JPS63233780A - 酢酸を指標とした培養方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物又は動物若しくは植物の細胞、特に遺
伝子組換え微生物を用いて、酵素や生理活性物質などを
生産させるに際し、目的とする有用物質を効率良く生産
させるための培養制御の方法及びその装置に関する。

〔従来の技術〕

従来、微生物や動植物細胞、特に遺伝子組換え微生物な
どを培養することにより、その代謝物である抗生物質、
アミノ酸、酵素又はホルモンなどの生理活性物質々どを
生産することが行われている。

この培養方法は大部分が培養槽に培地と種細胞を入れて
培養するだけの回分培養であり生産性は低い。

そこで、生産性を高めるために培養途中で基質又は誘導
剤を添加する培養方法が行われているが、培養のどの時
点で添加するかが問題となっておシ、その明確な指標は
知られていない。一方、パン酵母培養の場合はエタノー
ルの生成を呼吸商により検知して基質を流加する方法（
特開昭５７−５６９８５号゛、同５８−７８５８４号）
が開示されているが、これは菌体を得るための培養であ
り、代謝物生産とは全く真なる。

また、基質の添加にもかかわらず培養中に細胞の増殖速
度が低下する現象がある。これは増殖阻害物質の培養液
中への蓄積が原因であるといわれている。しかし、増殖
阻害物質についての知見は少なく、この点からも効率的
な培養を達成することが困難になっている。この増殖阻
害物質を特定せずに、これを除去するために培養液を断
続的又は連続的に抜出し、遠心分ＭＥよシ菌体を回収し
て再び培養槽に仕込む方法（特開昭５３−２９９８５号
）が提案されている。これは酵母を対象としたもので、
細胞を大量〈生産させるためのプロセスであり、細胞に
目的物質を生産させるためのプロセスではない。

〔発明が解決しよりとする問題点〕

上記従来技術は基質などの添加や増殖阻害物質の検知の
点について配慮がなされておらず、効率的な細胞増殖や
代謝物質の生産が難しいという問題があった。

本発明の目的は、微生物又は動植物細胞、特に遺伝子組
換え微生物を培養し、その代謝物質を生産させるに際し
て、培養液中の酢酸を指標とした培養制御の方法及びそ
の装置を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は培養方法に
関する発明であって、微生物又は動植物細胞を培養して
代謝物を生産する方法において、培養液中の酢酸濃度を
検知し、該微生物又は動植物細胞により該培養液中の酢
酸を資化して該酢酸濃度を設定値以下に調節する工程を
包含することを特徴とする。

また、本発明の第２の発明は培養装置に関する発明であ
って、培養を行う培養槽、培養液中の酢酸濃度分析装置
、基質を貯留するための基質槽、基質を流加するための
流量可変式の基質流加装置、及び該分析装置からの信号
に基づいて該基質流加装置からの基質流量を調節する信
号を出力する制御装置を包含することを特徴とする。

以下、本発明に関する具体的な説明として、プロモータ
にｔｒｐ　（）リデトファン）プロモータを用い、それ
にβ−ｇａｌ　（β−ガフクトシダーゼ）遺伝子を連結
した複合デフスミドｐＴＲ１１１：Ｚ１を保持する大腸
菌ＨＢ１０１株（微士研菌寄第８１５６号）による培養
制御の方法及び装置を示すが、本発明はこれに限定され
るものではない。

複合デフスミドｐＴＲＥＺ１のｔｒｐプロモータ部分は
大腸菌のｔｒｐオペロンのプロモータ、ｔｒｐＬ（リー
グベデタイド）及びｔｒｐ　Ｅ（アントフニ〜酸合成酵
素）の先端部分の一部を含む約５００ｂｐ　（ｂａｓｅ
　ｐａｉｒｓ　、塩基対）のＤＮＡ断片であり、ｐＢＲ
５２２デヲスミドのＥｃｏＲＩ部位に挿入したものであ
る。一方、β−ｇａｌ遺伝子はｐＭＣｌ　４０３（ジャ
ーナル　オプ　パクテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔａｒ
ｉｏｌ、　）　９１４５巻、第９７１〜９６０頁（１９
８０）］より切出した＆　２　ｋｂ　の大きさのもので
、ｔｒｐプロモータのＥｃｏＲＩ部位とｐＢＲ５２２の
Ｓａｌ　Ｉ部位間に挿入した。このように、複合プフス
ミドｐＴＲＥＺ１のβ−ｇａｌ遺伝子はｔｒｐプロモー
タの制御下にある。

ｔｒｐプロモータを有する複合デフスミドは、培養中に
３−β−インド−μアクリル酸（以下、１人と略記する
）を添加することにより、遺伝子が発現することが知ら
れている〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９１巻、第
５０３〜５０６頁（１９８１））。

これは遺伝子の転写を制御するリゾＶツサがＩＡにより
不活性化されるため、ＲＮＡボリメフーゼによるｍＲＮ
Ａの合成が開始されるからである。

本発明者らはβ−ｇａｌを生産する遺伝子組換え大腸菌
をモデ〜に用いてβ−ｇａｌを効率よく生産させるため
の培養制御方法について種々検討した結果、菌体を効率
よく増殖させ、目的とする物質を効率よく生産させるこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。

第２図に遺伝子組換え大腸菌を用いて流加培養を行った
結果を示す。すなわち第２図は、該流加培養結果の１例
を、培養時間（ｈ、横軸）と、菌体濃度（１１／ｌ　）
、β−ｇａｌ量（Ｕ／ｄ）及びグルコース濃度Ｃ９／ｌ
）Ｃ縦軸〕との関係で示すグラフである。

培養は、溶存酸素濃度の上昇を指標として基質であるグ
ルコース、カザミノ酸培地を流加した。

１８時間目には菌体濃度が１３ｇ／ｌに達したが、これ
以後菌体増殖は停止した。β−ｇａｌ生産を誘導させる
ため、誘導剤のＩＡと栄養物質であるカザミノ酸を３２
時間目に添加したが、β−ｇａｌ生産は誘導されなかっ
た。このようＫ、菌体増殖が停止し、β−ｇａｌ生産が
誘導されないのは培養上清液に菌体増殖やβ−ｇａｌ生
産を抑制する物質が存在するためではないかと推定した
。

そこで、菌体増殖停止後の培養１９時間目の培養上清液
を採取し、そこから限外ｆ過膜とイオン交換樹脂を用い
て菌体増殖阻害物質を分離した。

この分離液について細管式等速電気泳動分析装置によシ
有機酸を分析した結果、酢酸が５５９７ｔの高濃度に蓄
積していることが分った。そこで、相当量の酢酸塩を新
鮮培地に添加して培養したところ、菌体の増殖が阻害さ
れた（第５図参照）。

このことから菌体の増殖阻害に関与している物質は酢酸
であると判明した。また、遺伝子の発現（β−ｇａｌの
生産）に関しても、菌体の増殖阻害とほぼ同じ結果が得
られた（第４図参照）。すなわち、１５図は、培養液中
の酢酸濃度（１／ｌ、横軸）と比増殖速度（１／ｈ、縦
軸）との関係の１例を示すグラフであシ、第４図は、培
養液中の酢酸濃度Ｃｆｌ／ｌ、横軸）とβ−ｇａｌ生産
量（Ｕ／−１縦軸）との関係の１例を示すグラフである
。

更に、ガスクロマトグラフィーを用いた培養上清液の分
析においても、酢酸であることを確認した。

以上のように、培養液中に蓄積した酢酸が菌体増殖を阻
害することから、本発明者らは酢酸を指標として基質を
流加することによシ菌体を効率よく増殖させることがで
きるのではないかと考えるに至った。それには培養液中
に蓄積した酢酸を除去する必要があるが、本発明者らは
酢酸を菌体に資化させることにより酢酸を除去すること
にした。

そこで、培養液中に酢酸塩を酢酸濃度として０〜１０ｇ
／ｌＩ！Ａ加して、遺伝子組換え菌の酢酸資化の可能性
について検討した。第５図に示すように、培養液にはグ
ルコースを１１／Ｌ添加したため培養初期に培養液中の
酢酸濃度が高くなったが、以後酢酸濃度は徐々に低下し
た。これよシ培養液中の酢酸は菌体によシ資化されるこ
とが分った。その時の菌体濃度の経時変化をｔａ６図に
示す。すなわち第５図は、遺伝子組換え大腸菌の酢酸資
化の１例を、培養時間（ｈ１槓軸）と酢酸濃度（ＪＦ／
ｌ、縦軸）との関係で示すグラフである。第５図におい
て、初発酢酸濃度を、Ｉ／を単位で、白丸印は０、黒丸
印は１、白玉角印は５、黒三角印は１０とした場合につ
いて示している。第６図は、１５図の各条件における培
養時間（ｈ、横軸）と菌体濃度（ＯＤ５５０ｎｍ、縦軸
）との関係で菌体増殖を示すグラフである。第６図がら
明らがなようＫ、菌体濃度は菌体の酢酸資化により、酢
酸を添加しない場合よシ増加した。

このことから、酢酸の資化、従って酢酸濃度の調節は、
基質の流加量の調節により行うことが、簡便であシ有効
であって好適であることが判明した。

以上の結果よ〕、本発明者らは培養液中の酢酸濃度を検
知し、酢酸濃度が設定値よシも高くなった場合は基質流
加量を減らすか基質流加を止めることにより菌体に酢酸
を資化させて酢酸濃度を低下させること、酢酸濃度が設
定値よりも低下した時点で、基質流加量を増加させるか
、基質流加を再開する培養制御の方法が好適であること
を見出した。

本発明における培養液中の酢酸濃度は第５図の結果より
１５ｇ／を以下、望ましくは５９／を以下に抑制すべき
であることがわかる。なお、基質流加を制御する設定値
としては酢酸濃度が５ｇ／ｌと設定するだけでなく、例
えば１〜３９／ｌというように設定範囲を設けることも
可能である。

更に、誘導剤の添加によシ遺伝子を発現させる際にも、
培養液中の酢酸濃度は菌体増殖の場合と同様な阻害を示
した（第４図）。これより遺伝子発現における場合も酢
酸濃度は’４／を以下にすることが望ましい。

本発明において酢酸は培養上清液などを細管式等速電気
泳動装置、ガスクロマトグラフ装置、液体クロマトグラ
フ装置、及び質量分析計などに導入することにより迅速
かつ正確に検出することができる。

本発明における細胞としては前記した遺伝子組換え大腸
菌以外の細胞、例えば酵母、枯草菌、放線菌、動物細胞
及び植物細胞などについても、そ可能である。

また、目的物質の生産を誘導させるには、細胞が遺伝子
組換え大腸菌の場合にｔｒｐプロモータに対しては、上
記のＩＡの添加又は遺伝子の発現を抑制するトリプトフ
ァンを含まない、又はトリプトファン濃度が低い培地で
培養することが、またｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモ
ータに対シてｄＩＰＴＧ（イソグロビルーβ−Ｄ−チオ
ガラクトシド）等の添加が、ｐＬプロ七−夕に対しては
培賃液の温度を上昇させることが有効である。目的物質
の生産を誘導させる時に添加する栄養物質としては、ア
ミノ酸の混合物であるカザミノ酸、アミノ酸、グルコー
ス、酵母エキスなどが有効である。

既に概説した本発明の培養装置においては、酢酸濃度分
析装置の前に、採取した培養液試料を分析装置に適合す
るよりに調製するための試料調製装置を設けてもよいが
必須のものではない。

また基質流加装置の好適な例としてはポンプがある。

その他、当然これら各装置を連結する導管、原料供給設
備などが取付けられる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ 本発明の培養装置の１実施例の概要図を第１図に示す。

第１図において、符号１は培養槽、２はかくはん装置、
３は基質槽、４は基質流加用ボンデ、５は試料調製装置
、６は酢酸濃度分析装置、７は制御用電子計算機、８〜
１１は導管を意味する。

培地と敵生物とから成る培養液を仕込んだ培養槽１には
モータＭを備えたかくはん装置２のかくはん部が収納さ
れている。空気導入用導管８は培養槽１の底部に接続さ
れ、培養槽１の上部には排ガス排出用導管９が接続され
ている。培養槽１の側面には、培養液に接するように培
養液抜出し用導管１１が接続され、導管１１を介して試
料調製装置５と酢酸濃度分析装置６が接続されている。

培養ｆｆ１１の上部には基質流加用導管１０を介して、
流量可変式の基質流加用ポンプ４と基質槽３が接続され
ている。制御用電子計算機７は酢酸濃度分析装置６と基
質流加用ポンプ４に接続されている。

試料調製装置５には菌体分離器と試料溶液の酸性化装置
が収納されている。酢酸濃度分析装置ｉｔ　６には質量
分析計又はガスクロマトグラフ装置等が収納されている
。

以下本実施例の動作を説明する。培養槽１内では微生物
と基質槽３より供給された基質及び導管８からの空気が
かくはん装置２によってかくはんされ、微生物が増殖す
る。培養液は導管１１によシ抜出され、試料調製装置５
で菌体除去と酸による試料の酸性化を行った後、酢酸濃
度分析装置ｆ６に導入される。酢酸濃度分析装置６にガ
スクロマトグフフ装置が収納されている場合は試料は酸
性溶液のまま使用されるが、質量分析計が収納されてい
る場合は空気でバブリングすることにより気化された酢
酸が分析に供される。酢酸濃度分析装置６で分析された
培養液中の酢酸濃度の値は制御用電子計算機７に送られ
、設定値と比較される。

酢酸濃度の値が設定値よシも高い場合は基質流加を停止
するか又は基質流加速度を遅くするように信号を基質流
加用ポンプ４に送り、基質流加量を調節する。一方、設
定値よりも低い場合は基質流加を開始するか又は基質流
加速度を速くするように信号を基質流加用ポンプ４に送
り、基質流加量を調節する。以上のように基質流加量を
調節することで、培養液中の酢酸濃度を設定値以下に制
御でき、菌体の増殖速度を高レベルに維持することがで
きる。

実施例２ 菌体培養液中の酢酸を夏スクロマトグラフ装置により検
知し、培養液中の酢酸濃度が２１！／を以下になるよう
に基質流加量を制御した。なお、培地には菌体増殖時の
ｔｒｐプロモータの働きを抑えるためにトリプトファン
を添加した。

菌体：複合プフスミドｐＴＲＥＺ１を保持する大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株。

初発培地：Ｍ９−カザミノ酸培地、組成はＮＨ４Ｃ６１
ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４を６９、ＫＨ，ＰＯ４を３９、Ｎａ
Ｃｌ２　ｇ、Ｍｇ８０．−７Ｈ２０を［１１ｇ、ＣａＣ
６２・２Ｈ２０を１５岬、チアミン塩酸塩ａ、１９．プ
ロリン０．１ｇ、トリプトファンα０１ｇ、グルコース
５ｇ、カザミノ酸２．ｓ、）ｐ、酵母エキ７、１．５　
ｇ％蒸留水１ｔ、ｐＨ７，０である。なお、本培地には
複合ブツスミドを保持する大腸菌のみを増殖させるため
、アンピシリン（Ａｐ）を５０岬／を添加した。

流加用培地ニゲμコース２００ｇ、プロリン４Ｉ、カザ
ミノ酸１００ｇ、酵母エキス６０ｇ、トリプトファン１
４ｇ、Ａｐｌ、ｊｉｌ、蒸留水ＩＬ、ｐＨ７Ｏである。

培養条件：複合デフスミドを保持する大腸菌を５０−の
Ｍ９−カザミノ酸培地を入れた５００−音振とうフラス
コ４本に接種し、振とう培養機により、振幅７譚、振と
う回数１１５回／　！ｏｉｎ　。

３７℃で一晩培養した。この種菌液２００−をＭ９−カ
ザミノ酸培地の入った５ｔジヤーフアーメンタに接種し
、初発液量２Ｌで３７℃、ｐＨ７，０通気ｆｉｔ　２　
Ｌ　／　Ｉ！１ｌｉｎで培養を開始した。培養液中の酢
酸濃度は培養上清液をＰＢＧ６００＋フｐシンＰ　（Ｆ
４ｕｓｉｎＰ　）　（ガスクロ工業製）を充てんしたガ
スクロマトグラフ装置に導入することにより測定し、酢
酸濃度が２９／ｌに達した時点で基質流加を停止した。

結果：結果を第７図に示す。すなわち第７図は本実施例
による培養結果の１例を、培養時間（ｈ、横軸）と、酢
酸濃度（＃ｌ／ｌ）、菌体濃度（ｇ／ｌ）、β−ｇａｌ
量（Ｕ／ｄ）及び流加速度（−／ｍｉｎ　）　Ｃ縦軸〕
との関係で示すグラフである。

第７図に示すように、基質の流加により酢酸が生成され
たが、基質流加を停止すると酢酸は菌体に資化され、培
養液中の酢酸濃度が低下した。このように培養液中の酢
酸濃度を低く抑えて培養することにより、培養３０時間
目には菌体濃度は２９７７／ｌの高密度に達した。トリ
プトファンプロモータの働きを抑えるため、流加用培地
中にトリプトファンを添加したので、培養２２時間目ま
ではβ−ｇａｌ生産を抑えることができた。しかし、培
養２２時間目以降はトリプトファン濃度の低下により脱
抑制され、β−ｇａｌの生成が開始し、最終的にβ−ｇ
ａｌ生産量は１０４Ｕ／ＷｔＫ達した。

本実施例ではトリプトファン濃度低下による脱抑制によ
シβ−ｇａｌが生産されたのであるが、誘導剤であるＩ
Ａの添加によってもβ−ｇａｌの生産を開始できる。以
上、培養液中の酢酸濃度を抑えることで、菌体濃度は２
９ｆｌ／ｌの高密度に達し、菌体収率を１５７ｇ・細胞
／ｇ・グルコースの高い値に維持できた。

実施例３ 菌体培養液中の酢酸をガスクロマトグラフ装置により検
知し、培養液中の酢酸濃度が２　ｆｌ／を以下になるよ
うに基質流加量を制御した。培地へのトリプトファン添
加はせずに、菌体増殖と連動したβ−ｇａｌの生産を行
った。

トリプトファンの無添加培地を用いた以外は、使用菌株
、培養条件共に実施例２と同様にして洗加培養を行った
。

結果：培養結果の１例を、第７図と同様な関係で第８図
に示す。

第８図に示すように、菌体増殖と連動してβ−ｇａｌが
生産された。培＠ＳＯ時間目には濱体濃濱は５６９／ｌ
の高密度に達し、菌体収率はＱ、５４ｙ−細胞／ｇ・グ
ルコースであった。しかし、この時のβ−ｇａｌ生産量
は５９Ｕ／−であり、実施例１よりは低い値であった。

実施例４ 菌体培養液中の酢酸をガスクロマトグラフ装置により検
知し、培養液中の酢酸濃度が２ｇ７を以下になるように
基質流加量を制御した。培養前期は流加用培地にトリプ
トファンを添加し、β　−ｇａｌ生産を抑え、培養後期
はトリプトファンを含まない流加用培地を用いて、β−
Ｈａｌ−Ｈ上行った。

初発培地と培養前期に用いた流加用培地は実施例１と同
様な培地を用いたが、培養後期は実施例１の流加用培地
から酵母エキスとトリプトファンを除いた流加用培地を
用いた。以上に述べた培地以外は、使用菌株、培養条件
共に実施例２と同様にして流加培養を行った。

結果：培養結果の１例を、＠７図と同様な関係で第９図
に示す。

第９図に示すよりに、培養１２時間目にトリプトファン
を含まない流加用培地を用いて流加を開始したところ、
β−ｇａｌ生産が急激に始まり最大７０Ｕ／−のβ−ｇ
ａｌが生産された。菌体濃度は１ａ６ｐ／ｌ、菌体収率
は０．５２．ｐ−細胞／ｙ・グルコースであった。

比較例１ 培養液中のグルコース濃度を実施例２及び３と同様に１
　ｇ／Ｌ以下の低濃度になるように基質を流加した以外
、酢酸の生成を抑制する措置は採らなかった。

使用菌株、培養条件共に実施例２と同様にして流加培養
を行った。

結果：培養結果の１例を、第７図と同様な関係゛で第１
０図に示す。

第１０図に示すように、１体増殖と連動して酢酸が生成
し、酢酸濃度が２１９／ｌになった培養２０時間目には
菌体増殖が停止した。この時の菌体濃度は２１　ｇ／ｌ
であったが、菌体収率はα５６１・細胞／９・グルコー
スと低く、非常に生産効率が悪かった。更に、β−ｇａ
ｌ生産量も８Ｕ／ｇＩｔと極めて低かった。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明によれば、培養液中の酢酸
濃度を抑えることができるので、容易に高密度培養、高
菌体収率及び目的物質の高生産量を達成できるという顕
著な効果が奏せられる。例えば、β−ｇａｌ生産の場合
、２５９／を以上の高密度培養、ａ、ｓｇ・細胞／Ｉ・
グルコース以上の高菌体収率、５０Ｕ／−以上の高いβ
−ｇａｌ生産量を達成できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の培養装置の１例を示す概要図、第２図
は遺伝子組換え大腸菌を用いて流加培養を行った結果の
１例を示すグラフ、第３図は培養液中の酢酸濃度と比増
殖速度との関係の１例を示すグラフ、第４図は培養液中
の酢酸濃度とβ−ｇａｌ生産量との関係の１例を示すグ
ラフ、第５図は遺伝子組換え大腸菌の酢酸資化の１例を
示すグラフ、第６図は第５図の各条件における菌体増殖
の１例を示すグラフ、第７図〜第９図は本発明による酢
酸を指標とした遺伝子組換え大腸菌の流加培養結果の１
例を示すグラフ、＠１０図は比較例の培養結果の１例を
示すグラフである。 １：培養槽、２：かくはん装置、５：基質槽、４：基質
流加用ボンデ、５：試料調製装置、６：酢酸濃度分析装
置、７：制御用計算機、８〜１１：導管

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物又は動植物細胞を培養して代謝物を生産する
   方法において、培養液中の酢酸濃度を検知し、該微生物
   又は動植物細胞により該培養液中の酢酸を資化して該酢
   酸濃度を設定値以下に調節する工程を包含することを特
   徴とする培養方法。 ２、該酢酸濃度の調節を、基質の流加量の調節により行
   う特許請求の範囲第１項記載の培養方法。 ３、該酢酸濃度の設定値が、１５ｇ／ｌである特許請求
   の範囲第１項又は第２項記載の培養方法。 ４、該微生物が、遺伝子組換え大腸菌である特許請求の
   範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の培養方法。 ５、該遺伝子組換え大腸菌が保持する発現ベクターが、
   トリプトファンプロモータを含有するものである特許請
   求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の培養方
   法。 ６、誘導剤として３−β−インドールアクリル酸を用い
   る特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載
   の培養方法。 ７、トリプトファンを含まない、又はトリプトファン濃
   度が低い培地を用いて物質生産を誘導する特許請求の範
   囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の培養方法。 ８、培養を行う培養槽、培養液中の酢酸濃度分析装置、
   基質を貯留するための基質槽、基質を流加するための流
   量可変式の基質流加装置、及び該分析装置からの信号に
   基づいて該基質流加装置からの基質流量を調節する信号
   を出力する制御装置を包含することを特徴とする培養装
   置。