ES2963653T3 - Métodos de cultivo celular - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a métodos para reducir la heterogeneidad de una población de proteínas recombinantes producidas en cultivo celular, comprendiendo dichos métodos hacer crecer células huésped que producen una proteína recombinante en un medio de cultivo celular en el que el medio de cultivo celular comprende uno o más análogos de cisteína/cistina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos de cultivo celular
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de la fabricación de proteínas recombinantes, en particular de anticuerpos. Más específicamente, se refiere a métodos de cultivo celular para producir proteínas recombinantes con heterogeneidad reducida durante la fabricación a escala comercial.
Antecedentes de la invención
El desarrollo de proteínas recombinantes como proteínas terapéuticas, tales como anticuerpos terapéuticos, requiere la producción de proteínas recombinantes a una escala industrial. Con el fin de lograr esto, se pueden emplear diferentes sistemas de expresión, tanto sistemas procariotas como eucariotas. Sin embargo, durante las últimas dos décadas, la mayoría de las proteínas terapéuticas aprobadas como medicamentos se han fabricado por medio de cultivos de células de mamíferos y dichos sistemas siguen siendo los sistemas de expresión preferidos para producir una gran cantidad de proteínas recombinantes para uso humano.
Los cultivos de células de mamíferos, sin embargo, presentan desafíos significativos. El título de proteína recombinante producida es generalmente muy bajo en comparación con otros sistemas de producción eucariotas, tales como los basados en levaduras y células de insectos. Durante los últimos 30 años, se ha dedicado mucho esfuerzo a establecer los parámetros básicos del cultivo celular y la expresión de proteínas recombinantes, con gran parte de la investigación dedicada a lograr un crecimiento celular óptimo mediante cambios en la composición de los medios de cultivo celular (véase, p. ej. Hecklau C., et al.J Biotech218 (2016) 53-63; Zang Li. et al.Anal. Chem83 (2011) 5422-5430) y las condiciones de operación y desarrollo de grandes biorreactores. Por ejemplo, la L-cisteína es uno de los aminoácidos esenciales que se añade habitualmente a los medios y alimentaciones. Los derivados de cisteína, tales como la S-sulfocisteína y la N-acetil-cisteína, se han usado para mejorar la productividad específica en cultivos celulares (Hecklau et al. 2016, véase antes; Oh et al. (2005) Biotechnol. Prog. 21:1154; publicaciones internacionales WO2017186654; WO200803351; Seibel et al. (2017), MABS, 9(6) :889-897). Se han descrito otros derivados de cisteína, tales como el éster dimetílico de la N,N'-diacetil-L-cisteína, en relación con el cultivo de la línea celular de queratinocitos humanos (Kitazawa et al. (2002),FEBS Letters,526(1 -3):106-110).
Aunque el rendimiento sigue siendo un aspecto muy importante del cultivo de células de mamíferos, en los últimos años, el enfoque se ha desplazado hacia el control de la calidad del producto y la consistencia del procedimiento en todas las etapas de desarrollo y escala de producción. Las proteínas terapéuticas producidas por cultivo de células de mamífero presentan niveles variables de heterogeneidad. Dicha heterogeneidad incluye, pero no se limita a, diferentes patrones de glicosilación, diferencias resultantes de la desamidación u oxidación, diferentes variantes de carga o tamaño. La heterogeneidad de las proteínas recombinantes también puede conducir a diferencias en el color del producto, p. ej. entre diferentes lotes de la misma proteína fabricada por el mismo procedimiento de fabricación. Dicha heterogeneidad y, en particular, las diferencias de color de la proteína recombinante de interés, se hacen más evidentes cuando las proteínas terapéuticas se formulan en altas concentraciones. En los últimos años, ha habido una tendencia constante hacia la administración subcutánea de proteínas terapéuticas que requiere la formulación de proteínas terapéuticas en altas concentraciones. Las altas concentraciones también se han asociado con mayores niveles de agregados (Purdie J., et al.Biotechnology Progress,2016). El aumento de las variantes de carga, tal como el aumento de los niveles de especies ácidas, puede afectar a la estabilidad de la proteína (Banks D. D., et al.Journal of Pharmaceutical Sciences,2009), mientras que el color de la proteína terapéutica concentrada puede ser más intenso.
Las condiciones de cultivo celular, tales como la composición del medio (Kshirsagar R., et al.Biotechnology and Bioengineering,109:10, 2523-2532 (2012); US 2013/0281355; WO 2013/158275) y las condiciones de crecimiento, incluidos el pH y la temperatura (US 8765413) han demostrado tener un impacto en los atributos de calidad de las proteínas terapéuticas. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de proporcionar métodos de cultivo celular mejorados adicionales para la producción de proteínas terapéuticas y, en particular, anticuerpos terapéuticos con una heterogeneidad mínima.
Compendio de la invención
La presente invención aborda la necesidad identificada anteriormente mediante la adición de análogos de cisteína/cistina y/o la sustitución parcial de cisteína/cistina por análogos de cisteína/cistina en el medio usado para la producción de proteínas recombinantes en cultivo celular.
Por consiguiente, la invención se refiere a un método para producir una preparación de proteína recombinante que comprende:
(i) inocular células hospedantes en un medio basal, en donde el medio basal comprende una cantidad inicial de:
(a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
(ii) hacer progresar el cultivo a través de una fase de producción en donde las células producen la proteína recombinante, en donde, durante dicha fase de producción, el medio de cultivo celular se complementa con:
(a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
en donde (a) y (b) se pueden añadir simultánea o secuencialmente, en donde los análogos de cisteína/cistina se seleccionan del grupo que consiste en éster dimetílico de N,N’-diacetil-L-cistina, N-acetil-L-cisteína y N,N’-diacetil-L-cistina, y
en donde, cuando se suman los contenidos del medio basal y los complementos totales añadidos, la relación molar de (a) a (b) es entre 1:10 y 10:1.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Concentraciones de células viables
Figura 2: % de cambio relativo en el título de Mab el día 14 en comparación con el control (alimentación 100% de cisteína).
Figura 3: % de cambio relativo en el nivel de intensidad de color (valor b*) el día 14 en comparación con el control (alimentación 100% de cisteína)
Figura 4: % de cambio relativo en el nivel de especies ácidas el día 14 en comparación con el control (alimentación 100% de cisteína)
Figura 5: % de cambio relativo en el nivel de especie con carga principal el día 14 en comparación con el control (alimentación 100% de cisteína)
Figura 6: Concentraciones de células viables
Figura 7: % de cambio relativo en el título de Mab el día 14 en comparación con el control (alimentación 100% de cisteína)
Figura 8: % de cambio relativo en el nivel de especies ácidas el día 14 en comparación con el control (alimentación 100% de cisteína)
Figura 9: % de cambio relativo en el nivel de especies con carga principales el día 14 en comparación con el control (alimentación 100% de cisteína)
Figura 10: Perfil de crecimiento celular para la línea celular 1 en biorreactor de 2 L (concentraciones de células viables)
Figura 11: % de cambio relativo en el título de Mab en comparación con el control para la línea celular 1 en biorreactor de 2 L
Figura 12 % de cambio relativo en el nivel de especies ácidas en comparación con el control para la línea celular 1 en biorreactor de 2 L
Figura 13: % de cambio relativo en el nivel de especie con carga principal en comparación con el control para la línea celular 1 en biorreactor de 2 L
Figura 14: % de cambio relativo en la intensidad del color (valor b*) con respecto al control para la línea celular 1 en biorreactor de 2 L
Figura 15: Perfil de crecimiento celular para la línea celular 2 en biorreactor de 2 L (concentraciones de células viables)
Figura 16: % de cambio relativo en el título de Mab en comparación con el control para la línea celular 2 en biorreactor de 2 L
Figura 17 % de cambio relativo en el nivel de especies ácidas en comparación con el control para la línea celular 2 en biorreactor de 2 L
Figura 18: % de cambio relativo en el nivel de especie con carga principal en comparación con el control para la línea celular 2 en biorreactor de 2 L
Figura 19: Perfil de crecimiento celular medio de los conjuntos de datos 1 y 2 en biorreactores de 2 L (barras de error = 1 SD)
Figura 20: % de cambio relativo en el título de Mab con respecto al control. Valores medios de los conjuntos de datos 1 y 2 (barras de error = 1 SD)
Figura 21: % de cambio relativo en el nivel de especies ácidas con respecto al control. Valores medios de los conjuntos de datos 1 y 2 (barras de error = 1 SD)
Figura 22: % de cambio relativo en el nivel de especie con carga principal con respecto al control. Valores medios de los conjuntos de datos 1 y 2 (barras de error = 1 SD)
Figura 23: % de cambio relativo en la intensidad del color (valor b*) con respecto al control. Valores medios de los conjuntos de datos 1 y 2 (barras de error = 1 SD)
Figura 24: Perfil de crecimiento celular para la línea celular 1 en biorreactor de 15 ml
Figura 25: % de cambio relativo en el nivel de especies ácidas con respecto al control en respuesta a diferentes niveles de análogo de cisteína/cistina.
Figura 26: % de cambio relativo en el nivel de especie con carga principal con respecto al control en respuesta a diferentes niveles de análogo de cisteína/cistina.
Descripción detallada de la invención
El método de la invención en particular reduce la coloración de proteínas recombinantes. En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para producir una preparación de proteínas recombinantes que comprende:
(i) inocular células hospedantes en un medio basal, en donde el medio basal comprende una cantidad inicial de:
(a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
(ii) hacer progresar el cultivo a través de una fase de producción en donde las células producen proteínas recombinantes, en donde, durante dicha fase de producción, el medio de cultivo celular se complementa con:
(a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
en donde (a) y (b) se pueden añadir simultánea o secuencialmente, en donde los análogos de cisteína/cistina se seleccionan del grupo que consiste en éster dimetílico de N,N’-diacetil-L-cistina, N-acetil-L-cisteína y N,N’-diacetil-L-cistina, y
en donde, cuando se suman los contenidos del medio basal y los complementos totales añadidos, la relación molar de (a) a (b) es entre 1:10 y 10:1.
Heterogeneidad
La invención se basa en el hallazgo de que al añadir análogos de cisteína/cistina al medio de cultivo celular durante la fase de producción en un procedimiento para fabricar una proteína recombinante, se reduce la heterogeneidad de los polipéptidos recombinantes producidos, sin reducir el título de los polipéptidos recombinantes al final de la producción.
La heterogeneidad se reduce preferiblemente con respecto a:
a. color o intensidad del color;
b. heterogeneidad de carga, preferiblemente mediante la reducción de especies del grupo de picos ácidos (APG, por sus siglas en inglésAcidic Peak Group)y/o especies del grupo de picos básicos (BPG, por sus siglas en inglésBasic Peak Group),de modo que la especie con carga principal no disminuye; y/o
c. oxidación de aminoácidos, preferiblemente oxidación de metionina.
El término "heterogeneidad", como se usa en el presente documento, se refiere a diferencias entre moléculas individuales, p. ej. proteínas recombinantes, en una población de moléculas producidas por el mismo procedimiento de fabricación, o dentro del mismo lote de fabricación. La heterogeneidad puede resultar de modificaciones incompletas o no homogéneas de los polipéptidos recombinantes, p. ej. debido a modificaciones postraduccionales del polipéptido o a la incorporación incorrecta durante la transcripción o traducción. Las modificaciones postraduccionales pueden ser el resultado, p. ej., de reacciones de desaminación y/o reacciones de oxidación y/o adición covalente de moléculas pequeñas tales como reacciones de glicación y/o reacciones de isomerización y/o reacciones de fragmentación y/u otras reacciones y también incluyen variaciones en los patrones de glicación. La manifestación quimicofísica de dicha heterogeneidad conduce a varias características en las preparaciones de polipéptidos recombinantes resultantes que incluyen, pero no se limitan a, perfil de variantes de cargas, color o intensidad de color y perfil de pesos moleculares.
Los términos "coloreado" o "color", cuando se usan en el presente documento, indican que una solución líquida, tal como una preparación de proteínas concentrada, no es incolora. Siguiendo la definición de la farmacopea europea, una solución es incolora si tiene el aspecto del agua R o del disolvente o no está más intensamente coloreada que la solución de referencia B9 (Farmacopea europea 2.2.2). Una forma posible de medir la reducción del color o la intensidad del color de las proteínas recombinantes en el cultivo celular, que se puede usar según esta invención, es midiendo la distribución de potencia espectral relativa de la intensidad de color del Iluminante A estándar de CIE usando un espectrofotómetro por transmisión, p. ej. usando UltrascanPro y comparando los datos con la escala CIE (Commission Internationale de L'éclairage), por ejemplo, comparando el valor b*.
La reducción de la heterogeneidad de la carga se define preferiblemente midiendo las especies del grupo de picos ácidos (APG) en la población de proteínas recombinantes producidas en el cultivo celular. Una forma posible de medir la reducción de APG es determinando por electroforesis capilar con imágenes (p. ej., ProteinSimple iCE3) el porcentaje relativo de isoformas ácidas (APG para grupo de picos ácidos) de las proteínas recombinantes producidas en un medio de cultivo celular con o sin análogos de cisteína/cistina, cuya proteína recombinante está preferiblemente purificada en el momento de la medición. Cuando se miden las isoformas de las proteínas de recombinación, además del APG también se miden las isoformas básicas ((BPG) Grupo de picos básicos) y la especie con carga principal, en donde la especie con carga principal representa la isoforma de la proteína recombinante que se desea obtener. Se prefiere que cuando el APG disminuya, no haya un aumento sustancial del BPG. Preferiblemente, cuando disminuye el APG, aumenta el nivel de la especie con carga principal.
Como se describe, la invención se refiere a la fabricación de una proteína recombinante en donde se reduce la heterogeneidad de los polipéptidos recombinantes producidos, sin reducir el rendimiento de los polipéptidos recombinantes. Preferiblemente, se aumenta el título de los polipéptidos recombinantes. Según la invención, "el título" es la concentración del polipéptido recombinante al final de la fase de producción, a menos que se indique lo contrario.
Análogos de cisteína/cistina
El término “análogos de cisteína” o “derivados de cisteína”, cuando se usa en el presente documento, significa uno o más compuestos que son análogos estructurales de la cisteína, con la excepción de la propia cistina.
El término "análogos de cistina" o "derivados de cistina", cuando se usa en el presente documento, significa uno o más compuestos que son análogos estructurales de la cisteína, con la excepción de la propia cistina.
El término “análogos de cisteína/cistina” significa “análogos de cisteína” o “análogos de cistina” o una mezcla de “análogos de cisteína” y “análogos de cistina”.
El término “derivados de cisteína/cistina” significa “derivados de cisteína” o “derivados de cistina” o una mezcla de “derivados de cisteína” y “derivados de cistina”.
Los análogos de cisteína/cistina típicamente comprenden o consisten en uno o más compuestos seleccionados de los compuestos representados por las fórmulas 1 y 2, y sus sales:
en donde
R1, R2, R4 y R5 representan independientemente hidrógeno, aminocarbonilo, acilo C<2-22>, alquilo C<1-22>, cuyo grupo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados de hidroxi y alcoxi C<1-22>; heteroalquilo C<1-22>, hidroxisulfonilo, alquilC<1-22>sulfonilo o arilC<5-22>sulfonilo;
R3 y R6 representan independientemente hidroxi; NH<2>; alcoxi C<1-22>en donde uno o más carbonos del alquilo C<1-22>pueden estar opcionalmente reemplazados por un arilo o un heteroarilo; alquilamino C<1-22>cuyo grupo está opcionalmente sustituido con un hidroxi o un alquilo C<1-22>; hidroxiamino; alcoxiC<1-22>amino; alquilC<1-22>amino en donde uno o más carbonos del alquilo C<1-22>están reemplazados por un arilo o un heteroarilo; heteroalquilC<1-22>amino; di(alquil C<1-22>)amino que está opcionalmente sustituido con un hidroxi; di(alquil C<1-22>)amino en donde uno o más carbonos del alquilo C<1-22>están reemplazados por un arilo o heteroarilo; o di(heteroalquilo C<1-22>)amino;
R7 representa hidrógeno, fosfato o sulfato.
L representa una cadena de alquileno C<1-10>opcionalmente sustituida; y
con la condición de que el compuesto no es cisteína o cistina.
El término "alquilo C<1-22>", como se usa en el presente documento, se refiere a grupos hidrocarbonados alifáticos que pueden ser lineales o ramificados y pueden comprender de 1 a 22 átomos de carbono en la cadena. Generalmente, los grupos alquilo C<1-22>que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la invención incluyen grupos alquilo C<6-22>, grupos alquilo C<12-22>, grupos alquilo C<1-16>, grupos alquilo C<1-10>y grupos alquilo C<1-6>. Los ejemplos de grupos alquilo C<1-22>incluyen palmitinilo y estearilo.
El término “arilo C<5-22>”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo carbocíclico aromático insaturado de 5 a 22 átomos de carbono que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados. Generalmente, los grupos arilo C<5-22>que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la invención incluyen grupos arilo C<5-14>, incluyen adecuadamente grupos arilo C<5-10>. Ejemplos de grupos arilo C<5-22>son fenilo y naftilo.
El término "heteroarilo C<5-22>" como se usa en el presente documento representa grupos carbocíclicos aromáticos de 5 a 22 átomos de carbono que tienen un solo anillo o múltiples anillos condensados, en donde uno o más de dichos átomos de carbono se han reemplazado por uno o más heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre y nitrógeno. Generalmente, los grupos heteroarilo C<5-22>que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la invención incluyen grupos arilo heteroarilo C<5-14>, incluyen adecuadamente grupos heteroarilo C<5-10>.
El término "acilo C<2-22>", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo representado por la fórmula -(C=O)R en donde R representa un grupo alquilo C<1-22>como se define aquí antes. Generalmente, los grupos acilo C<2-22>que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la presente invención incluyen grupos acilo C<2-6>, grupos acilo C<6-22>y grupos acilo C<12-22>. Ejemplos de dicho acilo C<2-6>son metilcarbonilo, etilcarbonilo y butilcarbonilo. Ejemplos de grupos acilo C<12-22>incluyen palmitinilcarbonilo y estearilcarbonilo.
El término "alcoxi C<1-22>" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo representado por la fórmula -O-R, en donde R representa un grupo alquilo C<1-22>como se define aquí antes. Generalmente, los grupos alcoxi C<1-22>que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la presente invención incluyen grupos alcoxi C<1-6>, grupos alcoxi C<6-22>y grupos alcoxi C<12-22>. Ejemplos de grupos alcoxi C<1-6>son metoxi y etoxi. Ejemplos de grupos alcoxi C<12-22>incluyen palmitiniloxi y esteariloxi.
El término "heteroalquilo C<1-22>" como se usa en el presente documento se refiere a un alquilo C<1-22>como se define antes en donde uno o más átomos de carbono están reemplazados por uno o más átomos de oxígeno o nitrógeno. Generalmente, los grupos heteroalquilo C<1-22>que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la presente invención incluyen grupos heteroalquilo C<1-6>, grupos heteroalquilo C<6-22>y grupos heteroalquilo C<12-22>. Ejemplos de heteroalquilo C<1-22>incluyen oligómeros de etilenglicol.
El término “hidroxisulfonilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo representado por la fórmula -S(=O)<2>-OH.
El término "alquilC<1>-<22>sulfonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo representado por la fórmula -S(=O)<2>-R, en donde R representa un grupo alquilo C<1-22>como se define aquí antes. Generalmente, los grupos alquilC<1>-<22>sulfonilo que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la presente invención incluyen grupos alquilC<1>-<6>sulfonilo y grupos alquilC<6>-<22>sulfonilo, grupos alquilC<12>-<22>sulfonilo. Ejemplos de alquilC<1>-<22>sulfonilo incluyen metilsulfonilo, etilsulfonilo y terc-butilsulfonilo.
El término "arilC5-22sulfonilo" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo representado por la fórmula -S(=O)<2>-R', en donde R' representa un grupo arilo C<5-22>como se define aquí antes. Los ejemplos de arilCs-<22>sulfonilo incluyen fenilsulfonilo y tolilsulfonilo.
El término "alquilamino C<1>-<22>" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo representado por la fórmula -NH-R, en donde R representa un grupo alquilo C<1-22>como se define aquí antes. Generalmente, los grupos alquilamino C<1-22>que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la presente invención incluyen grupos alquilamino C<1>-6, grupos alquilamino C<6-22>y grupos alquilamino C<12>-<22>. Ejemplos de alquilamino C<1-22>incluyen metilamino, etilamino y butilamino.
El término alcoxiC<1>-<22>amino como se usa en el presente documento se refiere a un grupo representado por la fórmula -NH-OR en donde R representa un grupo alquilo C<1-22>como se define aquí antes. Generalmente, los grupos alcoxiC<i-22>amino que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la presente invención incluyen grupos alcoxiC<1-6>amino, grupos alcoxiC<6-22>amino y grupos alcoxiC<12-22>amino. Ejemplos de alquilamino C<1-22>incluyen metilamino, etilamino y butilamino.
El término "di(alquil C<1-22>)amino" como se usa en el presente documento se refiere a la fórmula -NRR' en donde R y R' representan independientemente un grupo alquilo C<1-22>como se define aquí antes. Generalmente, los grupos di(alquil C<1-22>)amino que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la presente invención incluyen di(alquil C<1-6>)amino, di(alquil C<6-22>)amino y di(alquil C<12-22>)amino. Ejemplos de di(alquil C<1-22>) amino incluyen dimetilamino, (metil)(etil)amino, dietilamino, propilamino y butilamino.
El término "heteroalquilC<1-22>amino" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo representado por la fórmula -NH-R, en donde R representa un grupo heteroalquilo C<1-22>como se define aquí antes. Generalmente, los grupos heteroalquilC<1-22>amino que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la presente invención incluyen heteroalquilC<1-6>amino, heteroalquilC<6-22>amino y heteroalquilC<12-22>amino.
El término "di(heteroalquil C<1-22>)amino" como se usa en el presente documento se refiere a la fórmula -NRR' en donde R y R' representan independientemente un grupo heteroalquilo C<1-22>como se define aquí antes. En general, los grupos di(heteroalquil C<1-22>)amino que pueden estar presentes en los compuestos de uso en la presente invención incluyen di(heteroalquil C<1-6>)amino, di(heteroalquil C<6-22>)amino y di(heteroalquil C<12-22>)amino.
El término "cadena de alquileno C<1-10>" se refiere a una cadena de alquileno lineal o ramificada divalente que contiene de 1 a 10 átomos de carbono. Los ejemplos típicos de "cadena de alquileno C<1-10>" incluyen metileno, etileno, propileno y butileno.
El término "aminocarbonilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo representado por la fórmula -CO- N(R<a>R<b>) en donde el carbono de -CO está unido al nitrógeno del análogo de cisteína/cistina y en donde R<a>y R<b>independientemente entre sí representan un alquilo C<1-22>como se define antes.
Generalmente, R1, R2, R4 y R5 representan independientemente hidrógeno, acilo C<2-22>, alquilo C<1-22>cuyo grupo está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados de hidroxi y alcoxi C<1-22>; o heteroalquilo C<1-22>.
Generalmente, R3 y R6 representan independientemente hidroxi; NH<2>; alcoxi C<1-22>en donde uno o más carbonos del alquilo C<1-22>pueden estar opcionalmente reemplazados por un arilo o un heteroarilo; alquilamino C<1-22>cuyo grupo está opcionalmente sustituido con un hidroxi; o di(alquil C<1-22>)amino que está opcionalmente sustituido con un hidroxi.
Generalmente, R7 representa hidrógeno.
Generalmente, L representa una cadena de alquileno C<1-4>, opcionalmente sustituida, con uno o más alquilo C<1-6>, preferiblemente, dos grupos metilo.
Adecuadamente, R1 representa hidrógeno o acilo C<2-22>. Típicamente, R1 representa hidrógeno o acilo C<2-6>. De manera ilustrativa, R1 representa hidrógeno o acetilo. En una realización particular, R1 representa hidrógeno.
Adecuadamente, R2 representa hidrógeno o acilo C<2-22>. Típicamente, representa hidrógeno o acilo C<2-6>. De manera ilustrativa, R2 representa hidrógeno o acetilo.
Adecuadamente, R3 representa hidroxi o alcoxi C<1-22>. Típicamente, R3 hidroxi o alcoxi C<1-6>. De manera ilustrativa, R3 representa hidroxi o metoxi.
Adecuadamente, R4 representa hidrógeno o acilo C<2 -22>. Típicamente, R4 representa hidrógeno o acilo C<2-6>. De manera ilustrativa, R4 representa hidrógeno o acetilo. En una realización particular, R4 representa hidrógeno.
Adecuadamente, R5 representa hidrógeno o acilo C<2 -22>. Típicamente, R5 representa hidrógeno o hidrógeno o acilo C<2-6>. De manera ilustrativa, R5 representa acetilo.
Adecuadamente, R6 representa hidroxi o alcoxi C<1-22>. Típicamente, R6 representa hidroxi o alcoxi C<1-6>. De manera ilustrativa, R6 representa hidroxi o metoxi.
Adecuadamente, L representa metileno o etileno. De manera ilustrativa, L representa metileno.
Las sales pueden formarse por reacción de un grupo hidroxi presente en los análogos de cisteína/cistina. Dichas sales incluyen sales de metales alcalinos, por ejemplo sales de sodio, potasio o litio; sales de metales alcalinotérreos, por ejemplo sales de magnesio o calcio; sales de amonio, por ejemplo, sales de tetraalquil o arilamonio; sales de sulfonio, por ejemplo trialquil o arilsulfonio; y sales de fosfonio, por ejemplo sales de tetraalquil o arilfosfonio.
Alternativamente, dichas sales pueden formarse por reacción de un grupo amino presente en la cisteína/análogos de cisteína. Dichas sales típicamente resultan de la reacción del grupo amino con un ácido inorgánico o un ácido orgánico e incluyen sales de mono- o di-HCl, sales de H<2>SO<4>, sales de H<3>PO<4>, acetato y fumarato.
Adecuadamente, los análogos de cisteína/cistina como se definen aquí antes tienen la misma quiralidad que la L-cisteína.
En el contexto de la presente invención, los análogos de cisteína/cisteína se seleccionan de éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina, N-acetil-L-cisteína y N,N'-diacetil-L-cistina.
En un aspecto particular de esta realización, los análogos de cisteína/cistina consisten en éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina representado por la fórmula 2a ((Ac-Cys-OMe)<2>.
Los análogos de cisteína/cisteína según la presente invención pueden estar disponibles comercialmente o se pueden sintetizar a partir de L-cisteína o L-cistina por métodos conocidos para los expertos en la técnica.
Cultivo celular
Como será evidente a partir de la descripción de la invención en lo sucesivo, el medio de cultivo celular se complementa con cisteína y/o cistina, es decir, dicha complementación se puede realizar con:
- cisteína; o
- cistina; o
- cisteína y cistina
La cisteína y la cistina en el medio de cultivo celular están en equilibrio constante en donde dos moléculas de cisteína se oxidan en una molécula de cistina y se reducen de nuevo a dos moléculas de cisteína.
El término "cultivo celular" o variaciones gramaticales de la misma incluye, pero no se limita a, una pluralidad de células hospedantes, preferiblemente células hospedantes de mamíferos, modificadas y/o manipuladas adecuadamente para expresar (es decir, para producir) uno o más polipéptidos recombinantes mantenidos o crecidos en medio de cultivo celular durante un periodo de tiempo particular, p. ej. la fase de producción.
El término "fase de producción" según la presente invención comprende la etapa de cultivo de células durante el procedimiento para fabricar una proteína recombinante cuando las células expresan (es decir, producen) el(los) polipéptido(s) recombinante(s). La fase de producción comienza cuando aumenta el título del producto deseado y finaliza con la recolección de las células o el líquido de cultivo celular o líquido sobrenadante. Típicamente, al comienzo de la fase de producción, el cultivo celular se transfiere a un recipiente de producción, tal como un biorreactor. La recolección es la etapa durante la cual se separa el líquido del cultivo celular de, p. ej., el recipiente de producción, con el fin de que la proteína recombinante, p. ej. el anticuerpo recombinante, sea recuperado y purificado en etapas posteriores.
Las células hospedantes preferidas son células hospedantes de mamífero, lo más preferiblemente células de ovario de hámster chino (CHO). Las células de mamífero, y en particular las células CHO, pueden cultivarse en cualquier medio que mantenga su crecimiento y expresión del polipéptido recombinante, preferiblemente el medio es un medio que está exento de productos derivados de animales tales como suero animal y peptona. Hay diferentes medios de cultivo celular disponibles para el experto en la técnica, comprendiendo cada medio diferentes combinaciones de vitaminas, aminoácidos, hormonas, factores de crecimiento, iones, tampones, nucleósidos, glucosa o una fuente de energía equivalente, presentes en concentraciones adecuadas para permitir el crecimiento celular y la producción de proteínas. Los medios adecuados se han descrito p. ej. en los documentos WO98/08934 y US2006/0148074.
Otros medios comercialmente disponibles que se podrían usar en la presente invención o modificarse para cumplir con los requisitos de cisteína/análogo de cisteína y/o cisteína y/o cistina incluyen, pero no se limitan a, medio AmpliCHO CD, medio Dynamis®, sistema semicontinuo EX-CELL® Advanced™ CHO, medio CD FortiCHO™, medio CP OptiCHO®, medio mínimo esencial (MEM), medio BalanCD® CHO Growth A, medio ActiPro®, DMEM-medio Eagle modificado por Dulbecco y RPMI-1640.
En una realización preferida del método de la invención, en donde dicho medio de cultivo celular comprende:
(a) análogos de cisteína/cistina; y
(b) cisteína y/o cistina,
en donde la relación molar de (a) a (b) es entre 1:10 y 10:1.
Preferiblemente, dicha relación molar de (a) a (b) es entre 1:10 y 10:1, p. ej. entre 1:8 y 8:1, tal como entre 1:6 y 6:1, p. ej. entre 1:4 y 4:1, tal como entre 1:3 y 3:1, p. ej., entre 1:2 y 2:1, tal como entre 1.5:1 y 1:1.5, p. ej. una relación molar de 1:1.
Con referencia a la realización preferida anterior, se observa que un experto en la materia sabe que la relación de (a) y (b) depende de si se toma como punto de referencia la forma de dímero o la forma de monómero. Dado que la cisteína y la cistina en el medio de cultivo celular están en equilibrio constante, la relación se considera respecto al equivalente de cisteína, en donde se supone que toda la cistina está en su forma reducida. La siguiente tabla da como ejemplo cómo difiere la relación dependiendo de si se tiene en cuenta un análogo de cisteína o un análogo de cistina.
En otra realización preferida, el método comprende las etapas de:
(i) inocular células hospedantes en un medio basal, en donde el medio basal comprende opcionalmente una cantidad inicial de:
(a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
(ii) hacer progresar el cultivo a través de una fase de producción en donde las células producen la proteína recombinante, en donde, durante dicha fase de producción, el medio de cultivo celular se complementa con: (a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
en donde (a) y (b) pueden añadirse simultánea o secuencialmente, en donde, los análogos de cisteína/cistina se seleccionan del grupo que consiste en éster dimetílico de N,N’-diacetil-L-cistina, N-acetil-L-cisteína y N,N’-diacetil-L-cistina, y
en donde, cuando se suman los contenidos del medio basal y los complementos totales añadidos, la relación molar de (a) a (b) es entre 1:10 y 10:1.
Preferiblemente, en las realizaciones mencionadas antes, dicha relación molar de (a) a (b) es entre 1:10 y 10:1, p. ej. entre 1:8 y 8:1, tal como entre 1:6 y 6:1, p. ej. entre 1:4 y 4:1, tal como entre 1:3 y 3:1, p. ej., entre 1:2 y 2:1, tal como entre 1.5:1 y 1:1.5, p. ej. una relación molar de 1:1.
Con referencia a la realización preferida anterior, se observa que un experto en la técnica sabe que la relación de (a) y (b) depende de si se toma como punto de referencia la forma de dímero o la forma de monómero. Dado que la cisteína y la cistina en el medio de cultivo celular están en equilibrio constante, la relación se considera con respecto al equivalente de cisteína, en donde se supone que toda la cistina está en su forma reducida.
En una realización preferida según el método de la invención, dicho medio de cultivo celular comprende:
(a) análogos de cisteína/cistina; y
(b) cisteína y/o cistina,
en donde, la cantidad molar de (a) es de 10 a 90 por ciento considerando la cantidad molar total de (a) y (b), en donde en caso de que se use un análogo de cisteína, la cantidad molar de (b) se calcula considerando los equivalentes de cisteína; y
en donde en caso de que se use un análogo de cistina, la cantidad molar de (b) se calcula considerando los equivalentes de cistina.
En la realización anterior, la cantidad molar de (a) considerando la cantidad molar total de (a) y (b) es preferiblemente de 20 a 90 por ciento; tal como de 30 a 90 por ciento, p. ej. de 40 a 90 por ciento o p. ej. de 50 a 90 por ciento, tal como de 20 a 80 por ciento; tal como de 30 a 80 por ciento, p. ej. de 40 a 80 por ciento o p. ej. de 50 a 80 por ciento, tal como de 20 a 70 por ciento, de 30 a 70 por ciento, p. ej. de 40 a 70 por ciento o p. ej. de 50 a 70 por ciento. Particularmente preferido es en donde el análogo de cistina es éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina o N,N'-diacetil-L-cistina, en donde la cantidad molar (a) considerando la cantidad molar total de (a) y (b) es de 20 a 90 por ciento, más preferiblemente de 30 a 90 por ciento, tal como de 20 a 70 por ciento, p. ej. de 30 a 70 por ciento, o en donde el análogo de cisteína es N-acetil-L-cisteína, en donde la cantidad molar (a) considerando la cantidad molar total de (a) y (b) es de 50 a 90 por ciento, preferiblemente de 50 a 80 por ciento, más preferiblemente de 50 a 70 por ciento. En otra realización, el método comprende las etapas de:
(i) inocular células hospedantes en un medio basal, en donde el medio basal comprende opcionalmente una cantidad inicial de:
(a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
(ii) hacer progresar el cultivo a través de una fase de producción en donde las células producen la proteína recombinante, en donde, durante dicha fase de producción, el medio de cultivo celular se complementa con:
(a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
en donde (a) y (b) pueden añadirse simultánea o secuencialmente, en donde, los análogos de cisteína/cistina se seleccionan del grupo que consiste en éster dimetílico de N,N’-diacetil-L-cistina, N-acetil-L-cisteína y N,N’-diacetil-L-cistina, y
en donde, cuando se suman los contenidos del medio basal y los complementos totales añadidos, la relación molar de (a) a (b) considerando la cantidad molar total de (a) y (b) es de 10 a 90 por ciento, en donde en caso de que se use un análogo de cisteína, la cantidad molar de (b) se calcula considerando el equivalente de cisteína; y
en donde en caso de que se use un análogo de cistina, la cantidad molar de (b) se calcula considerando el equivalente de cistina.
En la realización anterior, la cantidad molar de (a) considerando la cantidad molar total de (a) y (b) es preferiblemente de 20 a 90 por ciento, tal como de 30 a 90 por ciento, p. ej. de 40 a 90 por ciento o p. ej. de 50 a 90 por ciento, tal como de 20 a 80 por ciento; de 30 a 80 por ciento, p. ej. de 40 a 80 por ciento o p. ej. de 50 a 80 por ciento, tal como de 20 a 70 por ciento, de 30 a 70 por ciento, p. ej. de 40 a 70 por ciento o p. ej. de 50 a 70 por ciento.
Particularmente preferido es en donde el análogo de cistina es éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina o N,N'-diacetil-L-cistina, en donde la cantidad molar (a) considerando la cantidad molar total de (a) y (b) es de 20 a 90 por ciento, más preferiblemente de 30 a 90 por ciento, tal como de 20 a 70 por ciento, p. ej. de 30 a 70 por ciento, o en donde el análogo de cisteína es N,Acetil-L-cisteína, en donde la cantidad molar de (a) considerando la cantidad molar total de (a) y (b) es de 50 a 90 por ciento, preferiblemente de 50 a 80 por ciento, más preferiblemente de 50 a 70 por ciento. En una realización, la concentración de (b) en dicho medio basal es equivalente a entre 0.05 y 5 mmol/l de cisteína, tal como entre 0.1 y 1 mmol/l, p. ej. entre 0.2 y 0.6 mmol/l.
“equivalente a X mol de cisteína” en el presente documento indica que si se usan formas de dímero, tales como cistina o análogos de cistina, debe contarse el doble con el fin de calcular la cantidad para usar o añadir. P. ej. 1 mmol/l de cistina es equivalente a 2 mmol/l de cisteína.
En otra realización, durante la fase de producción, el medio se complementa con (a) análogos de cisteína/cistina y (b) cisteína y/o cistina, en donde la suma de (a) y (b) añadida al cultivo a lo largo de toda la fase de producción es equivalente a entre 1 y 75 mmol/l de cisteína, tal como entre 1 y 50 mmol/l, p. ej. entre 1 y 20 mmol/l, tal como entre 2 y 20 mmol/l, p. ej. entre 4 y 10 mmol/l,.
En otra realización, durante la fase de producción, el medio se complementa diariamente con (a) análogos de cisteína/cistina y (b) cisteína y/o cistina, en donde la adición diaria lleva la concentración de (a) (b) a una concentración equivalente a entre 0.05 y 5 mmol/l de cisteína, tal como entre 0.1 y 1 mmol/l.
La fase de producción se opera preferiblemente en un modo semicontinuo, pero se puede usar cualquier otro modo tal como modos discontinuos, de perfusión o en quimiostato como alternativa.
El cultivo celular puede tener lugar en cualquier recipiente adecuado, tal como un matraz de agitación o un biorreactor, que puede funcionar o no en un modo semicontinuo dependiendo de la escala de producción requerida. Estos biorreactores pueden ser reactores de tanque agitado o de flujo ascendente(Airlift).Preferiblemente, la fase de producción se lleva a cabo en un biorreactor, preferiblemente con un volumen igual o mayor que 50 L, igual o mayor que 100 L, igual o mayor que 500 L, igual o mayor que 1000 L, igual o mayor que 2000 L, igual o mayor que 5000 L, igual o mayor que 10000 L o igual o mayor que 20000 L.
Preferiblemente, la proteína recombinante se produce durante una fase de producción, en donde la fase de producción preferiblemente tiene una duración de al menos 7 días, más preferiblemente al menos 14 días.
En realizaciones preferidas, el cultivo se complementa diariamente en la fase de producción. En una realización del método de la invención, el medio de cultivo celular se complementa con:
- cisteína o cistina hasta una cantidad total de 10% en peso a 30% en peso de la cantidad total esperada de proteína recombinante producida; y/o
- triptófano hasta una cantidad total de 8% en peso a 35% en peso de la cantidad total esperada de proteína recombinante producida.
La cantidad total de cisteína o cistina y/o triptófano añadida puede expresarse en el presente documento como un porcentaje de la cantidad total de polipéptido recombinante producido. El término “% en peso” como se usa en el presente documento se refiere a un porcentaje en peso. “Total” se refiere a la cantidad total determinada al final de la fase de producción, es decir, la cantidad total de cisteína o cistina y/o triptófano añadida durante el transcurso de la fase de producción y la cantidad total de proteína recombinante producida durante el transcurso de la fase de producción, en donde la cantidad total de proteína recombinante producida se mide al final de la fase de producción.
La cantidad total de cisteína o cistina o triptófano añadida se calcula en función de la velocidad de alimentación (o volumen de alimentación) y la concentración de cisteína o cistina o triptófano en esa alimentación y la concentración de cisteína o cistina o triptófano en el medio en donde se añade el alimento por volumen de alimento añadido. La cantidad de polipéptido recombinante producido se calcula en función del volumen final del medio de cultivo celular y del título de polipéptido recombinante final. La relación de estos dos parámetros calculados es la cantidad total de cisteína o cistina y/o triptófano añadida por cantidad de polipéptido recombinante producido.
Las células hospedantes se pueden cultivar inicialmente (en la etapa a.) en un medio de cultivo celular que puede incluir ya o no análogos de cisteína/cistina, cisteína, cistina y/o triptófano. Si el medio de cultivo celular ya incluye una cantidad inicial de análogos de cisteína/cistina, cisteína, cistina y/o triptófano, entonces la cantidad total incluirá esta cantidad inicial.
En una realización del procedimiento de la invención, el medio de cultivo celular se complementa con cisteína o cistina hasta una cantidad total de 12.06% en peso a 28.03% en peso de la cantidad total esperada de polipéptido recombinante producido, tal como una cantidad total de 12% en peso a 28% en peso, p. ej. de 12% en peso a 25% en peso, tal como de 12% en peso a 20% en peso de la cantidad total esperada de polipéptido recombinante producido.
En otra realización del procedimiento de la invención, en donde el medio de cultivo celular se complementa con triptófano hasta una cantidad total de 8.84% en peso a 32.06% en peso de la cantidad total esperada de polipéptido recombinante producido, tal como una cantidad total de 8% en peso a 30% en peso, p. ej. de 8% en peso a 25% en peso, tal como de 8% en peso a 20% en peso de la cantidad total esperada de polipéptido recombinante producido.
En otra realización del método de la invención,
- la concentración de cisteína o cistina en el cultivo celular no supera 0.9 g/l en ningún momento durante la fase de producción, preferiblemente en donde la concentración de cisteína o cistina en el cultivo celular no supera 0.3 g/l en ningún momento durante la fase de producción, y/o
- la concentración de triptófano en el cultivo celular no supera 0.6 g/l en ningún momento durante la fase de producción, preferiblemente en donde la concentración de triptófano en el cultivo celular no supera 0.3 g/l en ningún momento durante la fase de producción.
En una realización adicional del método de la invención,
- la cantidad total de cisteína o cistina proporcionada durante el procedimiento es de 2.9 a 12 g/(1012 células), tal como de 2.9 a 7 g/(1012 células), p. ej. de 5.6 a 7 g/(1012 células), en donde células se refiere al recuento integral de células viables esperado al final de la fase de producción, y/o
- la cantidad total de triptófano proporcionada durante el procedimiento es de 2.5 a 7 g/(1012 células), tal como de 2.5 a 3.5 g/(1012 células/l), en donde células se refiere al recuento integral de células viables esperado al final del fase de producción.
Debe entenderse que el experto en la técnica sabría cómo medir la cantidad de cisteína o cistina y/o triptófano añadida y/o presente en un cultivo celular en una fase específica, tal como la fase de producción. De manera similar, el experto en la técnica sabría cómo medir la cantidad total de polipéptido recombinante producido por un cultivo celular y, por consiguiente, aplicar las enseñanzas de la presente invención para lograr el efecto técnico deseado.
Con el fin de diseñar un procedimiento en donde las cantidades de cisteína o cistina y/o triptófano por cantidad total de polipéptido recombinante producido se mantengan dentro de ciertos intervalos, puede ser necesario realizar uno o más experimentos iniciales para determinar los niveles aproximados de polipéptido recombinante producido por células hospedantes particulares en condiciones de cultivo particulares. Una vez que se conocen los niveles totales aproximados de polipéptido recombinante producido, se puede diseñar un procedimiento según la invención en donde las cantidades de cisteína o cistina y/o triptófano por cantidad total de polipéptido recombinante producido se mantienen dentro de los intervalos especificados,
Pueden emplearse diversas estrategias para alcanzar la cantidad total de análogos de cisteína/cistina, cisteína, cistina y/o triptófano en el medio de cultivo celular durante la fase de producción. En una realización, la cantidad total se puede alcanzar añadiendo análogos de cisteína/cistina, cisteína, cistina y/o triptófano justo al comienzo de la fase de producción, por ejemplo, solo una vez o ya incluidos en el medio de cultivo celular de producción. En otra realización, la cantidad total se puede alcanzar mediante la suma de las adiciones, por ejemplo, la adición diaria o adición continua, durante la fase de producción. En otra realización más, la cantidad total se puede alcanzar mediante una combinación de la concentración inicial de análogos de cisteína/cistina, cisteína, cistina y/o triptófano en el fluido de cultivo celular al comienzo de la fase de producción, y mediante adiciones.
Por consiguiente, en una realización del procedimiento de la invención, la cantidad total de análogos de cisteína/cistina, cisteína, cistina y/o triptófano en el medio de cultivo celular se alcanza mediante la adición de análogos de cisteína/cistina, cisteína, cistina y/o triptófano al medio de cultivo celular:
a. al comienzo de la fase de producción,
b. una o varias veces en cualquier momento durante la fase de producción,
c. mediante adición continua durante la fase de producción, o
d. en cualquier combinación de a., b. y c.
En un aspecto independiente adicional, la invención se refiere a un medio de cultivo celular adecuado para cultivar células de mamífero que comprende éster dimetílico de N,N’-diacetil-L-cistina.
Polipéptidos recombinantes
El procedimiento de la invención se puede usar para producir cualquier tipo de proteína o polipéptido recombinante, incluidos, por ejemplo, péptidos o polipéptidos más grandes que tienen una estructura terciaria significativa, así como p. ej. glicoproteínas y proteínas multiméricas.
En algunas realizaciones, la proteína recombinante producida es una proteína que, cuando se produce en condiciones estándar, daría como resultado una preparación coloreada a alta concentración. Dicha coloración se puede reducir o evitar usando el método de la invención. Por lo tanto, en una realización preferida del método de la invención, la proteína recombinante es una proteína que no es incolora en una concentración de 10 mg/ml o más, tal como 50 mg/ml o más, cuando se produce mediante células hospedantes cultivadas en un medio de cultivo celular que no comprende análogos de cisteína/cistina, en donde el color, p. ej. se determina como se describe en los ejemplos del presente documento. Las preparaciones de proteínas, tales como anticuerpos, que se van a administrar por vía subcutánea a un paciente, a menudo tienen concentraciones de proteínas incluso más altas de, p. ej. 100 mg/ml o más, o incluso más de 150 mg/ml. A dichas concentraciones, la coloración indeseable se convierte con frecuencia en un problema. Por lo tanto, en otra realización preferida, la proteína recombinante es una proteína que, cuando es producida por células hospedantes cultivadas en un medio de cultivo celular que no comprende análogos de cisteína/cistina, no es incolora en una concentración de 100 mg/ml o más, tal como 150 mg /ml o más.
En una realización preferida, la proteína recombinante producida en el procedimiento según la invención es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
El término "anticuerpo" o "anticuerpos" como se usa en el presente documento incluye, p. ej. tanto anticuerpos monoclonales como policlonales así como anticuerpos tanto monoespecíficos como multiespecíficos, tales como biespecíficos.
Anticuerpo" o "anticuerpos" incluyen anticuerpos de cualquier especie, en particular de especies de mamíferos, que típicamente tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, anticuerpos humanos de cualquier isotipo, incluidos IgA<1>, lgA<2>, IgD, IgG<1>, lgG<2a>, lgG<2b>, lgG<3>, IgG<4>IgE e IgM y sus variantes modificadas, anticuerpos de primates no humanos, p. ej., de chimpancé, babuino, Rhesus o macaco cangrejero, anticuerpos de roedores, p. ej., de ratón, rata o conejo, anticuerpos de cabra o caballo, y derivados de los mismos, o de especies de aves tales como anticuerpos de pollo o de especies de peces como anticuerpos de tiburón. El término "anticuerpo" o "anticuerpos" también se refiere a anticuerpos "quiméricos" en los que una primera porción de al menos una secuencia de anticuerpo de cadena pesada y/o ligera es de una primera especie y una segunda porción de secuencia de anticuerpo de cadena pesada y/o ligera es de una segunda especie. Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión al antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (p. ej. mono del viejo mundo, tal como babuino, mono Rhesus o macaco cangrejero) y secuencias de regiones constantes humanas. Los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia derivada de anticuerpos no humanos. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos (anticuerpo receptor) en los que los restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable o región determinante de la complementariedad (CDR) de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como como ratón, rata, conejo, pollo o primate no humano, que tenga la especificidad, afinidad y actividad deseadas. En la mayoría de los casos, los restos del anticuerpo humano (receptor) fuera de la CDR; es decir, en la región armazón (FR), se reemplazan adicionalmente por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donador. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar más el rendimiento de los anticuerpos. La humanización reduce la inmunogenicidad de los anticuerpos no humanos en seres humanos, facilitando así la aplicación de anticuerpos al tratamiento de enfermedades humanas. Los anticuerpos humanizados y varias tecnologías diferentes para generarlos son bien conocidos en la técnica. El término "anticuerpo" o "anticuerpos" también se refiere a anticuerpos humanos, que pueden generarse como una alternativa a la humanización. Por ejemplo, se pueden producir animales transgénicos (p. ej., ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de anticuerpos murinos endógenos. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión a la cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos con especificidad contra un antígeno particular tras la inmunización del animal transgénico que lleva los genes de inmunoglobulina de línea germinal humana con dicho antígeno. Las tecnologías para producir dichos animales transgénicos y las tecnologías para aislar y producir anticuerpos humanos a partir de dichos animales transgénicos son conocidas en la técnica. Alternativamente, en el animal transgénico; p.ej. ratón, solo los genes de inmunoglobulina que codifican las regiones variables del anticuerpo de ratón se reemplazan con las correspondientes secuencias de genes de inmunoglobulina humana variable. Los genes de inmunoglobulina de la línea germinal de ratón que codifican las regiones constantes del anticuerpo permanecen sin cambios. De esta forma, las funciones efectores del anticuerpo en el sistema inmunitario del ratón transgénico y, por consiguiente, el desarrollo de células B permanece esencialmente sin cambios, lo que puede conducir a una respuesta de anticuerpos mejorada tras el desafío antigénico in vivo. Una vez que los genes que codifican un anticuerpo particular de interés se han aislado de dichos animales transgénicos, los genes que codifican las regiones constantes pueden sustituirse con genes de la región constante humana para obtener un anticuerpo completamente humano. El término "anticuerpo" o "anticuerpos" como se usa en el presente documento, también se refiere a un anticuerpo aglicosilado.
El término "fragmento de unión al antígeno del mismo” o variaciones gramaticales del mismo como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento de anticuerpo. Un fragmento de un anticuerpo comprende al menos un dominio de inmunoglobulina de cadena pesada o ligera como se conoce en la técnica y se une a uno o más antígenos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos según la invención incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')<2>y Fv y scFv; así como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio (dAb), tales como sdAb, VHH o anticuerpos de camélidos (p. ej., de camellos o llamas tales como Nanobodies®) y fragmentos VNAR, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos o multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos o anticuerpos, incluyendo, pero no limitados a, construcciones Fab-Fv o Fab-Fv-Fv. Cuando se usan en el presente documento, los fragmentos de anticuerpos también incluyen moléculas que comprenden secuencias no derivadas de inmunoglobulinas además de dominios de inmunoglobulinas, p. ej. en forma de proteínas de fusión. Los fragmentos de anticuerpos definidos anteriormente son conocidos en la técnica.
En una realización particularmente preferida, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo producido mediante los métodos según la invención es (Tabla 1):
1) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que
a. comprende CDR-H1 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 1; CDR-H2 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID n O: 2; CDR-H3 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 3; CDR-L1 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 4; CDR-L2 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 5 y CDR-L3 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 6; o
b. comprende una región variable ligera que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 7 y una región variable pesada que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 8; o
c. comprende una región variable ligera que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia definida en la SEQ ID NO: 7 y una región variable pesada que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia definida en la SEQ ID NO: 8;
d. comprende una región variable ligera que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 7 y una cadena pesada que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 11 ; o
e. comprende una región variable ligera que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia como se define en la SEQ ID NO: 7 y una cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia como se define en la SEQ ID NO: 11; o
2) un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 9 y una cadena pesada que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 10; o
3) un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia definida en la SEQ ID NO: 9 y una cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia definida en la SEQ ID NO: 10.
Las regiones determinantes de la complementariedad (''CDR'') se definen en el presente documento según la definición de Kabat. La definición de Kabat es un estándar para numerar los restos en un anticuerpo y típicamente se usa para identificar regiones CDR (Kabat et al., (1991), 5.a edición, publicación NIH n.° 91-3242).
La proteína recombinante o el anticuerpo preferido o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser producido típicamente por células hospedantes que contienen un vector que codifica el polipéptido o la secuencia de nucleótidos del anticuerpo. Los anticuerpos o fragmento de unión al antígeno de los mismos pueden comprender solo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso solo se necesita usar una secuencia codificante de polipéptido de cadena pesada o de cadena ligera para transfectar las células. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, las células pueden transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede usar un solo vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.
Etapas adicionales opcionales
El método de la invención comprende además opcionalmente una etapa de recuperación de la proteína recombinante del medio de cultivo celular. Posteriormente, la proteína recombinante puede purificarse, p. ej. si la proteína es un anticuerpo, usando cromatografía de proteína A. El método además comprende opcionalmente una etapa de formular la proteína recombinante purificada, p. ej. en una formulación con una concentración alta de proteína, tal como una concentración de 10 mg/ml o más, p. ej. 50 mg/ml o más, tal como 100 mg/ml o más, p. ej. 150 mg/ml o más. En una realización adicional, la proteína se liofiliza o se seca por pulverización. La proteína puede administrarse en forma seca a un paciente o reconstituirse en una forma líquida antes de la administración.
Productos obtenidos u obtenibles por el método de la invención
Una preparación de proteína recombinante, tal como una preparación de proteína recombinante a granel, puede ser obtenible u obtenerse mediante los métodos según la invención. Las proteínas recombinantes, preferiblemente los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos en dicha preparación así obtenida, presentan menos heterogeneidad en comparación con las mismas proteínas recombinantes obtenidas con el mismo procedimiento, pero en donde el medio no incluye análogos de cisteína/cistina. En realizaciones preferidas, la preparación es incolora.
La invención ahora se describirá adicionalmente mediante ejemplos con referencias a las realizaciones ilustradas en los dibujos que acompañan.
Ejemplos
Abreviaturas
mAb: anticuerpo monoclonal; Cys: cisteína o cistina; APG: grupo de picos ácidos; VCC: recuento de células viables; DO: oxígeno disuelto; CO<2>: dióxido de carbono; CHO: ovario de hámster chino; UPLC: cromatografía líquida de ultra rendimiento.
Ejemplo 1
Se evaluó la capacidad de los derivados de cisteína/cistina para reducir el color y las especies ácidas de una preparación de anticuerpos producida de forma recombinante por células hospedantes cultivadas en cultivo celular. Para este experimento, se utilizó un modelo a escala reducida en matraz de agitación. Se inocularon células CHO-DG44 que producían un anticuerpo de longitud completa, mAb1, en 100 ml de medio basal a una densidad de siembra de 0.35x106 células/ml, mAb1 comprende una cadena ligera que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 9 y una cadena pesada que tiene la secuencia como se define en la SEQ ID NO: 10.
Los recipientes de los matraces de agitación eran matraces de agitación (Corning) de 250 ml dispuestos en una incubadora agitada (Infors) protegidos de la luz. Las células se cultivaron durante 14 días a 36.8°C con 80% de humedad. Los cultivos celulares se agitaron a 140 rpm al inicio del procedimiento. La agitación se aumentó durante el procedimiento progresivamente hasta llegar a 250 rpm para mantener un % de DO a 40% en el matraz de agitación, como se hace en un procedimiento de biorreactor de 2 L. El cultivo celular se mantuvo a pH 7.0±0.2 disminuyendo el CO<2>en la incubadora del 5% antes del procedimiento al 2% durante el procedimiento. Las células se cultivaron en un modo semicontinuo con adición en bolo de alimentación todos los días de cultivo. El medio basal contenía cisteína 0.04 mmol/l cistina 0.38 mmol/l. La alimentación contenía cistina 153.3 mmol/l. A lo largo de toda la fase de producción de 14 días, el volumen total de alimentación añadida correspondió a 4.47% (v/v) del volumen de inicio del cultivo.
La cisteína presente en la alimentación se sustituyó por diferentes derivados de cisteína y cistina en diferentes porcentajes como se presenta en la Tabla 1. La osmolalidad se controló diariamente usando un osmómetro de Advanced Instruments. El pH fuera de línea, el O<2>disuelto y el CO<2>disuelto se controlaron diariamente usando un analizador de gases en sangre modelo BioProfile pHOx® (Nova Biomedical Corporation, Waltham, MA). Las concentraciones de metabolitos se determinaron diariamente utilizando un sistema CedexBioHT (Roche). La concentración de células viables y la viabilidad celular se midieron diariamente usando un contador de células automatizado ViCell (Beckman Coulter). El fluido de cultivo celular se recogió diariamente mediante centrifugación de 1 ml de fluido de cultivo celular para la determinación del título de anticuerpos usando HPLC de proteína A (Waters). Al final de los 14 días de cultivo, el fluido de cultivo celular se recogió por centrifugación. Después, el líquido sobrenadante se purificó utilizando una cromatografía de afinidad con proteína A (MabSelect Sure, GE). Los eluatos de proteína A se usaron para la determinación del peso molecular usando UPLC de exclusión por tamaño (Waters). El porcentaje relativo de las isoformas principales, ácidas (APG para grupo de picos de ácidos) y básicas (BPG para grupo de picos básicos) del mAb purificado se determinó por electroforesis capilar con imágenes (ProteinSimple iCE3). Otra parte de los eluatos de proteína A se concentró a 40 mg/ml usando dispositivos de filtro centrífugo Amicon centricon (Millipore).
La intensidad del color de la composición de anticuerpos concentrada se midió en los eluatos de proteína A concentrados usando un espectrofotómetro por transmisión (UltrascanPro) y se comparó con la escala CIE (Commission Internationale de L'éclairage). Los resultados numéricos se normalizaron respecto a la concentración de 40 mg/ml.
La Figura 1 muestra el perfil de crecimiento celular usando diferentes derivados de cisteína y cistina con diferente proporción de sustitución de la cisteína en la alimentación. En condiciones con 100% de derivado de Cys, el crecimiento celular se ralentizó a partir del día 6 en comparación con las condiciones de control, excepto en las condiciones de 100% de S-sulfocisteína donde las células murieron rápidamente el día 7. La concentración de células viables fue similar a las condiciones de control para las alimentaciones de 50% de derivados hasta el día 10. A partir del día 10, las densidades de células viables fueron superiores a las de las condiciones de control. Sin embargo, para 50% de S-sulfocisteína, la concentración de células viables alcanzó un máximo de 2x106 células/ml, significativamente menor que las condiciones de control. Las células no crecieron tan bien como el control cuando se sustituyó el 100% de Cys con un derivado de Cys, lo que sugiere que los derivados de cisteína no pueden sustituir completamente a la cisteína. Por otro lado, las condiciones con 50% de derivados mostraron un mejor crecimiento que las condiciones de control, sugiriendo un impacto positivo de los derivados de cisteína/cistina cuando está presente un mínimo de cisteína. La S-sulfocisteína no parece actuar como los otros derivados ensayados con respecto a permitir el crecimiento celular.
Considerando la muerte celular observada con 100% de derivados de cisteína, se analizaron otros resultados de rendimiento y calidad del producto solo para las condiciones de 50% de derivados de cisteína.
El título del producto fue mayor en cultivos que usaban 50% de derivados de cisteína que en las condiciones de control, excepto cuando el derivado usado era S-sulfocisteína (Figura 2).
El valor b* del eluato de proteína A concentrado disminuyó entre 6.5% y 21.2% en comparación con las condiciones de control, observándose el mejor resultado con 50% de éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina (Número de registro CAS 32381-28-5, p. ej., obtenible de Bachem AG) (Figura 3). Asimismo, también se observó una disminución en el nivel de variantes ácidas de entre 7.6% a 24.8% en comparación con las condiciones de control, observándose el mejor resultado con 50% de éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina (Figura 4). Esta disminución en el nivel de especies ácidas se correlacionó con un aumento de la especie con carga principal (Figura 5) sin aumento significativo del nivel de la variante básica, excepto para la S-sulfocisteína (no mostrada). Estos resultados confirmaron la reducción de la microheterogeneidad de la proteína recombinante.
Tabla 1: Diferentes composiciones de alimentaciones ensayadas
Ejemplo 2
La capacidad de los derivados de cisteína/cistina para reducir el color y las especies ácidas de una preparación de proteína recombinante en cultivo celular se evaluó usando otra línea celular productora de anticuerpos, la línea celular 2. Para este experimento se usó un modelo a escala reducida en matraz de agitación. Se inocularon células CHO-DG44 que producían un derivado de anticuerpo multiespecífico en 100 ml de medio basal a una densidad de siembra de 0.35x106 células/ml. Los recipientes de matraces de agitación eran matraces de agitación de 250 ml (Corning) dispuestos en una incubadora agitada (Infors) protegida de la luz. Las células se cultivaron durante 14 días a 36.8°C con 80% de humedad. Los cultivos celulares se agitaron a 140 rpm al inicio del procedimiento. La agitación se aumentó durante el procedimiento progresivamente hasta llegar a 250 rpm para mantener un % de DO a 40% en el matraz de agitación, como se hace en el procedimiento del biorreactor de 2 L. El cultivo celular se mantuvo a pH 7.0±0.2 disminuyendo el CO<2>en la incubadora de 5% del procedimiento a 2% durante el procedimiento. Las células se cultivaron en un modo semicontinuo con la adición en bolo de alimentación todos los días de cultivo. Los medios basales contenían cisteína 0.04 mmol/l cistina 0.38 mmol/l. La alimentación contenía cistina 153.3 mmol/l. A lo largo de toda la fase de producción de 14 días, el volumen total de alimentación añadida correspondió a 2.81% (v/v) del volumen inicial del cultivo.
La cisteína presente en la alimentación se sustituyó por diferentes derivados de cisteína y cistina con una relación de sustitución de 50% equimolar (Tabla 1). También se añadió una condición con sólo 50% de los niveles de cisteína de control para ensayar si las mejoras observadas se debían a la presencia del derivado de cisteína o solamente a la reducción de cisteína. La osmolalidad se controló diariamente usando un osmómetro de Advanced Instrument. El pH fuera de línea, el O<2>disuelto y el CO<2>disuelto se controlaron diariamente usando un Nova Biomedical Phox (Nova Biomedical). Las concentraciones de metabolitos se determinaron diariamente utilizando un sistema CedexBioHT (Roche). La concentración de células viables y la viabilidad celular se midieron diariamente usando un contador de células automatizado ViCell (Beckman Coulter). El fluido de cultivo celular se recogió diariamente mediante centrifugación de 1 ml de fluido de cultivo celular para la determinación del título de anticuerpos utilizando la medición de proteína L con Octet (Pall). Al final de los 14 días de cultivo, el fluido de cultivo celular se recogió por centrifugación. Después, el líquido sobrenadante se purificó usando una cromatografía de afinidad de proteína L (CaptoL, GE). Los eluatos de proteína L se usaron para la determinación del peso molecular usando UPLC de exclusión por tamaño (Waters) y para la determinación de variantes de carga usando isoenfoque capilar (ProteinSimple iCE3). La proteína recombinante producida con la línea celular 2 no era una molécula coloreada. Por lo tanto, en este caso no se realizó ninguna medición de color.
La Figura 6 muestra el perfil de crecimiento celular usando diferentes derivados de cisteína y cistina con una relación de sustitución de 50% de la cisteína en la alimentación. Se observaron perfiles de crecimiento celular similares entre las condiciones de control y las condiciones con derivados de cisteína y cistina. Por lo tanto, estos componentes no afectan al crecimiento celular para esta línea celular (línea celular 2). El título del producto también fue similar a las condiciones de control para todos los derivados de cisteína y cistina (Figura 7).
Como puede verse en la Figura 8, se observó una disminución en el nivel de variantes ácidas de entre 46.6% y 50.2% en comparación con las condiciones de control con los dos derivados de cistina, N,N'-diacetil-L-cistina y éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina. Se observó una disminución de 14.5% del nivel de variantes ácidas con N-acetil-cisteína. Esta disminución en el nivel de especies ácidas se correlacionó con un aumento de la especie con carga principal (Figura 9) sin aumento significativo del nivel de variantes básicas (datos no mostrados). Estos resultados confirmaron la reducción de la microheterogeneidad de la proteína recombinante por el derivado de cistina. Por otro lado, se observó un aumento entre 5% y 10% de especies ácidas con S-sulfocisteína y con la reducción de cisteína solamente.
Ejemplo 3
La capacidad de los derivados de cisteína/cistina para reducir el color y las especies ácidas de una preparación de proteína recombinante producida en cultivo celular se evaluó en un biorreactor para dos líneas celulares. Este modelo es más representativo de la producción a gran escala que el matraz de agitación debido a la geometría y al control adicional. Se inocularon células CHO-DG44 de las líneas celulares 1 y 2 en 1300 ml de medio basal a una densidad de siembra de 0.35x106 células/ml en biorreactor agitado de 2 L (Sartorius). Las células se cultivaron durante 14 días en modo semicontinuo. Los cultivos celulares se agitaron a 280 rpm y el DO se mantuvo al 40%. El cultivo celular se mantuvo a pH 7.0 ± 0.2 con una regulación automática de burbujeo de CO2. Las células se cultivaron en un modo semicontinuo con la adición en bolo de alimentación todos los días de cultivo. Los medios basales contenían cisteína 0.04 mmol/l cistina 0.38 mmol/l. La alimentación contenía cistina 153.3 mmol/l. A lo largo de toda la fase de producción de 14 días, el volumen total de alimentación añadida correspondió a 5.7% (p/p) del volumen inicial de cultivo para la línea celular 1 y a 3.1% (p/p) del volumen inicial de cultivo para la línea celular 2.
La cisteína presente en la alimentación se reemplazó por diferentes derivados de cisteína y cistina en diferentes porcentajes como se presenta en la Tabla 2. Se añadió una condición con solo 50% de cisteína para ensayar si las mejoras observadas se debían al derivado de cisteína o solamente a la reducción de cisteína. La osmolalidad se controló diariamente usando un osmómetro de Advanced instrument. El pH fuera de línea, el O<2>disuelto y el CO<2>disuelto se controlaron diariamente usando un Nova Biomedical Phox (Nova Biomedical). Las concentraciones de metabolitos se determinaron diariamente usando un sistema CedexBioHT (Roche). La concentración de células viables y la viabilidad de las células se midieron diariamente usando un contador de células automatizado ViCell (Beckman Coulter). El fluido del cultivo celular se recogió diariamente mediante centrifugación de 1 ml de fluido de cultivo celular para la determinación del título de anticuerpos por HPLC de prot A (Waters) o usando la medición de proteína L con Octet (Pall). Al final de los 14 días de cultivo, el fluido de cultivo celular se recogió por centrifugación. Después, el líquido sobrenadante se purificó usando una cromatografía de afinidad (GE) de proteína A o L. Los eluatos de proteína A o L se usaron para la determinación del peso molecular usando UPLC de exclusión por tamaño (Waters) y para la determinación de variantes de carga usando isoenfoque capilar (ProteinSimple iCE3). Otra parte de los eluatos de proteína A (sólo de la línea celular 1) se concentró a 40 mg/ml usando dispositivos de filtro centrífugo Amicon centricon (Millipore). La intensidad del color de la composición de anticuerpos concentrada se midió en los eluatos de proteína A concentrados usando un espectrofotómetro por transmisión (UltrascanPro) y se comparó con la escala CIE (Commission Internationale de L'éclairage). Los resultados numéricos se normalizaron a la concentración de 40 mg/ml.
Tabla 2: Diferentes composiciones de alimentación ensayadas con la línea celular 1 y 2 en biorreactor de 2 L
Línea celular 1
Se observaron tendencias de crecimiento celular similares para todas las condiciones ensayadas (Figura 10).
Se observó una disminución significativa del título de anticuerpos con N,N'-diacetil-cistina y N-acetil-cisteína entre 10% y 17%, pero se observó una disminución no significativa de menos de 5% con éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina (Figura 11). También se observó una disminución significativa del título solo con la alimentación de 50% de cisteína, lo que sugiere que el éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina mejora el título.
En cuanto al nivel de especies ácidas, se observó una disminución de 5% con N,N'-diacetil-L-cistina, de 10% con N-acetil-L-cisteína y de 15% con éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina (Figura 12). Esta reducción se correlacionó con un aumento de la especie principal (Figura 13). Se observó un impacto similar en la variante de carga a una escala de 2 L como en los matraces de agitación. Esta reducción también se observó con alimentación de 50% de cisteína solamente. Esto sugiere que la reducción del nivel de especies ácidas en el presente documento puede deberse a la reducción de cisteína. Se observaron disminuciones del nivel del valor b del 2.5% con N,N'-diacetil-L-cistina, 13% con N-acetil-L-cisteína y 25% con éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina. Se observó un impacto similar en la intensidad del color del producto a una escala de 2 L como en los matraces de agitación. No se observó reducción del valor b* con la alimentación de 50% de cisteína solamente. Se confirmó el impacto del éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina en la coloración.
Línea celular 2
Se observaron tendencias de crecimiento celular similares para todas las condiciones ensayadas (Figura 15).
Se observó un aumento significativo del título de anticuerpos de entre 15% a 23% con N,N'-diacetil-cistina, N-acetilcisteína y éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina (Figura 16). Este resultado es por lo tanto diferente de los resultados obtenidos en matraces de agitación.
En cuanto al nivel de especies ácidas, se observó una disminución de 8% con N,N'-diacetil-L-cistina, 13% con N-acetil-L-cisteína y 13% con éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina (Figura 17). Esta reducción se correlacionó con un aumento de las especies principales (Figura 18). Se observó una tendencia similar para las variantes de carga a una escala de 2 L en comparación con los matraces de agitación, excepto para la N-acetil-cisteína. Se confirmó el impacto de la sustitución de cisteína por éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina en las variantes de carga.
Se observó una disminución de 27% del nivel de especies ácidas con una alimentación de 50% de cisteína. Esto indica que la reducción de cisteína es el principal impulsor de la reducción de especies ácidas. Se observó un aumento del título de 10% con la alimentación de 50% de cisteína en lugar de 15% a 23% con los derivados de cisteína/cistina. La sustitución de 50% de la cisteína por un derivado de cisteína/cistina es un buen compromiso entre el aumento del título y la reducción de la heterogeneidad para esta línea celular.
Ejemplo 4
La reproducibilidad de los resultados se evaluó en biorreactor con la línea celular 1. Los experimentos del Ejemplo 3 se repitieron con un control adicional y un biorreactor con alimentación de 50% de S-sulfocisteína 50% de cisteína. Los datos de los dos experimentos se analizaron para confirmar el efecto previamente observado con derivados de cisteína/cistina.
Tabla 3: Datos usados para el análisis
No se observaron diferencias en cuanto al crecimiento celular entre los días 0 y 8. A partir del día 9, las condiciones con S-sulfocisteína tenían una mayor muerte celular que el control. La alimentación de 50% de cisteína, alimentación de 50% de N,N'-diacetil-cistina 50% de cisteína y la alimentación de 50% de N-acetil-cisteína 50% de cisteína tenían VCC más altos que las condiciones de control. Las condiciones de alimentación de 50% éster dimetílico de N,N'-diacetil-cistina 50% de cisteína fueron similares al promedio de las condiciones de control (Figura 19).
Se observó una disminución no significativa en el título de anticuerpos de menos de 5% en comparación con el promedio de los controles con el éster dimetílico de N,N'-diacetil-cistina. Sin embargo, se observó una disminución de 10% para la alimentación de 50% de cisteína. El uso de éster dimetílico de N,N'-diacetil-cisteína ha compensado así el 5% de la pérdida de título debida a la reducción de cisteína en la alimentación. Además, el mayor VCC observado con alimentación de 50% de cisteína indica un aumento de la productividad específica con éster dimetílico de N,N’diacetil-cistina en comparación con la alimentación de 50% de cisteína. Esta observación confirma que una pérdida de productividad específica debida a la reducción de cisteína puede compensarse mediante la adición de éster dimetílico de N,N'-diacetil-cistina. También se observó una disminución de 10% con N-acetil-cisteína y N,N'-diacetilcisteína. Estas moléculas no afectaron a la productividad de esta línea celular. Por otro lado, se observó una disminución de 25% en el título con S-sulfocisteína. Esto se debió a la disminución de VCC y a la disminución de la productividad debido a la reducción de cisteína, pero no a un impacto específico de la S-sulfocisteína en la productividad específica (Figura 20).
En cuanto al nivel de especies ácidas, se observó una disminución promedio de 10% con N,N'-diacetil-L-cistina y N-acetil-L-cisteína (Figura 21). Esta reducción se correlacionó con un aumento de la especie principal (Figura 22).
Se observó una reducción promedio de 15% con N,N'-diacetil-L-cistina. Esta reducción también se observa con alimentación de 50% de cisteína solamente. Esto sugiere de nuevo que la reducción del nivel de especies ácidas se debe a la reducción de los niveles de cisteína. Se observaron niveles similares de especies ácidas entre la S-sulfocisteína y las condiciones de control. Esto sugiere que la S-sulfocisteína aumentó el nivel de especies ácidas normalmente disminuido por una reducción de cisteína.
En cuanto al nivel del valor b, se observó una disminución media de 5% con S-sulfocisteína, 14% con N,N'-diacetil-L-cistina, 13% con N-acetil-L-cisteína y 30% con éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina. No se observó reducción del valor b* con la alimentación de 50% de cisteína solamente. Se confirmó el impacto del éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina en la coloración (Figura 23).
Ejemplo 5
Se ensayaron diferentes concentraciones de derivados de cisteína/cistina en la mejora en el nivel de APG de una preparación de proteína recombinante producida en cultivo celular cultivado en minibiorreactores. Se inocularon células CHO-DG44 de la línea celular 1 en 12 ml de medio basal a una densidad de siembra de 0.35x106 células/ml en biorreactores Ambr15 (Sartorius). Las células se cultivaron en modo semicontinuo durante 14 días. El DO se mantuvo al 40% y el pH se mantuvo en 7.0 ± 0.2 con una regulación automática de burbujeo de CO<2>. La concentración de células viables y la viabilidad de las células se midieron diariamente usando un contador de células automatizado ViCell (Beckman Coulter). Las células se cultivaron en un modo semicontinuo con adición de un bolo diario de alimentación. El medio basal contenía cisteína 0.04 mmol/l cistina 0.38 mmol/l. La alimentación contenía cistina 153.3 mmol/l. A lo largo de toda la fase de producción de 14 días, el volumen total de alimentación añadida correspondió a 4.7% (v/v) del volumen inicial del cultivo.
Los diferentes porcentajes de cisteína presentes en la alimentación se sustituyeron por diferentes análogos de cisteína y cistina. La Tabla 4 proporciona una visión general de los diferentes porcentajes ensayados y su equivalencia en relación molar respecto a la cisteína o la cistina. P. ej. para la N-acetil-L-cisteína 10% significa que una cantidad molar equivalente al 10% de cisteína se ha sustituido por una cantidad molar de 10% de N-acetil-L-cisteína; para N,N'-diacetil-L-cistina, 10% significa que una cantidad molar equivalente de 10 de cistina se ha sustituido por una cantidad molar de 10% de N,N'-diacetil-L-cistina. Al final de los 14 días de cultivo, el fluido de cultivo celular se recogió por centrifugación. Después, el líquido sobrenadante se purificó utilizando una cromatografía de afinidad (GE) con proteína A. Los eluatos de proteína A se usaron para la determinación de variantes de carga usando isoenfoque capilar (ProteinSimple iCE3).
Tabla 4: Diferentes composiciones de alimentación ensayadas con la línea celular 1 en el biorreactor Ambr15
* para N-acetil-L-cisteína, el % de sustitución es considerando el equivalente de cisteína
La Figura 24 muestra los perfiles de crecimiento de las células. Se observó un perfil de concentración de células viables similar entre las condiciones de control (sin análogo añadido) y la mayoría de las condiciones ensayadas. Se observó inhibición del crecimiento con 90% de N,N'-diacetil-L-cistina y 90% de éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina.
Las Figuras 25 y 26 representan la respuesta a diferentes niveles de sustitución de cisteína/cistina de la N,N'-diacetil-L-cistina, éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina o N-acetil-cistina, en especies ácidas y nivel de especie con carga principal. Para la N,N'-diacetil-L-cistina, el nivel de especies ácidas se reduce con el aumento del porcentaje de sustitución para alcanzar una reducción máxima de 27.5%. Esta reducción de la microheterogeneidad se confirma por la diferencia positiva con respecto al control observado en el nivel de especie con carga principal. El nivel óptimo de especie con carga principal con éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina se obtuvo entre 50% y 70% de sustitución de cisteína/cistina. Sin embargo, el éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina tiene un impacto positivo en el nivel de especie con carga principal de entre 15% y 90% según la curva de ajuste. Este resultado se confirma por la disminución del nivel de especies ácidas que también se observa con el éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina en la Figura 25. Se observó menor impacto con N-acetil-cisteína con un valor óptimo en torno a 70% de sustitución con una disminución de especies ácidas de 12.5%.
Claims (12)
1. Un método para producir una preparación de proteína recombinante, en donde el método comprende las etapas de: (i) inocular células hospedantes en un medio basal, en donde el medio basal comprende una cantidad inicial de: (a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
(ii) hacer progresar el cultivo a través de una fase de producción en donde las células producen la proteína recombinante, en donde, durante dicha fase de producción, el medio de cultivo celular se complementa con:
(a) análogos de cisteína/cistina; y
(b) cisteína y/o cistina,
en donde (a) y (b) se pueden añadir simultánea o secuencialmente, en donde los análogos de cisteína/cistina se seleccionan del grupo que consiste en éster dimetílico de N,N'-diacetil-L-cistina, N-acetil-L-cisteína y N,N'-diacetil-L-cistina, y
en donde, cuando se suman los contenidos del medio basal y los complementos totales añadidos, la relación molar de (a) a (b) es entre 1:10 y 10:1.
2. El método según la reivindicación 1, en donde dicha relación molar de (a) a (b) es entre 1:8 y 8:1, tal como entre 1:6 y 6:1, p. ej. entre 1:4 y 4:1, tal como entre 1:3 y 3:1, p. ej. entre 1:2 y 2:1, tal como entre 1.5:1 y 1:1.5 o es 1:1.
3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende las etapas de: (i) inocular células hospedantes en un medio basal, en donde el medio basal comprende una cantidad inicial de: (a) análogos de cisteína/cistina; y/o
(b) cisteína y/o cistina,
(ii) hacer progresar el cultivo a través de una fase de producción en donde las células producen la proteína recombinante, en donde, durante dicha fase de producción, el medio de cultivo celular se complementa con:
(a) análogos de cisteína/cistina; y
(b) cisteína y/o cistina,
en donde (a) y (b) se pueden añadir simultánea o secuencialmente,
en donde, cuando se suman los contenidos del medio basal y los complementos totales añadidos, la cantidad molar de (a) considerando la cantidad molar total de (a) y (b) es de 10 a 90 por ciento, en donde en caso de que se use un análogo de cisteína, la cantidad molar de (b) se calcula considerando el equivalente de cisteína; y
en donde en caso de que se use un análogo de cistina, la cantidad molar de (b) se calcula considerando el equivalente de cistina.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la concentración de (b) en dicho medio basal es equivalente a entre 0.05 y 5 mmol/l de cisteína, tal como entre 0.1 y 1 mmol/l, p. ej. entre 0.2 y 0.6 mmol/l.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde, durante la fase de producción, el medio se complementa con (a) análogos de cisteína/cistina y (b) cisteína y/o cistina, en donde la suma de (a) y (b) añadida al cultivo a lo largo de toda la fase de producción es equivalente a entre 1 y 75 mmol/l de cisteína, tal como entre 2 y 20 mmol/l.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde, durante la fase de producción, el medio se complementa diariamente con (a) análogos de cisteína/cistina y (b) cisteína y/o cistina, en donde la adición diaria lleva la concentración de (a) (b) a una concentración equivalente a entre 0.05 y 5 mmol/l de cisteína, tal como entre 0.1 y 1 mmol/l.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células hospedantes son células de mamífero, preferiblemente células CHO.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína recombinante es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es:
i) un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que
a. comprende la CDR-H1 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 1; CDR-H2 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 2; CDR-H3 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 3; CDR-L1 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 4; CDR-L2 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 5 y CDR-L3 que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 6; o
b. comprende una región variable ligera que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 7 y una región variable pesada que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 8; o
c. comprende una región variable ligera que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia como se define en la SEQ ID NO: 7 y una región variable pesada que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia definida en la SEQ ID NO: 8;
d. comprende una región variable ligera que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 7 y una cadena pesada que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 11; o
e. comprende una región variable ligera que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia definida en la SEQ ID NO: 7 y una cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia definida en la SEQ ID NO: 11; o
ii) un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 9 y una cadena pesada que tiene la secuencia definida en la SEQ ID NO: 10; o
iii) un anticuerpo que comprende una cadena ligera que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia definida en la SEQ ID NO: 9 y una cadena pesada que tiene al menos 80% de identidad o similitud, preferiblemente 90% de identidad o similitud con la secuencia definida en la SEQ ID NO: 10.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína recombinante es una proteína que no es incolora en una concentración de 10 mg/ml o más, tal como 50 mg/ml o más, cuando es producida por células hospedantes cultivadas en un medio de cultivo celular que no comprende análogos de cisterna/ cistina.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método comprende la etapa de recuperar la proteína recombinante del medio de cultivo celular y una etapa adicional de purificar la proteína recombinante.
12. El método según la reivindicación 11, en donde el método comprende además la etapa de formular la proteína recombinante purificada.
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