domínio (dAbs), como sdAbs, VHH ou anticorpos camelídeos (por exemplo, de camelos ou lhamas como Nanobodies'Y) e fragmentos VNAR, anticorpos de cadeia única, anticorpos de cadeia única, biespeciíficos, triespecíficos, tetrasspecíficos ou anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos ou anticorpos de anticorpo, incluindo mas não limitados a construções Fab-Fv ou Fab-Fv-Fv.Os fragmentos de anticorpos como definidos acima são conhecidos na técnica.

[0178] Em uma modalidade particularmente preferencial, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo produzido através dos métodos de acordo com a invenção é (Tabela 1):

[0179] 1) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que

[0180] a. compreende CDR-H1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 1; CDR-H2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 2; CDR-H3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 3; CDR-L1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 4; CDR-L2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 5 e CDR-L3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 6; ou

[0181] b. compreende uma região variável leve que possui a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada que possui a sequência definida na SEQ ID NO: 8; ou

[0182] c. compreende uma região variável leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência como definida na SEQ ID NO: 8;

[0183] d. compreende uma região variável leve que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 11; ou

[0184] e. compreende uma região variável leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade para a sequência como definida na SEQ ID NO: 11; ou

[0185] 2) um anticorpo que compreende uma cadeia leve com a sequência definida na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada com a sequência definida na SEQ ID NO: 10; ou

[0186] 3) um anticorpo que compreende uma cadeia leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência, conforme definido na SEQ ID NO: 10.

[0187] Ao longo deste relatório descritivo, as regiões determinantes da complementaridade (“CDR”) são definidas de acordo com a definição de Kabat. À definição de Kabat é um padrão para numerar os resíduos em um anticorpo e é tipicamente usada para identificar regiões CDR (Kabat et al., (1991), 5º edição, publicação NIH Nº 91-3242).

TABELA 1 identificador

SEQ ID CDR-H1 GFTFSNYGMV SEQ ID NO: 1 CDR-H2 YIDSDGDNTYYRDSVKG SEQ ID NO: 2 CDR-H3 GIVRPFLY SEQ ID NO: 3 CDR-L1 KSSQSLVGASGKTYLY SEQ ID NO: 4 CDR-L2 LVSTLDS SEQ ID NO: 5 CDR-L3 LOGTHFPHT SEQ ID NO: 6 Região variável DDQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKSSQSLV GASGKTYLYW leve LFQOKPGKAPK RLIYLVSTLD SGIPSRFSGS GSGTEFTLTI SEQ ID NO: 7º |SSLOPEDFAT YYCLOGTHFP HTFGQGTKLE IK Região variável! EVPLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGFTFS NYGMVWVRQA pesada PGKGLEWVA IDSDGDNTYY RDSVKGRFTI SRDNAKSSLY SEQ ID NO: 8 |LOMNSLRAED TAVYYCTTGI VRPFLYWGOG TLVTVS Cadeia leve DIQMTQOSPSS LSASVGDRVT ITCKSSQSLV GASGKTYLYW SEQ ID NO:9 |LFOKPGKAPK RLIYLVSTLD SGIPSRFSGS GSGTEFTLTI

SSLQPEDFAT YYCLAGTHFP HTFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQOWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE

[| qresssvrenãee — “““"""S Cadeia pesada |EVPLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGFTFS NYGMVWVRQA SEQ ID NO: 10 /PGKGLEWVAY IDSDGDNTYY RDSVKGRFTI SRDNAKSSLY

LQMNSLRAED TAVYYCTTGI VRPFLYWGOQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLOSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVW VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHODW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

SLGK Cadeia pesada EVPLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGFTFS NYGMVWVRQA Fab PGKGLEWVA IDSDGDNTYY RDSVKGRFTI SRDNAKSSLY SEQ ID NO: 11 | LOMNSLRAED TAVYYCTTGI VRPFLYWGOQG TLVTVSSAST

KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLOSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC

[0188] A proteína recombinante ou o anticorpo preferido ou o seu fragmento de ligação ao antígeno podem ser tipicamente produzidos por células hospedeiras contendo um vetor que codifica a sequência nucleotídica da proteína ou anticorpo.

[0189] Os anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem compreender apenas uma proteína da cadeia pesada ou leve, caso em que apenas uma sequência de codificação da proteína da cadeia pesada ou da cadeia leve precisa ser usada para transfectar as células. Para a produção de produtos compreendendo cadeias pesadas e leves, as células podem ser transfectadas com dois vetores, um primeiro vetor que codifica uma proteína da cadeia leve e um segundo vetor que codifica uma proteína da cadeia pesada. Alternativamente, pode ser usado um único vetor, incluindo o vetor que codifica as sequências que codificam proteínas da cadeia leve e da cadeia pesada.

[0190] Em uma modalidade preferencial, a invenção fornece um processo para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultivar células CHO capazes de produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é produzido pelas células, em que, durante a dita fase de produção, a cultura é suplementada com cisteína ou cistina até uma quantidade total de 10% em peso a 30% em percentual em peso da quantidade total esperada de anticorpo ou seu fragmento de ligação ao anticorpo produzido c. e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a partir do meio de cultura de células, em que a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 12 g/(10? células), como 2,9 a 7 g/(10"? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(107? células), em que as células se referem à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção, e em que cisteína ou cistina é fornecida por adição diária durante a fase de produção, e em que a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,9 gl em qualquer momento durante a fase de produção, preferencialmente em que a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,3 g/l em qualquer momento durante a fase de produção, e em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de preferência: 1) compreende CDR-H1 possuindo a sequência definida na SEQ ID NO: 1; CDR-H2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 2; CDR-H3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 3; CDR-L1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 4; CDR-L2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 5 e CDR-L3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 6; ou 2) compreende uma região variável leve com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada com a sequência definida na SEQ ID NO: 8.

[0191] Em uma outra modalidade preferencial, a invenção fornece um processo para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: a. cultivar células CHO capazes de produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é produzido pelas células, em que, durante a dita fase de produção, o meio de cultura celular é suplementado com + cisteína ou cistina até uma quantidade total de 10% em peso a 30% em peso da quantidade total esperada de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo produzido; e/ou + triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 35% em peso da quantidade total esperada de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo produzido, c. e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a partir do meio de cultura de células, em que a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 12 g/(10? células), como 2,9 a 7 g/(10"? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(107? células), em que as células se referem à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção, e em que a quantidade total de triptofano fornecido durante o processo é de 2,5 a 7 g/(107? células), como 2,5 a 3,5 g/(10? células/I), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada em final da fase de produção e em que cisteína ou cistina e/ou triptofano são fornecidos por adição diária durante a fase de produção, e em que a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,9 gl em qualquer momento durante a fase de produção, preferencialmente em que a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,3 g/l em qualquer momento durante a fase de produção, e em que a concentração de triptofano na cultura de células não excede 0,6 g/| de meio em qualquer momento durante a fase de produção, preferencialmente em que a concentração de triptofano no meio de cultura de células não excede 0,3 g/! em qualquer momento durante a fase de produção e em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de preferência: 1) compreende CDR-H1 possuindo a sequência definida na SEQ ID NO: 1; CDR-H2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 2; CDR-H3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 3; CDR-L1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 4; CDR-L2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 5 e CDR-L3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 6; ou 2) compreende uma região variável leve com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada com a sequência definida na SEQ ID NO: 8.

[0192] A invenção será agora descrita adicionalmente por meio de exemplos com referências a modalidades ilustradas nos desenhos anexos.

EXEMPLOS Abreviações

[0193] mMAb: anticorpo monoclonal; MFCS: sistema de controle de fermentação múltipla; Cys: cisteína ou cistina; Trp: triptofano Materiais e métodos Linhagem celular, cultura celular e procedimento experimental

[0194] Foi usada uma linha celular CHO-DG44. As células foram cultivadas em meio de inoculação isento de animais, quimicamente definido, contendo cistina (0,05 g/1) e triptofano (0,2 g/I) sob condições operacionais padrão (pH 7, temperatura 36,8 ºC) em biorreator de vidro de tanque agitado de 2 | com torres de suprimento (C- DCUII, Sartorius Stedim Biotech) controladas por um sistema de controle de fermentação múltipla (Sartorius Stedim Biotech). Foram usadas quatro linhas celulares de produção diferentes, cada uma produzindo um anticorpo monocional (MAb) denominado MAb1, mAb2, mAb3 e mAbA4, respectivamente. mAb1 é um anticorpo anti-FcRn que compreende uma cadeia leve com a sequência definida na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada com a sequência definida na SEQ ID NO: 10.

[0195] A produção foi operada em modo de lote experimental por 14 dias. Durante esta fase, os anticorpos monoclionais são secretados no meio. As amostras foram coletadas diariamente para determinar a densidade celular viável (VCD), viabilidade, pH off-line, pCO2, osmolalidade, concentração de glicose-lactato, concentração de aminoácidos e concentração de mAb (armazenada a -80 ºC). Antiespumante foi adicionado manualmente sob demanda todos os dias para controlar o acúmulo de espaço. 72 horas após a inoculação, foi iniciada a alimentação contínua de nutrientes com uma taxa predeterminada. O meio de alimentação contínua de nutrientes não compreende cisteína/cistina ou triptofano. Nesse momento, cisteína/cistina e triptofano foram adicionados diariamente durante 10 dias como uma alimentação em bolus com a quantidade descrita nos exemplos abaixo. A quantidade de cisteína/cistina e triptofano descrita nos exemplos é a quantidade total de adições em bolus começando 72 horas após a inoculação, levando em consideração a quantidade inicial desses aminoácidos já presentes no meio de inoculação. Uma alimentação em bolus de glicose foi adicionada à cultura quando a concentração de glicose caiu abaixo de 6 g/I (a partir do dia 6) e as concentrações de glicose foram medidas diariamente. Amostras para a análise de aminoácidos foram coletadas antes da adição da ração. As concentrações após a alimentação foram calculadas com base na composição da ração e medida da concentração de nutrientes antes da adição da ração. Métodos analíticos

[0196] As células foram contadas usando um dispositivo de contagem de células automatizado VI-CELLO XR (Beckman-Coulter, Inc., Brea, CA) que operava com base na exclusão do azul de tripano.

[0197] Os níveis de glicose e lactato no meio de cultura foram determinados usando um analisador automático NOVA 400 BioProfile (Nova Biomedical, Waltham, MA).

[0198] Um osmômetro modelo de ponto de congelamento 2020 (Advanced Instruments, Inc., Nonvood, MA) foi usado para determinação da osmolaridade. As medições off-line de gás e pH foram realizadas com um analisador de gases no sangue modelo BioProfile pHOxO (Nova Biomedical Corporation, Waltham, MA).

[0199] As concentrações de metabólitos foram determinadas diariamente usando um sistema CedexBioHT (Roche).

[0200] A análise do título do produto foi realizada com um analisador de modelo ForteBio Octet (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) ou cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com proteína A com amostras de sobrenadante de cultura de células que foram armazenadas a -80 ºC antes da análise.

[0201] Os aminoácidos foram analisados por UPLC de fase reversa (método Waters AccQ Tagultra) após ultrafiltração usando filtros centrífugos Amicon Ultra-0,5 ml (Merck Millipore, Billerica, MA).

[0202] A purificação da proteína A (sistema ÁKTA Xpress) foi empregada para purificar o mAb nas amostras de sobrenadante da cultura de células. A porcentagem relativa de isoforma principal, ácida (APG para Acidic Peak Group) e básica (BPG para Basic Peak Group) do mAb purificado foi determinada por Eletroforese Capilar Imaginária (ProteinSimple iCE3). Os níveis de Espessura de Alto Peso Molecular (HMWS), monômero e Espécie de Baixo Peso Molecular (LMWS) do mAb purificado foram determinados por cromatografia de exclusão por tamanho (SE-UPLC).

[0203] A intensidade da cor das formulações de mAb1 e mAb2 concentrado foi medida nos eluatos da proteína concentrada usando um espectrofotômetro por transmissão (UltrascanPro) e comparada com a escala da Comissão Internacional de l'éclairage (CIL). Os resultados numéricos foram normalizados para a concentração de 40 mg/ml.

[0204] A espectrometria de massa de ionização por eletropulverização (ESI-MS) foi realizada em mAb1 purificado. Foi realizado o mapeamento de peptídeos para identificar modificações pós-traducionais nos anticorpos. A análise estatística foi realizada no software SAS JMP 11. Exemplo 1

[0205] Biorreatores de dois litros foram inoculados com células CHO produzindo mMAb1 a uma densidade de semeadura de 0,35 x 10º células/ml. Oito condições experimentais foram testadas no processo de batelada alimentada, conforme descrito na seção Materiais e Métodos, com várias concentrações máximas de cisteína ou cistina e triptofano atingidas durante a cultura celular e várias quantidades totais de cisteína ou cistina (Cys) e triptofano (Trp) em percentual em peso do peso total de mMAb1 produzido (Tabela 2a).O primeiro objetivo foi avaliar o impacto da cisteína ou cistina e triptofano na heterogeneidade do mAb1 recombinante. O segundo objetivo foi identificar se o impacto foi devido a altas concentrações de cisteína ou cistina e/ou triptofano atingidas durante a cultura celular e/ou devido à quantidade total adicionada em peso do% do peso total de mAb produzido. TABELA 2a = Quantidade total z Quantidade total ro fe ro rg mo e fossa as azar io lg eso sr asa ros e essa Ts pag mar [ear Ti pag er le essa sao oa ass essa ar og eo le essa osso fozogr assess

[0206] As variantes de carga proteica recombinante e a intensidade da cor foram medidas como descrito na seção de materiais e métodos. Os dados foram analisados por uma análise estatística Anova para um ajuste linear e valores de p <0,05 foram considerados aceitáveis.

[0207] Como mostrado na Figura 2b, houve uma correlação entre uma variante de carga do grupo de pico ácido aumentada no mMAb1 (APG%) e um aumento da quantidade total de cisteína ou cistina adicionada por peso total do mMAb1% (9/g)

produzido.

[0208] Com relação à intensidade da cor do mAb1, houve uma correlação entre um aumento da intensidade da cor do mAb1 (b*valor normalizado para 40 mg/ml) e uma quantidade total aumentada de triptofano adicionado por peso total do MAb1% (9/g) produzido (Figura 2a).

[0209] No entanto, quando os dados foram analisados em relação à concentração máxima de triptofano ou cisteína ou cistina, não houve impacto na cor ou APG (Figuras 2ce2d)

[0210] Para confirmar que é a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano por peso total de mAb1 produzido que afeta a heterogeneidade do mAb1 e não a concentração máxima de cisteína ou cistina e/ou triptofano atingida durante a fase de produção em um lote alimentado. Na configuração, 8 condições experimentais foram testadas com várias adições em bolus de cisteína ou cistina e triptofano no dia 3, a fim de atingir altas concentrações dos 2 aminoácidos (Tabela 2b). Para ter a mesma quantidade de cisteína ou cistina e triptofano adicionados% em peso (9/g) do peso total de MAb1 produzido, a estratégia de alimentação foi adaptada. Como mostrado nas condições do lote alimentado, há uma correlação entre uma variante de carga de grupo de pico ácido aumentada em mAb1 (APG%) e um aumento da quantidade total de cisteína ou cistina adicionada por mAb1 em peso total (g/g) produzido (Figura 3b) e entre um aumento da intensidade da cor do mMAb1 (b*valor normalizado para 40 mg/ml) e uma quantidade total aumentada de triptofano adicionado por peso total do mMAb1% (9g/g) produzido (Figura 3a). No entanto, não houve correlação com a variante de carga APG e as concentrações máximas (g/I) de cisteína ou cistina e triptofano (Figuras 3c e 3d, respectivamente). Estes resultados confirmam que a quantidade total de cisteína e triptofano adicionada durante a cultura celular por% em peso (9g/g) do peso total do MAb1 produzido afeta a variante de carga APG e a intensidade da cor. A concentração máxima de cisteína ou cistina e triptofano não afeta a variante de carga APG e a intensidade da cor.

TABELA 2B o asenema fm [uriaaea aaa 5 biorreator |máxima de Cys| concentração de Cys/mAb1%|de Trp/mAb1% em (9/1) máxima (g/l) em peso (g/g) |peso (9/g) Conclusões

[0211] A quantidade total adicionada de Cys e Trp% em peso do mAb1 recombinante total (g/g) produzido tem um impacto na variante de carga do mAb1 e na intensidade da cor. Pelo contrário, a concentração máxima de cisteína ou cistina e triptofano no meio de cultura de células não teve impacto na qualidade do mAb1. Exemplo 2

[0212] A fim de investigar melhor o impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano, adicionado% em peso do mAb total produzido (g/g), durante uma cultura celular, 48 condições experimentais (Tabela 3) em corridas de biorreatores de 2 | foram preparadas como descrito na seção de métodos. Foram analisadas a variante de carga mAb1, agregados (HMWS), intensidade de cor, título e crescimento celular viável. TABELA 3 ID do , Quantidade total Cys/mAb1% (9/g) | Quantidade total Trp/mAb1% (9/g) biorreator

ETR is os ig Be a

[0213] Como mostrado na Figura 4, a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada ao longo de uma fase de produção em percentual em peso de mAb1 total (g/g) produzido afeta o grupo variante de carga ácida (% de APG). Existe um efeito de saturação em torno de 50% em peso da quantidade total de cisteína ou cistina adicionada durante a fase de produção de 14 dias por mAb1 total (9/g) produzido. O impacto da cisteína ou cistina e triptofano é cumulativo sem interação. Diminuir a porcentagem da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado ao longo de uma fase de produção de 14 dias em peso do mAb1 total (g/g) produzido diminui a porcentagem do pico ácido no mAb1 produzido.

[0214] A Figura 5 mostra o impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano (adicionado ao longo de 14 dias de cultura celular) em peso do peso total de mAb1 produzido no grupo principal de pico. Como observado para o percentual de APG, o impacto da cisteína ou cistina e triptofano é cumulativo sem interação. À diminuição da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada ao longo de uma fase de produção de 14 dias em peso do peso total de mAb1 produzido aumenta a porcentagem do pico principal no mAb recombinante produzido.

[0215] A Figura 6 mostra o impacto da quantidade total de cisteína ou cistina adicionada ao longo de uma fase de produção de 14 dias em peso do mAb1 total (g/g) produzido em espécies de alto peso molecular (HMWS). Existe um efeito de saturação em torno de 50% da quantidade total de cisteína ou cistina adicionada ao longo de uma fase de produção de 14 dias em peso do mAb1 total (g/g) produzido. Diminuir a quantidade total de cisteína ou cistina reduz a porcentagem de HMWS no mAb recombinante produzido. Nenhum impacto da quantidade total de Trp adicionado é observado no HMWS.

[0216] —Osresultados mostrados na Figura 7 ilustram o impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada durante uma fase de produção de 14 dias em peso do mAb1 total (g/g) produzido na intensidade da cor (valor b normalizado para 40 mg/ml) do mAb1 recombinante. Diminuir a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado durante a fase de produção de 14 dias reduz a intensidade da cor do mAb1 recombinante produzido. Existe um efeito de interação entre a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada ao longo de uma fase de produção de 14 dias em peso do mAb1 total (g/g) produzido.

[0217] A Figura 8 mostra gráficos de contorno que ilustram intervalos ótimos da porcentagem da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionados durante uma fase de produção de 14 dias em peso do mAb-1 total (g/g) produzido para atingir os valores mais baixos de APG, HMWS, intensidade da cor e os valores mais altos para o grupo principal de pico; a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada entre 12,06 e 28,03% em peso de mAb-1 total (g/g) produzido para cisteína ou cistina e entre 8,84 e 32,06% em peso de mAb1 total (g/g) produzido para triptofano.

[0218] A contagem de células viáveis integrais cumulativas (IVCC) durante uma fase de produção de 14 dias foi calculada e normalizada pelo volume de cultura de células (CSV). Os resultados mostrados na Figura 9 mostram um impacto da porcentagem da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado ao meio de cultura de células por peso inicial de CSV no IVCC. Existem faixas ótimas de porcentagem do peso total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado ao meio de cultura de células por peso inicial de CSV, que estão entre 0,08% e 0,24% para cisteína ou cistina e entre 0,07% e 0,15% para triptofano. Não foi observado efeito sinérgico, apenas cumulativo (Figuras 9a e 9b).

[0219] As Figuras 10a e 10b mostram o impacto da porcentagem da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado ao meio de cultura de células por peso inicial de CSV no título de mAb1. Existe uma faixa ideal de porcentagem da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada ao meio de cultura de células por peso de CSV, que está entre 0,08% e 0,24% para cisteína ou cistina e entre 0,07% e 0,15% para triptofano em peso de CSV peso. Não há efeito de interação.

[0220] Os gráficos de contorno mostrado nas Figuras 11a e 11b mostram as gamas óptimas de quantidade total de cisteína ou cistina e de triptofano ao meio de cultura de células por IVCC*10-"2 no final da fase de produção, que são entre 2,9 e 12 g por Cys e entre 2,5 e 7 g para Trp. Exemplo 3

[0221] O anticorpo monoclonal recombinante foi caracterizado por três condições experimentais de lote alimentado, conforme descrito em material e métodos com várias quantidades totais de cisteína ou cistina e triptofano, adicionadas em percentual em peso do mAb1 recombinante total produzido (Tabela 4). TABELA 4 ID do biorreator % em peso (9/g) % em peso (9/g) Bo fes gg

[0222] A análise por espectroscopia de massa indicou uma mudança de massa do pico mais intenso observado no espectro de massa em condições de não desnaturação e desnaturação e para o mMAb1 glicosilado como resultado do aumento da concentração de cisteína ou cistina e triptofano. Essas observações levam à conclusão de que as modificações não estão ligadas a alterações nos padrões de glicosilação. A análise da cadeia leve, cadeia pesada e metade (uma cadeia pesada mais uma cadeia leve) do espectro de massa após deconvolução manual sugere que uma possível glicação do MAb1 ocorre com alta quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado ao longo de uma fase de produção de 14 dias em peso do peso total de mAb produzido. Possivelmente mais adutos, ou seja, adições de pequenas moléculas no mAb1, podem ser observados. A adução de cisteína na cadeia leve aumenta quando a quantidade total adicionada de cisteína ou cistina e triptofano também está aumentando. A Tabela 5 mostra o resumo das características do mAb1, obtido por Mapeamento de Peptídeos, para as três condições experimentais testadas. Os resultados mostram que o aumento da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado durante uma fase de produção de 14 dias em peso do peso total do mAb produzido leva a um aumento da oxidação da metionina na treonina 19 da cadeia pesada e desamidação na treonina 33 da cadeia pesada. Além disso, as variantes APG% e BPG% de mAb1 aumentam drasticamente com o aumento da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada ao longo de uma fase de produção de 14 dias em peso do peso total de mAb produzido, enquanto o pico principal aumenta com a diminuição de quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada ao longo de uma fase de produção de 14 dias em peso do peso total do mAb produzido. TABELA 5 ID do biorreator Met. Ox HC T019 10,60% 15,20% 19,70% Desamidação 2,60% 2,10% 2,20% HC T023 Desamidação 4,80% 6,60% 7,00% HC T033 APG (%) 39,30% 49,10% 82,90% BPG (%) 6,10% 7,30% 2,40% Principal (%) 54,70% 43,70% 14,80% Exemplo 4

[0223] A fim de identificar concentrações inibitórias de cisteína ou cistina e triptofano no crescimento de uma linha celular DG44 CHO expressando mAb1, várias adições em bolus de cisteína ou cistina e triptofano no dia 3 foram testadas com o objetivo de atingir altas concentrações desses aminoácidos (Tabela 2b). A fim de obter a mesma quantidade de cisteína ou cistina e triptofano adicionou% em peso do peso total de MAb1 produzido, a estratégia de alimentação foi adaptada. A Figura 12 mostra que altas concentrações de cisteína ou cistina e triptofano de 0,3 g/l a 0,9 g/l e 0,6 d/l, respectivamente, reduzem significativamente o crescimento celular (IVCC cumulativo durante uma fase de produção de 14 dias normalizada pelo CSV) Exemplo 5

[0224] Foi levantada a hipótese de que a depleção de cisteína ou cistina pode ter um impacto no crescimento e na produtividade de uma linha celular CHO que expressa o mMAb1. Foram analisadas nove condições experimentais em biorreatores de 2 | (Tabela 6a): três condições de controle sem depleção de cisteína ou cistina durante o processo de fase de produção, duas condições experimentais com depleções diárias a partir do dia 6 e continuando até o final da produção em batelada processo com uma concentração de cisteína ou cistina na ração de 6,87 g/| e quatro condições experimentais com depleção de cisteína ou cistina no dia 6 e com uma concentração de cisteína ou cistina na ração de 17,17 g/l. As depleções são cíclicas devido à adição diária de cisteína ou cistina. A estratégia de alimentação está descrita na Tabela 6b. A quantidade total de cisteína ou cisteína adicionada e a quantidade total de cisteína ou cisteína adicionada por IVCC está representada na Figura 13. As concentrações de cys antes da adição de ração são mostradas na Figura 14c. Conforme mostrado na Figura 14a, a depleção de cisteína ou cistina no dia 6 não afeta o crescimento celular se a concentração de cisteína ou cistina na ração for de cerca de 17,17 gl. Sem desejar estar vinculado pela teoria, acredita-se que os metabólitos relacionados à cisteína ou à cistina sejam acumulados e armazenados nas células e estejam disponíveis quando a cisteína ou a cistina se esgota. No entanto, a produtividade da linha celular do mAb1 é afetada pela depleção de cisteína ou cisteína (Figura 14b). TABELA 6A ID do biorreator adicionada por IVCC no dia ração adicionada (g/l) 14 (9/10? células)

EEE E Eos e TABELA 6B Po PILL = Po

EL IR

EL IR poe

E E e Exemplo 6

[0225] O efeito da redução da heterogeneidade causada pelo controle da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado ao longo de uma fase de produção em percentual em peso de mAb recombinante total não é exclusivo do mAb1, foram testadas experiências sobre a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado com outras três linhas celulares CHO também produzindo anticorpos recombinantes (Tabela 7). Como mostrado na Figura 15a, um aumento da variante de carga APG e intensidade da cor são correlacionados com um aumento da quantidade total de cisteína ou cistina e o triptofano adicionou% em peso do mAb2 total. Resultados semelhantes foram obtidos ao analisar a variante de carga APG para o mMAb3 (15b). Finalmente, um aumento das variantes de carga de APG e BPG e uma diminuição no pico principal correlacionaram-se com um aumento da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionada em percentual em peso de mAb4 total (15c). Esses resultados confirmam os resultados obtidos para o mAb1. TABELA 7 ID do Ab Quantidade total de Cys/mAb% |Quantidade total Trp/mAb% m, biorreator (9/9) (9/0)

ess gg Exemplo 7

[0226] O impacto da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado ao longo dos 14 dias de produção em percentual em peso total de mAb recombinante produzido foi analisado com base nos dados dos quatro anticorpos monoclilonais diferentes testados aqui (Tabelas 3 e 7). Como mostrado na Figura 16 (a eb) o aumento da variante de carga de APG está correlacionado com um aumento da quantidade total de cisteína ou cistina e o triptofano adicionou% em peso do peso total de anticorpo recombinante produzido para todos os quatro anticorpos analisados. Os resultados confirmam que a relação entre a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionou% em peso do peso total de anticorpo recombinante produzido e a heterogeneidade de um anticorpo não está confinada a um anticorpo específico, mas se aplica a qualquer anticorpo.

Exemplo 8 Formulações farmacêuticas líquidas

[0227] As formulações farmacêuticas do anticorpo monoclonal mAb1 foram fabricadas em modo batch alimentado em larga escala, isto é, em um biorreator de aço inoxidável de 2.000 |, sob condições operacionais padrão descritas no material e métodos com várias quantidades totais de cisteína ou cistina e triptofano adicionadas conforme especificado na Tabela 9. O tampão da amostra de anticorpo foi substituído por um tampão de diafiltração (33mM His e 250mM Pro, pH 5,6) por pelo menos 7 vezes (7 diavolumes), seguido por ultrafiltração usando uma membrana com um Corte Molecular de Peso (MWCO) de 30kDa. Adicionou-se polissorbato 80 na concentração requerida (0,03% em p/v com base na concentração final) assim que a concentração do anticorpo (140 mg/ml +/- 14 mg/ml) foi alcançada. A concentração do anticorpo foi medida usando UV AZ80.

[0228] A Tabela 8 mostra a aparência das variantes de carga do MAb1 formulado. Em duas produções definidas como “Adição mais alta de Cys" na Tabela 8 e 9, com maior quantidade total de cisteína ou cistina, adicionada% em peso do mAb1 recombinante total produzido do que as três outras produções são definidas como “Adição mais baixa de Cys" nas Tabelas 8 e 9. O aumento da variante de carga de APG está correlacionado com um aumento da quantidade total de cisteína ou cistina adicionada em peso do mAb1 recombinante total produzido. TABELA 8 Maior Maior Baixa Adição — delAdição — de adição de adição dejadição —“dejCys mais |Cys mais Cys Cys Cys baixa (ciclo|baixa (ciclo (ciclo nº 1) |(ciclo nº 2) |(ciclo nº 1) |nº2) nº 3) iCE% de APG 50,4% 45,5% 38,2% 36,4% 41,3% iCE% Pico E 40,6% 44,7% 54,6% 54,9% 48,7% principal Maior Maior Baixa Baixa Baixa adição —“de|/adição Jadição Jadição adição Cys deCys |deCys |deCys |deCys (ciclo nº | (ciclo nº | (ciclo nº (ciclo nº (ciclo nº 1) 2) 1) 2) 3) Quantidade total Cys/mAb1 15,66 14,10 12,20 12,36 12,77 % em peso (g/d) Quantidade total Trp/mAb1 8,89 8,00 8,13 8,22 8,50 % em peso (g/dg)

Exemplo 9

[0229] Um modelo para predizer o nível do grupo de pico ácido (APG) foi desenvolvido com base nos dados (Tabelas 3) de uma linha de células DG44 CHO que expressa anticorpos mAb1 (Figura 17). O APG é expresso em função da quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionado ao longo dos 14 dias de produção em peso do peso total do mAb recombinante total produzido usando a cinética Michealis Menten.

[0230] Para aplicar o modelo à produção de perfusão, cada dia de produção de perfusão foi definido como um novo lote de produção. Portanto, as proporções das quantidades totais de cisteína ou cisteína e/ou triptofano usadas são calculadas de acordo com a taxa de fluxo de perfusão versus a taxa de remoção da proteína recombinante produzida a partir do vaso de produção. Uma produção de perfusão foi realizada em biorreatores de 2 | usando a tecnologia de Fluxo Tangencial Alternado (ATF). Conforme mostrado na Figura 18, a previsão da variante de carga APG se ajusta bem aos dados experimentais. Os resultados confirmam que a relação entre a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano adicionou% em peso do peso total do anticorpo recombinante produzido e a heterogeneidade de um anticorpo pode ser estendida a outro modo de produção, como produções no modo de perfusão, lote ou quimiostato.

Claims

U7 REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a produção de uma proteína recombinante caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultivar células hospedeiras com capacidade de produzir uma proteína recombinante em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que a proteína recombinante é produzida pelas células, em que, durante a dita fase de produção, a cultura é suplementada com * cisteína ou cistina até uma quantidade total de 10% em peso a 30% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida; e * triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 35% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, c. e, opcionalmente, recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura é suplementada com cisteína ou cistina até uma quantidade total de 12% em peso a 28% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, como uma quantidade total de 12% em peso a 25% em peso, por exemplo, de 12% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cultura é suplementada com triptofano até uma quantidade total de 8% em peso a 30% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida, tal como uma quantidade total de 8% em peso a 25% em peso, por exemplo, de 8% em peso a 20% em peso da quantidade total esperada de proteína recombinante produzida.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 12 g/(10"? células), tal como de 2,9 a 7 g/(10"? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(10"? células), em que células se referem à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de triptofano fornecida durante o processo é de 2,5 a 7 g/(10? células), tal como de 2,5 a 3,5 g/(10*? células/|), em que células se referem à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção.

6 Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de cisteína ou cistina e triptofano na cultura é atingida pela adição de cisteína ou cistina e triptofano ao meio de cultura celular: a. no início da fase de produção, b. uma vez ou várias vezes em qualquer momento durante a fase de produção, c. através da adição contínua durante a fase de produção, ou d. em qualquer combinação de a., b.ec.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o processo é um processo em batelada, como um processo em batelada alimentada.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que cisteína ou cistina e triptofano são fornecidos por adição diária durante a fase de produção.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cisteína ou cistina é depletada na cultura antes da adição de cisteína ou cistina no dia seguinte, por exemplo, reduzindo a adição de cisteína ou cistina a um nível entre 5,6 e 7 g/(10? células), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que, durante a fase tardia da produção, ou seja, quando as células já atingiram a densidade celular máxima viável, o triptofano é depletado na cultura antes da adição do triptofano no dia seguinte.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não excede 0,9 g/l em qualquer momento durante a fase de produção, preferencialmente em que a concentração de cisteína ou cistina no meio de cultura de células não exceda 0,3 g/l em nenhum momento da fase de produção.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a concentração de triptofano no meio de cultura de células não excede 0,6 g/l em qualquer momento durante a fase de produção, de preferência em que a concentração de triptofano na cultura de células não excede 0,3 g/I médio a qualquer momento da fase de produção.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a fase de produção é realizada por pelo menos 7 dias, preferencialmente pelo menos 14 dias.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que, a qualquer momento, durante a 2º metade da fase de produção: * a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e * a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que, a qualquer momento, durante a fase de produção: * a quantidade de cisteína ou cistina na cultura é de 10% em peso a 30% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida; e * a quantidade de triptofano na cultura é de 8% em peso a 35% da quantidade esperada de proteína recombinante produzida.

16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são células de mamíferos, preferencialmente células CHO.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16,

caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante é um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antígeno.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é: 1) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que a. compreende CDR-H1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 1; CDR-H2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 2; CDR-H3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 3; CDR-L1 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 4; CDR-L2 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 5 e CDR-L3 que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 6; ou b. compreende uma região variável leve que possui a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada que possui a sequência definida na SEQ ID NO: 8; ou c. compreende uma região variável leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma região variável pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência como definida na SEQ ID NO: 8; d. compreende uma região variável leve que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada que tem a sequência como definida na SEQ ID NO: 11; ou e. compreende uma região variável leve com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade para a sequência como definida na SEQ ID NO: 11; ou 2) um anticorpo que compreende uma cadeia leve com a sequência definida na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada com a sequência definida na SEQ ID NO: 10; ou 3) um anticorpo que compreende uma cadeia leve com pelo menos 80%

de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência definida na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia pesada com pelo menos 80% de identidade ou similaridade, preferencialmente 90% de identidade ou similaridade com a sequência, conforme definido na SEQ ID NO: 10.

19. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a fase de produção é realizada em um biorreator, de preferência com um volume igual ou superior a 50 L, igual ou superior a 100 L, igual ou superior a 500 L, igual ou superior a 1.000 L, igual ou superior a 2.000 L, igual ou superior a 5.000 L, igual ou superior a 10.000 L ou igual ou superior a 20.000 L.

20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o processo compreende a etapa de recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células e uma etapa adicional de purificação da proteína recombinante.

21, Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a purificação compreende cromatografia de proteína A.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de formulação da proteína recombinante purificada.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante é formulada em uma formulação líquida que compreende um ou mais aminoácidos e um tensoativo.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende histidina e/ou prolina.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende histidina em uma concentração de 5 mM a 100 mM, por exemplo, uma concentração de 10 mM a 50 mM e/ou prolihna em uma concentração de 100 mM a 500 mM, a um pH entre 5 e 7,4, como entre 5 e 6,5, por exemplo, entre 5e 6.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende histidina em uma concentração de 30 mM e prolina em uma concentração de 250 mM, a um pH entre 5,2 e 6,0.

27. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é o polissorbato 80, de preferência em uma concentração de 0,001% a 0,1% (em p/v), por exemplo, 0,005% a 0,1%, como 0,01% a 0,1%, por exemplo, 0,01% a 0,05%, como 0,03%.

28. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante é um anticorpo e o anticorpo é formulado em uma concentração de 10 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 20 mg/ml a 250 mg/ml, como 50 mg/ml a 250 mg/ml, por exemplo, 120 mg/ml a 160 mg/ml, como 140 mg/ml.

29. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o processo reduz a heterogeneidade das proteínas recombinantes produzidas, em que a dita redução de heterogeneidade compreende reduzir: a. heterogeneidade de carga, preferencialmente grupo de pico ácido (APG); e/ou b. oxidação de aminoácidos, isomerização, fragmentação, outros adutos de glicação covalentes, desamidação, cisteinilação; e/ou c. cor ou intensidade da cor, por exemplo, entre diferentes lotes da proteína recombinante; e/ou d. espécies de alto peso molecular (HMWS); e/ou e. instabilidade proteica recombinante.

30. Processo para a produção de uma proteína recombinante caracterizado pelo fato de que compreende: a. cultivar células hospedeiras com capacidade de produzir uma proteína recombinante em um meio; b. progredir a cultura através de uma fase de produção em que a proteína recombinante é produzida pelas células e o meio de cultura de células é suplementado com cisteína ou cistina e triptofano, em que * a quantidade total de cisteína ou cistina fornecida durante o processo é de 2,9 a 7 g/((10? células), por exemplo, de 5,6 a 7 g/(10? células), em que células se refere à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção, e * a quantidade total de triptofano fornecida durante o processo é de 2,5 a 3,5 g/(107? células), em que as células se referem à contagem viável integral de células esperada no final da fase de produção, c. e, opcionalmente, recuperar a proteína recombinante do meio de cultura de células.

31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o processo tem uma ou mais das características adicionais citadas em qualquer uma das reivindicações 2 a 29.

32. Método para reduzir a heterogeneidade da população de proteínas recombinantes em um lote produzido na fase de produção por células hospedeiras recombinantes caracterizado pelo fato de que compreende limitar a quantidade total de a. cisteína ou cistina e b. triptofano presente no meio de cultura de células durante a fase de produção da proteína recombinante.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o processo tem uma ou mais das características adicionais citadas em qualquer uma das reivindicações 2 a 29.

34. Preparação de proteína recombinante caracterizada pelo fato de que é obtenível ou obtida por meio do processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31.

35. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo, em que a composição tem uma ou mais das características adicionais citadas em qualquer uma das reivindicações 23 a 28, de preferência em que o anticorpo é o anticorpo citado na reivindicação 18.