MXPA06002589A

MXPA06002589A - Metodos para producir proteinas recombinantes.

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Publication number: MXPA06002589A
Application number: MXPA06002589A
Authority: MX
Inventors: Dominic Gambier Reeks
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Priority date: 2003-09-09
Filing date: 2004-09-02
Publication date: 2006-06-05
Also published as: CA2536099C; KR20060125704A; ES2339352T3; JP4568722B2; IL173474A0; US7754447B2; BRPI0413813A; EP1664278A1; US20080044817A1; AU2004270929A1; SG145696A1; ATE454444T1; USRE44512E1; WO2005024000A1; GB0321100D0; AU2004270929B2; DE602004025011D1; NO20061576L; CN1849389B; PL1664278T3

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para controlar la particion de una proteina recombinate entre el sobrenadante y el periplasma en cultivos de celulas huesped de E.coli en el que la expresion de la proteina recombinante por dichas celulas esta bajo el control de un sistema inducible, comprendiendo dicho metodo: a) proporcionar un cultivo de celulas huesped de E.coli b) modificar la tasa de crecimiento de las celulas huesped de E.coli c) inducir la expresion de la proteina recombinate donde los pasos (b) y (c) se pueden realizar en cualquier orden o simultaneamente; y a continuacion d) determinar el rendimiento de la proteina recombinante en el sobrenadante del cultivo y en el periplasma de las celulas huesped de E.coli e) comparar el rendimiento determinado en el paso (d) con el rendimiento determinado al utilizar al menos otra tasa de crecimiento en el paso (b) f) seleccionar una tasa de crecimiento de la comparacion hecha en el paso (e) a la cual la particion de la proteina recombinate entre el sobrenadante y el periplasma sea la mas adecuada para la recuperacion primaria de la proteina recombinante.

Description

WO 2005/024000 Al ?? ? ? M lil U ? 1 ' ? ft l l lt 11 ti ?G ? G??? Fublished: For two-letter codes and other abbreviations, referto the "Guid- — with intemational search report ance Notes on Codes an Abbreviations" appearing at the begin- — befare, the expiration of the time limit for amending the ning of each regular issue oflhe PCT Gazptte. claims and to be repuhlished in the event of receipt of amendments 1 METODOS PARA PRODUCIR PROTEINAS RECOMBINANTES Campo de la invención La presente invención se relaciona en general con métodos para producir proteínas recombinantes en cultivos de células huésped de Escherichia coli y más específicamente proporciona un método para controlar la partición de dichas proteínas entre el periplasma de las células huésped de E.coli y el sobrenadante, del cultivo. Antecedentes de la invención La E. coli es un sistema conveniente y ampliamente utilizado para la producción de proteínas recombinantes . Las ventajas de este sistema comprenden la facilidad de manipulación de los genes, la disponibilidad de reactivos incluidos los vectores de expresión génica, la facilidad para producir cantidades de proteína, la velocidad y la gran adaptabilidad del sistema para expresar una amplia variedad de proteínas. Para un análisis, consulte Baneyx, Current Opinión in Biotechnology, 1999, 10, 411-421. Actualmente la E. coli se utiliza mucho para la producción a gran escala de proteínas terapéuticas como la insulina, la hormona del crecimiento y los anticuerpos (Swartz, Current Opinión in Biotechnology, 2001, 12, 195-201; Humphreys y Glover, Current Opinión in Drug Discovery and Development, 2001, 4, 172-185; Verma et al., Journal of Immunological Methods, 1998, 216, REF. : 169802 2 165-181; Simmons et al., Journal of Immunological Methods, 2002 , 263, 133-147) . La expresión de cualquier gen extraño en E. coli comienza con la inserción de una copia del ADNc del gen en un vector de expresión. Se dispone de muchas formas de vectores de expresión. Tales vectores comprenden en general un origen plasmídico de la replicación del ADN, un marcador para antibiótico que se puede elegir y un promotor y terminador transcripcional separado por un sitio de multiclonación (cassette de expresión) y una secuencia de ADN que codifica al menos un sitio de unión "del ribosoma. La transcripción del gen extraño se controla en general mediante un promotor regulable, que permite separar la multiplicación celular de la síntesis del producto dando como resultado mayores rendimientos que si la proteína se expresara constitutivamente. Se puede lograr el máximo rendimiento de la proteína determinando el momento óptimo durante la fermentación para inducir la expresión, en general una vez que las células se hayan multiplicado hasta una elevada densidad celular. Las proteínas recombinantes expresadas en E.coli se pueden producir en el citoplasma, o secretar en el periplasma o el sobrenadante según la naturaleza de la proteína y sus requerimientos de plegado (Makrides, Microbiological Revie s, 1996, 60, 512-538) . Por ejemplo, las proteínas se pueden dirigir al periplasma a través de una secuencia-señal y la 3 expresión en el periplasma puede ofrecer varias ventajas sobre la expresión en el citoplasma, que incluyen menores cantidades de proteínas de las células huésped, menos degradación de la proteína recombinante y un ambiente oxidante que facilita el adecuado plegado de la proteína. Aunque el rendimiento de la proteína durante la fermentación es un factor clave que influye en el costo de la producción de proteínas recombinantes en E.coli, el costo del proceso que sigue (DSP) de la proteína producida también es importante al determinar el costo inal de los productos . El término DSP abarca todos los pasos posteriores a la fermentación de la E.coli que dan lugar a la proteína funcional purificada final. Según la localización celular de la proteína recombinante producida, estos pasos pueden incluir en general los pasos de recuperación primaria como centrifugación, filtración, extracción y los pasos de concentración/diafiltración seguidos de uno o más pasos de purificación. La maximización de la eficiencia de estos pasos para obtener un alto rendimiento de la proteína funcional es clave para reducir al mínimo los costos durante la producción a gran escala de proteínas recombinantes. La naturaleza de los pasos de recuperación primaria utilizados durante el DSP afectará al rendimiento y a la calidad de la proteína recombinante obtenida y dependerá de varios factores que incluyen la escala de producción, la naturaleza de la 4 proteína y su localización celular al final de la fermentación. Por ejemplo, una consideración importante para las proteínas recombinantes producidas en el periplasma es el nivel de fuga de la proteína recombinante hacia el sobrenadante, ya que se produce un nivel de fuga natural durante la fermentación y esto puede tener un efecto perjudicial sobre el rendimiento y la calidad de la proteína recombinante obtenida del periplasma. Cuando pasan altos niveles de proteína recombinante al sobrenadante la viscosidad de éste aumenta, dificultando la recuperación primaria de las células mediante centrifugación o filtración y por consiguiente reduciendo el rendimiento de la proteína obtenida del periplasma. Las células mismas son también menos consistentes durante la centrifugación y tienen mayor probabilidad de lisarse dañando a la proteína y aumentando los niveles de proteína en el sobrenadante, con lo cual se reduce nuevamente el rendimiento . Un problema adicional es que la calidad de la proteína recuperada del periplasma durante la extracción también puede disminuir por contaminación con proteína recombinante proveniente del sobrenadante que puede no estar correctamente plegada o puede estar parcialmente degradada. Por consiguiente es aconsejable mejorar la eficiencia de la recuperación primaria de proteínas recombinantes y en consecuencia mejorar el rendimiento y la calidad finales de 5 la proteína funcional obtenida controlando la partición de las proteínas recombinantes entre el periplasma y el sobrenadante . Breve descripción de la invención En la presente invención, hemos podido demostrar que es posible controlar la partición de las proteínas recombinantes entre el sobrenadante y el periplasma en cultivos de células huésped- de E.coli mediante el ajuste de la tasa de crecimiento de las células huésped de E.coli. Seleccionando una tasa de crecimiento adecuada basada en la partición de la proteína entre el sobrenadante y el periplasma y no necesariamente sólo en el rendimiento, se puede aumentar la calidad y/o el rendimiento de la proteína producida. Descripción detallada de la invención Por lo tanto de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para controlar la partición de una proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma en cultivos de células huésped de E. coli en el que la expresión de la proteína recombinante por dichas células está bajo el control de un sistema inducible, comprendiendo dicho método: a) proporcionar un cultivo de células huésped de E.coli b) modificar la tasa de crecimiento de las células huésped de E.coli c) inducir la expresión de la proteína recombinante donde los pasos (b) y (c) se pueden realizar en cualquier orden o simultáneamente; y a continuación d) determinar el rendimiento de la proteína recombinante en el sobrenadante del cultivo y en el periplasma de las células huésped de E.coli e) comparar el rendimiento determinado en el paso (d) con el rendimiento determinado al utilizar al menos otra tasa de crecimiento en el paso (b) f) seleccionar una tasa de crecimiento de la comparación hecha en el paso (e) a la cual la partición de la proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma sea la más adecuada para la recuperación primaria de la proteína recombinante .

La protelna recombinante a utilizar en la presente invención puede ser cualquier péptido, polipéptido o proteína que tenga más de diez aminoácidos, aproximadamente. La proteína puede proceder de cualquier origen incluidas las bacterias pero más en particular puede proceder de mamíferos. En un ejemplo la proteína recombinante es un anticuerpo. El término "anticuerpo" como se usa aqui se refiere a cualquier molécula de inmunoglobulina de cualquier clase como IgG, IgE, IgM, IgD e IgA, por ejemplo un miembro de la clase de IgG, p. ej . IgGl y también cualquier fragmento de inmunoglobulina de unión al antígeno, como los fragmentos Fv, Fab, Fab' y 7 F(ab')2t Y todos los derivados de éstos, como los fragmentos de cadena única Fv. Estos anticuerpos y sus fragmentos pueden ser de origen natural, humanizados, quiméricos o anticuerpos COR injertados y se pueden usar las técnicas corrientes de biología molecular para modificar, agregar o suprimir aminoácidos o dominios según se desee . Los métodos para crear estas moléculas de anticuerpo son bien conocidos por los técnicos en la materia (consulte por ejemplo, Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc . Nati. Acad. Sci . EE.UU., 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al, 1988, Science, 242, 423; Queen et al., US 5.585.089; Adair, WO91/09967; Mountain y Adair, 1992, Biotechnol . Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181) . Las células huésped de E.coli a utilizar en la presente invención pueden ser cepas de E.coli de origen natural o mutadas capaces de producir proteínas recombinantes . Los ejemplos de cepas huésped de E.coli específicas incluyen C4100, TG1, TG2 , DHB4 , DH5a, DH1, BL21, XLIBlue y JM109. Los ejemplos también incluyen cepas de E.coli modificadas, por ejemplo mutantes metabólicos y cepas deficientes en proteasas. Una E. coli huésped preferida es la E. coli W3110 (ATCC 27,325), una cepa huésped comúnmente utilizada para las fermentaciones de proteínas recombinantes . 8 La protelna recombinante de la presente invención se expresa en general o en el periplasma de las células huésped de E.coli o en el sobrenadante del cultivo de células huésped, dependiendo de la naturaleza de la proteína y de la escala de producción. Los métodos para dirigir las proteínas a estos compartimientos son bien conocidos por los técnicos en la materia, para un análisis consulte Makrides, Microbiological Reviews, 1996, 60, 512-538. Los ejemplos de secuencias-señal adecuadas para dirigir - las proteínas al periplasma de E.coli incluyen las secuencias-señal de E.coli PhoA, OmpA, OmpT, LamB y OmpF. Las proteínas se pueden dirigir al sobrenadante basándose en las vías secretorias naturales o mediante inducción de una pérdida limitada de la membrana externa para causar secreción de las proteínas, ejemplos de lo cual son el uso del líder para pelB, líder para la proteína A, la coexpresión de la proteína de liberación de bacteriocina, la proteína de liberación de bacteriocina inducida por mitomicina junto con el agregado de glicina al medio de cultivo y la coexpression del gen kil para la permeabilizacion de la membrana. En la presente invención la expresión de la proteína recombinante en las células huésped de E.coli está bajo el control de un sistema inducible. El término "sistema inducible" como se usa aquí se refiere a un sistema de expresión inducible mediante el cual la expresión de la 9 proteína recombinante en E.coli está bajo el control de un promotor inducible. Muchos promotores inducibles adecuados para usar en E.coli son bien conocidos por los técnicos en la materia y, dependiendo del promotor, la expresión de la proteína recombinante puede ser inducida variando factores como la temperatura o la concentración de una sustancia particular en el medio de cultivo (Baneyx, supra; Goldstein y Doi, 1995, Biotechnol.Annu.Rev, 105-128) . Los ejemplos de promotores inducibles incluyen los promotores de E.coli lac, tac, y trc que se pueden inducir con lactosa o el análogo de lactosa no hidrolizable, isopropil-p-D-l-tiogalactopiranosido (IPTG) , y los promotores phoh, trp y araBAD que son inducidos por fosfato, triptofano y L-arabinosa respectivamente. El término "que induce la expresión" como se usa aquí se refiere al punto en el que se inicia la inducción mediante, por ejemplo, la adición de un inductor o un cambio en la temperatura cuando la inducción es dependiente de la temperatura. Donde se logra la inducción de la expresión de la proteína recombinante mediante la adición de un inductor al cultivo, el inductor se puede agregar por cualquier método adecuado dependiendo del sistema de fermentación y del inductor, por ejemplo, mediante una o múltiples adiciones de inyecciones o por una adición gradual del inductor a través de una alimentación. Se apreciará que puede haber una demora entre la adición del inductor y la inducción real de la 10 expresión de la proteína, por ejemplo cuando el inductor es lactosa puede haber una demora antes de que ocurra la inducción de la expresión de la proteína mientras se utiliza toda fuente de carbono preexistente antes que la lactosa. Los cultivos de células huésped de E.coli de la presente invención se pueden cultivar en cualquier medio que soporte la multiplicación de la E.coli y la expresión de la proteína recombinante . El medio puede ser cualquier medio químicamente definido, como los provistos en Pirt S.J. (1975) Principies of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publícations, con modificaciones cuando corresponda para controlar la tasa de crecimiento según se describe aquí. Un e emplo de un medio adecuado es ^SM6E' según lo descrito por Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320. El cultivo de células huésped de E. coli puede tener lugar en cualquier recipiente adecuado como un matraz con agitación o un termentador dependiendo de la escala de producción requerida. Existen varios termentadores de gran escala con una capacidad desde más de 1.000 litros hasta cerca de 100.000 litros. Preferentemente se usan los termentadores de 1.000 a 50.000 litros, más preferentemente de 1.000 a 10.000 litros. También se pueden usar fermentadores de menor escala con una capacidad entre 0,5 y 1.000 litros. La fermentación de E.coli se puede realizar en cualquier 11 sistema adecuado, por ejemplo de modo continuo, discontinuo o semicontinuo (fed-batch) (Thiry y Cingolani, 2002 , Trends in Biotechnology, 20, 103-105) dependiendo de la proteína y de los rendimientos necesarios . Se puede usar el modo discontinuo con adiciones de inyecciones de nutrientes o de inductores cuando sea necesario. Alternativamente, se puede usar un cultivo semicontinuo (fed-batch) y, por ejemplo, usar los cultivos crecidos preinducción en modo discontinuo a la máxima tasa de crecimiento específica que pueda mantenerse usando los nutrientes inicialmente presentes en el termentador y uno o más regímenes de alimentación de nutrientes para controlar la tasa de crecimiento post inducción hasta que la fermentación se complete. También se puede usar preinducción en el modo semicontinuo (fed-batch) para controlar el metabolismo de las células huésped de E. coli y para permitir alcanzar mayores densidades celulares (Lee, 1996, Tibtech, 14, 98-105) . En la presente invención las células se cultivan a cualquier tasa de crecimiento adecuada antes de la inducción de la expresión de la proteína. Para lograr una elevada tasa de crecimiento las células huésped de E.coli se cultivan en general en cultivos cuyos niveles de nutrientes, fuente de carbono, condiciones de temperatura y de oxígeno permiten dicho crecimiento. Preferentemente, en la presente invención las células huésped de E.coli se cultivan en condiciones 12 ilimitadas de nutrientes a una alta tasa de crecimiento para obtener una densidad celular elevada antes de la inducción de la expresión de la proteína recombinante . El crecimiento se puede medir de varias maneras diferentes, la más común de las cuales consiste en medir el aumento de la densidad celular midiendo el aumento de la densidad óptica a 600 nm con el paso del tiempo. La tasa de crecimiento específica se puede determinar trazando el logaritmo natural de las medidas de D060o frente al tiempo. Las mediciones del crecimiento se pueden tomar en todo el cultivo, por ejemplo, mediante medición en línea o tomando muestras de los cultivos a intervalos regulares durante la fermentación.

Preferentemente se obtiene una elevada densidad celular antes de inducir la expresión de la proteína recombinante. Los ejemplos de densidades adecuadas a las cuales se puede inducir la expresión de la protelna varían desde aproximadamente 60 a aproximadamente 100 de D060o - En el paso (b) del método de la presente invención se modifica la tasa de crecimiento en comparación con la tasa de crecimiento de los cultivos de E.coli proporcionada en el paso (a) del método. El cambio en la tasa de crecimiento en el paso (b) puede tener lugar en cualquier momento antes de la inducción de la expresión de la proteína en el paso (c) , al mismo tiempo que la inducción de la expresión de la proteína o después de la inducción de la expresión de la 13 proteína. En un ejemplo, donde la tasa de crecimiento se modifica antes del paso (c) , los cultivos se hacen crecer a una tasa de crecimiento alta en el paso (a) del método hasta que se alcanza una elevada densidad celular, después de lo cual se modifica la tasa de crecimiento y se induce la expresión de la proteina una vez que se observa el cambio de tasa de crecimiento deseado. En tal ejemplo la tasa de crecimiento se modifica entre aproximadamente 1 y 3 horas antes de la inducción de la expresión de la proteína. En otro ejemplo los cultivos se hacen crecer a una tasa de crecimiento alta en el paso (a) del método y la expresión de la proteína se induce en el paso (c) del método, después de lo cual la tasa de crecimiento se modifica en el paso (b) del método. En tal ejemplo la tasa de crecimiento se modifica entre aproximadamente 1 y 3 horas después del paso (c) . En otro ejemplo las células se cultivan a una tasa de crecimiento alta en el paso (a) del método y los pasos (b) y (c) tienen lugar simultáneamente, es decir aproximadamente al mismo tiempo de modo que la tasa de crecimiento se modifica en el punto de inducción. La tasa de crecimiento de las células huésped de E.coli se puede controlar por varios métodos diferentes bien conocidos por los técnicos en la materia dependiendo del sistema de fermentación (Consulte por ejemplo Lee 1996, Tibtech, 14, 98-105). Los métodos adecuados para controlar la 14 tasa de crecimiento incluyen cambios en la temperatura, los niveles de oxígeno y los niveles de nutrientes disponibles. Los cambios de temperatura, los niveles de oxígeno o las concentraciones de los nutrientes adecuados necesarios para lograr una tasa de crecimiento específica pueden ser determinados empíricamente por un técnico con experiencia en la materia probando un rango de concentraciones y midiendo el efecto sobre la tasa de crecimiento. En un ejemplo, se puede usar la concentración de los nutrientes como nitrógeno y fosfato presente al comienzo de la fermentación para controlar la tasa de crecimiento dependiendo del punto durante la inducción en el cual se agota el nutriente . En un ejemplo particular de la presente invención la fuente de nutrientes que controla la tasa de crecimiento es fosfato. Las concentraciones de fosfato adecuadas se proporcionan en estos ejemplos y son conocidas por los técnicos en la materia (Consulte, por ejemplo, Pirt, S.J. (1975) Principies of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publications) . Los ejemplos de concentraciones de fosfato adecuadas presentes en la fermentación inicial incluyen los del rango de 25 a 40 mM. En consecuencia, en un ejemplo de la presente invención la tasa de crecimiento en el paso (b) se modifica ajustando el nivel de fosfato de que disponen las células al comienzo de la fermentación. En otro ejemplo la tasa de crecimiento se puede ajustar modificando la 15 concentración de los nutrientes como carbono o nitrógeno agregados al cultivo por ejemplo a través de una alimentación o mediante adiciones de inyecciones . En otro ejemplo de la presente invención, la tasa de crecimiento en el paso (b) se modifica ajustando el nivel de carbono de que disponen las células huésped de E.coli. El nivel de la fuente de carbono disponible para las células se puede aumentar o disminuir para lograr el cambio necesario en la tasa de crecimiento. Preferentemente la tasa de crecimiento se controla ajustando la velocidad de alimentación de la fuente de carbono en el cultivo. El término "fuente de carbono" como se usa aquí se refiere a la fuente de carbono que está disponible como fuente de energía para la E. coli durante el cultivo e incluye azúcares como glucosa, lactosa, sacarosa y fructosa y otras fuentes de carbono como glicerol, succínato y lactato. En una materialización preferida de la presente invención la fuente de carbono es glicerol. Preferentemente las células huésped se cultivan en un fermentador semicontinuo (fed-batch) y la fuente de carbono es glicerol proporcionado a una velocidad de alimentación adecuada para lograr la tasa de crecimiento necesaria. Las velocidades de alimentación de glicerol adecuadas son bien conocidas por los técnicos en la materia e incluyen las descritas en los ejemplos que se proporcionan aquí. Los ejemplos de las velocidades de alimentación de 16 glicerol adecuadas incluyen las del rango de 0,5 a 11 ml/h. El término "partición" como se usa aquí se refiere a la distribución de la proteína recombinante entre el periplasma de las células huésped de E. coli y el sobrenadante en el cual se cultivan. Para determinar la partición de la proteína recombinante se determina el rendimiento en el periplasma y en el sobrenadante en el paso (d) del método. El rendimiento se puede determinar tomando muestras a intervalos de tiempo adecuados en todo el cultivo de células huésped de E.coli, por ejemplo aproximadamente cada 2 a 4 horas, o alternativamente en el momento de la cosecha, por ejemplo aproximadamente 24 a 36 horas después de la inducción. Los técnicos en la materia conocen muchos métodos de cuantificación de proteínas que incluyen métodos como electroforesis en gel, HPLC, cromatografía y métodos de inmunodetección como la inmunotransferencia de tipo Western y ELISA. Por ejemplo, las concentraciones de Fab' en los extractos periplásmicos y en los sobrenadantes de los cultivos se' pueden determinar por ELISA de la unidad Fab' según se describe en Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320. En el método de la presente invención los rendimientos de proteína recombinante en el sobrenadante y en el periplasma de las células huésped de E.coli cultivadas a dos o más tasas de crecimiento diferentes en el paso (b) se 17 comparan en el paso (e) del método a fin de encontrar la tasa de crecimiento que dé lugar a la partición más adecuada para la recuperación primaria de la proteína producto. Preferentemente los rendimientos comparados en el paso (e) se determinan en el paso (d) aproximadamente en el mismo momento después de la inducción para cada tasa de crecimiento. Se apreciará que esto puede no siempre ser posible, especialmente para los cultivos que crecen a tasas de crecimiento superiores donde la biomasa máxima se alcanza antes que en los cultivos que crecen a tasas de crecimiento inferiores. El cambio en la tasa de crecimiento en el paso (b) del método puede ser un aumento o una disminución de la tasa de crecimiento. El cultivo proporcionado en el paso (a) puede estar creciendo a cualquier tasa de crecimiento adecuada ya sea en condiciones ilimitadas o limitadas de nutrientes. Preferentemente el cultivo proporcionado en el paso (a) está creciendo en condiciones ilimitadas de nutrientes a la máxima tasa de crecimiento específica posible en esas condiciones. En un ejemplo la tasa de crecimiento de las células huésped de E.coli en el paso (a) está entre aproximadamente 0,1 y 0,25/h, preferentemente entre 0,13 y 0,22/h. Preferentemente la tasa de crecimiento se reduce en el paso (b) del método. La tasa de crecimiento se puede reducir a cualquier tasa adecuada por encima de 0/h, preferentemente entre 0/h y la tasa de crecimiento proporcionada en el paso (a) . Las tasas 18 de crecimiento adecuadas se pueden identificar empíricamente probando al menos dos tasas de crecimiento diferentes y comparándolas en el paso (e) del método. Cada tasa de crecimiento se puede probar en dos o más cultivos separados que se hagan crecer en paralelo y/o sucesivamente. En un ejemplo, al menos dos cultivos se hacen crecer simultáneamente usando en cada cultivo una tasa de crecimiento diferente en el paso (b) . En otro ejemplo, al menos dos cultivos se hacen crecer consecutivamente usando en cada cultivo una tasa de crecimiento diferente en el paso (b) . Alternativamente se pueden probar dos o más tasas de crecimiento diferentes en un único cultivo llevando a cabo los pasos (a) a (d) usando una tasa de crecimiento en el paso (b) y luego llevando a cabo los pasos (b) y (d) por lo menos una vez más variando la tasa de crecimiento en el paso (b) cada vez. Se apreciará que si no se identifica ninguna tasa de crecimiento adecuada en el paso (e) del método entonces se pueden probar más tasas de crecimiento repitiendo los pasos (a) a (d) del método. En general se probará un rango de diferentes tasas de crecimiento entre 0/h y la tasa de crecimiento de los cultivos en el paso (a) . En primer lugar el rango de las diferentes tasas de crecimiento probadas puede abarcar una amplia gama de tasas de crecimiento altas y bajas que luego se puede estrechar si es necesario repitiendo los pasos (a) a (d) del método, usando una gama más estrecha 19 de tasas de crecimiento en el paso (b) . Las tasas de crecimiento adecuadas para probar en primer lugar pueden ser por ejemplo entre aproximadamente 2 y 200 veces menores que la tasa de crecimiento en las condiciones ilimitadas de nutrientes. En un ejemplo, la tasa de crecimiento es entre aproximadamente 5 y 200 veces menor que la tasa de crecimiento en las condiciones ilimitadas de nutrientes. Alternativamente, en primer lugar el rango de las diferentes tasas de crecimiento probadas puede ser un rango estrecho, por ejemplo de tasas de crecimiento altas o bajas que se puede ampliar posteriormente si es necesario repitiendo los pasos (a) a (d) del método usando un rango más amplio de tasas de crecimiento en el paso (b) . Las tasas de crecimiento adecuadas para probar en primer lugar pueden ser por ejemplo entre aproximadamente 2 y 50 veces menores que la tasa de crecimiento en las condiciones ilimitadas de nutrientes o entre aproximadamente 100 y 200 veces menores. En un ejemplo, la tasa de crecimiento es entre aproximadamente 5 y 20 veces menor que la tasa de crecimiento en condiciones ilimitadas de nutrientes. Las tasas de crecimiento adecuadas para el paso (b) pueden incluir tasas de crecimiento en el intervalo de 0,0005 a 0,04/h. Una vez que se ha comparado la partición de la proteína recombinante a dos o más tasas de crecimiento diferentes se selecciona la tasa de crecimiento más adecuada para la 20 recuperación primaria de la proteína recombinante en el paso (f) del método. El término "recuperación primaria" como se usa aquí se refiere a los pasos de recuperación inicial necesarios para producir un sobrenadante exento de células o un extracto periplásmico adecuado para los pasos de purificación posterior. Los ejemplos de los pasos de recuperación primaria incluyen centrifugación, filtración, extracción o lisis celular, homogeneizacíón, concentración, diafiltración y adsorción en lecho expandido. La tasa de crecimiento más adecuada para la recuperación primaria de la proteína será la tasa de crecimiento que dé lugar al mejor rendimiento y/o la mejor calidad de la proteína después de uno o más pasos de recuperación primaria. El término 'calidad' como se usa aquí se refiere a la integridad de la proteína obtenida, si está intacta y/o correctamente plegada. De manera importante la tasa de crecimiento más adecuada puede no ser la tasa de crecimiento que dé lugar al máximo rendimiento de proteína recombinante en el cultivo de células huésped de E.coli sino en cambio ser la tasa de crecimiento que dé lugar a la mejor partición de la proteína entre el periplasma y el sobrenadante, lo cual dará como resultado una proteína de mejor calidad y/o mayores rendimientos después de uno o más pasos de recuperación primaria. En consecuencia la tasa de crecimiento seleccionada en el paso (f) puede ser un equilibrio entre el rendimiento de la proteína durante el 21 cultivo y el rendimiento y la calidad finales de la proteína recuperada en último término. En un ejemplo la proteína recombinante se puede expresar en el periplasma de las células huésped de E.coli puesto que éstas son más fáciles de manipular a gran escala que el sobrenadante . El primer paso de recuperación primaria necesario es la recuperación de las células huésped del medio de cultivo, ya sea por centrifugación o por filtración. Para las proteínas producidas en el periplasma una consideración importante es el nivel de fuga de la protelna recombinante hacia el sobrenadante ya que esto puede tener un efecto perjudicial sobre la recuperación primaria y la calidad de la proteína periplásmica . La mayor cantidad de protelna presente en el sobrenadante aumenta la viscosidad de éste dificultando la recuperación de las células mediante centrifugación o filtración y reduciendo el rendimiento de proteína periplásmica. Las células mismas son también menos consistentes durante la centrifugación y tienen mayor probabilidad de lisarse dañando a la proteína recombinante y aumentando aún más la viscosidad del sobrenadante debido a la liberación de proteína, ADN y lípidos, lo cual reduce nuevamente el rendimiento de la proteína recombinante en el periplasma. La calidad de la proteína recombinante recuperada del periplasma también puede reducirse por contaminación con proteína recombinante del sobrenadante que puede estar parcialmente degradada o no 22 estar correctamente plegada. En estos cultivos es importante por consiguiente, para mantener bajos los niveles de proteína recombinante en el sobrenadante, aumentar la calidad y/o el rendimiento de la proteina recombinante a continuación de la recuperación primaria. En este ejemplo se puede mejorar el rendimiento y/o la calidad finales de la proteina recombinante obtenida después de la recuperación primaria seleccionando una tasa de crecimiento a la que el nivel de proteína recombinante en el sobrenadante sea bajo aun si el rendimiento de proteína recombinante en el periplasma es inferior que a otras tasas de crecimiento a las que los niveles de proteína recombinante en el sobrenadante son mayores. Por consiguiente, para las proteínas producidas en el periplasma en el método de la presente invención se prefiere que la tasa de crecimiento seleccionada en el paso (f) sea una tasa de crecimiento a la que más de un 55 % de la proteína se exprese en el periplasma y menos del 45 % de la proteína esté en el sobrenadante. Preferentemente más del 80 % de la proteína producida por las células huésped se exprese en el periplasma y menos del 20 % esté en el sobrenadante. En un ejemplo más del 90 % de la proteína producida por las células huésped se expresa en el periplasma y menos del 10 % está en el sobrenadante. En otro ejemplo más del 95 % de la proteína producida por las células huésped se expresa en el periplasma y menos del 5 % está en el sobrenadante. 23 En otro ejemplo la proteína se puede producir en el sobrenadante. La proteina puede ser más fácil de purificar dado que no se requiere paso de extracción y habrá menos proteínas del huésped presentes en el medio. La calidad de la proteína también puede ser mejor dado que habrá menos proteólisis y puede haber un mejor plegado de la proteína. Para las proteínas producidas en el sobrenadante es importante que se maximice la cantidad de proteína recombinante expresada por las células huésped y secretada hacia el sobrenadante . Para determinar si toda la proteína recombinante producida por las células huésped está siendo secretada en el sobrenadante es importante medir los niveles de proteína recombinante también en el periplasma. Si éstos todavía son altos sería posible, usando el método de la presente invención, ajustar la partición de la proteína recombinante para aumentar aún más el rendimiento en el sobrenadante. Como resultado, para las proteínas producidas en el sobrenadante en el método de la presente invención se prefiere que la tasa de crecimiento seleccionada en el paso (f) sea una tasa de crecimiento a la cual más del 55 % de la proteína se exprese en el sobrenadante y menos del 45 % de la proteína esté en el periplasma. Preferentemente más del 80 % de la proteína recombinante producida por las células huésped se produzca en el sobrenadante y menos del 20 % en el periplasma. En un ejemplo, más del 90 % de la proteína 24 producida por las células huésped está en el sobrenadante y menos del 10 % está en el periplasma. En otro ejemplo, más del 95 % de la proteína producida por las células huésped está en el sobrenadante y menos del 5 % está en el periplasma. Habiendo identificado una tasa de crecimiento adecuada en el paso (f) del método, se puede usar la misma tasa de crecimiento durante las fermentaciones posteriores de células huésped de E.coli para asegurar que se logra la partición deseada de la proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma. La presente invención por consiguiente también proporciona un método para producir una proteína recombinante en cultivos de células huésped de E. coli en el que la expresión de la proteína recombinante por dichas células está bajo el control de un sistema inducible y la partición de la proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma es la más adecuada para la recuperación primaria de la proteína recombinante, comprendiendo dicho método el cultivo de células huésped de E.coli a la tasa de crecimiento seleccionada en el paso (f) del método descrito anteriormente . Estas fermentaciones posteriores pueden ser a la misma escala o a una escala diferente a la utilizada en el método descrito anteriormente. Por ejemplo las células huésped de E.coli se pueden fermentar a una escala pequeña para determinar la tasa de crecimiento más adecuada para la recuperación primaria de la proteína y, luego, en las 25 fermentaciones posteriores las células huésped se pueden fermentar a gran escala para producir mayores cantidades de la proteína recombinante usando la tasa de crecimiento seleccionada en el paso (f) . La proteína recombinante producida por el método de la presente invención se puede purificar posteriormente después de la recuperación primaria. Los pasos de recuperación primaria utilizados dependerán de la localización celular de la proteína recombinante al final de la fermentación. Por ejemplo, las proteínas expresadas en el periplasma se pueden recuperar dentro de las células huésped mediante centrifugación o filtración. Luego la proteína se puede extraer desde el interior de las células usando métodos como tratamiento térmico (consulte por ejemplo US 5,665,866) o extracción mecánica. Las proteínas expresadas en el sobrenadante se pueden recuperar usando métodos como adsorción en lecho expandido o centrifugación o filtración para eliminar las células seguidos, por ejemplo, de intercambio iónico o de cromatografía de afinidad para capturar la proteína. La proteína del extracto periplasmico o del sobrenadante se puede purificar posteriormente usando cualquiera de los métodos conocidos por los técnicos en la materia dependiendo de la naturaleza de la proteína recombinante y de sus propiedades físicas como tamaño, hidrofobicidad y punto isoeléctrico. Tales métodos pueden 26 incluir cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, intercambio iónico, cromatografía de afinidad y HPLC en fase reversa. Por lo tanto en otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir una proteína recombinante en cultivos de células huésped de E.coli en el que la expresión de la proteína recombinante por dichas células está bajo el control de un sistema inducible y la partición de la proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma es la más adecuada para la recuperación primaria de la proteína recombinante, comprendiendo dicho método el cultivo de células huésped de E. coli a la tasa de crecimiento seleccionada en el paso (f) del método descrito anteriormente y posteriormente purificar la proteína recombinante. EJEMPLOS La presente invención se describirá ahora sólo a modo de ejemplo, en la cual se hace referencia a: Figura 1. Perfil del crecimiento de E. coli a un rango de velocidades de alimentación de glicerol Figura 2. Tasa de crecimiento de E.coli post inducción a un rango de velocidades de alimentación de glicerol Figura 3. Partición de Fab'A. entre el periplasma y el sobrenadante en cultivos de E.coli que se hicieron crecer a un rango de velocidades de alimentación de glicerol Figura 4. Perfil del crecimiento de E. coli a un rango de 27 concentraciones de fosfato inorgánico Figura 5. Tasa de crecimiento de E.coli post inducción a un rango de concentraciones de fosfato inorgánico Figura 6. Partición de Fab' B entre el periplasma y el sobrenadante en cultivos de E.coli que se hicieron crecer a un rango de concentraciones de fosfato inorgánico Ej emplo 1 Optimización de la partición y el rendimiento de Fab' A utilizando una alimentación de glicerol limitante para controlar el crecimiento post inducción. Materiales y métodos Cepa y plásmido . La cepa utilizada en este trabajo fue Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) transformada con un plásmido que le confiere resistencia a la tetraciclina y que acarrea los genes que codifican los componentes polipeptxdicos de cadena ligera y pesada del fragmento Fab' , Fab' A. Cada polipéptido es precedido por el péptido líder OmpA de E.coli. La inducción de la expresión a partir de un único promotor tac da lugar a la síntesis y secreción de los polipéptidos de cadena ligera y pesada en el periplasma donde una porción de los polipéptidos se pliega y se ensambla para formar Fab' . Medio de cultivo. El medio de cultivo para la fermentación se basó en el medio SMSE (descrito en Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320) con 3,86 g/1 de 28 NaH2P0 .H2O y 112 g/1 de glicerol. Inoculo. Los cultivos de inoculo se hicieron crecer en el mismo medio complementado con 10 µg/ml de tetraciclina . Los cultivos se incubaron a 30°C con agitación durante aproximadamente 22 horas. Fermentación. Los fermentadores (2,5 litros de volumen total) se sembraron con cultivos de inoculo hasta 0,3-0,5 de D060o. La temperatura se mantuvo en 30°C durante la fase de crecimiento y se redujo a 25 °C antes de la inducción. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 30 % de saturación del aire mediante agitación variable y flujo de aire. El pH del cultivo se controló a 7,0 mediante titulación automática con NH40H al 15 % (v/v) y H2S04 conc. al 10 % (v/v) . Se controló la formación de espuma mediante adición de solución de Struktol J673 al 10 % (v/v) (Schill y Seilacher) .

Se hicieron varias adiciones en diferentes etapas de la fermentación. Cuando la concentración de biomasa alcanzó aproximadamente 40 de D060o/ se agregaron sales de magnesio y NaH2P0 .H20. Se hicieron agregados adicionales de NaH2P0 .H20 antes y durante la fase de inducción para asegurar que el fosfato se mantuviera en exceso. Cuando el glicerol presente al comienzo de la fermentación se agotó (aproximadamente a 75 de D060o) se aplicó una alimentación continua de glicerol al 80 % (p/p) a velocidades que variaron entre 0,5 y 10,9 ml/h. En el mismo punto de la fermentación se aplicó una 29 alimentación de IPTG a una velocidad de 1 ml/h durante 36 horas de modo que la concentración final de IPTG en el fermentador en ese momento fuera 0,5 mM. El comienzo de la alimentación de IPTG se tomó como el comienzo de la inducción. Las fermentaciones se llevaron a cabo en general durante 70 a 73 horas a las menores velocidades de alimentación de glicerol (0,5 a 2,5 ml/h) y durante 50 a 60 h a las mayores velocidades de alimentación de glicerol (5,4 a 10,9 ml/h). Medición de la concentración de biomasa y de la tasa de crecimiento. Se determinó la concentración de biomasa midiendo la densidad óptica de los cultivos a 600 nm. La tasa de crecimiento (µ) está relacionada con el cambio en la concentración de biomasa con el paso del tiempo por lo tanto: LnXt = LnX0 + µt donde XQ es la concentración original de biomasa, Xt es la concentración de biomasa después del intervalo, t. De este modo, un diagrama de LnXt frente a t para un cultivo discontinuo da una linea recta de pendiente igual a µ (la unidad por hora) . Sin embargo, la aplicación de una alimentación lineal limitante de glicerol a un cultivo discontinuo da lugar a una tasa de crecimiento descendente debido a los aumentos en la biomasa y en el volumen del cultivo. Por consiguiente, se determinó una tasa de crecimiento promedio durante el periodo de inducción trazando LnDOgoo frente al tiempo. Se determinó la pendiente de mejor 30 ajuste de una línea (por el método de mínimos cuadrados) para obtener la tasa de crecimiento promedio durante el período de alimentación. Extracción periplásmica. Se cosecharon las células de las muestras del cultivo mediante centrifugación. Se retuvo la fracción sobrenadante (a -20°C) para el análisis posterior. Se resuspendió la fracción de células en forma de pastilla hasta el volumen original del cultivo en tampón de extracción (Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM; pH 7,4) . Después de la incubación a 60 °C durante aproximadamente 16 horas el extracto se aclaró por centrifugación y se retuvo la fracción sobrenadante (a -20°C) para su análisis. Cuantificación de Fab' . Se determinaron las concentraciones de Fab 1 en los extractos periplásmicos y en los sobrenadantes de los cultivos mediante ELISA de la unidad Fab1 según se describe en Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320. Resultados Las fermentaciones de Fab' A se llevaron a cabo en condiciones en las que el crecimiento preinducción era ilimitado y el crecimiento se produjo a la máxima tasa específica (Hm x) pero posteriormente se restringió post inducción (Fig. 1) . Se controló la tasa de crecimiento post inducción mediante la aplicación de una alimentación limitante de un nutriente (glicerol) al cultivo discontinuo a 31 un rango de velocidades de flujo. Se seleccionaron las velocidades de flujo del glicerol para obtener un rango de tasas de crecimiento de más de aproximadamente 0/h. La Fig. 2 y la Tabla 1 muestran la tasa de crecimiento promedio real durante el período de inducción para un rango de velocidades de alimentación de glicerol . El aumento de la velocidad de alimentación de glicerol dio lugar a un aumento en la tasa de crecimiento promedio del cultivo en la forma prevista.

Tabla 1. Tasas de crecimiento promedio de cultivos de E.coli que se hicieron crecer a un rango de velocidades de alimentación de glicerol .

Cultivo Velocidad de Tasa de alimentación crecimiento/h (ml/h) FM291 0,5 -0,0008 F 292 1,0 0, 0044 FM294 1,1 0, 0033 FM295 1,6 0, 0071 FM296 2,1 0, 0075 FM297 2 , 5 0, 0092 F 288 5,44 0, 0289 FM289 10,88 0, 0374 32 Las fermentaciones se cosecharon aproximadamente a las 36 horas post inducción a las menores velocidades de alimentación de glicerol (0,5 a 2,5 ml/h) y aproximadamente a las 24 horas post inducción a las mayores velocidades de alimentación de glicerol (5,4 a 10,9 ml/h) y se determinó la concentración de Fab' en los extractos periplásmicos y los sobrenadantes de los cultivos mediante ELISA de la unidad Fab' . La Fig. 3 muestra la concentración y la distribución relativa de Fab' entre el periplasma y el medio de cultivo. Se encontró que una tasa de crecimiento óptima para el título de Fab' era de aproximadamente 0,0075/h. Se observó una tendencia general en la cual el título de Fab' en el sobrenadante del cultivo aumentaba con el aumento de la tasa de crecimiento. Por lo tanto, la tasa de crecimiento seleccionada para un desarrollo de la fermentación, un rendimiento de Fab' y una compatibilidad con la recuperación primaria óptimos, reflejará un equilibrio entre el rendimiento máximo y la distribución óptima de Fab' . En el ejemplo citado, se seleccionó una velocidad de alimentación de glicerol de 1,6 ml/h (tasa de crecimiento ~0,0071/h) para la fermentación llevada a escala. 33 Ejemplo 2 Optimización de la partición y el rendimiento de Fab' B variando la concentración de fosfato para controlar la tasa de crecimiento post inducción. Materiales y métodos Cepa y plásmido . La cepa utilizada en este trabajo fue Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) transformada con un plásmido que le confiere resistencia a la tetraciclina y que acarrea los genes que codifican los componentes polipeptidicos de cadena ligera y pesada del fragmento Fab', Fab'B. La inducción de la expresión a partir de un único promotor tac da lugar a la síntesis y secreción de los polipéptidos de cadena ligera y pesada en el periplasma donde una porción de los polipéptidos se pliega y se ensambla para formar Fab' . Medio de cultivo . El medio de cultivo para la fermentación se basó en el medio SM6E (descrito en Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320) con las concentraciones de NaH2P04.H20 que se presentan en la Tabla 2. 34 Tabla 2. Cantidad y concentración de NaH2P04.H20 utilizado en las fermentaciones de Fab'B Inoculo. Los cultivos de inoculo se hicieron crecer en el mismo medio con la concentración adecuada de NaH2P04.H20 (consulte la Tabla 2) y complementado con 10 µg/ml de tetraciclina. Los cultivos se incubaron a 30°C con agitación durante aproximadamente 19 a 26 horas. Fermentación. Los termentadores (2,5 litros de volumen total) se sembraron con cultivos de inoculo hasta 0,3 a 0,5 de DOSOo. La temperatura se mantuvo en 30°C durante la fase de crecimiento y se redujo a 27°C antes de la inducción. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 30 % de saturación del aire mediante agitación variable y 35 flujo de aire. El pH del cultivo se controló a 7,0 mediante titulación automática con HOH al 15 % (v/v) y H2S04 conc . al 10 % (v/v) . Se controló la formación de espuma mediante adición de solución de Mazu al 10 % (v/v) . Se hicieron varias adiciones en diferentes etapas de la fermentación. Se agregó glicerol a la fermentación en forma de 2 alícuotas de 45 mi de una solución al 80 % (p/p) , una de las adiciones se hizo a una concentración de biomasa de 20 de D060o y la otra a 40 de D060o- Cuando la concentración de biomasa alcanzó aproximadamente 40 de DOeoo también se agregaron sales de magnesio y calcio. Se agregó lactosa (60 mi de una solución al 50 % (p/p) ) a 60 de D06oo y sirvió como inductor y fuente de carbono durante la fase de inducción. La inducción se produjo a continuación del agotamiento del glicerol (entre aproximadamente 75 y 90 de DO600) como fue señalado por un aumento en la concentración del oxígeno disuelto. Se hicieron otras adiciones de lactosa cuando fue necesario para mantener la concentración en el termentador entre 0 y 55 g/1. Se hizo otra adición de magnesio entre 0 y 2 horas post inducción. Las fermentaciones se llevaron a cabo en general durante 56 a 61 horas. Análisis de las fermentaciones. Las extracciones periplásmicas , mediciones de la biomasa y cuantificación de Fab' se hicieron según se describió previamente (Ejemplo 1) . 36 Resultados Se controló el crecimiento post inducción de los cultivos de fermentación variando la cantidad de fosfato (NaH2P04.H20) manteniendo al mismo tiempo todos los otros nutrientes de partida constantes (Fig.4). Se determinó la tasa de crecimiento durante cada fermentación para el período de inducción en el cual la biomasa aumentaba (Fig. 5 y Tabla 3) .

Tabla 3. Tasas de crecimiento promedio de cultivos de E.coli que se hicieron crecer en un rango de concentraciones de fosfato .

El aumento de la concentración de fosfato dio lugar a un aumento en la tasa de crecimiento durante estos períodos de 37 inducción. Se seleccionaron las concentraciones de fosfato para que se agotara en distintos puntos en relación con la inducción (apenas antes de la inducción, p. ej . 26,9 mM, hasta varios puntos después de la inducción) . El punto (concentración de biomasa) en el cual se produce la inducción está relacionado con la concentración de partida del glicerol. La cantidad de fosfato necesaria para sostener el crecimiento hasta la biomasa de inducción deseada se calculó en base a los datos del coeficiente de rendimiento de biomasa para el fosfato inorgánico proporcionado en Pirt, S.J. (1975) Principies of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publications . La concentración de fosfato óptima para el rendimiento y la distribución de Fab' se determinó empíricamente según se describe aquí. Las fermen aciones se cosecharon 28 a 31 horas post inducción y se determinó la concentración de Fab' en los extractos periplásmicos y los sobrenadantes de los cultivos mediante ELISA de la unidad Fab'. La Fig. 6 muestra la concentración de Fab' tanto en el periplasma como en el sobrenadante del cultivo en el momento de la cosecha. Se observó una tendencia general en la cual la concentración de Fab' en el sobrenadante del cultivo aumentaba con la concentración de fosfato. El rango óptimo de fosfato para la recuperación primaria a gran escala utilizando extracción 38 periplásmica y métodos de centrifugación / filtración fue de 29, 8 mM.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

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REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para controlar la partición de una proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma en cultivos de células huésped de E.coli en el que la expresión de la proteína recombinante por dichas células está bajo el control de un sistema inducible, caracterizado porque comprende : a) proporcionar un cultivo de células huésped de E.coli b) modificar la tasa de crecimiento de las células huésped de E.coli c) inducir la expresión de la proteína recombinante donde los pasos (b) y (c) se pueden realizar en cualquier orden o simultáneamente; y a continuación d) determinar el rendimiento de la proteína recombinante en el sobrenadante del cultivo y en el periplasma de las células huésped de E.coli e) comparar el rendimiento determinado en el paso (d) con el rendimiento determinado al utilizar al menos otra tasa de crecimiento en el paso (b) f) seleccionar una tasa de crecimiento de la comparación hecha en el paso (e) a la cual la 40 partición de la proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma sea la más adecuada para la recuperación primaria de la proteína recombinante . 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los rendimientos comparados en el paso (e) provienen de al menos dos cultivos que se hicieron crecer simultáneamente usando en cada cultivo una tasa de crecimiento diferente en el paso (b) . 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los rendimientos comparados en el paso (e) provienen de al menos dos cultivos que se hicieron crecer consecutivamente usando en cada cultivo una tasa de crecimiento diferente en el paso (b) .
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los rendimientos comparados en el paso (e) provienen de un cultivo que se hizo crecer al menos a dos tasas de crecimiento diferentes llevando a cabo los pasos (a) a (d) usando una tasa de crecimiento en el paso (b) y luego llevando a cabo los pasos (b) y (d) al menos una vez más variando la tasa de crecimiento en el paso (b) cada vez.
5. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la tasa de crecimiento en el paso (b) se reduce.
6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 41 5, caracterizado porque modificar la tasa de crecimiento de las células huésped de E.coli en el paso (b) comprende ajustar el nivel de carbono disponible para las células.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la fuente de carbono se selecciona entre glucosa, lactosa, sacarosa, fructosa, glicerol, succinato y lactato .
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la fuente de carbono es glicerol .
9. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque modificar la tasa de crecimiento de las células huésped de E.coli en el paso (b) comprende ajustar el nivel de fosfato disponible para las células.
10. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque modificar la tasa de crecimiento de las células huésped de E.coli en el paso (b) comprende ajustar el nivel de oxígeno disponible para las células.
11. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la proteína recombinante es dirigida al periplasma.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque la tasa de crecimiento seleccionada en el paso (f) es una tasa de crecimiento a la cual más del 80 % de la proteína recombinante producida por las células huésped se expresa en el periplasma. 42
13. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la proteína recombinante es dirigida al sobrenadante .
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la tasa de crecimiento seleccionada en el paso (f) es una tasa de crecimiento a la cual más del 80 % de la proteína recombinante producida por las células huésped se produce en el sobrenadante.
15. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el sistema inducible comprende un promotor derivado de lac.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque el promotor derivado de lac es lac, tac o trc.
17. El método de acuerdo con las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque el promotor es inducido con lactosa o IPTG.
18. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la proteína recombinante es un anticuerpo o un fragmento de éste.
19. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo es una IgG.
20. El fragmento del anticuerpo de la reivindicación 18, caracterizado porque el fragmento es un Fab, Fab' , F (ab' ) 2 o scFv. 43
21. Un método para producir una proteína recombinante en cultivos de células huésped de E.coll, caracterizado porque la expresión de la proteína recombinante por dichas células está bajo el control de un sistema inducible y la partición de la proteína recombinante entre el sobrenadante y el periplasma es la más adecuada para la recuperación primaria de la proteína recombinante, comprendiendo dicho método el cultivo de células huésped de E.coll a la tasa de crecimiento seleccionada en el paso (f) de la reivindicación 1.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado porque la proteína recombinante producida es posteriormente purificada.