PT2531526T

PT2531526T - Processo de obtenção de anticorpos

Info

Publication number: PT2531526T
Application number: PT117029744T
Authority: PT
Inventors: Pierre Bilgischer Jean-Pascal; Robert Pearce-Higgins Mark; John Kenny Andrew; Jonathan Bassett Philip
Original assignee: Ucb Biopharma Sprl
Priority date: 2010-02-03
Filing date: 2011-02-02
Publication date: 2017-11-16
Also published as: LT3275896T; NO2531526T3; HUE037191T2; SG183151A1; JP2013518572A; AU2011212493B2; PL2531526T3; KR101779234B1; BR112012019404A2; BR112012019404B8; DK2531526T3; EP2531526A1; CN102812042B; ES2647387T3; JP2016005483A; BR112012019404B1; HK1179272A1; SG10201408639RA; EP3275896B1; US20220348641A1

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ANTICORPOS"

Esta invenção refere-se a métodos para aumentar os rendimentos na produção e no isolamento de anticorpos recombinantes, e, em particular, de anticorpos terapêuticos. Os métodos são particularmente adequados para o fabrico industrial em grande escala de anticorpos terapêuticos.

As técnicas de ADN recombinante têm evoluído rapidamente e são particularmente úteis na produção de anticorpos, em particular anticorpos terapêuticos. Os sistemas para a expressão de genes recombinantes são bem conhecidos do especialista no campo em questão. Estes incluem a expressão em células de mamífero, células de insetos, células fúngicas, células bacterianas, e animais e plantas transgénicas. A escolha do sistema de expressão depende das características da proteína codificada, por exemplo das modificações pós-tradução. Outras considerações incluem o tempo e, em particular, o custo envolvido na produção da quantidade desejada de material da qualidade necessária. Estas últimas considerações são particularmente importantes na produção de anticorpos terapêuticos da qualidade necessária para aprovação regulamentar e nas quantidades necessárias para o tratamento de grandes números de doentes. 0 sistema mais amplamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes baseia-se na expressão em Escherichia coli (E. coli) . Um problema específico que se encontra na utilização de E. coli é a dificuldade em produzir material da qualidade necessária em quantidades necessárias para terapia. Em particular, o tempo e custos envolvidos podem ser proibitivos. Um problema específico digno de nota é a perda que ocorre no rendimento dos anticorpos durante a extração dos anticorpos de E. coli.

Embora, proporcionalmente, os custos de purificação são uma fração dos custos totais de um produto de anticorpo terapêutico, aumentando cada vez mais a proporção dos custos de purificação à medida que os custos de produção a montante se tornam menos dispendiosos. Assim, as melhorias na recuperação e purificação de anticorpos reduzirão ainda mais os custos de produção independentemente dos meios de produção (Humphreys & Glover, Curr. Opin. Drug Disc/'overy & Development, 2001, 4:172-185). Deste modo, há uma necessidade de métodos que introduzam poupanças de tempo e/ou custos na produção de anticorpos terapêuticos e, em particular, na purificação, por exemplo aumentando a recuperação do produto e/ou melhorando a qualidade da corrente de produto. O baixo rendimento de produto por fermentação ou cultura é frequentemente um problema particular observado na primeira etapa de extração; a expressão do anticorpo é alta dentro das células, mas é extraordinariamente dificil conseguir-se uma alta percentagem de recuperação na primeira etapa de extração.

Um método que resolve parcialmente este último problema e que permite a produção de anticorpos aceitáveis para utilização terapêutica é descrito na US 5,655,866. Este método envolve a utilização de tratamento térmico para facilitar o isolamento subsequente de fragmentos Fab' funcionais de anticorpos a partir de anticorpos não funcionais, sendo o tratamento térmico realizado em qualquer momento durante a fermentação ou cultura, ou em qualquer etapa durante a extração e purificação dos anticorpos. A temperaturas elevadas, acima da temperatura ambiente, os anticorpos funcionais são extraordinariamente estáveis, enquanto muitas outras proteínas incluindo as proteínas da célula hospedeira e as espécies livres das cadeias leves e pesadas e os fragmentos não funcionais de anticorpos, formam precipitados e/ou agregados que são facilmente separados do anticorpo funcional durante os procedimentos de purificação principais tais como filtração ou centrifugação ou cromatografia de leito fluidizado. No método descrito na US 5,655,866, os extratos de células foram preparados incubando as células intactas em tampão de Tris HC1 100 mM, pH 7,4 que continha EDTA 10 mM. A US 5,665,866 também refere que o pH deve ser controlado e mantido a 7,0 ± 0,05 durante a fermentação das células hospedeiras, mas não menciona o controlo ou ajuste do pH após a fermentação. A W02006/054063 descreve um aumento no rendimento do anticorpo funcional na primeira etapa de extração pela inclusão de um tratamento não litico em combinação com tratamento térmico. Este método ensina que após centrifugação os sedimentos celulares foram ressuspensos numa amostra que compreende Tris 1M, pH 7,4, que contém EDTA 100 mM, seguido de tratamento não litico e, em seguida, tratamento térmico. A W02005/019466 descreve um aumento no rendimento de proteínas recombinantes através da inclusão de um passo de interrupção sob condições definidas de temperatura e pH após fermentação, mas antes do processamento a jusante incluindo extração.

Sumário da Invenção

Esta invenção aqui descrita baseia-se na observação surpreendente e inesperada que depois de se cultivar uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante, um aumento no pH da amostra resultante durante o primeiro processo de recuperação tem um impacto benéfico significativo sobre o rendimento do anticorpo.

Surpreendentemente, embora o anticorpo possa começar a um pH na gama de 6 - 9 antes do processamento, tal como aquecimento, o pH cai mesmo quando tamponado, provavelmente como consequência do metabolismo celular. Os presentes inventores acreditam agora que isto é prejudicial para a produção/recuperação e propuseram resolver isto ajustando, quando apropriado, o pH do material antes e/ou durante o processamento para garantir que o pH permanece dentro da gama alvo.

Determinou-se surpreendentemente que o pH da amostra antes de um passo de tratamento térmico tem um efeito considerável no rendimento de anticorpo da amostra de células. Determinou-se que o ajuste do pH da amostra de maneira que o pH da amostra se situe a pH 6 a 9 antes do passo de tratamento térmico proporciona um aumento no rendimento de anticorpo de até 40%. Isto permite poupanças imensamente benéficas no tempo e custo de produção de quantidades de anticorpos funcionais de qualidade terapêutica. Na realidade, outros passos frequentemente utilizados para aumentar o rendimento, tais como os passos de homogeneização e espera, podem não ser necessários para se conseguir niveis altos de rendimento de anticorpos.

Nos métodos anteriormente utilizados, por exemplo na US 5,655,866, os extratos celulares eram preparados incubando as células intactas num tampão que tem um pH de 7,4. Determinou-se que apesar da adição de um tampão que se esperaria que mantivesse o pH da amostra a um nivel constante, o pH da amostra de células na realidade diminui ao longo do tempo. Em certas circunstâncias, tal como ao longo de intervalos de tempo longos após adição de um tampão, determinou-se que o pH da amostra é tão baixo quanto pH 5,5 antes do passo de tratamento térmico. Determinou-se que a deteção e opcionalmente o ajuste do pH antes do tratamento térmico para assegurar que o pH da amostra é de 6 a 9 resultam num aumento surpreendente no rendimento de anticorpo.

Embora não se pretenda ficar limitado pela teoria, julga-se que é importante manter o pH na gama 6 a 9 durante o passo de processamento, tal como o tratamento térmico. 0 ajuste do pH antes do processamento (tal como um passo de tratamento térmico) ajuda a manter o pH na gama correta. Por conseguinte, num aspeto é proporcionado um passo de extração de anticorpo em que o pH é mantido substancialmente na gama 6 a 9, durante substancialmente a duração do processo.

Sem se ficar limitado pela teoria, julga-se que os métodos proporcionados pela presente invenção permitem a recuperação de proteína recombinante a partir do periplasma durante o isolamento primário, a qual não é libertada sob condições de extração padrão.

Por conseguinte, é aqui divulgado um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende cultivar uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; adicionar um tampão de extração à amostra; e submeter a amostra a um passo de tratamento térmico; em que o pH da amostra é detetado após adição do tampão de extração e opcionalmente ajustado para assegurar que o pH da amostra é de 6 a 9 antes do passo de tratamento térmico. A monitorização do pH nesta etapa é essencial para estabelecer um controlo sobre o pH.

Num aspeto alternativo, é aqui divulgado um método de extração de moléculas de anticorpos recombinantes a partir de uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; que compreende os passos de: ajustar o pH de uma composição das referidas células para que se situe na gama 6 a 9, de tal forma que o pH seja mantido na gama durante um passo de extração subsequente, submeter as células a uma passo de extração, tal como um passo de tratamento térmico, em que o pH é monitorizado pelo menos num ponto no tempo imediatamente antes e/ou durante o passo de extração.

Determinou-se também que um aumento no pH do tampão de extração proporciona um aumento surpreendente no rendimento de anticorpo depois de a amostra ser submetida a um passo de tratamento térmico.

Por conseguinte, num segundo aspeto é aqui divulgado um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende cultivar uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; adicionar um tampão de extração à amostra que tem um pH de 7,5 a 9,0; e submeter a amostra a um passo de tratamento térmico.

Descrição detalhada da Invenção

Molécula de anticorpo como aqui utilizado pretende referir-se a um anticorpo inteiro ou um fragmento de ligação do mesmo, em particular um anticorpo inteiro ou um fragmento Fab. Moléculas de anticorpo nas formas de realização da invenção pretende referir-se a um fragmento Fab, Fab modificado, um Fab de charneira modificado, Fab', F(ab')2 ou Fv; um anticorpo de cadeia simples; um Fv de cadeia simples em que os domínios variáveis das cadeias pesada e leve estão unidos por uma unidade de ligação peptídica, e um anticorpo de dupla especificidade, tal como um Fab-dAb.

No primeiro aspeto da presente invenção, a amostra tem ou é ajustada de forma a ter um pH de 7 a 9 antes do passo de tratamento térmico.

Numa forma de realização preferida, a amostra tem um pH de pH 7,0 a 9,0, pH 7,0 a 8,5, pH 7,0 a 8,0, pH 7,1 a 8,0, pH 7,5 a 8,0, pH 7,0 a 7,8, pH 7,1 a 7,8, pH 7,1 a 7,7, pH 7,2 a 7,6, pH 7,3 a 7,5, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8 ou pH 7,9, tal como um pH 7,4, em particular pH 6,8 antes do passo de tratamento térmico. A medição de pH aqui referida é geralmente normalizada a 20 graus C. O passo de tratamento térmico no método da presente invenção é um passo de manutenção da temperatura da amostra a uma temperatura elevada desejada, assim que esta temperatura elevada desejada foi atingida durante uma fase de aquecimento. As gamas de temperatura adequadas para o passo de tratamento térmico são desde 40 a 70 °C.

No contexto da presente invenção a redação "antes do passo de tratamento térmico" significa antes e incluindo o ponto no tempo em que a amostra atinge a temperatura elevada desejada e começa o passo de tratamento térmico (mantendo a uma temperatura elevada). A fim de atingir a temperatura elevada desejada para o passo de tratamento térmico a amostra é submetida a um "fase de aquecimento" durante a qual a temperatura da amostra é aumentada até à temperatura elevada desejada. Numa forma de realização, o método de acordo com a presente invenção compreende submeter a amostra a uma fase de aquecimento e um passo de tratamento térmico.

No método da presente invenção a amostra tem um pH de 7 a 9, antes do passo de tratamento térmico. Neste contexto, "antes do passo de tratamento térmico" significa que o pH da amostra se encontra ao nível necessário antes ou no ponto no tempo em que a amostra atinge a temperatura elevada desejada para o passo de tratamento térmico. Na forma de realização em que o método compreende submeter a amostra a uma fase de aquecimento e um passo de tratamento térmico, a amostra pode estar ao nivel de pH necessário antes do início da fase de aquecimento e/ou ao nível de pH necessário durante a fase de aquecimento.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende cultivar uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; adicionar um tampão de extração à amostra; e submeter a amostra a uma fase de aquecimento e um passo de tratamento térmico; em que o pH da amostra é detetado após adição do tampão de extração e opcionalmente ajustado para assegurar que o pH da amostra é pH 7 a 9, por exemplo tal como pH 7 a 8, antes da fase de aquecimento.

Numa forma de realização alternativa, a presente invenção proporciona um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende cultivar uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; adicionar um tampão de extração à amostra; e submeter a amostra a uma fase de aquecimento e um passo de tratamento térmico; em que o pH da amostra é detetado após a adição do tampão de extração.

Numa forma de realização, o pH da amostra é detetado e opcionalmente ajustado para assegurar que o pH da amostra se encontra a um primeiro pH antes da fase de aquecimento e a um segundo pH durante a fase de aquecimento. 0 primeiro e segundo niveis de pH são preferencialmente diferentes. De um modo preferido, o segundo pH é inferior ao primeiro pH. Por conseguinte, a presente invenção proporciona um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende cultivar uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; adicionar um tampão de extração à amostra; e submeter a amostra a uma fase de aquecimento e um passo de tratamento térmico; em que o pH da amostra é detetado após a adição do tampão de extração, e opcionalmente ajustado para assegurar que o pH da amostra é ρΗ 7 a 9, preferencialmente pH 7 a 8, antes da fase de aquecimento. Nesta forma de realização, o pH da amostra pode ser detetado e opcionalmente ajustado antes da fase de aquecimento, e detetado e opcionalmente ajustado durante a fase de aquecimento.

Numa forma de realização preferida, a amostra tem um pH de pH 7 a 9, mais preferencialmente pH 7 a 8, imediatamente antes da fase de aquecimento. É também divulgado um método em que a amostra tem um pH de 6 a 9, preferencialmente pH 6 a 8, mais preferencialmente pH 6 a 7 imediatamente antes do passo de tratamento térmico durante a fase de aquecimento, incluindo opcionalmente o ponto em que a amostra atinge a temperatura elevada desejada e começa o passo de tratamento térmico. Constatou-se que o pH da amostra imediatamente antes da fase de aquecimento ou imediatamente antes do passo de tratamento térmico tem um impacto significativo sobre o rendimento do anticorpo recombinante.

No contexto da presente invenção, o termo "imediatamente antes" significa preferencialmente um período de 30 minutos ou menos, 20 minutos ou menos, 15 minutos ou menos, 10 minutos ou menos, 5 minutos ou menos, 4 minutos ou menos, 3 minutos ou menos, 2 minutos ou menos, 1 minuto ou menos, 30 segundos ou menos, 10 segundos ou menos, 5 segundos ou menos, 1 segundo ou menos antes da fase de aquecimento do passo de tratamento térmico. Ο ρΗ da amostra é detetado após a adição do tampão de extração. 0 pH da amostra pode ser detetado utilizando qualquer equipamento de medição de pH adequado conhecido na técnica. 0 pH da amostra pode ser detetado em um ou mais pontos separados durante o método, tal como no ponto de adição do tampão de extração, imediatamente depois da adição do tampão de extração, imediatamente antes do inicio da fase de aquecimento, no ponto de inicio da fase de aquecimento, durante a fase de aquecimento incluindo o ponto em que a amostra atinge a temperatura elevada desejada para o passo de tratamento térmico, durante o passo de tratamento térmico e após o passo de tratamento térmico. Alternativamente, o pH da amostra é detetado por monitorização continua. Nesta forma de realização em que o pH da amostra é continuamente monitorizado, o pH é preferencialmente monitorizado de forma continua desde depois do passo de cultura das células, preferencialmente depois de um passo de centrifugação após cultura, até ao inicio do passo de tratamento térmico. Numa forma de realização preferida, o pH da amostra é monitorizado continuamente desde o ponto de adição do tampão de extração até ao inicio do passo de tratamento térmico. No entanto, o pH pode ser também monitorizado durante o passo de cultura e/ou durante o passo de tratamento térmico.

Assim, numa forma de realização o perfil de pH do passo de aquecimento é controlado.

Numa forma de realização preferida, o pH da amostra é detetado e opcionalmente ajustado, e a fase de aquecimento é iniciada, preferencialmente de forma automática, quando a amostra atinge o pH desejado. 0 tampão de extração é adicionado após o passo de cultura da amostra de células. Se o método compreende um passo de centrifugação após o passo de cultura, o tampão de extração pode ser adicionado antes e/ou durante e/ou após o passo de centrifugação. Preferencialmente o tampão de extração é adicionado após um passo de centrifugação para ressuspender o sedimento celular resultante da centrifugação.

Numa forma de realização da presente invenção, o tampão de extração tem um pH adequado que assegura que o pH da amostra é pH 7 a 9, antes do passo de tratamento térmico. Nesta forma de realização, quando o tampão de extração tem um pH adequado para assegurar que o pH da amostra é 7 a 9, antes do tratamento térmico, o tampão de extração, por exemplo, tem um pH de pH 7,5 a 9,0, pH 7,5 a 8.8, pH 7,5 a 8,5, pH 8,0 a 9,0, pH 8,5 a 9,0, pH 8,6 a

8.9, pH 8,0, pH 8,1, pH 8,2, pH 8,3, pH 8,4, pH 8,5, pH 8,6, pH 8,7, pH 8,8, pH, 8,9 ou pH 9,0. A fase de aquecimento e o passo de tratamento térmico são preferencialmente realizados pouco depois, preferencialmente imediatamente depois, da adição do tampão de extração a fim de assegurar que a amostra tem o pH necessário antes do passo de tratamento térmico. Por exemplo, a fase de aquecimento ou o passo de tratamento térmico pode ser realizado 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, 2 horas ou menos, 1 hora ou menos, 30 minutos ou menos, 10 minutos ou menos ou 5 minutos ou menos após a adição do tampão de extração.

Por conseguinte, o método da presente invenção pode não requerer um passo de ajuste do pH da amostra. O pH da amostra pode ser detetado após a adição do tampão de extração como sendo de pH 7 a 9, consoante necessário. Por exemplo, este pode ser o caso se o pH do tampão de extração é adequado para trazer o pH da amostra até 7 a 9, como se descreve acima e.g. em que o tampão de extração tem um pH de 7,5 a 9,0 e o passo de tratamento térmico é realizado pouco depois.

No entanto, tipicamente, devido à duração de tempo entre a adição do tampão de extração e o passo de tratamento térmico, o método de acordo com a presente invenção requer um passo de deteção e ajuste do pH da amostra, além de qualquer ajuste do pH que possa ser provocado pela adição do tampão de extração, para assegurar que o pH da amostra é 7 a 9 antes do passo de tratamento térmico.

Nesta forma de realização em que o método compreende um passo de deteção e ajuste do pH, o pH do tampão de extração pode ser inferior a pH 8.

Alternativamente, numa forma de realização preferida, o tampão de extração tem um pH de 7,5 a 9,0, pH 7,5 a 8,8, pH 7,5 a 8,5, pH 8,0 a 9,0, pH 8,5 a 9,0, pH 8,6 a 8,9, pH 8,0, pH 8,1, pH 8,2, pH 8,3, pH 8,4, pH 8,5, pH 8,6, pH 8,7, pH 8,8, pH, 8,9, pH 9,0 muito preferencialmente pH 8,0.

Nesta forma de realização, o pH da amostra pode ser ajustado por qualquer meio adequado e em qualquer momento adequado durante o método. O pH da amostra pode ser ajustado antes e/ou após a adição do tampão de extração.

Numa forma de realização, o pH da amostra é ajustado antes da adição do tampão de extração. Nesta forma de realização, se o método compreende um passo de centrifugação após o passo de cultura, o passo de ajuste do pH pode ser realizado antes e/ou após o passo de centrifugação. O pH da amostra após cultura das células e, opcionalmente, após centrifugação, é tipicamente baixo. Por exemplo, a amostra pode ter um pH de aproximadamente pH 5,5. Por conseguinte, após a cultura das células e, opcionalmente, após um ou mais passos adicionais, tal como centrifugação, o pH da amostra pode ser ajustado. Por exemplo, o pH da amostra pode ser ajustado antes da adição do tampão de extração até pH 6,5 a 8,0, preferencialmente pH 7,0 a 8,0, pH 6,5 a 7,5, pH 6,6 a 7,4, pH 6,7 a 7,3, pH 6, 8 a 7,2, pH 6,9 a 7,1, muito preferencialmente pH 6,9.

Numa forma de realização em que o pH da amostra antes da adição do tampão de extração é inferior a pH 7, tal como pH 6,9, e o pH da amostra antes do passo de tratamento térmico tem de ser de pH 7 a 9, o pH da amostra requer aumento adicional pela adição de tampão de extração e/ou por ajuste adicional do pH após a adição do tampão de extração de tal forma que o pH da amostra é de 7 a 9 antes do passo de tratamento térmico.

Numa forma de realização preferida da presente invenção o pH da amostra é ajustado a pH 7 a 9 após a adição do tampão de extração, mas antes do passo de tratamento térmico. Nesta etapa, a amostra é preferencialmente ajustada a pH 7,0 a 9,0, pH 7,0 a 8,5, pH 7,0 a 8,0, pH 7,1 a 8,0, pH 7,5 a 8,0, pH 7,0 a 7,8, pH 7,1 a 7,8, pH 7,1 a 7,7, pH 7,2 a 7,6, pH 7,3 a 7,5, pH 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 ou 7,9 e muito preferencialmente a pH 7,4. Numa forma de realização, o pH da amostra é ajustado antes da fase de aquecimento. Preferencialmente, o pH da amostra é ajustado a pH 7 a 9, preferencialmente pH 7 a 8, antes da fase de aquecimento. Alternativa ou adicionalmente, o pH da amostra é ajustado durante a fase de aquecimento. Preferencialmente, o pH da amostra é ajustado a pH 6 a 8, preferencialmente pH 6 a 7 durante a fase de aquecimento.

Numa forma de realização preferida da presente invenção é adicionado um tampão de extração que tem um pH 8 à amostra e o pH da amostra é detetado e subsequentemente ajustado a um pH de 7,4 antes do passo de tratamento térmico, preferencialmente antes da fase de aquecimento, de forma mais preferida imediatamente antes da fase de aquecimento.

Na forma de realização em que o pH da amostra é detetado após a adição do tampão de extração e ajustado antes do passo de tratamento térmico, o pH da amostra pode ser detetado e ajustado antes do inicio da fase de aquecimento. Adicional ou alternativamente, o pH da amostra pode ser detetado e ajustado durante a fase de aquecimento.

Numa forma de realização preferida, o pH da amostra é detetado e ajustado imediatamente antes da fase de aquecimento. Adicional ou alternativamente, o pH da amostra é detetado e ajustado imediatamente antes do passo de tratamento térmico durante a fase de aquecimento, incluindo opcionalmente o ponto em que a amostra atingiu a temperatura elevada desejada e começa o passo de tratamento térmico.

No contexto da presente invenção, o termo "imediatamente antes" significa preferencialmente que o pH da amostra é detetado e ajustado a pH 7 a 9 durante 30 minutos ou menos, 20 minutos ou menos, 15 minutos ou menos, 10 minutos ou menos, 5 minutos ou menos, 4 minutos ou menos, 3 minutos ou menos, 2 minutos ou menos, 1 minuto ou menos, 30 segundos ou menos, 10 segundos ou menos, 5 segundos ou menos, 1 segundo ou menos antes da fase de aquecimento ou antes do passo de tratamento térmico. 0 termo "imediatamente antes" pode abranger também que o pH da solução é detetado e ajustado no inicio da fase de aquecimento ou no inicio do passo de tratamento térmico.

Numa forma de realização preferida, a fase de aquecimento e/ou o passo de tratamento térmico são desencadeados, preferencialmente de forma automática quando se deteta que o pH da amostra é de pH 6 a 9. 0 pH da amostra pode ser detetado e ajustado por qualquer passo único ou múltiplos passos de ajuste do pH como se descreve acima. Por conseguinte, o pH pode ser ajustado: • apenas antes da adição do tampão de extração; • apenas após a adição do tampão de extração, mas antes do passo de tratamento térmico; ou • antes da adição do tampão de extração e após a adição do tampão de extração, mas antes do passo de tratamento térmico. 0 pH pode ser ajustado várias vezes após a adição de tampão de extração, por exemplo 1, 2, 3, 4 ou mais vezes,

Numa forma de realização, o pH da amostra é ajustado de forma continua, preferencialmente entre a adição do tampão de extração e antes do passo de tratamento térmico.

Numa forma de realização, o pH da amostra pode ser adicionalmente detetado e opcionalmente ajustado durante o passo de tratamento térmico. Por conseguinte, o método de acordo com a presente invenção pode incluir ainda um passo de ajuste do pH da amostra durante o passo de tratamento térmico. 0 pH da amostra é preferencialmente ajustado durante o passo de tratamento térmico até pH 6,0 a 9.0, pH 6,5 a 8,5, pH 6,5 a 8,0, pH 7,0 a 9,0, pH 7,0 a 8.5, pH 7,0 a 8,0, pH 7,1 a 8,0, pH 7,5 a 8,0, pH 7,0 a 7,8, pH 7,1 a 7,8, pH 7,1 a 7,7, pH 7,2 a 7,6, pH 7,3 a 7.5, pH 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 ou 7,9.

No segundo aspeto de acordo com a presente invenção é proporcionado um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende cultivar uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; adicionar um tampão de extração à amostra que tem um pH de 7,5 a 9,0; e submeter a amostra a um passo de tratamento térmico.

Como se descreve anteriormente no primeiro aspeto da presente invenção, o tampão de extração tem preferencialmente um pH de 7,5 a 9,0, pH 7,5 a 8,8, pH 7,5 a 8,5, pH 8,0 a 9,0, pH 8,5 a 9,0, pH 8,6 a 8,9, pH 8,0, pH

8.1, pH 8,2, pH 8,3, pH 8,4, pH 8,5, pH 8,6, pH 8,7, pH 8,8, ρΗ, 8,9 ou ρΗ 9,0. Neste aspeto da presente invenção não é essencial que se detete o pH da amostra. O método de acordo com o segundo aspeto da presente invenção pode compreender a deteção do pH da amostra e o ajuste do pH da amostra como se descreveu no primeiro aspeto da presente invenção. No entanto, não é essencial que se inclua um passo de deteção do pH ou ajuste do pH. Numa forma de realização, o método de acordo com o segundo aspeto da invenção não inclui um passo de deteção do pH da amostra ou um passo de ajuste do pH. A seguinte descrição detalhada da invenção aplica-se a formas de realização tanto do primeiro como do segundo aspeto da presente invenção.

Agente de ajuste do pH e tampão de extração O ajuste do pH deve ser de tal forma que o pH seja sustentado/mantido na gama desejada de pH 6-9, durante o passo de tratamento térmico.

Numa forma de realização, o pH é ajustado com uma base tal como uma base inorgânica, por exemplo, hidróxido de sódio ou uma base orgânica tal como trietilamina ou trimetilamina.

Qualquer agente adequado pode ser utilizado para ajustar o pH da amostra. O agente pode ser o tampão de extração ou pode ser adicionado antes e/ou após o tampão de extração. Os agentes típicos que podem ser utilizados para ajustar o pH compreendem ou consistem em um ou mais dos seguintes: NaOH, NH4OH, Ácido sulfúrico, EDTA, tampão de Tris. Preferencialmente, o pH da amostra é ajustado utilizando uma base tal como hidróxido de sódio ou hidróxido de amónio.

Numa forma de realização, o tampão de extração é um tampão de Tris(hidroximetil)aminometano / Sal dissódico do ácido etilenodinitrilotetracético desidratado (Tris / EDTA) tipicamente ajustado a um pH desejado por adição de HC1. Sem se ficar limitado pela teoria, julga-se que o Tris e o EDTA atuam sinergicamente na libertação de lipopolissacáridos (LPS) a partir da membrana externa de E. coli. 0 EDTA remove os catiões bivalentes que estabilizam os LPS da membrana externa. Julga-se que o Tris se liga aos LPS e substitui o Ca2+ e o Mg2+. Isto resulta numa redução de interações entre as moléculas de LPS e, por conseguinte, num aumento da permeabilidade da membrana externa (Vaara, M. 1992. Agents That Increase the Permeability of the Outer Membrane. American Society for Microbiology 56:395-411).

Passo de Tratamento Térmico 0 passo de tratamento térmico no método da presente invenção é preferencialmente como se descreve em pormenor na US 5,665,866. 0 passo de tratamento térmico permite obter uma amostra de anticorpo solúvel, corretamente montado e dobrado, facilitando a remoção de outro material relacionado com o anticorpo. Um anticorpo que é "corretamente montado e dobrado" é mostrado pela presença de uma única banda correspondente ao peso molecular esperado para as cadeias pesada e leve montadas sobre a SDS-PAGE não redutora. 0 outro material relacionado com o anticorpo será tipicamente cadeias pesadas e leves livres ou partes das mesmas, fragmentos parcialmente degradados de um anticorpo corretamente montado e dobrado. 0 passo de tratamento térmico é realizado submetendo a amostra a uma temperatura elevada desejada. Muito preferencialmente, o passo de tratamento térmico é realizado dentro da gama de 40 °C a 70 °C. A temperatura pode ser selecionada conforme desejado e pode depender da estabilidade do anticorpo para purificação. Noutra forma de realização, a temperatura situa-se dentro da gama de 40 °C a 65 °C, ou preferencialmente dentro da gama de 40 °C a 60 °C, mais preferencialmente dentro da gama de 45 °C a 60 °C, ainda mais preferencialmente dentro da gama de 50 °C a 60°C e muito preferencialmente a 55 °C a 60 °C, 58 °C a 60 °C ou 59 °C. Assim, a temperatura mínima é 40 °C e as temperaturas máximas são 60 °C, 65 °C ou 70 °C. O passo de tratamento térmico é preferencialmente realizado durante um intervalo de tempo prolongado. A duração do tratamento térmico é preferencialmente entre 1 e 24 horas, mais preferencialmente entre 4 e 18 horas, ainda mais preferencialmente entre 6 e 16 horas e muito preferencialmente entre 10 e 14 horas ou entre 10 e 12 horas, por exemplo 12 horas. Assim, o tempo mínimo para o tratamento térmico é de 1, 2 ou 3 horas e o máximo é de 20, 22 ou 24 horas.

Numa forma de realização particular, o tratamento térmico é realizado a 50 °C a 60 °C durante 10 a 16 horas, e mais preferencialmente a 59 °C durante 10 a 12 horas. Um especialista na técnica entenderá que as temperaturas e os tempos podem ser selecionados em conformidade com a amostra em questão e com as características do anticorpo a ser produzido.

Numa forma de realização, o processo de acordo com a presente divulgação não inclui um passo de pré-tratamento de conservação das células sob condições controladas antes da realização do passo de tratamento térmico.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende cultivar uma amostra de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante e adicionar um tampão de extração à amostra e submeter a amostra a um passo de tratamento térmico dentro da gama de 40 °C a 70 °C, preferencialmente 59 °C, durante um período de até 15 horas, preferencialmente 10-12 horas, em que antes do passo de tratamento térmico o pH da amostra é monitorizado e ajustado de tal forma que o pH da amostra é ρΗ 7 a 8, preferencialmente pH 7,4, antes do passo de tratamento térmico, preferencialmente imediatamente antes da fase de aquecimento. Preferencialmente, adiciona-se à amostra um tampão de extração que tem um pH de 7,4 ou 8,0. O passo de tratamento térmico é preferencialmente realizado num agitador ajustado a uma RPM adequada, tal como 200 RPM. No entanto, a RPM adequada variará dependendo da escala do método.

Fermentação O passo de cultura de uma amostra de células hospedeiras pode compreender a fermentação em qualquer escala desejada. Nos métodos da invenção, uma amostra pode ser o produto de uma fermentação que compreende bactérias, especialmente bactérias gram-negativas. Muito preferencialmente, a amostra é o produto de uma fermentação que compreende E. coli que expressa um anticorpo recombinante, em que os referidos anticorpos produzidos podem ser uma mistura de anticorpos funcionais e não funcionais. Caso se pretenda, as células hospedeiras podem ser submetidas a colheita a partir do meio de fermentação, e.g. as células hospedeiras podem ser recolhidas a partir da amostra por centrifugação, filtração ou concentração. Em particular, os métodos da invenção são adequados para o fabrico industrial em grande escala de anticorpos de qualidade terapêutica.

Passos Adicionais É também aqui divulgado um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende um ou mais passos adicionais. É também aqui divulgado um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende um passo de centrifugação após o passo de cultura, seguido de suspensão das células por adição de tampão de extração. 0 método pode compreender adicionalmente procedimentos de purificação primários tais como filtração e/ou centrifugação. Está também incluída a cromatografia de leito fluidizado. Os procedimentos de purificação a jusante preferidos incluem cromatografia de troca iónica, microfiltração, ultrafiltração, diafiltração, e captura em leito fixo e captura em leito expandido, e combinações de qualquer um destes.

Passo de Tratamento não Litico 0 método pode compreender ainda submeter a amostra a um passo de tratamento não litico antes de se submeter a amostra ao passo de tratamento térmico. Este passo pode ser também referido como um passo de homogeneização (passo de homog.). 0 passo de tratamento não litico pode aumentar ainda mais o rendimento dos anticorpos funcionais isolados ou obtidos e facilitar o manuseamento da amostra numa grande escala. A lise provoca um aumento na viscosidade que pode originar problemas no processamento e purificação a jusante do anticorpo funcional. Em particular, a lise das células hospedeiras provoca a libertação de proteínas da célula hospedeira tornando a purificação mais dispendiosa e demorada, uma vez que para se conseguir a pureza necessária podem ser necessários mais passos de purificação e/ou serão necessárias maiores quantidades de materiais cromatográficos. A libertação substancial de ADN da célula hospedeira aumenta a viscosidade da amostra originando dificuldades de filtração e centrifugação que é uma causa importante de perda de proteína durante a purificação. Uma amostra lisada (i.e. que contém proteínas e ADN da célula hospedeira) pode originar também o bloqueio dos materiais cromatográficos. 0 passo de tratamento não lítico é preferencialmente realizado como descrito em WO 2006/054063. Como descrito em WO 2006/054063. O passo de tratamento não lítico inclui qualquer tratamento que não produza lise de uma proporção substancial das bactérias, células de mamífero, levedura, células de inseto, ou outro organismo utilizado para a expressão do anticorpo recombinante, e.g. E. coli. Numa forma de realização muito preferida, o tratamento não lítico compreende tratamento por pressão. Alternativamente, o tratamento não lítico compreende um passo de pré-condicionamento de agitação ou mistura. Uma "proporção substancial" inclui que uma proporção de 80% ou mais dos organismos numa fermentação ou cultura se encontra presente na forma intacta, encontrando-se intactos mais preferencialmente mais de 85%, ainda mais preferencialmente mais de 90% e muito preferencialmente 95% ou mais. A lise pode ser avaliada de qualquer maneira conhecida na técnica, que inclui: a observação sob um microscópio, a análise por triagem celular ativada por fluorescência (FACS) e o doseamento da proteína total versus a proteína no sobrenadante e/ou num sedimento (celular) do organismo. Numa forma de realização, a lise pode ser avaliada após tratamento não lítico comparando a proteína total numa amostra antes e após tratamento. Se um tratamento provoca lise, a proteína total presente no sobrenadante da amostra tratada aumentaria em comparação com a proteína total presente na referida amostra não tratada, por exemplo medida utilizando um ensaio de Bradford. Numa forma de realização preferida, realiza-se a análise por FACS em que a amostra é marcada com um corante fluorescente, seguido de tratamento não lítico e análise por FACS. Muito preferencialmente, a análise por FACS é realizada antes do tratamento dando um valor de referência para comparação.

Assim, o tratamento não lítico pode incluir o pré-condicionamento por ressuspensão suave ao longo de um intervalo de tempo, por exemplo por agitação ou mistura, ou por ressuspensão manual tal como por pipetagem, e.g. num tampão. Numa forma de realização, o pré-condicionamento é realizado durante entre 1 hora e 24 horas, preferencialmente entre 1 hora e 20 horas, mais preferencialmente entre 2 horas e 18 horas, 4 horas e 16 horas, 6 horas e 16 horas, e muito preferencialmente durante 12, 14 ou 16 horas. Assim, o tempo mínimo par pré-condicionamento é 1, 2 ou 4 horas e o máximo é 16, 18 ou 24 horas. 0 pré-condicionamento pode ser realizado por rotação a 50 a 250 rpm, preferencialmente a 60 rpm a 100 rpm, e muito preferencialmente durante 14 ou 16 horas. Durante o pré-condicionamento as células são mantidas a uma temperatura dentro da gama de 4 °C a 30 °C, mais preferencialmente entre 4 °C a 20 °C e muito preferencialmente à temperatura ambiente. É também aqui divulgado um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende ainda submeter a amostra a um tratamento não lítico incluindo um passo de pré-condicionamento que não constitua parte do processo. É também aqui divulgado um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende ainda um tratamento não litico que compreende submeter as células hospedeiras a pressões aumentadas, por exemplo utilizando uma prensa francesa ou descompressão com azoto. Num exemplo específico, a amostra é o produto de uma fermentação de E. coli, em que a referida E. coli expressa um anticorpo recombinante, o qual é submetido a tratamento por pressão numa prensa francesa. As pressões podem variar desde 750 psi ou perto disso até 5000 psi ou perto disso. Numa forma de realização, o tratamento por pressão é realizado a 1000 psi, ou 1250 psi, 1500 psi, 1750 psi, 2000 psi, 2250 psi, 2500 psi, 2750 psi, 3000 psi, 3250 psi, 3500 psi, 4000 psi, 4250 psi, 4500 psi ou 4750 psi. Mais preferencialmente, o tratamento por pressão é realizado entre 1000 psi e 3000 psi, e muito preferencialmente a 2000 psi. O tratamento por pressão que é substancialmente não litico (i.e. origina menos de 20% de lise) pode ser determinado por experimentação simples dependendo do tampão e tipo de células que constituem a amostra, e da pressão. É também aqui divulgado um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que não inclui um passo de tratamento não litico como se descreve acima, tal como por submissão das células hospedeiras a pressões aumentadas ou a pré-condicionamento por ressuspensão suave ao longo de um intervalo de tempo. Sabe-se que a inclusão de um passo de tratamento não litico melhora o rendimento de uma proteína recombinante (WO 2006/054063). No entanto, constatou-se surpreendentemente que se consegue um melhor rendimento de anticorpo pelo método da presente invenção com ou sem um tal passo de tratamento não litico. Por conseguinte, a forma de realização em que o método não compreende um passo de tratamento não litico da presente invenção proporciona um meio mais simples e rentável para proporcionar um anticorpo recombinante.

Passo de Espera É também aqui divulgado método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que compreende um passo de interrupção do método entre o passo de cultura da amostra de células hospedeiras e antes da adição do tampão de extração. Durante o passo de interrupção as amostras são mantidas a uma temperatura adequada. Este passo de interrupção do método é preferencialmente realizado como descrito em WO 2005/019466. Este passo pode ser também referido como um passo de espera da pasta celular (CSH). Preferencialmente, o método é interrompido durante um período de pelo menos cerca de uma hora, 1 hora a 72 horas, 12 horas a 48 horas, durante 12 horas, 24 horas, 33 horas ou 48 horas. A amostra é preferencialmente mantida a uma temperatura adequada durante a interrupção do método, tal como 18 °C. É também aqui divulgado um método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes que não inclui um passo de interrupção após o passo de cultura da amostra de células hospedeiras, tal como descrito em WO 2005/019466. Sabe-se que a inclusão dessa interrupção melhora o rendimento de uma proteína recombinante (WO 2005/019466). Constatou-se surpreendentemente que se consegue uma melhoria semelhante no rendimento de anticorpo pelo método da presente invenção com ou sem esse passo de interrupção i.e. não foi observado qualquer aumento adicional no rendimento quando o passo de interrupção foi incluído no método. Por conseguinte, o método que não compreende um passo de interrupção proporciona um meio mais simples e rentável para proporcionar um anticorpo recombinante. Por conseguinte, o intervalo de tempo entre o passo de cultura da amostra de células hospedeiras e o passo de adição do tampão de extração pode ser inferior a 12 horas, preferencialmente 10 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, 2 horas ou menos ou 1 hora ou menos ou menos de 1 hora.

Anticorpo

Como aqui utilizado, 'anticorpo funcional' inclui moléculas de anticorpo que retêm a capacidade para reconhecer ou ligar-se especificamente ao antigénio contra o qual foram geradas (antigénio cognato). A produção de um anticorpo funcional é mostrado pela presença de uma única banda na SDS-PAGE não redutora correspondente ao peso molecular esperado para o anticorpo, ou por um ensaio de ligação direta que utiliza BIAcore ou outros métodos conhecidos do especialista na técnica, por exemplo mas não se limitando a, ELISA. Os anticorpos não funcionais incluem fragmentos que não reconhecem o seu antigénio cognato, e incluem anticorpos dobrados incorretamente ou montados incorretamente, cadeias pesadas e leves livres, e fragmentos das mesmas, incluindo fragmentos parcialmente degradados de anticorpos que não reconhecem ou não se ligam ao seu antigénio cognato.

Num exemplo preferido, a molécula de anticorpo recombinante é pelo menos parte de uma cadeia leve de anticorpo e pelo menos parte de uma cadeia pesada de anticorpo, de tal forma que pelo menos algumas das moléculas de anticorpo de cadeias leves e pesadas expressadas são capazes de se combinar para formar um anticorpo funcional.

Como aqui utilizado, 'anticorpos' incluem anticorpos que têm cadeias pesadas e leves de comprimento total; fragmentos funcionalmente ativos, derivados ou análogos dos mesmos e podem ser, mas não se limitam ao fragmento VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, um Fab de charneira modificado, Fab', F(ab')2 ou Fv; um monómero ou dímero de cadeia leve ou cadeia pesada; um anticorpo de cadeia simples, e.g. um Fv de cadeia simples em que os domínios variáveis das cadeias pesada e leve são unidos por uma unidade de ligação peptídica, ou um anticorpo de dupla especificidade, tal como um Fab-dAb, como descrito em PCT/GB2008/003331.

Os anticorpos podem ser anticorpos policlonais, monoclonais, bi-, tri- ou tetravalentes, anticorpos humanizados ou quiméricos. Estes anticorpos e seus fragmentos podem ser anticorpos naturais, humanizados, quiméricos ou com enxertos de CDR e pode utilizar-se técnicas de biologia molecular padrão para modificar, adicionar ou suprimir aminoácidos ou domínios, consoante desejado. Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas que têm uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de espécies não humanas e uma região estrutural de uma molécula de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, US 5,585,089). As moléculas de anticorpo purificadas utilizando os métodos da invenção podem ser de qualquer classe (e.g. IgG, igE, igM, IgD e IgA) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

Os métodos para gerar estas moléculas de anticorpo são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341:544; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sei. USA, 86:3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322:323; Bird et al, 1988, Science, 242:423; Queen et al., US 5,585,089; Adair, WO91/09967; Mountain e Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10:1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181).

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica tal como a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) e a técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985) .

Os anticorpos quiméricos são os anticorpos codificados por genes de imunoglobulina que foram geneticamente modificados para que os genes das cadeias leves e pesadas sejam constituídos por segmentos de genes de imunoglobulina que pertencem a espécies diferentes. Estes anticorpos quiméricos são provavelmente menos antigénicos. Os anticorpos bivalentes podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539; WO 93/08829, Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659). Os anticorpos bi-, tri- e tetravalentes podem compreender múltiplas especificidades ou podem ser monoespecíficos (ver, por exemplo, WO 92/22853).

As sequências dos anticorpos podem ser também geradas utilizando métodos de anticorpos de linfócitos únicos com base na clonagem e expressão molecular de ADNcs das regiões variáveis de imunoglobulina gerados a partir de linfócitos únicos que foram selecionados para a produção de anticorpos específicos tal como descrito por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93(15):7843-7848 e em WO 92/02551. Os últimos métodos baseiam-se no isolamento de células produtoras de anticorpos individuais que são em seguida expandidas clonalmente, seguido de pesquisa daqueles clones que produzem um anticorpo que reconhece o seu antigénio cognato, e, caso se pretenda, na identificação subsequente da sequência dos seus genes das cadeias pesada (VH) e leve (VL) variáveis. Alternativamente, as células que produzem o anticorpo que reconhece o seu antigénio cognato podem ser cultivadas em conjunto, seguido de triagem.

Os anticorpos preparados utilizando os métodos da invenção são muito preferencialmente anticorpos humanizados que podem ser subsequentemente ligados a toxinas, fármacos, compostos citotóxicos, ou polímeros ou outros compostos que prolongam a semivida do anticorpo quando administrados a um doente. 0 anticorpo pode ser específico para qualquer antigénio alvo. 0 antigénio pode ser uma proteína associada às células, por exemplo uma proteína da superfície celular sobre células tais como células bacterianas, células de levedura, células T, células endoteliais ou células tumorais, ou pode ser uma proteína solúvel. Os antigénios de interesse podem ser também qualquer proteína medicamente relevante tal como as proteínas reguladas positivamente durante a doença ou infeção, por exemplo os recetores e/ou seus ligandos correspondentes. Os exemplos particulares de proteínas da superfície celular incluem moléculas de adesão, por exemplo integrinas tais como integrinas βΐ e.g. VLA-4, selectina E, selectina P ou selectina L, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40 L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (0X40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27 L, CDCPl, CSFl ou CSFl-Recetor, DPCRl, DPCRl, dudulina 2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, semelhante a nectina 2, NKCCl, PTK7, RAIG1, TCAMl, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMPll, DTD, antigénio carcinoembrionário (CEA), globulina da gordura do leite humano (HMFG1 e 2), antigénios de MHC de Classe I e MHC de Classe II, KDR e VEGF, e quando apropriado, recetores dos mesmos.

Os antigénios solúveis incluem interleucinas tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 ou IL-17, tal como IL17A e/ou IL17F, antigénios virais, por exemplo, antigénios do virus sincicial respiratório ou citomegalovirus, imunoglobulinas, tais como IgE, interferões tais como interferão a, interferão β ou interferão y, fator de necrose tumoral TNF (antigamente conhecido como fator de necrose tumoral-α), fator de necrose tumoral-β, fatores de estimulação de colónias tais como G-CSF ou GM-CSF, e fatores de crescimento derivados de plaquetas tais como PDGF-α e PDGF-β e, quando apropriado, recetores dos mesmos. Outros antigénios incluem antigénios da superfície de células bacterianas, toxinas bacterianas, vírus tais como gripe, EBV, HepA, B e C, agentes de bioterrorismo, radionuclídeos e metais pesados, e venenos de cobras e aranhas e toxinas.

Numa forma de realização, o anticorpo pode ser utilizado para modificar funcionalmente a atividade do antigénio de interesse. Por exemplo, o anticorpo pode neutralizar, antagonizar ou agonizar a atividade do referido antigénio, direta ou indiretamente.

Numa forma de realização preferida, o anticorpo é um anticorpo anti-TNF, mais preferencialmente um Fab' anti-TNF, como descrito em W001/094585.

Os métodos para a expressão de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica. Os exemplos adequados de células hospedeiras para a expressão de moléculas de anticorpos recombinantes incluem bactérias tais como bactérias gram-positivas ou gram-negativas, e.g. E. coli. Muito preferencialmente, nos métodos da invenção, um anticorpo recombinante é produzido em bactérias, e.g. E. coli (ver Verma et al., 1988, J. Immunol. Methods 216:165-181; Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods 263:133- 147) . Células O termo "amostra" utilizado na presente invenção refere-se a uma população de células que foi transformada com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante. A amostra pode estar em qualquer escala adequada desde a produção em pequena escala de anticorpos até ao fabrico em grande escala de anticorpos para fins comerciais.

As células utilizadas na presente invenção podem ser, por exemplo, mas sem limitação bactérias, especialmente bactérias gram-negativas. Muito preferencialmente, as células são E. coli. As células podem ser células de tipo selvagem ou células recombinantes que foram geneticamente modificadas. As células hospedeiras de E. coli podem ser estirpes naturais de E. coli ou estirpes mutadas capazes de produzir proteínas recombinantes. Os exemplos de estirpes hospedeiras de E. coli específicas incluem MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5a, DHl, BL21, K12, XLlBlue e JM109. Um exemplo é a E. coli W3110 (ATCC 27 325) uma estirpe hospedeira comummente utilizada para fermentações de proteínas recombinantes. Os exemplos incluem também estirpes de E. coli modificadas, por exemplo mutantes metabólicos e estirpes deficientes em proteases. 0 anticorpo recombinante produzido utilizando os métodos da presente invenção é tipicamente expresso no periplasma da célula hospedeira de E. coli ou no sobrenadante da cultura de células hospedeiras, dependendo da natureza da proteína e da escala de produção. Os métodos de direcionamento das proteínas para estes compartimentos são bem conhecidos na técnica, para um revisão ver Makrides, Microbiological Reviews, 1996, 60, 512-538. Os exemplos de sequências sinal adequadas para direcionar as proteínas para o periplasma de E. coli incluem as sequências sinal PhoA, OmpA, OmpT, LamB e OmpF de E. coli. As proteínas podem ser direcionadas para o sobrenadante com base nas vias secretoras naturais ou pela indução de perda limitada da membrana externa para originar a secreção da proteína, cujos exemplos são a utilização do líder pelB, da proteína líder A, da coexpressão da proteína de libertação de bacteriocina, da proteína de libertação de bacteriocina induzida por mitomicina juntamente com a adição de glicina para o meio de cultura e a coexpressão do gene kil para permeabilização da membrana. Muito preferencialmente, nos métodos da invenção, a proteína recombinante é expressa no periplasma da E. coli hospedeira. A expressão da proteína recombinante nas células hospedeiras de E. coli podem estar também sob o controlo de um sistema induzível, de acordo com o que a expressão do anticorpo recombinante em E. coli se encontra sob o controlo de um promotor induzível. Na técnica são bem conhecidos muitos promotores induzíveis adequados para uso em E. coli e, dependendo do promotor, a expressão da proteína recombinante pode ser induzida por vários fatores tais como a temperatura ou a concentração de uma substância particular no meio de crescimento (Baneyx, Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10:411-421; Goldstein e Doi, 1995, Biotechnol.Annu.Rev, 105-128). Os exemplos de promotores induzíveis incluem os promotores lac, tac, e trc de E. coli que são induzíveis com lactose ou o análogo de lactose não hidrolisável, isopropil-p-D-l-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e os promotores phoA, trp e araBAD que são induzidos pelo fosfato, triptofano e L-arabinose, respetivamente. A expressão pode ser induzida, por exemplo, pela adição de um indutor ou por uma alteração na temperatura quando a indução é dependente da temperatura. Quando a indução da expressão da proteína recombinante é conseguida pela adição de um indutor à cultura, o indutor pode ser adicionado por qualquer método adequado dependendo do sistema de fermentação e do indutor, por exemplo, por adições de porções simples ou múltiplas ou por uma adição gradual do indutor através de uma alimentação. Entender-se-á que pode haver um atraso entre a adição do indutor e a indução efetiva da expressão de proteínas, por exemplo, quando o indutor é lactose pode haver um atraso antes que ocorra a indução da expressão de proteínas, enquanto é utilizada qualquer fonte de carbono preexistente antes da lactose.

As culturas de células hospedeiras de E. coli (fermentações) podem ser cultivadas em qualquer meio que suporte o crescimento de E. coli e a expressão da proteína recombinante. 0 meio pode ser qualquer meio quimicamente definido, tal como os proporcionados em Pirt S.J. (1975) Principies of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publications, com modificações quando apropriado para controlar a taxa de crescimento, como aqui se descreve. Um exemplo de um meio adequado é o ' SM6E' como descrito por Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26:309-320. A cultura das células hospedeiras de E. coli pode ocorrer em qualquer recipiente adequado tal como um balão de agitação ou um fermentador dependendo da escala de produção necessária. Estão disponíveis vários fermentadores de grande escala com uma capacidade de mais do que 1 000 litros até cerca de 100 000 litros. Preferencialmente, são utilizados fermentadores de 1 000 a 50 000 litros, mais preferencialmente 1 000 a 10 000 ou 12 000 litros. Pode também utilizar-se fermentadores de escala mais pequena com uma capacidade entre 0,5 e 1 000 litros. A fermentação de E. coli pode ser realizada em qualquer sistema adequado, por exemplo no modo continuo, descontinuo ou descontinuo com alimentação (Thiry &

Cingolani, 2002, Trends in Biotechnology, 20:103-105) dependendo da proteina e dos rendimentos necessários. O modo de lote pode ser utilizado com adições em porção de nutrientes ou indutores, se necessário. Alternativamente, pode utilizar-se uma cultura descontinua com alimentação e as culturas cultivadas no modo descontinuo pré-induzidas à taxa de crescimento especifica máxima que pode ser sustentada utilizando os nutrientes inicialmente presentes no fermentador e utilizados um ou mais regimes de alimentação de nutrientes para controlar a taxa de crescimento até a fermentação ser completa. O modo descontinuo com alimentação pode ser também utilizado com pré-indução para controlar o metabolismo das células hospedeiras de E. coli e permitir que se alcance densidades celulares mais altas (Lee, 1996, Tibtech, 14:98-105).

As caracteristicas preferidas de cada forma de realização da invenção são como para cada uma das outras formas de realização mutatis mutandis. É também aqui divulgado um anticorpo obtido ou obtenível a partir do referido processo. É também aqui divulgada a utilização de meios de controlo de pH, tais como um tampão, para melhorar a extração do anticorpo, por exemplo extração primária, em particular quando o controlo assegura que o pH é mantido na gama de pH 6 a 9 durante um passo de extração, tal como um passo de extração a quente. 0 meio de controlo de pH como aqui utilizado é um tampão, base e/ou ácido. A invenção será agora descrita com respeito aos seguintes exemplos, os quais são meramente ilustrativos e não devem de maneira nenhuma ser interpretados como limitando o âmbito da presente invenção. A Figura 1 é um gráfico que mostra o pH das células ressuspensas em tampão de extração de Tris/EDTA de pH 7,4 e pH 8 ao longo do tempo. A Figura 2a é um histograma que mostra o efeito do pH do tampão de extração sobre o rendimento de anticorpo A. A Figura 2b é um histograma que mostra o pH das amostras de células (pasta celular ressuspensa) imediatamente após a adição de um tampão de extração que tem um pH desde 7,4 a 9,0 e o pH das amostras de células 1 hora após a adição do tampão de extração antes da fase de aquecimento. A Figura 3a é um histograma que mostra o efeito de ajuste do pH da amostra antes do passo de tratamento térmico sobre o rendimento do anticorpo A. Os números por cima de cada barra indicam o aumento em % do rendimento em comparação com o controlo sem passo de ajuste do pH. A Figura 3b é um gráfico que mostra a variação do pH das amostras através das várias etapas do método: a pasta celular (após a cultura e centrifugação); após adição do tampão (imediatamente após a adição do tampão de extração); antes do ajuste do pH; após o ajuste do pH, mas antes da fase de aquecimento; e após o passo de tratamento térmico. A Figura 4 mostra uma análise por SDS-PAGE de amostras do anticorpo A extraídas de células após tratamento térmico. A Faixa 1 é um marcador de peso molecular, a Faixa 2 é uma amostra de anticorpo A, a Faixa 3 é a amostra sem ajuste do pH e as Faixas 4 a 8 mostram as amostras após ajuste do pH a 7,0, 7,2, 7,4, 7,6 e 7,8, respetivamente, antes do passo de tratamento térmico. A Figura 5 é um histograma que mostra o efeito da utilização de um tampão de extração a pH 8 e do ajuste do pH da amostra até pH 7,4 antes do passo de tratamento térmico sobre o rendimento de anticorpo A. A Figura 5 também mostra o efeito da inclusão de um passo de homogeneização ou um passo de espera da pasta celular. Os números por cima de cada barra indicam o aumento em % do rendimento em comparação com o controlo com um passo de homogeneização, mas sem o passo de ajuste do pH. A Figura 6 mostra uma análise por SDS-PAGE de amostras do anticorpo A extraídas a partir de células após tratamento térmico.

Faixa 1 é um marcador de peso molecular;

Faixa 2 é uma amostra de anticorpo A;

Faixa 3 é a amostra após um passo de homogeneização, mas sem ajuste do pH e sem espera da pasta celular;

Faixa 4 é a amostra após tratamento com tampão de extração a pH 8 e ajuste até pH 7,4, antes do tratamento térmico e um passo de homogeneização e sem espera da pasta celular; Faixa 5 é a amostra após nenhum ajuste do pH, sem homogeneização e sem espera da pasta celular;

Faixa 6 é a amostra após tratamento com tampão de extração a pH 8 e ajuste até pH 7,4 antes do tratamento térmico e sem homogeneização e sem espera da pasta celular;

Faixa 7 é a amostra após espera da pasta celular, mas sem ajuste do pH e sem homogeneização;

Faixa 8 é a amostra após tratamento com tampão de extração a pH 8 e ajuste até pH 7,4, antes do tratamento térmico e uma espera da pasta celular, mas sem homogeneização. A Figura 7 é um gráfico que mostra o pH da amostra ao longo do tempo para uma amostra de controlo sem ajuste do pH, uma amostra que foi tratada com tampão de extração de pH 8, uma amostra que foi tratada com tampão de extração de pH 7,4 e um ajuste do pH da amostra até pH 7,4 antes do passo de tratamento térmico e uma amostra que foi tratada com tampão de extração de pH 8 e um ajuste do pH da amostra até pH 7,4 antes do passo de tratamento térmico. 0 primeiro pico mostra o ponto em que foi adicionado o tampão de extração e o segundo pico mostra o ponto em que foi ajustado o pH de duas das amostras antes do passo de tratamento térmico. A Figura 8 é um histograma que mostra o efeito de uma amostra de controlo sem ajuste do pH, uma amostra que foi tratada com tampão de extração de pH 7,4 e um ajuste do pH da amostra até pH 7,4 antes do passo de tratamento térmico, uma amostra que foi tratada com tampão de extração de pH 8, e uma amostra que foi tratada com tampão de extração de pH 8 e um ajuste do pH da amostra até pH 7,4 antes do passo de tratamento térmico sobre o rendimento do anticorpo A. Os números por cima de cada barra indicam o aumento em % do rendimento em comparação com o controlo sem passo de ajuste do pH. A Figura 9 é um histograma que mostra o efeito de uma amostra de controlo sem ajuste do pH, uma amostra que foi tratada com tampão de extração de pH 7,4 e ajuste do pH da amostra a 7,4 durante a fase de aquecimento antes do passo de tratamento térmico, e uma amostra que foi tratada com tampão de extração de pH 8 e ajuste do pH da amostra a 7,4 durante a fase de aquecimento antes do passo de tratamento térmico sobre o rendimento de anticorpo A. Os números por cima de cada barra indicam o aumento em % do rendimento em comparação com o controlo sem passo de ajuste do pH. A Figura 10 é um histograma que mostra o efeito de ajuste do pH a 6,6, 7,0, 7,4 e 7,8 unidades sobre o titulo de Fab' em comparação com um controlo sem ajuste de pH. A experiência é repetida com três passos de pré-tratamento diferentes (antes da extração) de sem pré-tratamento, espera da pasta celular e homogeneização. A Figura 11 é um histograma que mostra o titulo médio de Fab' nas seguintes condições; sem ajuste do pH, sem pré-tratamento e ajuste do pH (na gama de 6,6 - 7,8 unidades), homogeneização e ajuste do pH (na gama de 6,6 - 7,8 unidades) e todas as condições de ajuste do pH (homogeneização e sem pré-tratamento). As barras de erros mostram um desvio padrão da média.

MÉTODO GERAL

Nos exemplos que se seguem, o método é realizado como se segue salvo indicação em contrário:

Passo de Cultura de Células e Centrifugação: 0 anticorpo A (um Fab') foi expresso em células de E. coli W3110 utilizando o vetor pTTOD com ADN que codifica o anticorpo A inserido. A fermentação foi realizada a 25 °C durante 30 horas, após indução com lactose e pronta para colheita. Alíquotas de 50 mL ou 1 L da cultura colhida foram centrifuqadas durante 1 hora a 4200 RPM e a 4 °C. O sobrenadante foi decantado e para simular a purificação à escala de produção uma pequena proporção do sobrenadante foi adicionada às células para trazer a amostra de pasta celular resultante até 35% do peso da colheita.

Passo de Espera da Pasta Celular (CSH):

Nalgumas experiências foi realizado um passo de espera da pasta celular em que a amostra foi mantida durante 33 horas a 18 °C e 200 RPM antes da adição do tampão de extração.

Adição do Tampão de Extração: A amostra de pasta celular resultante (a seguir referida como a amostra) foi ressuspensa utilizando uma solução-mãe de Tris 300 mM e EDTA 30 mM a uma concentração final de Tris 100 mM e EDTA 10 mM que tem um pH ajustado de 7.4 utilizando HC1. Nas experiências descritas a seguir, o pH deste tampão de extração é ajustado do pH do controlo de 7.4 para niveis de pH mais altos entre pH 7,4 e 9,0.

Passo de Homogeneização (Homog.):

Nalgumas experiências foi realizado um passo de homogeneização após a adição do tampão de extração por uma única passagem a 1500 psi.

Ajuste do pH antes da fase de aquecimento:

Nalgumas experiências, a amostra foi submetida a ajuste do pH com NaOH 5 M até um nível desejado entre 7,0 e 7,8 antes do início da fase de aquecimento.

Fase de Aquecimento

As amostras foram submetidas a uma fase de aquecimento em que a temperatura da amostra foi aumentada desde 18 °C até à temperatura elevada desejada de 59 °C, momento em que se iniciou o passo de tratamento térmico.

Ajuste do pH durante a fase de aquecimento:

Nalgumas experiências, a amostra foi submetida a ajuste do pH com NaOH 5 M até um nível desejado de 7,4 ± 0,02 durante a fase de aquecimento, até se atingir a temperatura elevada desejada de 59 °C.

Passo de Tratamento Térmico A amostra foi mantida a 59 °C durante 10 a 12 horas e 200 RPM.

Após tratamento térmico, os sedimentos celulares ressuspensos foram purificados por centrifugação a 4200 rpm durante 1 hora a 4 °C. O sobrenadante que continha o anticorpo funcional A foi analisado para o Fab' utilizando análise por HPLC com Proteína G em tampão de fosfato 20 mM. O anticorpo A foi eluído utilizando um gradiente de pH desde pH 7,0 na injeção, reduzindo até pH 2,5.

As amostras de extratos reduzidas foram corridas sobre geles de SDS-PAGE com Tris-Glicina com uma concentração de carga de aproximadamente 1 pg. EXEMPLO 1: Efeito sobre o pH da Amostra após a Adição de um Tampão de Extração O passo de cultura das células e passo de adição do tampão de extração, em que o tampão tinha um pH de 8,0 ou pH 7,4) foram realizados como se descreve na Secção do Método Geral. O pH da amostra foi monitorizado a partir da adição do tampão de extração. A Figura 1 mostra que há uma queda rápida no pH da amostra após a adição do tampão e o pH cai rapidamente abaixo de pH 7, especialmente quando o tampão tem um pH de 7,4. EXEMPLO 2: Efeito do pH do Tampão de Extração sobre o Rendimento de Anticorpo 0 passo de cultura das células, o passo de adição do tampão de extração, a fase de aquecimento e o passo de tratamento térmico foram realizados como se descreve na Secção dos Métodos Gerais. 0 passo de espera da pasta celular, o passo de homogeneização e o passo de ajuste do pH ante ou durante o aquecimento não foram realizados. 0 pH do tampão de extração foi modificado como se segue: 7,4, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 e 9,0. Os resultados são mostrados na Figura 2a, a qual mostra as concentrações de Fab' após extração a quente. Pode verificar-se que um pH elevado do tampão de extração superior a 7,4 resultou num aumento significativo da recuperação de Fab', aumentando o rendimento até pH 8,8. Acima de 8,8 as concentrações do Fab' começaram a diminuir.

Tabela 1

A Tabela 1 e a Figura 2b mostram o pH das amostras de células (pasta celular ressuspensa) imediatamente após a adição do tampão de extração que tem um pH desde 7,4 a 9,0 e o pH das amostras de células 1 hora após a adição do tampão de extração antes da fase de aquecimento. EXEMPLO 3: Efeito do pH antes da Fase de Aquecimento sobre o Rendimento de Anticorpo O passo de cultura das células, o passo de adição do tampão de extração, o passo de homogeneização, o passo de ajuste do pH antes do aquecimento, a fase de aquecimento e o passo de tratamento térmico foram realizados como se descreve na Secção dos Métodos Gerais. 0 controlo não foi submetido a um passo de ajuste do pH.

Na experiência de controlo, o tampão de extração era de pH 7,4 e nas outras experiências quando o pH foi ajustado antes da fase de aquecimento, o tampão de extração era de pH 8,0. O passo de espera da pasta celular e o passo de ajuste do pH durante o aquecimento não foram realizados.

No controlo não foi realizado ajuste do pH antes da fase de aquecimento. Nas outras experiências, o pH da amostra foi ajustado antes da fase de aquecimento até pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6 e 7,8.

Os resultados são mostrados na Figura 3a, os quais mostram que este passo de ajuste do pH resultou em melhores recuperações de Fab'. A Figura 3a demonstra como o ajuste do pH a pontos de referência dentro de uma gama de pH 7,0 a 7,8 aumentou a recuperação do produto em 26 a 40% em comparação com a amostra de controlo que não foi submetida a ajuste do pH.

Tabela 2

0 pH da amostra foi detetado em vários pontos do método. A Tabela 2 acima e a Figura 3b mostram a variação do pH das amostras ao longo das várias etapas do método: a pasta celular (após a cultura e centrifugação); após adição do tampão (imediatamente após a adição do tampão de extração) ; antes do ajuste do pH; após ajuste do pH, mas antes da fase de aquecimento; e após o passo de tratamento térmico. 0 gel de SDS-PAGE na Figura 4 mostra os perfis de proteina das amostras após extração. A Faixa 1 é um marcador de peso molecular, a Faixa 2 é uma amostra de anticorpo A, a Faixa 3 é a amostra após nenhum ajuste do pH e as Faixas 4 a 8 mostram amostras após ajuste do pH a 7,0, 7,2, 7,4, 7,6 e 7,8, respetivamente, antes do passo de tratamento térmico. O peso de carga da amostra foi normalizado a 1 yg de Fab'. Não foram observadas diferenças significativas nos perfis de proteínas entre o controlo e as amostras com ajuste do pH antes do aquecimento. EXEMPLO 4: Efeito do pH do Tampão de Extração e ajuste do pH sobre o Rendimento de Anticorpo na presença e ausência de um passo de Espera da Pasta Celular e Passo de Homogeneização

As seguintes experiências foram realizadas como se descreve na Secção dos Métodos Gerais. • Controlo (com homog.): passo de cultura das células, passo de adição do tampão de extração (pH 7,4), passo de homogeneização, fase de aquecimento e passo de tratamento térmico; • Tampão a pH 8 e ajuste antes do aquecimento até pH 7,4 (com homog.): passo de cultura das células, passo de adição do tampão de extração (pH 8), passo de homogeneização, passo de ajuste do pH antes do aquecimento até pH 7,4, fase de aquecimento e passo de tratamento térmico; • Controlo (sem homog. ou CSH) : passo de cultura das células, passo de adição do tampão de extração (pH 7,4), fase de aquecimento e passo de tratamento térmico; • Tampão a pH 8 e ajuste antes do aquecimento até pH 7,4 (sem homog. ou CSH): passo de cultura das células, passo de adição do tampão de extração (pH 8), passo de ajuste do pH antes do aquecimento até pH 7,4, fase de aquecimento e passo de tratamento térmico; • Controlo (com CSH) : passo de cultura das células, passo de espera da pasta celular, passo de adição do tampão de extração (pH 7,4), fase de aquecimento e passo de tratamento térmico; e • Tampão a pH 8 e ajuste antes do aquecimento até pH 7,4 (com CSH): passo de cultura das células, passo de espera da pasta celular, passo de adição do tampão de extração (pH 8), passo de ajuste do pH antes do aquecimento até pH 7,4, fase de aquecimento e passo de tratamento térmico. A Figura 5 mostra os resultados das experiências anteriores. Pode verificar-se que a adição do passo de ajuste do pH antes do aquecimento resultou em títulos de extração ~34% mais altos em comparação com o controlo. Pode também verificar-se que a inclusão do passo de homogeneização não teve qualquer efeito sobre o rendimento quando comparada com o método com o passo de ajuste do pH. A espera da pasta celular dá um maior rendimento quando se compara com extrações de controlo, mas não quando se compara aquela com o passo de ajuste do pH. 0 gel de SDS-PAGE na Figura 6 mostra os perfis de proteína de amostras após extração.

Faixa 1 é um marcador de peso molecular;

Faixa 2 é uma amostra de anticorpo A;

Faixa 4 é a amostra após tratamento com tampão de extração a pH 8 e ajuste até pH 7,4 antes do tratamento térmico e um passo de homogeneização e sem espera da pasta celular;

Faixa 5 é a amostra após nenhum ajuste do pH, sem homogeneização e sem espera da pasta celular;

Faixa 8 é a amostra após tratamento com tampão de extração a pH 8 e ajuste até pH 7,4 antes do tratamento térmico e uma espera da pasta celular, mas sem homogeneização.

Os perfis de proteína dos extratos com ajuste do pH foram comparáveis aos controlos de espera da pasta celular. EXEMPLO 5: Efeito do pH do Tampão de Extração e/ou passo de ajuste do pH antes do aquecimento sobre o pH da amostra e rendimento de Fab'. 0 passo de cultura das células, o passo de adição do tampão de extração, a fase de aquecimento e o passo de tratamento térmico foram realizados como se descreve na Secção dos Métodos Gerais. Duas experiências incluíram um ajuste do pH antes do passo de aquecimento e duas não incluíram este passo. 0 passo de espera da pasta celular, o passo de homogeneização e o passo de ajuste do pH durante o aquecimento não foram realizados.

Foram realizadas quatro estratégias de controlo de pH diferentes: 1. Controlo: tampão de extração pH 7,4 e sem ajuste do pH antes do aquecimento; 2. Tampão de extração pH 7,4 e ajuste do pH a 7,4 antes do aquecimento ; 3. Tampão pH 8: Tampão de extração pH 8,0 e sem ajuste do pH antes do aquecimento; e 4. Tampão de extração pH 8,0 e ajuste do pH a 7,4 antes do aquecimento. O pH foi monitorizado ao longo de toda a recuperação primária começando a partir da pasta celular e ao longo da adição de tampão (primeiro pico), ajuste do pH antes do aquecimento (segundo pico) e tratamento térmico (queda de pH). A Figura 7 mostra o perfil de pH durante os métodos. 0 efeito sobre o rendimento de Fab' é mostrado na Figura 8, onde se pode verificar que todas as estratégias de aumento do pH (1 a 3) resultaram num aumento do rendimento de Fab' e a estratégia 4 que utilizou uma combinação de tampão elevado e ajuste do pH antes do aquecimento resultou nas recuperações mais elevadas de Fab' . EXEMPLO 6: Efeito do pH do Tampão de Extração e/ou passo de ajuste do pH durante o aquecimento sobre o pH da amostra e rendimento de Fab'. 0 passo de cultura das células, o passo de adição do tampão de extração, a fase de aquecimento e o passo de tratamento térmico foram realizados como se descreve na Secção dos Métodos Gerais. Duas experiências incluíram um ajuste do pH durante o passo de aquecimento e o controlo não incluiu este passo. 0 passo de espera da pasta celular, o passo de homogeneização e o passo de ajuste do pH antes do aquecimento não foram realizados.

Foram realizadas três estratégias de controlo de pH diferentes: 1. Controlo: tampão de extração pH 7,4 e sem ajuste do pH durante o aquecimento; 2. Tampão de extração pH 7,4 e ajuste do pH a 7,4 durante o aquecimento; 3. Tampão de extração pH 8,0 e ajuste do pH a 7,4 durante o aquecimento. O efeito sobre o rendimento de Fab' é mostrado na Figura 9, onde se pode verificar que todas as estratégias de aumento do pH (2 e 3) resultaram em aumento do rendimento de Fab' e a estratégia 4 que utilizou uma combinação de tampão elevado e ajuste de pH durante o aquecimento resultou nas recuperações mais elevadas de Fab' .

Exemplo 7 A experiência foi realizada recolhendo o caldo de fermentação e centrifugando para remover a maioria do meio gasto, produzindo, desse modo, uma pasta celular. Esta pasta celular foi mantida, no caso da espera da pasta celular, durante 33 horas. No caso das condições homogeneizadas e sem pré-tratamento, as células foram ressuspensas em tampão de extração e quer homogeneizadas ou foram extraídas a quente sem qualquer pré-tratamento. Após a espera da pasta celular, as células foram ressuspensas em tampão de extração. Assim que todas as condições foram ressuspensas em tampão de extração, o pH daquelas foi ajustado até ao ponto de referência desejado (mostrado na figura 12) e foi iniciada a extração a quente (59 °C durante 10 horas). Após extração a quente, o extrato foi purificado por centrifugação para determinar o titulo de Fab' na fase liquida.

Os dados a seguir são também representados na

Figura 12. sem pré-tratamento, sem

ajuste do pH sem pré-tratamento, sem

ajuste do pH

Lisboa, 10 de novembro de 2017

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para o fabrico de moléculas de anticorpos recombinantes selecionadas de um fragmento Fab, Fab modificado, um Fab de charneira modificado, Fab', F(ab')2 ou Fv; um anticorpo de cadeia simples; um Fv de cadeia simples em que os domínios variáveis das cadeias pesada e leve são unidos por uma unidade de ligação peptídica, e um anticorpo de dupla especificidade, tal como um Fab-dAb que compreende a) cultivar uma amostra de células hospedeiras de bactérias gram-negativas transformadas com um vetor de expressão que codifica uma molécula de anticorpo recombinante; b) adicionar um tampão de extração que tem um pH de 7,5 a 9 à amostra; e c) submeter a amostra a um passo de tratamento térmico dentro de uma gama de 40 °C a 70 °C durante 1 a 24 horas; caracterizado por se detetar o pH da amostra após a adição do tampão de extração e ajustar para assegurar que o pH da amostra é de 7 a 9 antes do passo de tratamento térmico.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o pH é detetado antes e durante a fase de aquecimento, durante a qual a temperatura da amostra é aumentada até à temperatura elevada desejada.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o pH durante a fase de aquecimento é inferior àquele antes desta.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que o pH da amostra é monitorizado continuamente desde o ponto de adição do tampão de extração até ao inicio do passo de tratamento térmico.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que pH da amostra é monitorizado continuamente durante o passo de tratamento térmico.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o passo de tratamento térmico é realizado dentro da gama de 40 °C a 65 °C.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o tampão de extração é tampão de Tris.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o pH da amostra é ajustado com NaOH, NH40H, ácido sulfúrico, EDTA ou tampão de Tris.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o anticorpo é especifico para um antigénio selecionado de integrinas, interleucinas, interferões, antigénios virais, TNF, fatores de estimulação de colónias e fatores de crescimento derivados de plaquetas.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a célula hospedeira é E. coli.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a molécula de anticorpo é expressa no periplasma de E. coli.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o método compreende adicionalmente um passo de filtração, centrifugação ou cromatografia de troca iónica, ou uma combinação dos mesmos. Lisboa, 10 de novembro de 2017