BR112012019404B1 - Método para a preparação de moléculas de anticorpos recombinantes - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE MOLÉCULAS DE ANTICORPO RECOMBINANTES, ANTICORPO, E, USO DE MEIOS DE CONTROLE DE PH, TAL COMO UM TAMPÃO. A presente invenção se refere a um método para a fabricação de moléculas de anticorpo recombinantes compreendendo a cultura de uma amostra da célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; a a dição de um tampão de extração à amostra, e submeter a amostra a uma etapa de tratamento térmico; em que o pH da amostra é detectado após a adição do tampão de extração, e opcionalmente ajustado, para assegurar que o pH da amostra seja de 6 a 9 antes da etapa de tratamento térmico.

Description

[0001] A presente invenção se refere a métodos para aumento dos rendimentos na produção e isolamento de anticorpos recombinantes, e em particular anticorpos terapêuticos. Os métodos são particularmente apropriados para a produção industrial em larga escala de anticorpos terapêuticos.

[0002] Técnicas de DNA recombinante têm sido desenvolvidas rapidamente e são particularmente úteis na produção de anticorpos, em particular anticorpos terapêuticos. Sistemas para a expressão de genes recombinantes são bem conhecidos pelo especialista no campo em questão. Estes incluem expressão em células de mamíferos, células de insetos, células de fungos, células de bactérias, de plantas e de animais transgênicos. A escolha do sistema de expressão é dependente de características da proteína codificada, por exemplo, modificações pós- translacionais. Outras considerações incluem tempo e, em particular, o custo envolvido na produção da quantidade desejada de material com a qualidade requerida. Essas últimas considerações são particularmente importantes na produção de anticorpos terapêuticos com qualidade requerida para aprovação regulamentar e em quantidades necessárias para tratamento de um grande número de pacientes.

[0003] O sistema mais amplamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes é baseado na expressão em Escherichia coli (E. coli). Um problema específico encontrado com o emprego de E. coli é a dificuldade na produção de material com qualidade requerida em quantidades necessárias para aplicações terapêuticas. Em particular, o tempo e custos envolvidos podem ser demasiadamente elevados. Um problema específico é a perda incorrida no rendimento de anticorpos durante a extração dos anticorpos da E. coli.

[0004] Embora, proporcionalmente, os custos de purificação sejam uma fração do custo total de um anticorpo terapêutico como produto, a proporção do custo de purificação aumentará ainda que os custos de produção a montante se tornem menores. Deste modo, melhorias na recuperação e purificação de anticorpos reduzirão os custos de produção ainda mais, independentemente dos meios de produção (Humphreys & Glover, Curr. Opin. Drug Discovery & Development, 2001, 4:172-185). Consequentemente, há uma demanda por métodos que introduzam economia de tempo e/ou custo na produção de anticorpos terapêuticos e em particular na purificação, por exemplo, pelo aumento da recuperação do produto e/ou aumento da qualidade da corrente de produto.

[0005] Baixo rendimento de produto por fermentação ou cultura apresenta-se comumente como um problema particular observado no estágio de extração primária; a expressão do anticorpo é alta no interior das células, mas um alto percentual de recuperação no estágio de extração primária é notavelmente difícil de ser alcançado.

[0006] Um material que trata parcialmente deste último problema e que permite a produção de anticorpos aceitáveis para uso terapêutico é descrito em US 5.655.866. Esse método envolve o emprego de tratamento térmico para facilitar o subsequente isolamento de fragmentos Fab de anticorpos a partir de anticorpos não funcionais, a realização do tratamento térmico em qualquer momento durante a fermentação ou cultura, ou em qualquer estágio durante a extração ou purificação dos anticorpos. Em temperaturas elevadas, acima da temperatura ambiente, anticorpos funcionais são notavelmente estáveis, ao passo que muitas outras proteínas incluindo proteínas de células hospedeiras e espécies de cadeia pesada e leve livres e fragmentos não funcionais de anticorpos, formam precipitados e/ou agregados que são facilmente separados do anticorpo funcional durante procedimentos de purificação primária, como filtração, centrifugação ou cromatografia em leito fluidizado. Os extratos celulares foram preparados de acordo com o método descrito na patente US 5.655.866, pela incubação das células intactas em solução tampão Tris HCl a 100mM, pH 7,4 contendo EDTA a 10mM.

[0007] O pedido de patente WO2006/054063 descreve um aumento no rendimento de anticorpo funcional no estágio de extração primária pela inclusão de um tratamento sem ocorrência de lise em combinação com tratamento térmico. O método descreve que após a centrifugação os agregados de células foram submetidos à ressuspensão em uma amostra compreendendo Tris a 1M, a um pH 7,4 contendo EDTA a 100mM seguida de tratamento sem ocorrência de lise e então o tratamento térmico.

[0008] O pedido de patente WO2005/019466 descreve um aumento no rendimento de proteínas recombinantes pela inclusão de uma etapa de interrupção em condições definidas de temperatura e pH após fermentação antecedente ao processamento a jusante incluindo extração.

Sumário da Invenção

[0009] A invenção aqui descrita baseia-se na observação surpreendente e inesperada de que a após amostra de célula hospedeira transformada com um vetor de expressão codificante de uma molécula de anticorpo recombinante ter sido cultivada, um aumento no pH da amostra resultante durante o processo de recuperação primária tem um impacto benéfico significativo no rendimento de anticorpo.

[0010] Embora o anticorpo possa partir de um pH na faixa de 6 a 9 antes do processamento, tal como aquecimento, surpreendentemente, mesmo quando tamponado, o pH diminui, provavelmente como um resultado do metabolismo celular. Os presentes inventores atualmente acreditam que tal fato é prejudicial ao rendimento/recuperação e propuseram como resolução deste, quando conveniente, o ajuste do pH do material antes e/ou durante o processamento para garantir que o pH permaneça dentro da faixa de interesse.

[0011] De maneira surpreendente, observou-se que o pH da amostra antes da etapa de tratamento térmico apresenta um efeito considerável no rendimento de anticorpo a partir de uma amostra celular. Observou-se que o ajuste do pH da amostra de modo que o pH da amostra seja de 6 a 9 antes da etapa de tratamento térmico leva a um aumento no rendimento de anticorpo de até 40%. Tal fato permite economias extremamente benéficas de tempo e custo de produção de quantidades de anticorpos funcionais de qualidade terapêutica. Certamente outras etapas frequentemente empregadas para aumentar o rendimento, como homogeneização e etapas de interrupção, podem não ser mais necessárias para alcançar altos níveis de rendimento de anticorpo.

[0012] Em métodos anteriormente utilizados, por exemplo, na patente US 5.655.866, extratos celulares foram preparados por incubação das células intactas em um tampão com pH de 7,4. Observou-se que apesar da adição de um tampão, do qual seria esperada a manutenção do pH da amostra num nível constante, o pH da amostra celular de fato diminui com o tempo. Em certas circunstâncias, tais como em longos períodos de tempo seguintes à adição do tampão, o pH encontrado para a amostra foi tão baixo como pH 5,5, antes da etapa de tratamento térmico. Foi observado que a detecção e o ajuste opcional do pH antes do tratamento térmico, para garantir que o pH da amostra seja de 6 a 9, resultam em um aumento surpreendente no rendimento de anticorpo.

[0013] Apesar de não desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que seja importante manter o pH na faixa de 6 a 9 durante a etapa de processamento, tal como tratamento térmico. O ajuste do pH antes do processamento (tal como uma etapa de tratamento térmico) auxilia a manutenção do pH na faixa correta. Portanto, em um aspecto, é fornecida uma etapa de extração de anticorpo na qual o pH é mantido substancialmente na faixa de 6 a 9, por substancialmente a duração do processo.

[0014] Sem ser limitar à teoria, acredita-se que os métodos proporcionados pela presente invenção permitem a recuperação de proteína recombinante a partir do periplasma durante isolamento primário, a qual não é liberada sob condições de extração padrão.

[0015] Portanto, num primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a manufatura de moléculas de anticorpo recombinante compreendendo a cultura de uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão codificante de uma molécula de anticorpo recombinante; adição de um tampão de extração à amostra e submissão da amostra a uma etapa de tratamento térmico; no qual o pH da amostra é medido após a adição do tampão de extração, e opcionalmente ajustado a fim de se garantir que o pH da amostra se encontre entre 6 e 9 antes da etapa de tratamento térmico.

[0016] O monitoramento do pH nesse estágio é essencial para o estabelecimento do controle sobre o pH.

[0017] Em um aspecto alternativo, é fornecido um método para extração das moléculas de anticorpo recombinante a partir de uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão codificante de uma molécula de anticorpo recombinante; compreendendo as etapas de: ajuste de pH de uma composição das células mencionadas para a faixa de 6 a 9, tal que o pH seja mantido na faixa durante a etapa de extração subsequente, submissão das células a uma etapa de extração, tal como uma etapa de tratamento térmico, monitoramento do pH ao menos em um ponto no tempo imediatamente antes e/ou durante a etapa de extração.

[0018] Também foi observado que um aumento no pH do tampão de extração leva a um surpreendente aumento no rendimento de anticorpo após a amostra ser submetida à etapa de tratamento térmico.

[0019] Portanto, num segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a manufatura de moléculas de anticorpo recombinante compreendendo a cultura de uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão codificante de uma molécula de anticorpo recombinante; adição de um tampão de extração à amostra com um pH de 7,5 a 9 e submissão da amostra a uma etapa de tratamento térmico.

Descrição Detalhada da Invenção

[0020] Molécula de anticorpo, conforme aqui empregada, refere-se a um anticorpo como um todo ou um fragmento ligante deste, em particular um anticorpo em sua totalidade ou um fragmento Fab.

[0021] No primeiro aspecto da presente invenção, a amostra apresenta ou é ajustada de modo a apresentar um pH de 6 a 9 antes da etapa de tratamento térmico.

[0022] Numa forma preferida de realização, a amostra apresenta um pH de 6,5 a 8,5; pH de 6,5 a 8,0; pH de 7,0 a 9,0; pH de 7,0 a 8,5; pH de 7,0 a 8,0; pH de 7,1 a 8,0; pH de 7,5 a 8,0; pH de 7,0 a 7,8; pH de 7,1 a 7,8; pH de 7,1 a 7,7; pH de 7,2 a 7,6; pH de 7,3 a 7,5; pH 7,1; pH 7,2; pH 7,3; pH 7,4; pH 7,5; pH 7,6; pH 7,7; pH 7,8 ou pH 7,9, tal como um pH 7,4; em particular um pH 6,8; antes da etapa de tratamento térmico.

[0023] A medida de pH aqui referida é em geral normalizada a 20°C.

[0024] A etapa de tratamento térmico no método da presente invenção consiste em uma etapa na qual a temperatura da amostra é mantida a uma temperatura elevada desejada, uma vez que essa temperatura elevada desejada tenha sido alcançada durante a fase de aquecimento. Faixas de temperatura convenientes para tratamento térmico incluem de 30 a 70°C.

[0025] No contexto da presença invenção, a expressão “antes da etapa de tratamento térmico” significa antes do, e incluindo o, ponto no tempo no qual a amostra alcança a temperatura elevada desejada e a etapa de tratamento térmico (retenção à temperatura elevada) tem início. De modo a alcançar a temperatura elevada desejada para a etapa de tratamento térmico, a amostra é submetida a uma “fase de aquecimento” durante a qual a temperatura da amostra é elevada até a temperatura elevada desejada. Em uma forma de realização, o método de acordo com a presente invenção compreende a submissão da amostra a uma fase de aquecimento e a uma etapa de tratamento térmico.

[0026] No método da presente invenção, a amostra apresenta um pH de 6 a 9, por exemplo pH 6,8 antes da etapa de tratamento térmico. Nesse contexto, “antes da etapa de tratamento térmico” significa que o pH da amostra apresenta-se em um nível requerido antes de, ou no ponto do, tempo no qual a amostra alcança a temperatura elevada desejada para a etapa de tratamento térmico. Na realização na qual o método compreende a submissão da amostra a uma fase de aquecimento e a uma etapa de tratamento térmico, a amostra pode encontrar-se no nível de pH requerido antes do início da fase de aquecimento e/ou no nível de pH requerido durante a fase de aquecimento.

[0027] Em uma forma preferida de realização, a amostra apresenta-se no nível de pH requerido de 6 a 9 antes do início da fase de aquecimento.

[0028] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para a manufatura de moléculas de anticorpo recombinante compreendendo a cultura de amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão codificante de uma molécula de anticorpo recombinante, adição de um tampão de extração à amostra e submissão da amostra a uma fase de aquecimento e a uma etapa de tratamento térmico; no qual o pH da amostra é medido após adição do tampão de extração, e opcionalmente ajustado, de modo a garantir que o pH da amostra encontre-se na faixa de pH de 6 a 9, por exemplo a um pH de 7 a 9, tal como um pH de 7 a 8, antes da fase de aquecimento.

[0029] Em uma forma alternativa de realização, a presente invenção fornece um método para a manufatura de moléculas de anticorpo recombinante compreendendo a cultura de uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão codificante de uma molécula de proteína recombinante; adição de um tampão de extração à amostra e submissão da amostra a uma fase de aquecimento e uma etapa de tratamento térmico; no qual o pH da amostra é medido após a adição do tampão de extração, e opcionalmente ajustado a fim de garantir que o pH da amostra seja um pH de 6 a 9, preferivelmente um pH de 6 a 8, mais preferivelmente um pH de 6 a 7 durante a fase de aquecimento.

[0030] Em uma forma de realização, o pH das amostras é medido e opcionalmente ajustado de modo a garantir que o pH da amostra seja um primeiro pH antes da fase de aquecimento e seja um segundo pH durante a fase de aquecimento. Os primeiro e segundo níveis de pH são preferivelmente diferentes. Em uma forma preferida, o segundo pH é menor que o primeiro pH. Portanto, a presente invenção fornece um método para a manufatura de moléculas de anticorpo recombinante compreendendo a cultura de uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão codificante de uma molécula de anticorpo recombinante, adição de um tampão de extração à amostra e submissão da amostra a uma fase de aquecimento e uma etapa de tratamento térmico; no qual o pH das amostras é medido após a adição do tampão de extração, e opcionalmente ajustado, de modo a garantir que o pH das amostras seja um pH de 7 a 9, preferivelmente um pH de 7 a 8, antes da fase de aquecimento e, a garantir que o pH da amostra seja um pH de 6 a 8, preferivelmente um pH de 6 a 7 durante a fase de aquecimento. Nessa forma de realização, o pH da amostra pode ser detectado e opcionalmente ajustado durante a fase de aquecimento.

[0031] Em uma forma preferida de realização, a amostra apresenta um pH de 6 a 9, preferivelmente um pH de 7 a 9, mais preferivelmente um pH de 7 a 8, imediatamente antes da fase de aquecimento. Adicionalmente ou alternativamente, a amostra apresenta um pH de 6 a 9, preferivelmente um pH de 6 a 8, mais preferivelmente um pH de 6 a 7, imediatamente antes da etapa de tratamento térmico durante a fase de aquecimento, opcionalmente incluindo o ponto no qual a amostra alcança a temperatura elevada desejada e a etapa de tratamento térmico tem início.

[0032] Foi observado que o pH da amostra imediatamente antes da fase de aquecimento ou imediatamente antes da etapa de tratamento térmico apresentou um impacto significativo no rendimento do anticorpo recombinante.

[0033] No contexto da presente invenção, o termo “imediatamente antes de” preferivelmente significa um período de 30 minutos ou menos, 20 minutos ou menos, 15 minutos ou menos, 10 minutos ou menos, 5 minutos ou menos, 4 minutos ou menos, 3 minutos ou menos, 2 minutos ou menos, 1 minuto ou menos, 30 segundos ou menos, 10 segundos ou menos, 5 segundos ou menos, 1 segundo ou menos antes da fase de aquecimento e da etapa de tratamento térmico. O termo “imediatamente antes de” pode também incluir o pH da solução sendo de 6 a 9 no início da fase de aquecimento ou no início da etapa de tratamento térmico.

[0034] O pH da amostra é medido após a adição do tampão de extração. O pH da amostra pode ser detectado utilizando um equipamento adequado para medida de pH conhecido na área de conhecimento. O pH da amostra pode ser medido em um ou mais pontos separados durante o método, tais como no ponto de adição do tampão de extração, imediatamente após a adição do tampão de extração, imediatamente antes do início da fase de aquecimento, no ponto de início da fase de aquecimento, durante a fase de aquecimento incluindo o ponto no qual a amostra alcança a temperatura elevada adequada para a etapa de tratamento térmico, durante a etapa de tratamento térmico e após a etapa de tratamento térmico. Alternativamente, o pH da amostra é medido por monitoramento contínuo. Nessa forma de realização, na qual o pH da amostra é monitorado continuamente, o pH é preferivelmente monitorado continuamente desde após a etapa de cultura das células, preferivelmente após a etapa seguinte de centrifugação da cultura, até o início da etapa de tratamento térmico. Em uma forma preferida de realização, o pH da amostra é monitorado continuamente desde o ponto de adição do tampão de extração até o início da etapa de tratamento térmico. No entanto, o pH também pode ser monitorado durante a etapa de cultura e/ou durante a etapa de tratamento térmico.

[0035] Assim, em uma forma de realização o perfil do pH da etapa de aquecimento é controlado.

[0036] Em uma forma preferida de realização, o pH da amostra é medido, e opcionalmente ajustado, e a fase de aquecimento é iniciada, preferivelmente de forma automática, quando a amostra alcança o pH desejado. O tampão de extração é adicionado após a etapa de cultura da amostra de célula. Caso o método compreenda uma etapa de centrifugação após a etapa de cultura, o tampão de extração pode ser adicionado antes e/ou durante e/ou após a etapa de centrifugação. Preferivelmente, o tampão de extração é adicionado após uma etapa de centrifugação ou de ressuspensão do agregado de células resultante da centrifugação.

[0037] Em uma forma de realização da presente invenção, o tampão de extração apresenta um pH adequado de modo a garantir que o pH da amostra seja de 6 a 9, por exemplo um pH de 6 a 8, antes da etapa de tratamento térmico. Nessa forma de realização, onde o tampão de extração apresenta um pH adequado de modo a garantir que o pH da amostra seja de 6 a 9, por exemplo, um pH de 6 a 8, antes do tratamento térmico, o tampão de extração, por exemplo, apresenta um pH de 7,5 a 9,0; pH de 7,5 a 8,8; pH de 7,5 a 8,5; pH de 8,0 a 9,0; pH de 8,5 a 9,0; pH de 8,6 a 8,9; pH 8,0; pH 8,1; pH 8,2; pH 8,3; pH 8,4; pH 8,5; pH 8,6; pH 8,7; pH 8,8; pH 8,9 ou pH 9,0. A fase de aquecimento e a etapa de tratamento térmico são preferivelmente realizadas logo após, preferivelmente imediatamente depois, a adição do tampão de extração a fim de garantir que a amostra apresente o pH requerido antes da etapa de tratamento térmico. Por exemplo, a fase de aquecimento ou a etapa de tratamento térmico podem ser realizadas 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, 2 horas ou menos, 1 hora ou menos, 30 minutos ou menos, 10 minutos ou menos ou 5 minutos ou menos após a adição do tampão de extração.

[0038] Portanto, o método da presente invenção pode não requerer uma etapa de ajuste de pH da amostra. O pH da amostra pode ser medido após a adição do tampão de extração a fim de garantir um pH de 6 a 9 como requerido. Este pode ser o caso, por exemplo, se o pH do tampão de extração for adequado para levar o pH da amostra para 6 a 9 conforme descrito acima, por exemplo, quando o tampão de extração apresenta um pH de 7,5 a 9,0 e a etapa de tratamento térmico é realizada pouco tempo depois da adição deste.

[0039] Tipicamente, no entanto, devido ao período de tempo entre a adição do tampão de extração e a etapa de tratamento térmico, o método de acordo com a presente invenção requer uma etapa de medição e ajuste do pH da amostra, em adição a qualquer ajuste de pH que pode ser causado pela adição do tampão de extração, de modo a garantir que o pH da amostra encontre-se entre 6 a 9 antes da etapa de tratamento térmico.

[0040] Nessa forma de realização em que o método compreende uma etapa de medição e ajuste de pH, o pH do tampão de extração deve ser inferior a pH 8, tal como um pH 7,4 ou inferior, por exemplo um pH de 6,0 a 7,4; pH de 6,5 a 7,4, tal como um pH 6,8.

[0041] Alternativamente, em uma forma preferida de realização, o tampão de extração apresenta um pH de 7,5 a 9,0; pH de 7,5 a 8,8; pH de 7,5 a 8,5; pH de 8,0 a 9,0; pH de 8,5 a 9,0; pH de 8,6 a 8,9; pH 8,0; pH 8,1; pH 8,2; pH 8,3; pH 8,4; pH 8,5; pH 8,6; pH 8,7; pH 8,8; pH 8,9; pH 9,0; mais preferivelmente um pH 8,0.

[0042] Nessa forma de realização, o pH da amostra pode ser ajustado por quaisquer meios convenientes e a qualquer momento conveniente durante o método. O pH da amostra pode ser ajustado antes e/ou depois da adição do tampão de extração.

[0043] Em uma forma de realização, o pH da amostra é ajustado antes da adição do tampão de extração. Nessa forma de realização, se o método compreende uma etapa de centrifugação na sequência da etapa de cultura, a etapa de ajuste de pH pode ser realizada antes e/ou depois da etapa de centrifugação. O pH da amostra após a cultura das células, e opcionalmente após a centrifugação, é tipicamente baixo. Por exemplo, a amostra pode apresentar um pH de cerca de 5,5. Por conseguinte, após a cultura das células e opcionalmente após uma ou mais etapas adicionais, tal como centrifugação, o pH da amostra pode ser ajustado. Por exemplo, o pH da amostra pode ser ajustado antes da adição do tampão de extração para um pH de 6,5 a 8,0; preferivelmente para um pH de 7,0 a 8,0; pH de 6,5 a 7,5; pH de 6,6 a 7,4; pH de 6,7 a 7,3; pH de 6,8 a 7,2; pH de 6,9 a 7,1; mais preferivelmente para um pH 6,9.

[0044] Em uma forma de realização na qual o pH da amostra antes da adição do tampão de extração é inferior ao pH 7, tal como um pH 6,9, e é requerido que o pH da amostra antes da etapa de tratamento térmico se encontre a um pH de 7 a 9, o pH da amostra requer um aumento adicional pela adição do tampão de extração e/ou pelo ajuste adicional do pH após a adição do tampão de extração tal que o pH da amostra se encontre entre 7 a 9 antes da etapa de tratamento térmico.

[0045] Em uma forma preferida de realização da presente invenção, o pH da amostra é ajustado para um pH de 6 a 9 após a adição do tampão de extração mas antes da etapa de tratamento térmico. Nesse estágio, a amostra é preferivelmente ajustada para um pH de 7,0 a 9,0; pH de 7,0 a 8,5; pH de 7,0 a 8,0; pH de 7,1 a 8,0; pH de 7,5 a 8,0; pH de 7,0 a 7,8; pH de 7,1 a 7,8; pH de 7,1 a 7,7; pH de 7,2 a 7,6; pH de 7,3 a 7,5; pH 7,1; 7,2; 7,3; 7,4; 7,5; 7,6; 7,7; 7,8 ou 7,9 e mais preferivelmente para um pH 7,4. Em uma forma de realização, o pH da amostra é ajustado antes da fase de aquecimento. Preferivelmente, o pH da amostra é ajustado para um pH de 7 a 9, preferivelmente para um pH de 7 a 8, antes da fase de aquecimento. Alternativamente ou adicionalmente, o pH da amostra é ajustado durante a fase de aquecimento. Preferivelmente, o pH da amostra é ajustado para um pH de 6 a 8, preferivelmente para um pH de 6 a 7 durante a fase de aquecimento.

[0046] Em uma forma preferida de realização da presente invenção, um tampão de extração apresentando um pH 7,4 ou um pH 8 é adicionado à amostra e o pH da amostra é medido e subsequentemente ajustado para um pH de 7,4, antes da etapa de tratamento térmico, preferivelmente antes da fase de aquecimento, mais preferivelmente imediatamente antes da fase de aquecimento.

[0047] Em uma forma de realização em que o pH da amostra é medido após a adição do tampão de extração e ajustado antes da etapa de tratamento térmico, o pH da amostra pode ser detectado e ajustado antes do início da fase de aquecimento. Adicionalmente ou alternativamente, o pH da amostra pode ser medido e ajustado durante a fase de aquecimento.

[0048] Em uma forma preferida de realização, o pH da amostra é medido e ajustado imediatamente antes da fase de aquecimento. Adicionalmente ou alternativamente, o pH da amostra é detectado e ajustado imediatamente antes da etapa de tratamento térmico durante a fase de aquecimento, opcionalmente incluindo o ponto no qual a amostra alcança a temperatura elevada desejada e a etapa de tratamento térmico tem início.

[0049] No contexto da presente invenção, o termo “imediatamente antes de” preferivelmente significa que o pH da amostra é medido e ajustado para um pH de 6 a 9 a 30 minutos ou menos, 20 minutos ou menos, 15 minutos ou menos, 10 minutos ou menos, 5 minutos ou menos, 4 minutos ou menos, 3 minutos ou menos, 2 minutos ou menos, 1 minuto ou menos, 30 segundos ou menos, 10 segundos ou menos, 5 segundos ou menos, 1 segundo ou menos antes da fase de aquecimento ou antes da etapa de tratamento térmico. O termo “imediatamente antes de” podem também incluir o pH da solução sendo medido e ajustado no início da fase de aquecimento ou no início da etapa de tratamento térmico. Em uma forma preferida de realização, a fase de aquecimento e/ou etapa de tratamento térmico é acionada, preferivelmente de forma automática, quando o pH da amostra medido for um pH de 6 a 9.

[0050] O pH da amostra pode ser medido e ajustado em única ou múltiplas etapas de ajuste de pH conforme descrito acima. Por conseguinte, o pH pode ser ajustado: somente antes da adição do tampão de extração;somente antes do tampão de extração mas antes da etapa de tratamento térmico; ou antes da adição do tampão de extração e após a adição do tampão de extração, mas antes da etapa de tratamento térmico.

[0051] O pH pode ser ajustado em períodos múltiplos após a adição do tampão de extração, por exemplo 1, 2, 3, 4 ou mais vezes.

[0052] Em uma forma de realização, o pH da amostra é continuamente ajustado, preferivelmente entre a adição do tampão de extração e antes da etapa de tratamento térmico.

[0053] O pH da amostra pode em uma forma de realização ser adicionalmente medido e opcionalmente ajustado durante a etapa de tratamento térmico. Por conseguinte, o método de acordo com a presente invenção pode adicionalmente incluir uma etapa de ajuste de pH da amostra durante a etapa de tratamento térmico. O pH das amostras é preferivelmente ajustado durante a etapa de tratamento térmico para um pH de 6,0 a 9,0; pH de 6,5 a 8,5; pH de 6,5 a 8,0; pH de 7,0 a 9,0; pH de 7,0 a 8,5; pH de 7,0 a 8,0; pH de 7,1 a 8,0; pH de 7,5 a 8,0; pH de 7,0 a 7,8; pH de 7,1 a 7,8; pH de 7,1 a 7,7; pH de 7,2 a 7,6; pH de 7,3 a 7,5; pH 7,1; 7,2; 7,3; 7,4; 7,5; 7,6; 7,7; 7,8 ou 7,9.

[0054] No segundo aspecto de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para a manufatura de moléculas de anticorpo recombinante compreendendo a cultura de uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão codificante de uma molécula de anticorpo recombinante; adição de um tampão de extração à amostra apresentando um pH de 7,5 a 9,0 e submissão da amostra a uma etapa de tratamento térmico.

[0055] Conforme descrito acima no primeiro aspecto da presente invenção, o tampão de extração apresenta preferivelmente um pH de 7,5 a 9,0; pH de 7,5 a 8,8; pH de 7,5 a 8,5; pH de 8,0 a 9,0; pH de 8,5 a 9,0; pH de 8,6 a 8,9; pH 8,0; pH 8,1; pH 8,2; pH 8,3; pH 8,4; pH 8,5; pH 8,6; pH 8,7; pH 8,8; pH 8,9 ou pH 9,0. Nesse aspecto na presente invenção, a medida do pH da amostra não é essencial. O método de acordo com o segundo aspecto da presente invenção pode compreender a medida do pH da amostra e o ajuste do pH da amostra como descrito no primeiro aspecto da presente invenção. No entanto, a inclusão de uma etapa de medida de pH ou ajuste de pH não é essencial. Em uma forma de realização, o método de acordo com o segundo aspecto da invenção não inclui uma etapa de medida do pH da amostra ou uma etapa de ajuste do pH da amostra.

[0056] A descrição detalhada da invenção a seguir aplica-se à realizações de ambos primeiro e segundo aspectos da presente invenção.

[0057] Agente de ajuste de pH e tampão de extração

[0058] O ajuste do pH deve ser tal que o pH seja sustentado/mantido na faixa desejada de pH 6-9 durante a etapa de tratamento térmico.

[0059] Em uma forma de realização, o pH é ajustado com uma base tal como uma base inorgânica, por exemplo hidróxido de sódio, ou uma base orgânica tal como trietilamina ou trimetilamina.

[0060] Qualquer agente conveniente pode ser utilizado para ajustar o pH da amostra. O agente deve ser o tampão de extração ou pode ser adicionado antes e/ou depois do tampão de extração. Agentes típicos que podem ser utilizados para ajustar o pH compreendem, ou consistem em, um ou mais dos seguintes: NaOH, NH4OH, ácido sulfúrico, EDTA, tampão Tris. Preferivelmente, o pH da amostra é ajustado utilizando uma base como hidróxido de sódio ou hidróxido de amônio.

[0061] Em uma forma de realização, o tampão de extração é um tampão de Tris- (hidróxi-metil)-aminometano / sal desidratado dissódico de ácido etilenodiamino tetra- acético (Tris / EDTA) tipicamente ajustado para um pH desejado pela adição de HCl. Sem limitar-se à teoria, acredita-se que Tris e EDTA trabalhem sinergeticamente na liberação de lipopolissacarídeos (LPS) da membrana externa de E. coli. O EDTA remove cátions bivalentes que estabilizam LPS da membrana externa. Acredita-se que Tris se ligue a moléculas de LPS e substitua cátions Ca2+ e Mg2+. Tal fato resulta na redução das interações entre moléculas de LPS e por conseguinte, no aumento da permeabilidade da membrana externa (Vaara, M. 1992. Agents That Increase the Permeability of the Outer Membrane. American Society for Microbiology 56:395-411). Etapa de Tratamento Térmico

[0062] A etapa de tratamento térmico no método da presente invenção é preferivelmente da forma como descrita em detalhes em US 5.665.866 (o conteúdo desta é aqui incorporado como referência). A etapa de tratamento torna possível a obtenção de uma amostra de anticorpo solúvel, corretamente enovelada e montada; pela facilitação da remoção de outro material relacionado ao anticorpo. Anticorpo o qual é “corretamente enovelado e montado” é acusado pela presença de uma banda simples correspondente à massa molecular para cadeias leves e pesadas reunidas em análise por SDS-PAGE não redutora. Outros materiais relacionados ao anticorpo serão tipicamente cadeias leves e pesadas livres ou parte destas, fragmentos parcialmente degradados de anticorpo corretamente enovelado e montado.

[0063] A etapa de tratamento térmico é realizada pela submissão da amostra a uma temperatura elevada desejada. Mais preferivelmente, a etapa de tratamento térmico é realizada dentro da faixa de 30°C a 70°C. A temperatura pode ser selecionada conforme desejada e pode depender da estabilidade do anticorpo para purificação. Em outra forma de realização, a temperatura se encontra dentro da faixa de 40°C a 65°C, ou preferivelmente dentro da faixa de 40°C a 60°C, mais preferivelmente dentro da faixa de 45°C a 60°C, ainda mais preferivelmente dentro da faixa de 50°C a 60C e na forma mais preferida de 55°C a 60°C, 58°C a 60°C ou 59°C. Dessa forma, as temperaturas mínimas são 30°C, 35°C ou 40°C e as temperaturas máximas são 60°C, 65°C ou 70°C.

[0064] A etapa de tratamento térmico é preferivelmente realizada por um período de tempo prolongado. A duração do tratamento térmico é preferivelmente entre 1 e 24 horas, mais preferivelmente entre 4 e 18 horas, ainda mais preferivelmente entre 6 e 16 horas e da forma mais preferível entre 10 e 14 horas ou entre 10 e 12 horas, por exemplo 12 horas. Dessa forma, o período mínimo para o tratamento térmico é de 1, 2 ou 3 horas e o máximo de 20, 22 ou 24 horas.

[0065] Em uma forma de realização em particular, o tratamento térmico é realizado de 50°C a 60°C por 10 a 16 horas, e mais preferivelmente a 59°C por 10 a 12 horas. Um especialista na área entenderá que temperaturas e tempos podem ser selecionados como convir à amostra em questão e às características do anticorpo sendo produzido.

[0066] Em uma forma de realização, o processo de acordo com a presente descrição não inclui uma etapa de pré-tratamento de retenção das células sob condições controladas antes da realização do tratamento térmico.

[0067] Em uma forma preferida de realização, a presente invenção fornece um método para a manufatura de moléculas de anticorpo recombinante compreendendo a cultura de uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão codificante de uma molécula de anticorpo recombinante e adição de um tampão de extração à amostra e a submissão da amostra a uma etapa de tratamento térmico dentro da faixa de 40°C a 70°C, preferivelmente a 59°C, por um período de até 15 horas, preferivelmente 10-12 horas, em que antes da etapa de tratamento térmico, o pH da amostra é monitorado e ajustado de tal forma que o pH da amostra seja um pH de 7 a 8, preferivelmente um pH 7,4, antes da etapa de tratamento térmico, preferivelmente imediatamente antes da fase de aquecimento. Preferivelmente, um tampão de extração apresentando um pH de 7,4 ou 8,0 é adicionado à amostra.

[0068] A etapa de tratamento térmico é preferivelmente realizada em um aparelho agitador a uma RPM adequada, tal como 200 RPM. No entanto, a RPM adequada variará dependendo da escala do método.

Fermentação

[0069] A etapa de cultura de uma amostra de células hospedeiras compreende fermentação em qualquer escala desejada. Nos métodos da invenção, uma amostra pode ser o produto de uma fermentação compreendendo bactérias, especialmente bactérias gram-negativas, ou levedura, ou cultura celular, por exemplo, mas sem limitar-se à, uma cultura de células de inseto ou mamífero. Na forma mais preferida, a amostra é o produto de uma fermentação de E. coli expressando um anticorpo recombinante, em que o anticorpo citado produzido pode ser uma mistura de anticorpos funcionais e não funcionais. Se desejado, as células hospedeiras podem ser sujeitas à coleta a partir do meio de fermentação, por exemplo, as células hospedeiras podem ser coletadas a partir da amostra por centrifugação, filtração ou por concentração. Em particular, os métodos da invenção são adequados para manufatura industrial em larga-escala de anticorpos de qualidade terapêutica.

Etapas Adicionais

[0070] O método de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais etapas adicionais. Em uma forma de realização, o método de acordo com a presente invenção compreende uma etapa de centrifugação após a etapa de cultura, seguida da suspensão das células pela adição do tampão de extração.

[0071] O método pode adicionalmente compreender procedimentos de purificação primária tais como filtração e/ou centrifugação. Cromatografia em leito fluidizado também é incluída. Procedimentos de purificação a jusante preferidos incluem cromatografia de troca iônica, microfiltração, ultrafiltração, diafiltração, e captura em leito fixo e captura em leito expandido, e combinações de quaisquer destes.

Etapa de Tratamento Sem a Ocorrência de Lise

[0072] O método pode adicionalmente compreender a submissão da amostra a uma etapa de tratamento sem ocorrência de lise, antes da submissão da amostra à etapa de tratamento térmico. Essa etapa pode também ser referida como uma etapa de homogeneização (etapa de homog.). A etapa de tratamento sem ocorrência de lise pode aumentar ainda mais o rendimento de anticorpos funcionais isolados ou obtidos e facilitar o manuseio da amostra em larga escala. Lise causa um aumento na viscosidade que pode causar problemas no processamento a jusante e purificação dos anticorpos funcionais. Em particular, a lise das células hospedeiras causa a liberação das proteínas das células hospedeiras tornando a purificação mais cara e consumidora de tempo conforme mais etapas de purificação possam ser requeridas e/ou maiores quantidades de materiais para cromatografia sejam necessários para alcançar a pureza requerida. Liberação substancial de DNA de célula hospedeira leva ao aumento da viscosidade da amostra, causando dificuldades na filtração e na centrifugação, que é a principal causa de perda de proteína durante a clarificação. Uma amostra que sofreu lise (isto é, contém proteínas de células hospedeiras e DNA) pode também causar o bloqueio de materiais cromatográficos. A etapa de tratamento sem ocorrência de lise é preferivelmente realizada conforme descrito em WO 2006/054063 (o conteúdo desta foi aqui incorporado como referência). Conforme descrito em WO 2006/054063, a etapa de tratamento sem ocorrência de lise inclui qualquer tratamento que não produz lise em uma proporção substancial de bactéria, célula de mamífero, levedura, célula de inseto ou outro organismo utilizado para expressão de anticorpo recombinante, por exemplo, E. coli. Em uma forma de realização mais preferida, o tratamento sem a ocorrência de lise compreende uma etapa de pré-condicionamento de agitação. Uma “proporção substancial” inclui uma proporção de 80% ou mais dos organismos em uma fermentação ou cultura apresentando-se em forma intacta, mais preferivelmente mais que 85%, ainda mais preferivelmente mais que 90%, e da forma mais preferida, 95% ou mais se apresentando na forma intacta.

[0073] Lise pode ser avaliada de qualquer forma conhecida na área, incluindo: por observação em microscópio, análise de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) e ensaio do total de proteína versus o teor de proteína no sobrenadante e/ou no agregado do organismo (celular). Em uma forma de realização, lise pode ser avaliada após o tratamento sem ocorrência de lise pela comparação do teor de proteína total numa amostra antes e depois do tratamento. Se o tratamento fosse causador de lise, o teor de proteína total presente no sobrenadante da amostra tratada aumentaria comparado ao teor de proteína total presente na amostra citada não tratada, por exemplo, medido utilizando-se um ensaio de Bradford. Em uma forma preferida de invenção, análise de FACS é realizada com a amostra marcada com um pigmento fluorescente, seguida pelo tratamento sem ocorrência de lise e pela análise de FACS. Na forma mais preferida, análise de FACS é realizada antes do tratamento, gerando um valor de linha base para comparação.

[0074] Desta maneira, tratamento sem ocorrência de lise pode incluir pré- condicionamento por ressuspensão gradual ao longo de um período de tempo, por exemplo, por agitação, ou por ressuspensão manual tal como por pipetagem em, por exemplo, um tampão. Em uma forma de realização, pré-condicionamento é realizado por entre 1 hora e 24 horas, preferivelmente por entre 1 hora e 20 horas, mais preferivelmente por entre 2 horas e 18 horas, 4 horas e 16 horas, 6 horas e 16 horas e da forma mais preferencial por 12, 14 ou 16 horas. Desta forma, o período mínimo para pré-condicionamento é de 1, 2 ou 4 horas e o máximo é de 16, 18 ou 24 horas. Pré-condicionamento pode ser realizado à rotação de 50 a 250 RPM, preferivelmente de 60 RPM a 100 RPM, e da forma mais preferida por 14 ou 16 horas. Durante o pré- condicionamento, as células são mantidas a uma temperatura dentro da faixa de 4°C a 30°C, mais preferivelmente entre 4°C e 20°C e da forma mais preferida, à temperatura ambiente.

[0075] Em uma forma de realização, a etapa de pré-condicionamento não compreende parte do processo.

[0076] Em uma forma preferida de realização, tratamento sem ocorrência de lise compreende a submissão das células hospedeiras a pressões elevadas, por exemplo, utilizando uma prensa francesa ou descompressão com nitrogênio. Em um exemplo específico, a amostra é um produto de uma fermentação de E. coli, com a E. coli citada expressando um anticorpo recombinante, o qual é submetido a um tratamento sob pressão em uma prensa francesa. Pressões podem variar de, ou cerca de, 750 psi a, ou cerca de, 5000 psi. Em uma forma de realização, o tratamento sob pressão é realizado a 1000 psi, ou 1000 psi, ou 1250 psi, 1500 psi, 1750 psi, 2000 psi, 2250 psi, 2500 psi, 2750 psi, 3000 psi, 3250 psi, 3500 psi, 4000 psi, 4250 psi, 4500 psi ou 4750 psi. Mais preferivelmente, o tratamento sob pressão é realizado entre 1000 psi e 3000 psi, e da forma mais preferida a 2000 psi. O tratamento sob pressão o qual não leva à ocorrência substancial de lise (isto é, causando menos de 20% de lise) pode ser definido por experimentação simples, dependendo do tampão e o tipo de célula que consiste a amostra e da pressão.

[0077] Em uma forma de realização da presente invenção, o método não inclui uma etapa de tratamento sem a ocorrência de lise conforme descrito acima, tal como submissão das células hospedeiras a pressões elevadas ou pré-condicionamento por ressuspensão gradual ao longo de um período de tempo. A inclusão de tal tratamento sem a ocorrência de lise é conhecida por aumentar o rendimento de uma proteína recombinante (WO 2006/054063). No entanto, foi descoberto de maneira surpreendente que o aumento do rendimento de anticorpo é alcançado pelo método da presente invenção na presença ou ausência de tal tratamento sem ocorrência de lise. Por consequência, a forma de realização da presente invenção em que o método não compreende uma etapa de tratamento sem ocorrência de lise fornece meios mais simplificados e rentáveis para o fornecimento de um anticorpo recombinante.

Etapa de Retenção da Lama Contendo as Células

[0078] Em uma forma de realização, o método de acordo com a presente invenção compreende uma etapa de interrupção do método entre a etapa de cultura da amostra de célula hospedeira e um momento antes da adição do tampão de extração. Durante a etapa de interrupção, as amostras são mantidas a uma temperatura adequada. Esta etapa de interrupção do método é preferivelmente realizada conforme descrito em WO 2005/019466. Esta etapa pode também ser referida como uma etapa de retenção da lama contendo as células (RLCC). Preferivelmente, o método é interrompido por um período de pelo menos uma hora, de 1 hora a 72 horas, de 12 horas a 48 horas, por 12 horas, 24 horas, 33 horas ou 48 horas.

[0079] A amostra é preferivelmente mantida a uma temperatura adequada durante a interrupção do método, tal como 18°C.

[0080] Em uma forma de realização da presente invenção, o método não inclui uma etapa de interrupção após a etapa de cultura da amostra de célula hospedeira, conforme descrito em WO 2005/019466. A inclusão de tal interrupção é conhecida por aumentar o rendimento de uma proteína recombinante (WO 2005/019466). Foi descoberto de maneira surpreendente que um aumento similar no rendimento de anticorpo é alcançado pelo método da presente invenção com ou sem tal etapa de interrupção, isto é, nenhum aumento adicional no rendimento foi observado quando a etapa de interrupção foi incluída no método. Por consequência, a forma de realização da presente invenção na qual o método não compreende uma etapa de interrupção fornece meios mais simplificados e rentáveis para fornecimento de um anticorpo recombinante. Por consequência, em uma forma de realização, o período de tempo entre a etapa de cultura da amostra de célula hospedeira e a etapa de adição do tampão de extração é inferior a 12 horas, preferivelmente 10 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, 2 horas ou menos ou 1 hora ou menos ou menos que 1 hora.

Anticorpo

[0081] Conforme aqui utilizado, “anticorpo funcional” inclui moléculas que retêm a habilidade de reconhecer especificamente ou de se ligar a antígenos contra os quais eles foram criados (antígeno cognato). A produção de um anticorpo funcional é indicada pela presença de uma banda simples em análise de SDS-PAGE não redutora correspondente à massa molecular esperada do anticorpo, ou pelo ensaio de ligação direta utilizando BIAcore ou outros métodos conhecidos por um especialista na área, como por exemplo mas não limitado a, teste ELISA. Anticorpos não funcionais incluem fragmentos que não reconhecem seu antígeno cognato, e incluem anticorpos enovelados de forma incorreta ou agregados de forma incorreta, cadeias leves e pesadas livres, e seus fragmentos, incluindo fragmentos degradados de anticorpos os quais não reconhecem ou se ligam aos seus anticorpos cognatos.

[0082] Em um exemplo preferido, a molécula de anticorpo recombinante é pelo menos uma parte de uma cadeia leve de anticorpo e pelo menos parte de uma cadeia pesada de anticorpo, tal que pelo menos algumas das moléculas de anticorpo de cadeia pesada e leve expressas são capazes de se combinar de modo a formar um anticorpo funcional.

[0083] Conforme aqui utilizado, “anticorpos” incluem anticorpos apresentando cadeias leves e pesadas em seu comprimento total; fragmentos funcionalmente ativos, seus derivados ou análogos e podem ser, mas não se limitam a, fragmentos VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, Fab de dobradiça alterada, Fab’, F(ab’)2 ou Fv; um monômero ou dímero de cadeia pesada ou cadeia leve; anticorpo de cadeia simples, por exemplo, um Fv de cadeia simples no qual os domínios variáveis de cadeia leve e pesada são unidos por um ligante, ou um anticorpo com dupla funcionalidade, tal como um Fab-dAb, conforme descrito em PCT/GB2008/003331.

[0084] Os anticorpos podem ser anticorpos policlonais, monoclonais, bi-, tri- ou tetravalentes, anticorpos quiméricos ou humanizados. Estes anticorpos e seus fragmentos podem ser de ocorrência natural, anticorpos humanizados, quiméricos ou enxertado com CDR e técnicas de biologia molecular padrão podem ser utilizadas para modificar, adicionar ou excluir aminoácidos ou domínios conforme desejado. Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies que não são humanas contendo uma ou mais regiões determinantes de complementariedade (CDRs) de espécies que não são humanas e um arcabouço de uma molécula de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, US 5.585.089). As moléculas de anticorpo purificadas utilizando os métodos da invenção podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) ou subclasse de moléculas de imunoglobulina.

[0085] Os métodos para criação dessas moléculas de anticorpo são bem conhecidos na área (ver, por exemplo, Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341:544; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86:3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322:323; Bird et al, 1988, Science, 242:423; Queen et al., US 5,585,089; Adair, WO91/09967; Mountain e Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10:1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181).

[0086] Anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na área tal como técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), técnica de trioma, técnica de hibridoma envolvendo célula-B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) e técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0087] Anticorpos quiméricos são aqueles anticorpos codificados por genes de imunoglobulina que foram obtidos por engenharia genética de modo que os genes de cadeia pesada e leve são compostos de segmentos de gene de imunoglobulina pertencentes a diferentes espécies. Esses anticorpos quiméricos são provavelmente menos antigênicos. Anticorpos bivalentes são obtidos por métodos conhecidos na área (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539; WO 93/08829, Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659). Anticorpos bi-, tri- e tetravalentes podem compreender especificidades múltiplas ou podem ser monoespecíficos (ver, por exemplo WO 92/22853).

[0088] Sequências de anticorpo podem também ser geradas utilizando métodos de obtenção de anticorpo a partir de um único linfócito baseados na clonagem molecular e expressão de cDNAs de região variável de imunoglobulina gerados a partir de linfócitos únicos que foram selecionados para produção de anticorpos específicos tal como descrito por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848 e em WO 92/02551. Os últimos métodos dependem do isolamento de células produtoras de anticorpo individuais, as quais então sofrem expansão clonal seguida de triagem dos clones que são produtores de anticorpo que reconhece seu antígeno cognato, e, se desejada, a subsequente identificação da sequência de seus genes variáveis de cadeia leve (VL) e pesada (VH). Alternativamente, as células produtoras de anticorpo que reconhece seu antígeno cognato podem ser submetidas ao cultivo juntas seguido pela triagem.

[0089] Anticorpos preparados utilizando os métodos da invenção são, na forma mais preferida, anticorpos humanizados que podem ser subsequentemente ligados a toxinas, drogas, compostos citotóxicos, ou polímeros ou outros compostos que prolonguem a meia vida do anticorpo quando administrado a um paciente.

[0090] O anticorpo pode ser específico para qualquer antígeno alvo. O antígeno pode ser uma proteína associada à célula, por exemplo, uma proteína de superfície celular em células tais como células bacterianas, células de leveduras, células T, células endoteliais, células tumorais, ou pode ser uma proteína solúvel. Antígenos de interesse podem também ser quaisquer proteínas relevantes medicamente tais como aquelas proteínas ativadas durante doença ou infecção, por exemplo, receptoras e/ou suas ligantes correspondentes. Exemplos particulares de proteínas de superfície de células incluem moléculas de adesão, como por exemplo, integrinas tais como β1 integrinas como VLA-4, E-selectina, P selectina ou L-selectina, Receptor CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 ou CSF1, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, similar a nectina-2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembriônico (CEA), globulina lipídica do leite humano (HMFG1 e 2), antígenos MHC Classe I e MHC Classe II, KDR e VEGF, e onde for apropriado, seus receptores.

[0091] Antígenos solúveis incluem interleucinas tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 ou IL-17, tais como IL17A e/ou IL17F, antígenos virais, como por exemplo, antígenos do vírus sincicial respiratório ou do citomegalovírus, imunoglobulinas, tal como IgE, interferons tais como interferon □, interferon □ ou interferon □, fator de necrose tumoral TNF (formalmente conhecido como fator de necrose tumoral □), fator de necrose tumoral □, fatores estimuladores de colônia tal como G-CSF ou GM-CSF, e fatores de crescimento derivado das plaquetas tais como PDGF-α e PDGF-β e onde apropriado, seus receptores. Outros antígenos incluem antígenos de superfície de células bacterianas, toxinas bacterianas, vírus tais como influenza; EBV; HepA, B e C; agentes de bioterrorismo, radionuclídeos e metais pesados, toxinas e venenos de cobra e aranha.

[0092] Em uma forma de realização, o anticorpo pode ser utilizado para alterar funcionalmente a atividade do antígeno de interesse. Por exemplo, o anticorpo pode neutralizar, antagonizar ou agonizar a atividade do antígeno citado, diretamente ou indiretamente.

[0093] Em uma forma preferida de realização, o anticorpo é um anticorpo anti- TNF, mais preferivelmente um Fab’ de um anti-TNF, conforme descrito em WO1/094585 (cujo conteúdo é aqui incorporado na forma de referência).

[0094] Métodos para expressão de proteínas recombinantes são bem conhecidos na área. Exemplos convenientes de células hospedeiras para a expressão das moléculas de anticorpo recombinante incluem bactérias tal como gram-positiva ou gram-negativa, como por exemplo, E. coli, ou células de leveduras, como por exemplo, S. cerevisiae, ou células de mamíferos, como por exemplo, células CHO e de mieloma ou linhagem de células de hibridoma, como por exemplo células NOS. Na forma mais preferida, nos métodos da invenção, um anticorpo recombinante é produzido em bactéria, como por exemplo, E. coli (ver Verma et al., 1988, J. Immunol. Methods 216:165-181; Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods 263:133-147).

Células

[0095] O termo “amostra”, utilizado na presente invenção, refere-se a uma população de células que foram transformadas com um vetor de expressão codificante de uma molécula de anticorpo recombinante. A amostra pode estar em qualquer escala conveniente, de produção do anticorpo em pequena escala à manufatura do anticorpo em larga escala para fins comerciais.

[0096] As células utilizadas na presente invenção podem ser, por exemplo, mas sem limitação à, de bactérias, especialmente de bactérias gram-negativas; de leveduras; de mamíferos ou de insetos. Na forma mais preferida, as células são de E. coli. As células podem ser células do tipo selvagem ou células recombinantes as quais foram submetidas a técnicas de engenharia genética. Células hospedeiras de E. coli podem ser de estirpes de E. coli de ocorrência natural ou estirpes mutantes capazes de produzir proteínas recombinantes. Exemplos de estirpes de E. coli hospedeiras específicas incluem MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue e JM109. Um exemplo é a E. coli W3110 (ATCC 27,325), uma estirpe hospedeira comumente empregada para fermentação de proteínas recombinantes. Exemplos também incluem estirpes de E. coli modificadas, como por exemplo mutantes metabólicos e estirpes com deficiência de protease.

[0097] O anticorpo recombinante produzido utilizando os métodos da presente invenção é tipicamente expresso tanto no periplasma da célula hospedeira de E. coli, quanto no sobrenadante da cultura da célula hospedeira, dependendo da natureza da proteína e da escala de produção. Os métodos para direcionamento das proteínas para essas regiões específicas são bem conhecidos na área e para uma revisão, consultar Makrides, Microbiological Reviews, 1996, 60, 512-538. Exemplos de sequências sinais adequadas para direcionar proteínas para o periplasma de E. coli incluem as sequências sinais PhoA, OmpA, OmpT, LamB e OmpF de E. coli. Proteínas podem ser direcionadas para o sobrenadante pela dependência das vias secretoras naturais ou pela indução de vazamento limitado através membrana externa a fim de causar secreção de proteína, como por exemplo, pelo uso da sequência líder peIB, da sequência líder da proteína A, da coexpressão da proteína de liberação de bacteriocina, da proteína de liberação de bacteriocina induzida por mitomicina juntamente com a adição de glicina ao meio de cultura e da coexpressão do gene kil para permeabilização da membrana. Da forma mais preferida, nos métodos da presente invenção, a proteína recombinante é expressa no periplasma da E. coli hospedeira.

[0098] Expressão de proteína recombinante nas células hospedeiras de E. coli também pode ocorrer sob controle de um sistema induzível, por meio do qual a expressão do anticorpo recombinante na E. coli está sob controle de um promotor induzível. Muitos promotores induzíveis adequados para o uso em E. coli são conhecidos na área e dependendo do promotor, a expressão da proteína recombinante pode ser induzida por fatores variados tais como temperatura ou concentração de uma substância em particular no meio de crescimento (Baneyx, Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10:411-421; Goldstein e Doi, 1995, Biotechnol. Annu.Rev., 105-128). Exemplos de promotores induzíveis incluem os promotores lac, tac e trc de E. coli, que são induzíveis com lactose ou análogo não hidrolisável da lactose, isopropil-D-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e os promotores phoA, trp e araBAD, os quais são induzidos por fosfato, triptofano e L-arabinose respectivamente. Expressão pode ser induzida por, por exemplo, adição de um indutor ou uma mudança na temperatura na qual a indução seja dependente da temperatura. Onde a indução da expressão da proteína recombinante é alcançada pela adição de um indutor à cultura, o indutor pode ser adicionado por qualquer método conveniente dependendo do sistema de fermentação e do indutor, por exemplo, por adições em dose única ou múltipla ou pela adição gradual do indutor por meio de um sistema de alimentação. Será observado que, pode haver um intervalo de tempo entre a adição do indutor e a indução efetiva da expressão da proteína, por exemplo, no caso do indutor ser a lactose, pode haver um intervalo de tempo antes da ocorrência de expressão da proteína enquanto alguma fonte de carbono pré-existente é utilizada antes da lactose.

[0099] Culturas de células hospedeiras de E. coli (fermentações) podem ser realizadas em qualquer meio que suportará o crescimento de E. coli e a expressão da proteína recombinante. O meio pode ser qualquer meio definido quimicamente, tal como aqueles fornecidos em Pirt S.J. (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publications, com modificações onde forem apropriadas a fim de controlar a taxa de crescimento conforme aqui descrito. Um exemplo de um meio conveniente é o ‘SM6E’ conforme descrito por Humphreys et al., 2002, em Protein Expression and Purification, 26:309-320.

[0100] A cultura de células hospedeiras E. coli pode ser realizada em qualquer recipiente adequado tal como um frasco agitado ou um fermentador dependendo da escala de produção requerida. Vários fermentadores em larga escala encontram-se disponíveis com capacidade de mais de 1.000 litros até cerca de 100.000 litros. Preferivelmente, fermentadores de 1.000 a 50.000 litros são utilizados, mais preferivelmente de 1.000 a 10.000 ou 12.000 litros. Fermentadores em menor escala também podem ser utilizados com capacidade entre 0,5 a 1.000 litros.

[0101] Fermentação de E. coli pode ser realizada em qualquer sistema conveniente, por exemplo de modo contínuo, em batelada ou em batelada alimentada (Thiry & Cingolani, 2002, Trends in Biotechnology, 20:103-105) dependendo da proteína e dos rendimentos requeridos. O modo em batelada pode ser empregado com adições em doses de nutrientes ou indutores conforme requerido. Alternativamente, uma cultura em batelada alimentada pode ser empregada e as culturas crescem em pré-indução no modo batelada à taxa específica de crescimento máxima que pode ser sustentada utilizando os nutrientes presentes inicialmente no fermentador e um ou mais regimes de alimentação de nutrientes utilizados no controle da taxa de crescimento até que a fermentação seja completada. O modo de batelada alimentada pode também ser empregado na pré-indução para controlar o metabolismo de células hospedeiras de E. coli e para permitir que densidades celulares elevadas sejam alcançadas (Lee, 1996, Tibtech, 14:98-105).

[0102] Características preferidas de cada forma de realização da invenção são como para cada uma das formas de realização mutatis mutandis. Todas as publicações, incluindo, mas não limitando a, patentes e aplicações de patentes citadas nessa especificação são aqui incorporadas como referência, como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser aqui incorporada como referência, como se totalmente exposta.

[0103] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo obtido ou obtenível a partir do processo descrito.

[0104] Em um aspecto, é fornecido o uso de meios de controle de pH, tal como uma solução tampão, para melhorar a extração de anticorpo, por exemplo extração primária, em particular onde o controle garanta que o pH seja mantido na faixa de pH de 6 a 9 durante a etapa de extração, tal como uma etapa de extração em temperatura elevada.

[0105] Meios de controle de pH significam, conforme aqui empregado, tampão, base e/ou ácido.

[0106] A invenção será agora descrita com referência aos exemplos a seguir, os quais são meramente ilustrativos e não devem, de forma alguma, ser interpretados como limitantes do escopo da presente invenção.

[0107] Figura 1 trata-se de um gráfico apresentando o pH das células após ressuspensão em tampão de extração de Tris/EDTA com pH 7,4 e pH 8 ao longo do tempo.

[0108] Figura 2a trata-se de um histograma apresentando o efeito do pH do tampão de extração no rendimento de anticorpo A.

[0109] Figura 2b trata-se de um histograma apresentando o pH das amostras de células (lama contendo células após ressuspensão) imediatamente após a adição de um tampão de extração com um pH de 7,4 a 9,0 e o pH das amostras de célula, 1 hora após a adição do tampão de extração mas antes da fase de aquecimento.

[0110] Figura 3a trata-se de um histograma apresentando o efeito do ajuste do pH da amostra antes da etapa de tratamento térmico no rendimento de anticorpo A. Os números acima de cada barra indicam o aumento percentual no rendimento comparado ao controle sem a etapa de ajuste de pH.

[0111] Figura 3b trata-se de um gráfico apresentando a variação do pH das amostras ao longo dos vários estágios do método: a lama contendo as células (após cultura e centrifugação), posterior adição do tampão (imediatamente após a adição do tampão de extração), pré-ajuste de pH, ajuste posterior do pH mas anterior à fase de aquecimento; e posterior etapa de tratamento térmico.

[0112] Figura 4 apresenta uma análise por SDS-PAGE de amostras de anticorpo A extraídas a partir de células após tratamento térmico. O Perfil 1 corresponde a um marcador de massa molecular, Perfil 2 corresponde à uma amostra de anticorpo A, Perfil 3 corresponde à uma amostra que não foi submetida ao ajuste de pH e os Perfis de 4 a 8 correspondem às amostras submetidas ao ajuste de pH para 7,0; 7,2; 7,4; 7,6 e 7,8 respectivamente antes da etapa de tratamento térmico.

[0113] Figura 5 trata-se de um histograma apresentando o efeito do emprego de um tampão de extração a um pH 8 e do ajuste do pH da amostra para pH 7,4 antes da etapa de tratamento térmico no rendimento de anticorpo A. Figura 5 também apresenta o efeito da inclusão de uma etapa de homogeneização ou uma etapa de retenção da lama contendo as células. Os números acima de cada barra indicam o aumento percentual no rendimento comparado ao controle com uma etapa de homogeneização, mas sem a etapa de ajuste de pH.

[0114] Figura 6 apresenta uma análise por SDS-PAGE de amostras de anticorpo A extraídas a partir das células após tratamento térmico.

[0115] Perfil 1 corresponde a um marcador de massa molecular;

[0116] Perfil 2 corresponde à uma amostra de anticorpo A;

[0117] Perfil 3 corresponde à amostra após uma etapa de homogeneização mas sem ajuste de pH de sem retenção da lama contendo as células;

[0118] Perfil 4 corresponde à amostra após tratamento com tampão de extração a um pH 8 e ajuste para um pH 7,4 antes do tratamento térmico e após uma etapa de homogeneização e sem retenção da lama contendo as células;

[0119] Perfil 5 corresponde à amostra que não foi submetida ao ajuste de pH, sem homogeneização e sem retenção da lama contendo as células;

[0120] Perfil 6 corresponde à amostra após tratamento com tampão de extração a um pH 8 e ajuste para um pH 7,4 antes da etapa de tratamento térmico e que não foi submetida à homogeneização e não foi submetida à retenção da lama contendo as células;

[0121] Perfil 7 corresponde à amostra após retenção da lama contendo as células mas que não foi submetida ao ajuste de pH e não foi submetida à homogeneização;

[0122] Perfil 8 corresponde à amostra após tratamento com tampão de extração a um pH 8 e ajuste para pH 7,4 antes da etapa de tratamento térmico e retenção da lama contendo as células mas sem homogeneização;

[0123] Figura 7 trata-se um gráfico apresentando o pH da amostra ao longo do tempo para uma amostra controle que não foi submetida ao ajuste de pH, uma amostra que foi tratada com tampão de extração a um pH 8, uma amostra que foi tratada com tampão de extração de pH 7,4 e um ajuste do pH da amostra para pH 7,4 antes da etapa de tratamento térmico e uma amostra que foi tratada com tampão de extração com pH 8 e um ajuste de pH da amostra para pH 7,4 antes da etapa de tratamento térmico. O primeiro pico indica o ponto no qual o tampão de extração foi ajustado e o segundo pico indica o ponto no qual o pH de duas das amostras foi ajustado antes da etapa de tratamento térmico.

[0124] Figura 8 trata-se de um histograma apresentando o efeito de uma amostra de controle que não foi submetida a um ajuste de pH, uma amostra que foi tratada com tampão de extração com pH 7,4 e um ajuste de pH da amostra para pH 7,4 antes da etapa de tratamento térmico, uma amostra que foi tratada com tampão de extração com pH 8, e uma amostra que foi tratada com tampão de extração com pH 8 e um ajuste de pH da amostra para pH 7,4 antes da etapa de tratamento térmico no rendimento de anticorpo A. Os números acima de cada barra indicam o aumento percentual no rendimento comparado ao controle sem etapa de ajuste de pH.

[0125] Figura 9 trata-se de um histograma apresentando o efeito de uma amostra controle sem ajuste de pH, uma amostra que foi tratada com tampão de extração com pH 7,4 e ajuste de pH da amostra para 7,4 durante a fase de aquecimento antes da etapa de tratamento térmico, e uma amostra que foi tratada com tampão de extração com pH 8 e ajuste de pH da amostra para pH 7,4 durante a fase de aquecimento antes da etapa de tratamento térmico no rendimento de anticorpo A. Os números acima de cada barra indicam o aumento percentual no rendimento comparado ao controle sem etapa de ajuste de pH.

[0126] Figura 10 trata-se de um histograma apresentando o efeito de ajuste de pH para 6,6; 7,0; 7,4 e 7,8 na concentração de Fab’ comparado ao controle, que não foi submetido ao ajuste de pH. O experimento é repetido com três etapas de pré- tratamento diferentes (anteriores à extração): sem pré-tratamento, retenção da lama contendo as células e homogeneização.

[0127] Figura 11 trata-se de um histograma apresentando a concentração média de Fab’ nas seguintes condições: sem ajuste de pH, sem pré-tratamento e ajuste de pH (para a faixa de 6,6 a 7,8 unidades), homogeneização e ajuste de pH (para a faixa de 6,6 a 7,8 unidades) e todas as condições com pH ajustado (homogeneização e pré-tratamento). Barras de erro indicam um desvio padrão com relação à média.

Método Geral

[0128] Nos exemplos a seguir, o método é realizado como segue, a menos que o contrário seja indicado.

Etapa de Cultura de Células e Centrifugação

[0129] Anticorpo A (um Fab’) foi expresso em células de E. coli W3110 utilizando o vetor pTT0D com DNA codificante de anticorpo A enxertado. Fermentação foi realizada a 25°C por 30 horas após indução com lactose e pronta para coleta. Alíquotas de cinquenta mL ou 1 L de cultura coletada foram centrifugadas por 1 hora a 4200 RPM e a 4°C.

[0130] O sobrenadante foi decantado e para estimular a clarificação na escala de produção, uma pequena proporção do sobrenadante foi adicionada às células a fim de que amostra de lama contendo as células correspondesse a 35% da massa coletada.

Etapa de Retenção da Lama Contendo as Células (RLCC)

[0131] Em alguns experimentos, uma etapa de retenção da lama contendo as células foi realizada, na qual a amostra foi retida por 33 horas a 18°C e 200 RPM antes da adição do tampão de extração.

Adição do Tampão de Extração

[0132] A amostra resultante de lama contendo as células (doravante referida como a amostra) foi submetida à ressuspensão utilizando uma solução estoque de Tris a 300 mM e EDTA a 30 MM para uma concentração final de Tris de 100 mM e de EDTA de 10 mM e utilizando HCl para ajuste do pH para 7,4. Nos experimentos descritos abaixo, o pH desse tampão de extração é ajustado a partir do pH de controle de 7,4 para níveis de pH mais elevados entre pH 7,4 e 9,0.

Etapa de Homogeneização (Homog.)

[0133] Em alguns experimentos, uma etapa de homogeneização foi realizada após a adição do tampão de extração por uma única passagem a 1500 psi.

Ajuste de pH Antes da Etapa de Aquecimento

[0134] Em alguns experimentos a amostra foi submetida ao ajuste de pH com NaOH a 5 M para um nível desejado entre 7,0 e 7,8 antes do início de uma fase de aquecimento.

Fase de Aquecimento

[0135] As amostras foram submetidas a uma fase de aquecimento na qual a temperatura da amostra foi elevada de 18°C até a temperatura elevada desejada de 59°C na qual a etapa de tratamento térmico teve início.

Ajuste de pH Durante a Fase de Aquecimento

[0136] Em alguns experimentos, a amostra foi submetida ao ajuste de pH com NaOH a 5 M para um nível desejado de 7,4 ± 0,02 durante a fase de aquecimento até que a temperatura elevada desejada de 59°C fosse alcançada.

Etapa de Tratamento Térmico

[0137] A amostra foi mantida a 59°C por 10 a 12 horas a 200 RPM.

[0138] Após o tratamento térmico, os aglomerados de células submetidos à ressuspensão foram clarificados a 4200 RPM por 1 hora a 4°C. O sobrenadante contendo anticorpo A funcional foi ensaiado para Fab’ por meio da análise de HPLC com coluna de Proteína G em tampão de fosfato a 20 mM. Anticorpo A foi eluído utilizando um gradiente de pH de pH 7,0 na injeção, reduzindo a um pH 2,5.

[0139] Amostras de extratos reduzidos foram submetidas a corridas eletroforéticas em géis de SDS-PAGE Tris-Glicina com uma massa de aplicação de aproximadamente 1 Dg.

Exemplo 1: Efeito no pH da Amostra após a Adição de um Tampão de Extração

[0140] A etapa de cultura das células e a etapa de adição do tampão de extração, na qual o tampão apresenta um pH 8,0 ou pH 7,4, foram realizadas conforme descrito na seção de Método Geral. O pH da amostra foi monitorado a partir da adição do tampão de extração. A Figura 1 apresenta a ocorrência de um decréscimo rápido no pH da amostra após a adição do tampão e o pH diminui rapidamente para valores inferiores a 7, especialmente quando o tampão apresenta um pH de 7,4.

Exemplo 2: Efeito do pH do Tampão de Extração no Rendimento de Anticorpo

[0141] A etapa de cultura das células, etapa de adição do tampão de extração, fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico foram realizadas conforme descrito na seção de Método Geral.

[0142] A etapa de retenção da lama contendo as células, etapa de homogeneização e a etapa de ajuste do pH antes ou durante o aquecimento não foram realizadas.

[0143] O pH do tampão de extração foi variado como segue: 7,4; 8,0; 8,1; 8,2; 8,3; 8,4; 8,5; 8,6; 8,7; 8,8; 8,9 e 9,0. Os resultados foram apresentados na Figura 2a, a qual apresenta as concentrações de Fab’ após a extração a quente. Pode ser observado que, um pH elevado do tampão de extração, acima de 7,4, resultou em um aumento significativo na recuperação de Fab’, aumentando o rendimento até pH 8,8.Acima de 8,8, as concentrações de Fab’ começam a diminuir. Tabela 1

[0144] A tabela 1 e a Figura 2b apresentam o pH das amostras de células (lama contendo as células submetidas à ressuspensão) imediatamente após a adição do tampão de extração apresentando um pH de 7,4 a 9,0 e o pH das amostras de células, 1 hora após a adição do tampão de extração antes da fase de aquecimento.

Exemplo 3: Efeito do pH Antes da Fase de Aquecimento no Rendimento da Produção de Anticorpos

[0145] A etapa de cultura das células, etapa de adição do tampão de extração, etapa de ajuste de pH antes do aquecimento, fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico foram realizadas conforme descrito na seção de Método Geral. O controle não foi submetido a uma etapa de ajuste de pH.

[0146] No experimento de controle, o tampão de extração apresentava um pH 7,4 e nos demais experimentos, quando o pH foi ajustado antes da fase de aquecimento, o tampão de extração apresentava um pH de 8,0.

[0147] A etapa de retenção da lama contendo as células e a etapa de ajuste do pH durante o aquecimento não foram realizadas.

[0148] No controle, não foi realizado ajuste de pH antes da fase de aquecimento. Nos demais experimentos, o pH da amostra foi ajustado antes da fase de aquecimento para pH 7,0; 7,2; 7,4; 7,6 e 7,8.

[0149] Os resultados são apresentados na Figura 3a, a qual apresenta que esta etapa de ajuste de pH resultou no aumento da recuperação de Fab’. Figura 3a demonstra como o ajuste do pH para pontos definidos dentro de uma faixa de pH de 7,0 a 7,8 aumentou a recuperação do produto de 26 para 40% comparado à amostra de controle, a qual não foi submetida ao ajuste de pH.Tabela 2

[0150] O pH da amostra foi medido em vários pontos no método. A Tabela 2 acima e a Figura 3b apresentam a variação do pH das amostras ao longo de vários estágios do método: a lama contendo as células (após cultura e centrifugação), posterior adição do tampão (imediatamente após a adição do tampão de extração), pré-ajuste do pH, posterior ajuste do pH mas anterior à fase de aquecimento e posterior etapa de tratamento térmico.

[0151] O gel de SDS-PAGE na Figura 4 apresenta os perfis de proteína das amostras após a extração. O perfil 1 corresponde a um marcador de massa molecular, o perfil 2 corresponde a uma amostra de anticorpo A, o perfil 3 corresponde à amostra sem ajuste de pH e os perfis 4 a 8 correspondem a amostras após o ajuste do pH para 7,0; 7,2; 7,4; 7,6 e 7,8, respectivamente, mas antes da etapa de tratamento térmico.

[0152] A massa de amostra aplicada foi normalizada para 1 μg de Fab’. Não foram observadas diferenças significativas nos perfis de proteína entre o controle e as amostras submetidas ao ajuste de pH antes do aquecimento.

Exemplo 4: Efeito do pH do Tampão de Extração e do Ajuste do pH no Rendimento de Anticorpos Produzidos na Presença e na Ausência de uma Etapa de Retenção de Lama Contendo Células e de uma Etapa de Homogeneização

[0153] Os experimentos seguintes foram realizados conforme descrito na seção de Método Geral.

[0154] Controle (com homog.): etapa de cultura de células, etapa de adição de um tampão de extração (pH 7,4), etapa de homogeneização, fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico;

[0155] Tampão com pH 8 e ajuste de pH antes do aquecimento para pH 7,4 (com homog.): etapa de cultura das células, adição do tampão de extração (pH 8,0), etapa de homogeneização, etapa de ajuste de pH antes do aquecimento para pH 7,4, fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico;

[0156] Controle (sem homog. ou RLCC): etapa de cultura das células, etapa de adição de tampão de extração (pH 7,4), fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico;

[0157] Tampão com pH 8 e ajuste de pH antes do aquecimento para pH 7,4 (sem homog. ou RLCC): etapa de cultura das células, etapa de adição do tampão de extração (pH 8), etapa de ajuste de pH antes do aquecimento para pH 7,4, fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico;

[0158] Controle (com RLCC): etapa de cultura das células, etapa de retenção da lama contendo as células, etapa de adição do tampão de extração (pH 7,4), fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico; e

[0159] Tampão com pH 8 e ajuste de pH antes do aquecimento para pH 7,4 (com RLCC): etapa de cultura das células, etapa de adição do tampão de extração (pH 8), etapa de ajuste de pH antes do aquecimento para pH 7,4, fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico.

[0160] Figura 5 apresenta os resultados dos experimentos acima. Pode-se observar que a adição da etapa de ajuste de pH antes do aquecimento resultou em valores concentração de extração aproximadamente 34% maiores em comparação ao controle. Também pode ser observado que a inclusão de uma etapa de homogeneização não tem efeito no rendimento, quando comparado ao método com etapa de ajuste de pH. A retenção da lama contendo as células leva a um aumento no rendimento, quando comparado ao rendimento das extrações controle, mas não quando comparado ao rendimento daquelas com etapa de ajuste de pH.

[0161] O gel de SDS-PAGE na Figura 6 apresenta os perfis de proteína das amostras após a extração.

[0162] O perfil 1 corresponde a um marcador de massa molecular;

[0163] O perfil 2 corresponde a uma amostra de anticorpo A;

[0164] O perfil 3 corresponde a uma amostra após uma etapa de homogeneização mas sem ajuste de pH e sem retenção da lama contendo as células;

[0165] O perfil 4 corresponde à amostra após tratamento com tampão de extração com pH 8 e ajuste para pH 7,4 antes do tratamento térmico e uma etapa de homogeneização e sem retenção de lama contendo as células;

[0166] O perfil 5 corresponde à amostra sem ajuste de pH, sem homogeneização e sem retenção da lama contendo as células;

[0167] O perfil 6 corresponde à amostra após tratamento com tampão de extração com pH 8 e ajuste para pH 7,4 antes do tratamento térmico e sem homogeneização e sem retenção da lama contendo as células;

[0168] O perfil 7 corresponde à amostra após retenção da lama contendo as células mas sem ajuste de pH e sem homogeneização;

[0169] O perfil 8 corresponde à amostra após tratamento com tampão de extração com pH 8 e ajuste para pH 7,4 antes do tratamento térmico e retenção da lama contendo as células mas sem homogeneização.

[0170] Os perfis de proteína dos extratos com ajuste de pH foram comparáveis aos controles submetidos à retenção da lama contendo as células.

Exemplo 5: Efeito do pH do Tampão de Extração e/ou Etapa de Ajuste de pH Antes do Aquecimento no pH da Amostra e no Rendimento de Fab’.

[0171] A etapa de cultura das células, etapa de adição do tampão de extração, fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico foram realizadas conforme descrito na seção de Método Geral. Dois experimentos incluíram um ajuste do pH antes da etapa de aquecimento e dois outros não incluíram essa etapa.

[0172] A etapa de retenção da lama contendo as células, etapa de homogeneização e etapa de ajuste de pH durante o aquecimento não foram realizadas.

[0173] Quatro diferentes estratégias de controle de pH foram realizadas: Controle: tampão de extração com pH 7,4 e sem ajuste de pH antes do aquecimento; Tampão de extração com pH 7,4 e ajuste de pH para 7,4 antes do aquecimento; Tampão com pH 8: Tampão de extração com pH 8,0 e sem ajuste de pH antes do aquecimento; e Tampão de extração com pH 8,0 e ajuste do pH para 7,4 antes do aquecimento.

[0174] O pH foi monitorado ao longo da recuperação primária com início a partir da lama contendo as células passando pela adição do tampão (primeiro pico), ajuste do pH antes do aquecimento (segundo pico) e tratamento térmico (redução do pH). A Figura 7 apresenta o perfil de pH durante os métodos.

[0175] O efeito no rendimento de Fab’ é apresentado na Figura 8, na qual pode ser observado que todas as estratégias de aumento do pH (1 a 3) resultaram no aumento do rendimento de Fab’ e a estratégia 4, utilizando uma combinação de tampão elevado e ajuste de pH antes do aquecimento, resultou na recuperação de Fab’ mais elevada.

[0176] Exemplo 6: Efeito do pH do Tampão de Extração e/ou Etapa de Ajuste de pH Durante o Aquecimento no pH da Amostra e no Rendimento de Fab’

[0177] A etapa de cultura de células, etapa de adição do tampão de extração, fase de aquecimento e etapa de tratamento térmico foram realizados conforme descrito na seção de Método Geral. Dois experimentos incluíram um ajuste de pH durante a etapa de aquecimento e o controle não incluiu esta etapa.

[0178] A etapa de retenção da lama contendo as células, etapa de homogeneização e a etapa de ajuste de pH antes do aquecimento não foram realizadas.

[0179] Três diferentes estratégias de controle de pH foram realizadas:Controle: tampão de extração com pH 7,4 e sem ajuste de pH durante o aquecimento; Tampão de extração com pH 7,4 e ajuste de pH para 7,4 durante o aquecimento; Tampão de extração com pH 8,0 e ajuste para 7,4 durante o aquecimento.

[0180] O efeito no rendimento de Fab’ é apresentado na Figura 9, na qual pode ser observado que todas as estratégias de elevação de pH (2 e 3) resultaram no aumento do rendimento de Fab’ e a estratégia 4, utilizando uma combinação de tampão elevado e ajuste de pH durante o aquecimento, resultou em um aumento na recuperação de Fab’.

Exemplo 7

[0181] O experimento foi realizado pela coleta do caldo de fermentação e centrifugação a fim de remover a maior parte do meio exaurido produzindo então uma lama contendo as células. Esta lama contendo as células foi mantida na condição de retenção por 33 horas. No caso das condições de homogeneização e sem pré- tratamento, as células foram submetidas à ressuspensão no tampão de extração e homogeneizadas ou extraídas em temperatura elevada sem qualquer pré-tratamento. Na sequência da retenção da lama, as células foram submetidas à ressuspensão no tampão de extração. Uma vez que todas as condições foram submetidas à ressuspensão no tampão de extração, elas tiveram o pH ajustado para o ponto definido desejado (apresentado na Figura 10) e a extração em temperatura elevada (59°C por 10 horas) foi iniciada. Na sequência da extração a quente, o extrato foi clarificado por centrifugação para determinar a concentração de Fab’ na fase líquida.

[0182] Os dados abaixo também estão representados na Figura 12.

[0183] O controle não foi submetido a um pré-tratamento e não houve controle de pH.

Claims (13)

1. Método para a preparação de moléculas de anticorpos recombinantes selecionadas dentre Fab, Fab modificado, um Fab de articulação alterada, Fab', F(ab')2 ou fragmento Fv; um anticorpo de cadeia única, uma cadeia única Fv na qual os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são unidos por um ligante de peptídeo, e de um anticorpo de especificidade dupla, como um Fab-dAb, compreendendo: a) a cultura de uma amostra de célula hospedeira de uma bactéria gram- negativa transformada com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; b) a adição de um tampão de extração tendo um pH de 7,5 a 9 na amostra; e c) submeter a amostra a uma etapa de tratamento térmico dentro de uma faixa de 40°C a 70°C por 1 a 24 horas; caracterizado pelo fato de que o pH da amostra é detectado após a adição do tampão de extração e ajustado se o pH da amostra não tiver um pH de 7 a 9, para assegurar que o pH da amostra seja de 7 a 9 antes da etapa de tratamento térmico e não ajustar se a amostra tiver um pH de 7 a 9.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH é detectado antes e durante a fase de aquecimento.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pH é mais baixo durante a fase de aquecimento do que antes da fase de aquecimento.

4. Método de acordo com a reivindicação 1,2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o pH da amostra é monitorado continuamente do ponto de adição do tampão de extração ao início da fase de aquecimento.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o pH da amostra é monitorado continuamente durante a etapa de tratamento térmico.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de tratamento térmico é executada dentro da faixa de 40°C a 65°C.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o tampão de extração é tampão Tris/EDTA.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o pH da amostra é ajustado com NaOH, NH4OH, ácido sulfúrico, EDTA ou tampão Tris.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é específico para um antígeno selecionado dentre integrinas, interleucinas, interferons, antígenos virais, TNF, CD40, CD40L, OX40, fatores estimuladores de colônia e fatores de crescimento derivado das plaquetas.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que célula hospedeira é E.coli.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpo é expressa no periplasma de E.coli.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente purificação primária e purificação a jusante.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a purificação primária compreende filtração ou centrifugação e a purificação a jusante compreende cromatografia de troca iônica, microfiltração, ultrafiltração ou diafiltração.

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