JPH02100667A - 微生物の流加培養方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物とくに遺伝子組換え菌を用いて有用物質
を生産させるに際し、菌体の高密度培養と遺伝子の高効
率発現が可能となる流加培養方法及び装置に関するもの
である。

〔従来の技術〕 微生物の培養は大部分が、培養前に基質を加えただけの
回分培養であり、生産性が低かった。しかし、培養途中
に基質を加える流加培養は、菌体に好適な濃度で基質を
供給できるので、菌体を高密度に培養できるものとして
注目されている。

従来、基質の流加時期や流加方法として、炭素源が有機
酸である場合にｐＨを指標とする方法（公開特許公報特
開昭４８−３６３８９号）や溶存酸素濃度又はｐＨ調整
剤の添加量を指標とした基質流加方法（Ｊ、Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ、
　１２゜ｐ　３１３〜３１９．１９７９．公開特許公報
特公昭６０−１８３９２号）などが提案されている。し
かし、以上述べた方法により、有機酸を生成しその有機
酸の蓄積により増殖阻害を受ける微生物を培養した場合
は、菌体増殖が途中で停止し高菌体濃度を得ることは困
難である。

阻害物質を生成する微生物としてはエタノールを生成す
る酵母が知られており、呼吸商を指標とした流加方法（
公開特許公報、特開昭５２−１２５６８６号）などが提
案されているが、これは菌体の生産に関するものであり
、物質生産を目的としたものとは異なる。また、培地交
換により阻害物質を除去する方法（公開特許公報、特開
昭５３−２９９８５号）があるが、装置や操作が複雑に
なる問題があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は阻害物質について配慮されてなかったり
複雑な技術を必要としており、菌体の高密度化や効率的
な代謝物生産が困難であった。

本発明の目的は増殖に伴って生成される有機酸とくに酢
酸により増殖を阻害される微生物とくに大腸菌又は組換
え遺伝子を保持する大腸菌を培養しその代謝物を生産さ
せるに際し、有機酸による阻害を受けないように、ｐＨ
を指標にして基質を流加することを特徴とした新しい流
加培養方法及び装置を提供することにある。

更に、本願の第２の目的は酢酸を生成しその酢酸により
増殖を阻害される微産物とくに大腸菌又は遺伝子組換え
大腸菌を培養し、その代謝物を生産させるに際し、酢酸
による阻害を受けないようにｐＨと酢酸濃度を指標とし
て基質を流加することを特徴とした流加培養方法及び装
置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記第１の目的は、培養液のＰ）（が設定値より低下し
た時基質流加を停止又は基質流加量を減少させ、ｐＨが
設定値より上昇した時、基質流加を開始又は基質流加量
を増加させることにより、達成される。

本発明にあたり使用した菌株を示す。使用した菌株はｔ
ｒｐ（トリプトファン）プロモータにβ−ｇａｌ（β−
ガラクトシダーゼ）遺伝子を連結した複合プラスミドｐ
ＴＲＥＺ　１を保持する大腸菌ＨＢＩＯＩ　　（微生物
受配番号：微工研菌寄第８１３６号）である。複合プラ
スミドｐＴＲＥＺ　１のｔｒｐプロモータ部分は大腸菌
のｔｒｐオペロンのプロモータ＋　ｔｒｐ　Ｌ　（リー
ダペプチド）及びｔｒｐ　Ｅ　（アントラニール酸合成
酵素）の先端部分の一部を含む約５００ｂｐ　（ｂａｓ
ｅ　ｐａｉｒｓ、塩基対）のＤＮＡ断片であり、ｐ　Ｂ
　Ｒ３２２プラスミドのＥｃｏＲ１部位に挿入した。一
方、β−ｇａｌ遺伝子はｐ　Ｍ　Ｃ１４０３（Ｊ　、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４３．　ｐ９７１−９８０．
１９８０）より切り出した６　、　２　ｋｂｐの大きさ
のもので、ｔｒｐプロモーターのＥｃｏＲ１部位とＰ　
Ｂ　Ｒ３２２のＳａｌ　１部位間に挿入した。このよう
に複合プラスミドＰＴＲＥＺ１のβ−ｇａｌ遺伝子はｔ
ｒｐプロモーターの制御下にある。

ｔｒｐプロモーターを有する複合プラスミドはＩＡ（３
−β−インドールアクリル酸）により遺伝子の発現を誘
導されることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ、　２９１
．　ｐ５０３〜５０６．１９８１）。

大腸菌が有機酸を生成することは一般に知られているが
１本発明者らは上記遺伝子組換え菌ＨＢ１０１［ｐＴＲ
ＥＺ　１　］を用いて検討した結果、有機酸の中でも特
に酢酸が多量に生成され増殖が阻害されることを明らか
にした。第１図に溶存酸素濃度を指標として溶存酸素濃
度が急上昇した時点で基質を添加した流加培養の結果を
示す。菌体は基質中のグルコースを炭素源として増殖し
ながら酢酸を生成した。酢酸濃度が約１５　ｇ　／　Ｑ
となった培養１４時時間口降は、グルコースが消費され
るにも拘らず菌体増殖は停止した。一方、酢酸は生成さ
れ続けた。このように酢酸が一定濃度以上、培養液中に
蓄積されると菌体増殖が停止し、菌体の高密度化を防げ
ることが分った。そこで、遺伝子組換え大腸菌の増殖活
性に対する酢酸の影響について検討した。その結果を第
２図に示す。菌゛体の比増殖速度は酢酸濃度が１５　ｇ
　／　Ｑ以上で著しく低下しており、遺伝子の発現も酢
酸濃度１５　ｇ　／　Ｑ以上で著しく阻害された。これ
により、効率的に遺伝子産物を代謝生産させるためには
、酢酸濃度を１５　ｇ　／　Ｑ以上、好ましくは５ｇ／
Ｑ以下に抑制すべきことが分った。

菌体により生成された酢酸を除去する方法として酢酸を
菌体自体に資化させることを考え、その可能性を検討す
るために、酢酸を含む培地に菌体を接種し、坂ロフラス
コを用いて振どう培養した。

培養液中の酢酸濃度の経時変化を第３図に、その時の菌
体濃度の経時変化を第４図に示す。第３図に示すように
、培養開始時にグルコースを１　ｇ／　Ｑ添加している
ので培養２時間口まで酢酸濃度は上昇したが、その後酢
酸濃度は減少していった。また、第４図からどの酢酸濃
度においても菌体が増殖し、酢酸を添加しない場合に比
べて菌体濃度が高くなることが分った。したがって、菌
体は酢酸を資化することができた。これにより、酢酸濃
度を指標として基質を流加する方法が考えられるが、酢
酸濃度の測定にはガスクロマトグラフなどの分析機器及
び相当の分析時間が必要である。

ところで、酢酸の生成と資化による培養液中のｐＨ変化
と酢酸濃度の関係を考えると、酢酸濃度はｐＨに比例す
る筈である。そこで、後述する実施例１に示した培地組
成と同じ培地に酢酸を添加したときの酢酸濃度とｐＨの
変化を第５図に示す。

図から、酢酸濃度とｐＨは相関関係にあることが分った
。また、培地の種類や培養条件が異なっても両者には相
関が成立つと考えられた。したがって、培養液のｐＨの
指標として基質流加制御を行えば、培養液中の酢酸濃度
を制御できる。

さらに、大腸菌が酢酸を生成しないように基質を流加す
ることが菌体増殖を最適な状態に維持することになると
考えられる。よって、ｐＨを一定範囲内に維持するよう
に基質流加を行えば培養液中への酢酸の蓄積をなくすこ
とができると考えた。

以上の結果１本発明者らは培養液のｐＨが低下した場合
基質流加を停止又は基質流加量を減少させて菌体に酢酸
を資化させ、ｐＨが上昇した場合基質流加を開始又は基
質流加量を増加させることを特徴とする流加培養方法を
発明するに至った。

本発明において、酢又はアルカリ性物質などのｐＨｍ整
剤を添加してｐＨを制御する場合、その設定値は基質流
加のためのｐＨの設定値より広い範囲にする必要がある
。

本発明において基質中に含まれる糖として、例えば、グ
ルコース、マンニトールソルビトール、サッカロースな
どがある。また、使用できる細胞としては前記遺伝子組
換え大腸菌以外にも、例えば酵母、枯草菌、放線菌及び
動植物細胞などについても有機酸を生成及び資化するこ
とが可能であり、その有機酸により増殖が阻害される場
合には本発明が適用可能である。

本発明の基本的な装置の一例を第６図に示す。

培養槽１に種菌と培養基質を入れ培養を開始すると菌体
が有機酸を生成することにより培養液のｐＨは低下する
。このｐＨの変化量をｐＨセンサー２により感知しｐＨ
計３から制御器４へ信号を出力する。制御器４はｐＨが
設定値より低くなったと判断した時基質流加を停止又は
基質流加量を減少させる信号を定量ポンプ５に出力する
。菌体は培養液中の酢酸を資化し始め培養液のｐＨは上
昇し、ｐＨ変化量がｐＨセンサー２及びｐＨ計３から制
御器４へ入力される。ｐＨが設定値より高くなった時、
制御器４は定量ポンプ５に基質流加の開始又は基質流加
量の増加を指示する信号を出力する。以上の操作を繰り
返すことにより本発明を実施することができる。

上記第２の目的は、迅速に測定される培養液のｐＨを指
標とした基質流加制御方法と定期的又は随時測定される
培養液中の酢酸濃度を指標とした基質流加制御方法を組
合せた制御方法により達成される。

制御方法を示すフローチャートの一例を第８図に示す、
培養液中の酢酸濃度が未測定の場合で培養液のｐＨが低
下した時は基質流加量を減少させ、上昇した時は基質流
加量を増加させる。また、培養液中の酢酸濃度を測定し
た時に酢酸濃度が設定値より高い場合は基質流加量を減
少させ、低い場合は基質流加量が増加させることにより
、迅速かつ確実に好適な基質流加を行える。

本願の第２の発明にあたり使用した菌株は、ｔｒｐ（ト
リプトファン）プロモータにβ−ｇａｌ（β−ガラクト
シダーゼ）遺伝子を連結した複合プラスミドＰＴＲＥＺ
　１を保持する大腸菌ＨＢ１０１［ＰＴＲＥＺ　１１　
　（微工研菌寄第８１３６号）　テある。

複合プラスミドρＴＲＥＺ　１のｔｒｐプロモータ部分
は大腸菌のｔｒｐオペロンのプロモータ、ｔｒｐ　Ｌ（
リーダペプチド）及びｔｒｐ　Ｅ　（アントラニル酸合
成酵素）の先端部分の一部を含む約５００ｂｐ（ｂａｓ
ｅ　Ｐａ１ｒｓ、塩基対）のＤＮＡ断片であり、ｐ　Ｂ
　Ｒ３２２プラスミドのＥｃｏＲ１部位に挿入した。

一方、β−ｇａｌ遺伝子はｐ　ＭＣ１４０３（Ｊ　。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４３．　Ｐ９７１〜９８０．
１９８０　）より切り出した６　、　２　ｋｂｐの大き
さであり、ｔｒｐプロモータのＥｃｏＲ１部位とｐ　Ｂ
　Ｒ３２２のＳａｌ　１部位間に挿入した。このように
複合プラスミドｐＴＲＥＺ　１のβ−ｇａｌ遺伝子はｔ
ｒｐプロモータの制御下にある。

ｔｒｐプロモータを有する複合プラスミドはＩＡ（３−
β−インドールアクリル酸）により遺伝子の発現を誘導
されることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ。

２９１、　Ｐ５０３〜５０６．１９８１）。

大腸菌が有機酸を生成することは一般に知られているが
、本発明者らが上記遺伝子組換え菌ＨＢ１０１［ｐＴＲ
ＥＺ　１　］を用いて検討した結果、有機酸の中でも酢
酸が多量に生成されていた。そこで、菌体の増殖活性に
対する酢酸濃度の影響について検討した。その結果を第
９図に示す。菌体の比増殖速度は酢酸濃度１５　ｇ　／
　Ｑ以上で著しく低下しており、遺伝子の発現も１５　
ｇ　／　Ｑ以上で著しく阻害され、β−ｇａｌはほとん
ど生成されなかった。

以上の結果から、効率的に菌体を増殖させ、かつ、遺伝
子産物を生産させるには、酢ａ濃度を１５ｇ／Ｑ以下好
ましくは５　ｇ　／　Ｑ以上に抑制すべきことが分った
。

酢ｍ′ａ度を一定範囲に抑制するには酢酸を除去しなけ
ればならない。そこで、その方法として菌体に酢酸を資
化させることを考え、可能性を検討した。結果を第１０
図に示す。培養開始時にグルコースをｌ　ｇ　／　Ｑ添
加しているので、培養初期に酢酸濃度が上昇したが、そ
の後酢酸濃度は減少した。この時の菌体濃度の経時変化
を第１１図に示す。酢酸を添加しなかった場合に比べて
、すべて菌体濃度が高くなった。したがって、菌体は酢
酸を資化できるといえる。

これにより、酢酸濃度を指標とした基質流加制御方法が
考えられるが、ガスクロマトグラフや細管式等速電気泳
動装置などによる酢酸濃度の測定には士数分の分析時間
を必要とするために、菌体の生理活性に応じた基質流加
制御を行うには時間遅れが問題となる。

そこで、連続的に測定でき、かつ、感度の高いｐＨと酢
酸濃度の関係を考えると、ｐＨは酢酸濃度の変化に影響
される筈である。そこで、後述する実施例１の培地に酢
酸を添加した場合のｐＨ変化量と酢酸濃度の関係を第１
２図に示す。図から明らかなように、酢酸濃度とｐＨは
相関関係にある。したがって、酢酸が生成されている時
ｐＨは低下し、資化されている時ｐＨは上昇することに
なる。

以上の結果から、ｐＨの変化により感度良く迅速に基質
流加を制御できることが分った。しかし、培養中には酢
酸以外の有機酸の生成やｐＨ調整剤の添加によるｐＨの
変化が考えられる。そこで。

定期的又は随時測定した酢酸濃度を用いて基質流加制御
を行ない、Ｐ、　Ｈを指標とした制御方法を支援するこ
とにより、確実に酢酸濃度を一定範囲内に維持するよう
に基質流加を制御できると考え、ｐＨと酢酸濃度の２つ
を指標として基質流加制御を行うことを特徴とする流加
培養方法を発明するに至った。

本発明において、ｐＨの設定値は使用する微生物の至適
ｐＨ，例えば大腸菌の場合ｐ　Ｈ７もしくは、６．５〜
７．５　などのように設定することができる。また、酢
酸濃度の設定値は５ｇ／Ｑ以下もしくは１〜３ｇＩＱな
どのように設定することができる。

本発明において基質中に含まれる糖として、例えば、グ
ルコース、マンニトール、ソルビトール、サッカロース
などがある。また、使用できる細胞としては前記遺伝子
組換え大腸菌以外にも例えば、酵母、枯草菌、放線菌及
び動植物細胞などの中で、酢酸を生成及び資化すること
が可能であり酢酸により増殖を阻害される細胞であれば
、本発明が適用可能である。

本発明の基本的な装置の一例を第１３図に示す。

培養槽１には菌体と培地から成る培養液が仕込まれてお
り、培養液に接するようにｐＨセンサー２と培養液抜出
し用溝￥／７が設置されている。

ｐＨセンサー２はｐＨ計３に接続されており、ｐＨ計３
から制御器４へｐＨ値が出力される。試料調整装置８は
導管７を通ってきた培養液から菌体を分離し、酸性溶液
の試料に調整する。酢酸分析装置７に例えばガスクロマ
トグラフが収納されている場合試料は酸性溶液のまま使
用される。酢酸分析装置９により測定された酢酸濃度の
値は制御器４へ出力される。制御器４は入力されたｐＨ
値と酢酸濃度値を用いて前記第８図に示すフローチャー
トに従って、定量ポンプ５に基質流加を制御する信号を
出力する。定量ポンプ５により基質槽６から培養槽１へ
基質が流加される。

〔作用〕

前記本願の第１の発明について： 菌体が増殖に伴って有機酸を生成又はその有機酸を資化
する場合、培養液中の有機酸濃度はｐＨの変化に比例す
る。そこで、ｐＨの変化に基づいて基質流加を制御する
ことによって培養液中の有機酸濃度を一定範囲内に保つ
ことが可能となるので、菌体の増殖阻害や遺伝子発現へ
の悪影響を防止できる。

前記本願の第２の発明について： 微生物が酢酸を生成又は資化する場合、培養液中の酢酸
濃度の変化とｐＨの変化は比例する。そこで、迅速に測
定できるｐＨの変化に基づして基質流加を精密制御する
ことにより酢酸の蓄積を防止し、かつ、測定した培養液
中の酢酸濃度を用いて、ｐＨを指標とした基質流加制御
を支援する。

このように２つの制御指標を組合せることにより、迅速
かつ確実に酢′ｆＩ！濃度を一定範囲内に保つことが可
能となるので、微生物の増殖阻害や遺伝子発現への悪影
響を防止できる。

〔実施例〕

以下、本願の第１の発明群に係わる一実施例を第７図に
より説明するが１本発明はこれによりなんら限定される
ものではない。

実施例Ｉ ＮＨ４ＣＱ　　１　ｇ、　ＮａｚＨＰＯａ　　６　ｇ、
　ＫＨｚＰＯ４３ｇ。

Ｎａｃ９　０．５ｇ、Ｍｇ５Ｏ＋７）１ｚ０　０．５ｇ
、ＣａＣＱｚ・２Ｈ２００，０１５ｇ、チアミン塩酸塩
０．１　ｇ、プロリン０．１ｇ、　　トリプトファン０
．０２　ｇ、グルコース５ｇ、カザミノ酸２．５ｇ、酵
母エキス１．５ｇ、蒸溜水ＩＱからなる培地を２ＮＮａ
ＯＨ水溶液にてｐＨ７に調整し、常法により滅菌処理し
た。尚、培養前にアンピシリンを５０１１Ｉｇ／Ｑとな
るように加えた。滅菌した５　００　ｍ　Ｑ坂ロフラス
コに上記培地を５０　ｍ　ｎ加え、ＨＢ　１０１［ｐＴ
ＲＥＺ　１　］株（微工研菌寄第８１３６号）を−白金
耳接種し、３７℃、振幅７】、１１５回／ｌ１ｉｎの条
件で一晩振どう培養したものを種菌液とした。上記培地
を滅菌済みの５℃培養槽に入れ５種菌液２００ｍＱを接
種し、初発液量２Ｑ、３７℃、通気量２Ｑ／ｗｉｎで培
養を開始した。基質流加に用いる流加培地の組成は。

グルコース２００　ｇ　／　Ｑ　、カザミノ酸１００ｇ
／１２、酵母エキス６０　ｇ　／　ｎ、プロリン４ｇ／
Ω、トリプトファン０．４ｇ／Ｑ、アンピシリン１ｇ／
Ｑとした。この流加培地を培養液のｐＨが６．８　より
低くなった時流加を停止し、ｐＨが７．２　より高くな
った時に流加を開始して流加培養した結果が第７図であ
る。

培養６時間目以降、流加を停止すればｐＨが上昇し、開
始すればｐＨが低下する良好な相関が得られた。よって
５酢酸濃度をＯ〜２ｇ／Ｑの範囲に保つことができ、菌
体は酢酸による阻害を受けず培養２６時間目には２８ｇ
／Ｑに達した。培地中にトリプトファンを入れることで
トリプトファンプロモーターの働きを抑制していたので
培養２２時間目まではβ−ｇａｌ生産を抑えることがで
きた。培養２２時間目以降、トリプトファン濃度の低下
によると考えられる脱抑制が起こり、β−ｇ　ａ　ｌは
培養２６時間目に６２　Ｕ　／　ｍ　Ｑに達した。本実
施例ではトリプトファン濃度の低下により脱抑制が起こ
りβ−ｇａｌが生産されたが、誘導剤であるＩＡの添加
によってもβ−ｇａｌ生産を開始することができる。

以上、ｐＨの変化に基づいて基質を流加することにより
、菌体濃度は２８ｇ／Ｑの高密度に達し、菌体収率も０
．５７　ｇ　−ｃｅｌｌ／　ｇ−ｇｌｎｃｏｓｅの高い
値に維持できた。また、β−ｇａｌ生産量が６２Ｕ／ｍ
ｆｌとなったことから、遺伝子発現も十分に行われた。

以下、本願の第２の発明の一実施例を第１４図により説
明するが、本発明はこれによりなんら限定されるもので
はない。

実施例２ 使用した菌株はＨＢ　１０１［ＰＴＲＥＺ　１コ　（微
工研菌寄第８１３６号）であり１本菌株が保持するβ−
ｇａｌ遺伝子はｔｒｐプロモータの制御下にあるので、
培養前半はβ−ｇａｌ生産を抑制するために基質中にト
リプトファンを加え、培養後半は脱抑制させるためにト
リプトファンを含まない基質を流加した。酢酸濃度の測
定にはガスクロマトグラフを用い、分離カラムはＰ　Ｅ
　Ｇ　６０００　＋　Ｆｌｎｓｉｎ　Ｐ（ガスクロ工業
製）を使用した。

初発培地 ＮＨ４Ｃｌ　　１　ｇ　／　Ｑ　、　ＮａｚＨＰ０４６
　ｇ　／　Ｑ　、Ｋ）ＩｚＰＯ４３ｇ／　　Ｑ　　、　
Ｎａｃｌ　　　０．５　　ｇ／　　Ｑ、　　Ｍｇ５Ｏａ
　　・　７Ｈ２００，５ｇ／　Ｑ　、　ＣａＣ１ｚ・２
Ｈ２００，０１５ｇ／　Ｑ、チアミン塩酸塩０．１ｇ／
Ｑ、プロリン０　、１　ｇ／　Ｑ、トリプトファン０．
０２　ｇ　／　Ｑ　、グルコース５　ｇ　／　ｎ、カザ
ミノ酸２．５ｇ／Ｑ、酵母エキス１．５ｇ／Ｑ、アンピ
シリン０．０５ｇ／ｆ１．ｐＨ７゜流加培地 Ａニゲルコース２００　ｇ　／　Ｑ、カザミノ酸１００
ｇ／Ｑ、酵母エキス６０　ｇ　／　１１、プロリン４ｇ
／ρ、トリプトファン０．４　　ｇ／ρ、アンピシリン
Ｉｇ／Ｑ、ｐＨ７゜ Ｂニゲルコース２００ｇ／１２、カザミノ酸１００　ｇ
　／　Ｑ、プロリン４　ｇ　／　Ｑ、アンピシリンＩｇ
／１２、ｐＨ７゜ 培養条件 種培養：５００ｍＱ坂ロフラスコに初発培地５０　ｍ　
Ｑを加え、菌体を一白金耳接種したものを３７℃、振幅
７１．１１５　回／ｍａｎの条件で一晩振どう培養した
。

本培養：上記種培養液２００ｍｕを初発培地の入った５
Ｑ槽に接種し、初発液量２Ｑで３７℃、通気量２　ｆ２
　／ｗｉｎ　、撹拌数４００〜１１０００ｒｐの条件で
培養を開始した。培養１２時間目までの基質流加には流
加培地Ａを、それ以降は流加培地Ｂを用いた。流加制御
の設定値は培養１２時間目までｐＨは６．８〜７．２の
範囲、酢酸濃度は０．８ｇ／Ｑ以下とし、培養１２時間
目以降、酢酸濃度は２　ｇ　／　Ｑ以下とした。

結果：培養期間を通して培養液中の酢酸濃度は２ｇ／ρ
以下に抑えることができ、菌体は培養終了時まで順調に
増殖し、菌体濃度は培養１８時間目に１９．３ｇ／Ｑに
達した。また、流加培地をＡがらＢへ切り換えることで
、β−ｇａｌ生産を開始させることができ、４　、３　
Ｕ　／　ｍｇ−ｄｒｙｃｅｌｌという良好な遺伝子発現
がなされた。菌体収率は、０．５４匹・ｃｅｌｌ／　ｇ
−ｇｌｎｃｏｓｅの高い値に維持でき、好適な基質流加
を行うことができた。

〔発明の効果〕

本願の第１の発明によれば、培養液中の酢酸濃度を低濃
度に保つことができるので、増殖阻害を防止し、容易に
２５　ｇ　／　Ｑ以上の高密度培養、０　、５　ｇ−ｃ
ｅｌｌ／　ｇ”ｇｌｎｃｏｓｅ以上の高菌体収率及び５
０Ｕ／ｍＱ以上のβ−ｇａｌ生産が行える効果がある。

また、ｐＨ調整剤が不要又は使用量の低減が可能なので
、培養装置を簡略化及び経費を節約する効果がある。

本願の第２の発明によれば、培養液中の酢酸濃度を低濃
度に保ちながら基質を供給することができるので、増殖
阻害を防止し容易に１９　ｇ　／　Ｑ以上の高密度培養
、０　、５　ｇ−ｃｅｌｌ／　ｇ−ｇｌｎｃｏｓｅ以上
の高菌体収率及びβ−ｇａｌ生産性が４Ｕ／＋＊ｇ以上
の高効率発現が行える効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は溶存酸素濃度を指標としだ流加培養の一例を表
わす図、第２図は培養液中の酢酸濃度と比増殖速度及び
β−ｇａｌ生産量の一例を表わす図、第３図は遺伝子組
換え大腸菌による酢酸資化の一例を表わす図、第４図は
酢酸資化時の菌体濃度の経時変化の一例を表わす図、第
５図は酢酸濃度とｐＨの関係の一例を表わす図、第６図
は培養装置の一実施例の概略を表わす図、第７図は本発
明の一実施例の培養結果を表わす図である。第８図は基
質流加制御方法を表わすフロチャート、第９図は培養液
中の酢酸濃度と比増殖速度及びβ−ｇａｌ生産量の一例
を表わす図、第１０図は遺伝子組換え大腸菌による酢酸
資化の一例を表わす図、第１１図は酢酸資化時の菌体濃
度の経時変化の一例を表わす図、第１２図は酢酸濃度と
ｐＨの関係の一例を表わす図、第１３図は培養装置の一
実施例の概略を表わす図、第１４図は本発明の一実施例
の培養結果を表わす図である。 １・・・培養槽、２・・・ｐＨセンター、３・・・ｐＨ
計、４・・・制御器、５・・・定量ポンプ、６・・・基
質槽、７・・・培養液抜き出し用導管、８・・・試料調
整装置、９・・・酢酸分析装置。 箭 図 嶋養時団（ｈ） ア 函 俤 嫉、 濃 痰 （牙／Ｊり 堀 已 遣 苓 崎 （ｈ） 第 函 ＋鞠ｌＹ鰻壌友 ０　（２／り Ｉト （２／ス） ＝ムー ５（肋） 傍 委 時 閏 茹 邑 １柾 醸壊＆ｔｊｊ／ｉ） 系 す 品 ｐＨセシザー 系 ？ 函 あ 図 考 茶 吋 閂 （ｈ） 第 図 奸 咲 壊 戻 （＃／１） −に−ネ刀ダ酢市史叡 １ヘー １ト Ｏ（私） （・） ５（・） （？１） １設壌友 （？／ｉ） 采 図 渚 峯 吐 Ｉｒ１ （ｈ） 茶 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも有機酸を生成する微生物を培養する過程
   において培養液のｐＨが設定値より低下した時、基質流
   加を停止するか又は基質流加量を減ずること、設定値よ
   り上昇した時、基質流加を開始するか又は基質流加量を
   増やすことを特徴とする微生物の流加培養方法。 ２、該微生物が大腸菌とくに組換え遺伝子を保持する大
   腸菌であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の微生物の流加培養方法。 ３、該基質中の炭素源として糖を含むことを特徴とする
   特許請求の範囲第１及び２項のいずれかに記載の微生物
   の流加培養方法。 ４、該有機酸が酢酸であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１、２及び３項のいずれに記載の微生物の流加培
   養方法。 ５、該遺伝子組換え菌が保持する発現ベクターがトリプ
   トファンプロモータを含有していることを特徴とする特
   許請求の範囲第１、２、３及び４項のいずれかに記載の
   微生物の流加培養方法。 ６、所定の微生物培養槽と、当該微生物培養槽中の培養
   液のｐＨを測定するための測定手段と、培養基質流加を
   実施せしむる定量ポンプと、前記ｐＨを測定するための
   測定手段よりの信号に基づいて培養液のｐＨを所定値と
   比較し、当該ｐＨが所定値より低下もしくは増大した時
   、基質流加を制御する手段を少なくとも有することを特
   徴とする微生物の流加培養装置。 ７、少なくとも酢酸を生成し、該酢酸により増殖を阻害
   される微生物の培養に際し、培養液のｐＨが設定値より
   低下した場合は基質流加量を減少し、設定値より上昇し
   た場合は基質流加量を増加すること、または酢酸濃度が
   設定値より低い場合は基質流加を開始又は基質流加量を
   増加し、設定値より高い場合は基質流加を停止又は基質
   流加量を減少することを特徴とする流加制御方法。 ８、該微生物が大腸菌とくに遺伝子組換え大腸菌である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の流加制御
   方法。 ９、該基質中の炭素源として糖を含むことを特徴とする
   特許請求の範囲第７及び８項のいずれかに記載の流加制
   御方法。 １０、該遺伝子組換え大腸菌が保持する発現ベクターが
   トリプトファンプロモータを含有していることを特徴と
   する特許請求の範囲第７、８及び９項のいずれかに記載
   の流加制御方法。