JP2676511B2 - 酢酸を指標とした培養方法及びその装置 - Google Patents
酢酸を指標とした培養方法及びその装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、微生物、得に遺伝子組換え微生物を用い
て、酵素や生理活性物質などを生産させるに際し、目的
とする有用物質を効率良く生産させるための培養制御の
方法及びその装置に関する。 〔従来の技術〕 従来、微生物、特に遺伝子組換え微生物などを培養す
ることにより、その代謝物である抗生物質、アミノ酸、
酵素又はホルモンなどの生理活性物質などを生産するこ
とが行われている。この培養方法は大部分が培養槽に培
地と種細胞を入れて培養するだけの回分培養であり生産
性は低い。 そこで、生産性を高めるために培養途中で基質又は誘
導剤を添加する培養方法が行われているが、培養のどの
時点で添加するかが問題となつており、その明確な指標
は知られていない。一方、パン酵母培養の場合はエタノ
ールの生成を呼吸商により検知して基質を流加する方法
（特開昭57−36983号、同58−78584号）が開示されてい
るが、これは菌体を得るための培養であり、代謝物生産
とは全く異なる。 また、基質の添加にもかかわらず培養中に細胞の増殖
速度が低下する減少がある。これは増殖阻害物質の培養
液中への蓄積が原因であるといわれている。しかし、増
殖阻害物質についての知見は少なく、この点からも効率
的な培養を達成することが困難になつている。この増殖
阻害物質を特定せずに、これを除去するために培養液を
断続的又は連続的に抜出し、遠心分離により菌体を回収
して再び培養槽に仕込む方法（特開昭53−29985号）が
提案されている。これは酵母を対象としたもので、細胞
を大量に生産させるためのプロセスであり、細胞に目的
物質を生産させるためのプロセスではない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記従来技術は基質などの添加や増殖阻害物質の検知
の点について配慮がなされておらず、効率的な細胞増殖
や代謝物質の生産が難しいという問題があつた。 本発明の目的は、微生物又は動植物細胞、特に遺伝子
組換え微生物を培養し、その代謝物質を生産させるに際
して、培養液中の酢酸を指標とした培養制御の方法及び
その装置を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は培養方法
に関する発明であつて、微生物に基質を流加して培養
し、代謝物を生産する培養方法において、基質の流加に
よる微生物の増殖に連動して酢酸が生成された培養液中
の酢酸濃度を検知し、該酢酸濃度が設定値を超えたとき
は、基質の流加量を低下し、該微生物により該培養液中
の酢酸を資化して該酢酸濃度を設定値よりも低下させる
処理を包含することを特徴とする。 また、本発明の第２の発明は培養装置に関する発明で
あつて、基質を貯留するための基質槽、培養を行う培養
槽、基質の流加による微生物の増殖と連動して酢酸が生
成された培養液中の酢酸濃度を検知する分析装置、基質
を基質槽から培養槽に流加するための流量可変式の基質
流加装置、及び酢酸濃度が設定値を超えたことを該分析
装置が検知したとき該基質流加装置に基質流量を低下す
る信号を出力する制御装置を包含することを特徴とす
る。 以下、本発明に関する具体的な説明として、プロモー
タにtrp（トリプトフアン）プロモータを用い、それに
β−gal（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子を連結した複
合プラスミドpTREZ1を保持する大腸菌HB101株〔微工研
条寄第815号（FERM BP−815）〕による培養制御の方法
及び装置を示すが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。 複合プラスミドpTREZ1のtrpプロモータ部分は大腸菌
のtrpオペロンのプロモータ、trpL（リーダペプタイ
ド）及びtrpE（アントラニル酸合成酵素）の先端部分の
一部を含む約500bp（base pairs、塩基対）のDNA断片で
あり、pBR322プラスミドのEcoR I部位に挿入したもので
ある。一方、β−gal遺伝子はpMC1403〔ジヤーナル オ
ブ バクテリオロジー（J.Bacteriol.）第143巻、第971
〜980頁（1980）〕より切出した6.2kbの大きさのもの
で、trpプロモータのEcoR I部位とpBR322のSal I部位間
に挿入した。このように、複合プラスミドpTREZ1のβ−
gal遺伝子はtrpプロモータの制御下にある。 trpプロモータを有する複合プラスミドは、培養中に
３−β−インドールアクリル酸（以下、IAと略記する）
を添加することにより、遺伝子が発現することが知られ
ている〔ネーチヤー（Nature）第291巻、第503〜506頁
（1981）〕。これは遺伝子の転写を制御するリプレツサ
がIAにより不活性化されるため、RNAポリメラーゼによ
るmRNAの合成が開始されるからである。 本発明者らはβ−galを生産する遺伝子組換え大腸菌
をモデルに用いてβ−galを効率よく生産させるための
培養制御方法について種々検討した結果、菌体を効率よ
く増殖させ、目的とする物質を効率よく生産させること
に成功し、本発明を完成するに至つた。 第２図に遺伝子組換え大腸菌を用いて流加培養を行つ
た結果を示す。すなわち第２図は、該流加培養結果の１
例を、培養時間（ｈ、横軸）と、菌体濃度（g/）、β
−gal量（U/ml）及びグルコース濃度（g/）〔縦軸〕
との関係で示すグラフである。 培養は、溶存酸素濃度の上昇を指標として基質である
グルコース、カザミノ酸培地を流加した。18時間目には
菌体濃度が13g/に達したが、これ以後菌体増殖は停止
した。β−gal生産を誘導させるため、誘導剤のIAと栄
養物質であるカザミノ酸を32時間目に添加したが、β−
gal生産は誘導されなかつた。このように、菌体増殖が
停止し、β−gal生産が誘導されないのは培養上清液に
菌体増殖やβ−gal生産を抑制する物質が存在するため
ではないかと推定した。 そこで、菌体増殖停止後の培養19時間目の培養上清液
を採取し、そこから限外過膜とイオン交換樹脂を用い
て菌体増殖阻害物質を分離した。この分離液について細
管式等速電気泳動分析装置により有機酸を分析した結
果、酢酸が33g/の高濃度に蓄積していることが分つ
た。そこで、相当量の酢酸塩を新鮮培地に添加して培養
したところ、菌体の増殖が阻害された（第３図参照）。
このことから菌体の増殖阻害に関与している物質は酢酸
であると判明した。また、遺伝子の発現（β−galの生
産）に関しても、菌体の増殖阻害とほぼ同じ結果が得ら
れた（第４図参照）。すなわち、第３図は、培養液中の
酢酸濃度（g/、横軸）と比増殖速度（1/h、縦軸）と
の関係の１例を示すグラフであり、第４図は、培養液中
の酢酸濃度（g/、横軸）とβ−gal生産量（U/ml、縦
軸）との関係の１例を示すグラフである。 更に、ガスクロマトグラフイーを用いた培養上清液の
分析においても、酢酸であることを確認した。 以上のように、培養液中に蓄積した酢酸が菌体増殖を
阻害することから、本発明者らは酢酸を指標として基質
を流加することにより菌体を効率よく増殖させることが
できるのではないかと考えるに至つた。それには培養液
中に蓄積いた酢酸を除去する必要があるが、本発明者ら
は酢酸を菌体に資化させることにより酢酸を除去するこ
とにした。そこで、培養液中に酢酸塩を酢酸濃度として
０〜10g/添加して、遺伝子組換え菌の酢酸資化の可能
性について検討した。第５図に示すように、培養液には
グルコースを1g/添加したため培養初期に培養液中の
酢酸濃度が高くなつたが、以後酢酸濃度は徐々に低下し
た。これより培養液中の酢酸は菌体により資化されるこ
とが分つた。その持の菌体濃度の経時変化を第６図に示
す。すなわち第５図は、遺伝子組換え大腸菌の酢酸資化
の１例を、培養時間（ｈ、横軸）と酢酸濃度（g/、縦
軸）との関係で示すグラフである。第５図において、初
発酢酸濃度を、g/単位で、白丸印は０、黒丸印は１、
白三角印は５、黒三角印は10とした場合について示して
いる。第６図は、第５図の各条件における培養時間
（ｈ、横軸）と菌体濃度（OD550nm、横軸）との関係で
菌体増殖を示すグラフである。第６図から明らかなよう
に、菌体濃度は菌体の酢酸資化により、酢酸を添加しな
い場合より増加した。 このことから、酢酸の資化、従つて酢酸濃度の調節
は、基質の流加量の調節により行うことが、簡便であり
有効であつて好適であることが判明した。 以上の結果より、本発明者らは培養液中の酢酸濃度を
検知し、酢酸濃度が設定値よりも高くなつた場合は基質
流加量を減らすか基質流加を止めることにより菌体に酢
酸を資化させて酢酸濃度を低下させること、酢酸濃度が
設定値よりも低下した時点で、基質流加量を増加させる
か、基質流加を再開する培養制御の方法が好適であるこ
とを見出した。 本発明における培養液中の酢酸濃度は第３図の結果よ
り15g/以下、望ましくは5g/以下に抑制すべきであ
ることがわかる。なお、基質流加を制御する設定値とし
ては酢酸濃度が5g/と設定するだけでなく、例えば１
〜3g/というように設定範囲を設けることも可能であ
る。 更に、誘導剤の添加により遺伝子を発現させる際に
も、培養液中の酢酸濃度は菌体増殖の場合と同様な阻害
を示した（第４図）。これより遺伝子発現における場合
も酢酸濃度は5g/以下にすることが望ましい。 本発明において酢酸は培養上清液などを細管式等速電
気泳動装置、ガスクロマトグラフ装置、液体クロマトグ
ラフ装置、及び質量分析計などに導入することにより迅
速かつ正確に検出することができる。 本発明における細胞としては前記した遺伝子組換え大
腸菌以外の細胞、例えば酵母、枯草菌、放線菌、などに
ついても、それらの細胞が酢酸によつて増殖が阻害され
るが、その酢酸を資化する能力がある場合には、本発明
の適用が可能である。 また、目的物質の生産を誘導させるには、細胞が遺伝
子組換え大腸菌の場合にtrpプロモータに対しては、上
記のIAの添加又は遺伝子の発現を抑制するトリプトフア
ンを含まない、又はトリプトフアン濃度が低い培地で培
養することが、またlacプロモータ、tacプロモータに対
してはIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシ
ド）等の添加が、PLプロモータに対しては培養液の温度
を上昇させることが有効である。目的物質の生産を誘導
させる時に添加する栄養物質としては、アミノ酸の混合
物であるカザミノ酸、アミノ酸、グルコース、酵母エキ
スなどが有効である。 既に概説した本発明の培養装置においては、酢酸濃度
分析装置の前に、採取した培養液試料を分析装置に適合
するように調製するための試料調製装置を設けてもよい
が必須のものではない。 また基質流加装置の好適な例としてはポンプがある。 その他、当然これら各装置を連結する導管、原料供給
設備などが取付けられる。 〔実施例〕 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。 実施例１ 本発明の培養装置の１実施例の概要図を第１図に示
す。 第１図において、符号１は培養槽、２はかくはん装
置、３は基質槽、４は基質流加用ポンプ、５は試料調製
装置、６は酢酸濃度分析装置、７は制御用電子計算機、
８〜11は導管を意味する。 培地と微生物とから成る培養液を仕込んだ培養槽１に
はモータＭを備えたかくはん装置２のかくはん部が収納
されている。空気導入用導管８は培養槽１の底部に接続
され、培養槽１の上部には排ガス排出用導管９が接続さ
れている。培養槽１の側面には、培養液に接するように
培養液抜出し用導管11が接続され、導管11を介して試料
調製装置５と酢酸濃度分析装置６が接続されている。培
養槽１の上部には基質流加用導管10を介して、流量可変
式の基質流加用ポンプ４と基質槽３が接続されている。
制御用電子計算機７は酢酸濃度分析装置６と基質流加用
ポンプ４に接続されている。 試料調製装置５には菌体分離器と試料溶液の酸性化装
置が収納されている。酢酸濃度分析装置６には基質分析
計又はガスクロマトグラフ装置等が収納されている。 以下本実施例の動作を説明する。培養槽１内では微生
物と基質槽３より供給された基質及び導管８からの空気
がかくはん装置２によつてかくはんされ、微生物が増殖
する。培養液は導管11により抜出され、試料調製装置５
で菌体除去と酸による試料の酸性化を行つた後、酢酸濃
度分析装置６に導入される。酢酸濃度分析装置６にガス
クロマトグラフ装置が収納されている場合は試料は酸性
溶液のまま使用されるが、質量分析計が収納されている
場合は空気でバブリングすることにより気化された酢酸
が分析に供される。酢酸濃度分析装置６で分析された培
養液中の酢酸濃度の値は制御用電子計算機７に送られ、
設定値と比較される。酢酸濃度の値が設定値よりも高い
場合は基質流加を停止するか又は基質流加速度を遅くす
るように信号を基質流加用ポンプ４に送り、基質流加量
を調節する。一方、設定値よりも低い場合は基質流加を
開始するか又は基質流加速度を速くするように信号を基
質流加用ポンプ４に送り、基質流加量を調節する。以上
のように基質流加量を調節することで、培養液中の酢酸
濃度を設定値以下に制御でき、菌体の増殖速度を高レベ
ルに維持することができる。 実施例２ 菌体培養液中の酢酸をガスクロマトグラフ装置により
建築し、培養液中の酢酸濃度が2g/以下になるように
基質流加量を制御した。なお、培地には菌体増殖時のtr
pプロモータの働きを抑えるためにトリプトフアンを添
加した。 菌体：複合プラスミドpTREZ1を保持する大腸菌HB101
株。 初発培地:M9−カザミノ酸培地、組成はNH4Cl1g、Na2HPO
4を6g、KH2PO4を3g、NaCl5g、MgSO4・7H2Oを0.1g、CaCl
2・2H2Oを15mg、チアミン塩酸塩0.1g、プロリン0.1g、
トリプトフアン0.01g、グルコース5g、カザミノ酸2.5
g、酵母エキス1.5g、蒸留水１、pH7.0である。なお、
本培地には複合プラスミドを保持する大腸菌のみを増殖
させるため、アンピシリン（Ap）を50mg/添加した。 流加用培地：グルコース200g、プロリン4g、カザミノ酸
100g、酵母エキス60g、トリプトフアン0.4g、Ap 1g、蒸
留水１、pH7.0である。 培養条件：複合プラスミドを保持する大腸菌を50mgのM9
−カザミノ酸培地を入れた500ml容振とうフラスコ４本
に接種し、振とう培養機により、振幅7cm、振とう回数1
15回/min、37℃で一晩培養した。この種菌液200mlをM9
−カザミノ酸培地の入つた５ジヤーフアーメンタに接
種し、初発液量２で37℃、pH7.0通気量２/minで培
養を開始した。培養液中の酢酸濃度は培養上清液をPEG6
00＋フルシンＰ（FlusinP）（ガスクロ工業製）を充て
んしたガスクロマトグラフ装置に導入することにより測
定し、酢酸濃度が2g/に達した時点で基質流加を停止
した。 結果：結果を第７図に示す。すなわち第７図は本実施例
による培養結果の１例を、培養時間（ｈ、横軸）と、酢
酸濃度（g/）、菌体濃度（g/）、β−gal量（U/m
l）及び流加速度（ml/min）〔縦軸〕との関係で示すグ
ラフである。 第７図に示すように、基質の流加により酢酸が生成さ
れたが、基質流加を停止すると酢酸は菌体に資化され、
培養液中の酢酸濃度が低下した。このように培養液中の
酢酸濃度を低く抑えて培養することにより、培養30時間
目には菌体濃度は29g/の高密度に達した。トリプトフ
アンプロモータの働きを抑えるため、流加用培地中にト
リプトフアンを添加したので、培養22時間目まではβ−
gal生産を抑えることができた。しかし、培養22時間目
以降はトリプトフアン濃度の低下により脱抑制され、β
−galの生成が開始し、最終的にβ−gal生産量は104U/m
lに達した。本実施例ではトリプトフアン濃度低下によ
る脱抑制によりβ−galが生産されたのであるが、誘導
剤であるIAの添加によつてもβ−galの生産を開始でき
る。以上、培養液中の酢酸濃度を抑えることで、菌体濃
度は29g/の高密度に達し、菌体収率を0.57g・細胞/g
・グルコースの高い値に維持できた。 実施例３ 菌体培養液中の酢酸をガルクロマトグラフ装置により
検知し、培養液中の酢酸濃度が2g/以下になるように
基質流加量を制御した。培地へのトリプトフアン添加は
せずに、菌体増殖と連動したβ−galの生産を行つた。 トリプトフアンの無添加培地を用いた以外は、使用菌
株、培養条件共に実施例２と同様にして流加培養を行つ
た。 結果：培養結果の１例を、第７図と同様な関係で第８図
に示す。 第８図に示すように、菌体増殖と連動してβ−galが
生産された。培養30時間目には菌体濃度は36g/の高密
度に達し、菌体収率は0.54g・細胞/g・グルコースであ
つた。しかし、この時のβ−gal生産量は59U/mlであ
り、実施例１よりは低い値であつた。 実施例４ 菌体培養液中の酢酸をガスクロマトグラフ装置により
検知し、培養液中の酢酸濃度が2g/以下になるように
基質流加量を制御した。培養前期は流加用培地にトリプ
トフアンを添加し、β−gal生産を抑え、培養後期はト
リプトフアンを含まない流加用培地を用いて、β−gal
生産を行つた。 初発培地と培養前期に用いた流加用培地は実施例１と
同様な培地を用いたが、培養後期は実施例１の流加用培
地から酵母エキスとトリプトフアンを除いた流加用培地
を用いた。以上に述べた培地以外は、使用菌株、培養条
件共に実施例２と同様にして流加培養を行つた。 結果：培養結果の１例を、第７図と同様な関係で第９図
に示す。 第９図に示すように、培養12時間目にトリプトフアン
を含まない流加用培地を用いて流加を開始したところ、
β−gal生産が急激に始まり最大70U/mlのβ−galが生産
された。菌体濃度は18.6g/、菌体収率は0.52g・細胞/
g・グルコースであつた。 比較例１ 培養液中のグルコース濃度を実施例２及び３と同様に
1g/以下の低濃度になるように基質を流加した以外、
酢酸の生成を抑制する措置は採られなかつた。 使用菌株、培養条件共に実施例２と同様にして流加培
養を行つた。 結果：培養結果の１例を、第７図と同様な関係で第10図
に示す。 第10図に示すように、菌体増殖と連動して酢酸が生成
し、酢酸濃度が21g/になつた培養20時間目には菌体増
殖が停止した。この時の菌体濃度は21g/であつたが、
菌体収率は036g・細胞/g・グルコースと低く、非常に生
産効率が悪かつた。更に、β−gal生産量も8U/mlと極め
て低かつた。 〔発明の効果〕 以上説明したように、本発明によれば、培養液中の酢
酸濃度を抑えることができるので、容易に高密度培養、
高菌体収率及び目的物質の高生産量を達成できるという
顕著な効果が奏せられる。例えば、β−gal生産の場
合、25g/以上の高密度培養、0.5g・細胞/g・グルコー
ス以上の高菌体収率50U/以上の高いβ−gal生産量を達
成できる。
て、酵素や生理活性物質などを生産させるに際し、目的
とする有用物質を効率良く生産させるための培養制御の
方法及びその装置に関する。 〔従来の技術〕 従来、微生物、特に遺伝子組換え微生物などを培養す
ることにより、その代謝物である抗生物質、アミノ酸、
酵素又はホルモンなどの生理活性物質などを生産するこ
とが行われている。この培養方法は大部分が培養槽に培
地と種細胞を入れて培養するだけの回分培養であり生産
性は低い。 そこで、生産性を高めるために培養途中で基質又は誘
導剤を添加する培養方法が行われているが、培養のどの
時点で添加するかが問題となつており、その明確な指標
は知られていない。一方、パン酵母培養の場合はエタノ
ールの生成を呼吸商により検知して基質を流加する方法
（特開昭57−36983号、同58−78584号）が開示されてい
るが、これは菌体を得るための培養であり、代謝物生産
とは全く異なる。 また、基質の添加にもかかわらず培養中に細胞の増殖
速度が低下する減少がある。これは増殖阻害物質の培養
液中への蓄積が原因であるといわれている。しかし、増
殖阻害物質についての知見は少なく、この点からも効率
的な培養を達成することが困難になつている。この増殖
阻害物質を特定せずに、これを除去するために培養液を
断続的又は連続的に抜出し、遠心分離により菌体を回収
して再び培養槽に仕込む方法（特開昭53−29985号）が
提案されている。これは酵母を対象としたもので、細胞
を大量に生産させるためのプロセスであり、細胞に目的
物質を生産させるためのプロセスではない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 上記従来技術は基質などの添加や増殖阻害物質の検知
の点について配慮がなされておらず、効率的な細胞増殖
や代謝物質の生産が難しいという問題があつた。 本発明の目的は、微生物又は動植物細胞、特に遺伝子
組換え微生物を培養し、その代謝物質を生産させるに際
して、培養液中の酢酸を指標とした培養制御の方法及び
その装置を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は培養方法
に関する発明であつて、微生物に基質を流加して培養
し、代謝物を生産する培養方法において、基質の流加に
よる微生物の増殖に連動して酢酸が生成された培養液中
の酢酸濃度を検知し、該酢酸濃度が設定値を超えたとき
は、基質の流加量を低下し、該微生物により該培養液中
の酢酸を資化して該酢酸濃度を設定値よりも低下させる
処理を包含することを特徴とする。 また、本発明の第２の発明は培養装置に関する発明で
あつて、基質を貯留するための基質槽、培養を行う培養
槽、基質の流加による微生物の増殖と連動して酢酸が生
成された培養液中の酢酸濃度を検知する分析装置、基質
を基質槽から培養槽に流加するための流量可変式の基質
流加装置、及び酢酸濃度が設定値を超えたことを該分析
装置が検知したとき該基質流加装置に基質流量を低下す
る信号を出力する制御装置を包含することを特徴とす
る。 以下、本発明に関する具体的な説明として、プロモー
タにtrp（トリプトフアン）プロモータを用い、それに
β−gal（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子を連結した複
合プラスミドpTREZ1を保持する大腸菌HB101株〔微工研
条寄第815号（FERM BP−815）〕による培養制御の方法
及び装置を示すが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。 複合プラスミドpTREZ1のtrpプロモータ部分は大腸菌
のtrpオペロンのプロモータ、trpL（リーダペプタイ
ド）及びtrpE（アントラニル酸合成酵素）の先端部分の
一部を含む約500bp（base pairs、塩基対）のDNA断片で
あり、pBR322プラスミドのEcoR I部位に挿入したもので
ある。一方、β−gal遺伝子はpMC1403〔ジヤーナル オ
ブ バクテリオロジー（J.Bacteriol.）第143巻、第971
〜980頁（1980）〕より切出した6.2kbの大きさのもの
で、trpプロモータのEcoR I部位とpBR322のSal I部位間
に挿入した。このように、複合プラスミドpTREZ1のβ−
gal遺伝子はtrpプロモータの制御下にある。 trpプロモータを有する複合プラスミドは、培養中に
３−β−インドールアクリル酸（以下、IAと略記する）
を添加することにより、遺伝子が発現することが知られ
ている〔ネーチヤー（Nature）第291巻、第503〜506頁
（1981）〕。これは遺伝子の転写を制御するリプレツサ
がIAにより不活性化されるため、RNAポリメラーゼによ
るmRNAの合成が開始されるからである。 本発明者らはβ−galを生産する遺伝子組換え大腸菌
をモデルに用いてβ−galを効率よく生産させるための
培養制御方法について種々検討した結果、菌体を効率よ
く増殖させ、目的とする物質を効率よく生産させること
に成功し、本発明を完成するに至つた。 第２図に遺伝子組換え大腸菌を用いて流加培養を行つ
た結果を示す。すなわち第２図は、該流加培養結果の１
例を、培養時間（ｈ、横軸）と、菌体濃度（g/）、β
−gal量（U/ml）及びグルコース濃度（g/）〔縦軸〕
との関係で示すグラフである。 培養は、溶存酸素濃度の上昇を指標として基質である
グルコース、カザミノ酸培地を流加した。18時間目には
菌体濃度が13g/に達したが、これ以後菌体増殖は停止
した。β−gal生産を誘導させるため、誘導剤のIAと栄
養物質であるカザミノ酸を32時間目に添加したが、β−
gal生産は誘導されなかつた。このように、菌体増殖が
停止し、β−gal生産が誘導されないのは培養上清液に
菌体増殖やβ−gal生産を抑制する物質が存在するため
ではないかと推定した。 そこで、菌体増殖停止後の培養19時間目の培養上清液
を採取し、そこから限外過膜とイオン交換樹脂を用い
て菌体増殖阻害物質を分離した。この分離液について細
管式等速電気泳動分析装置により有機酸を分析した結
果、酢酸が33g/の高濃度に蓄積していることが分つ
た。そこで、相当量の酢酸塩を新鮮培地に添加して培養
したところ、菌体の増殖が阻害された（第３図参照）。
このことから菌体の増殖阻害に関与している物質は酢酸
であると判明した。また、遺伝子の発現（β−galの生
産）に関しても、菌体の増殖阻害とほぼ同じ結果が得ら
れた（第４図参照）。すなわち、第３図は、培養液中の
酢酸濃度（g/、横軸）と比増殖速度（1/h、縦軸）と
の関係の１例を示すグラフであり、第４図は、培養液中
の酢酸濃度（g/、横軸）とβ−gal生産量（U/ml、縦
軸）との関係の１例を示すグラフである。 更に、ガスクロマトグラフイーを用いた培養上清液の
分析においても、酢酸であることを確認した。 以上のように、培養液中に蓄積した酢酸が菌体増殖を
阻害することから、本発明者らは酢酸を指標として基質
を流加することにより菌体を効率よく増殖させることが
できるのではないかと考えるに至つた。それには培養液
中に蓄積いた酢酸を除去する必要があるが、本発明者ら
は酢酸を菌体に資化させることにより酢酸を除去するこ
とにした。そこで、培養液中に酢酸塩を酢酸濃度として
０〜10g/添加して、遺伝子組換え菌の酢酸資化の可能
性について検討した。第５図に示すように、培養液には
グルコースを1g/添加したため培養初期に培養液中の
酢酸濃度が高くなつたが、以後酢酸濃度は徐々に低下し
た。これより培養液中の酢酸は菌体により資化されるこ
とが分つた。その持の菌体濃度の経時変化を第６図に示
す。すなわち第５図は、遺伝子組換え大腸菌の酢酸資化
の１例を、培養時間（ｈ、横軸）と酢酸濃度（g/、縦
軸）との関係で示すグラフである。第５図において、初
発酢酸濃度を、g/単位で、白丸印は０、黒丸印は１、
白三角印は５、黒三角印は10とした場合について示して
いる。第６図は、第５図の各条件における培養時間
（ｈ、横軸）と菌体濃度（OD550nm、横軸）との関係で
菌体増殖を示すグラフである。第６図から明らかなよう
に、菌体濃度は菌体の酢酸資化により、酢酸を添加しな
い場合より増加した。 このことから、酢酸の資化、従つて酢酸濃度の調節
は、基質の流加量の調節により行うことが、簡便であり
有効であつて好適であることが判明した。 以上の結果より、本発明者らは培養液中の酢酸濃度を
検知し、酢酸濃度が設定値よりも高くなつた場合は基質
流加量を減らすか基質流加を止めることにより菌体に酢
酸を資化させて酢酸濃度を低下させること、酢酸濃度が
設定値よりも低下した時点で、基質流加量を増加させる
か、基質流加を再開する培養制御の方法が好適であるこ
とを見出した。 本発明における培養液中の酢酸濃度は第３図の結果よ
り15g/以下、望ましくは5g/以下に抑制すべきであ
ることがわかる。なお、基質流加を制御する設定値とし
ては酢酸濃度が5g/と設定するだけでなく、例えば１
〜3g/というように設定範囲を設けることも可能であ
る。 更に、誘導剤の添加により遺伝子を発現させる際に
も、培養液中の酢酸濃度は菌体増殖の場合と同様な阻害
を示した（第４図）。これより遺伝子発現における場合
も酢酸濃度は5g/以下にすることが望ましい。 本発明において酢酸は培養上清液などを細管式等速電
気泳動装置、ガスクロマトグラフ装置、液体クロマトグ
ラフ装置、及び質量分析計などに導入することにより迅
速かつ正確に検出することができる。 本発明における細胞としては前記した遺伝子組換え大
腸菌以外の細胞、例えば酵母、枯草菌、放線菌、などに
ついても、それらの細胞が酢酸によつて増殖が阻害され
るが、その酢酸を資化する能力がある場合には、本発明
の適用が可能である。 また、目的物質の生産を誘導させるには、細胞が遺伝
子組換え大腸菌の場合にtrpプロモータに対しては、上
記のIAの添加又は遺伝子の発現を抑制するトリプトフア
ンを含まない、又はトリプトフアン濃度が低い培地で培
養することが、またlacプロモータ、tacプロモータに対
してはIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシ
ド）等の添加が、PLプロモータに対しては培養液の温度
を上昇させることが有効である。目的物質の生産を誘導
させる時に添加する栄養物質としては、アミノ酸の混合
物であるカザミノ酸、アミノ酸、グルコース、酵母エキ
スなどが有効である。 既に概説した本発明の培養装置においては、酢酸濃度
分析装置の前に、採取した培養液試料を分析装置に適合
するように調製するための試料調製装置を設けてもよい
が必須のものではない。 また基質流加装置の好適な例としてはポンプがある。 その他、当然これら各装置を連結する導管、原料供給
設備などが取付けられる。 〔実施例〕 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。 実施例１ 本発明の培養装置の１実施例の概要図を第１図に示
す。 第１図において、符号１は培養槽、２はかくはん装
置、３は基質槽、４は基質流加用ポンプ、５は試料調製
装置、６は酢酸濃度分析装置、７は制御用電子計算機、
８〜11は導管を意味する。 培地と微生物とから成る培養液を仕込んだ培養槽１に
はモータＭを備えたかくはん装置２のかくはん部が収納
されている。空気導入用導管８は培養槽１の底部に接続
され、培養槽１の上部には排ガス排出用導管９が接続さ
れている。培養槽１の側面には、培養液に接するように
培養液抜出し用導管11が接続され、導管11を介して試料
調製装置５と酢酸濃度分析装置６が接続されている。培
養槽１の上部には基質流加用導管10を介して、流量可変
式の基質流加用ポンプ４と基質槽３が接続されている。
制御用電子計算機７は酢酸濃度分析装置６と基質流加用
ポンプ４に接続されている。 試料調製装置５には菌体分離器と試料溶液の酸性化装
置が収納されている。酢酸濃度分析装置６には基質分析
計又はガスクロマトグラフ装置等が収納されている。 以下本実施例の動作を説明する。培養槽１内では微生
物と基質槽３より供給された基質及び導管８からの空気
がかくはん装置２によつてかくはんされ、微生物が増殖
する。培養液は導管11により抜出され、試料調製装置５
で菌体除去と酸による試料の酸性化を行つた後、酢酸濃
度分析装置６に導入される。酢酸濃度分析装置６にガス
クロマトグラフ装置が収納されている場合は試料は酸性
溶液のまま使用されるが、質量分析計が収納されている
場合は空気でバブリングすることにより気化された酢酸
が分析に供される。酢酸濃度分析装置６で分析された培
養液中の酢酸濃度の値は制御用電子計算機７に送られ、
設定値と比較される。酢酸濃度の値が設定値よりも高い
場合は基質流加を停止するか又は基質流加速度を遅くす
るように信号を基質流加用ポンプ４に送り、基質流加量
を調節する。一方、設定値よりも低い場合は基質流加を
開始するか又は基質流加速度を速くするように信号を基
質流加用ポンプ４に送り、基質流加量を調節する。以上
のように基質流加量を調節することで、培養液中の酢酸
濃度を設定値以下に制御でき、菌体の増殖速度を高レベ
ルに維持することができる。 実施例２ 菌体培養液中の酢酸をガスクロマトグラフ装置により
建築し、培養液中の酢酸濃度が2g/以下になるように
基質流加量を制御した。なお、培地には菌体増殖時のtr
pプロモータの働きを抑えるためにトリプトフアンを添
加した。 菌体：複合プラスミドpTREZ1を保持する大腸菌HB101
株。 初発培地:M9−カザミノ酸培地、組成はNH4Cl1g、Na2HPO
4を6g、KH2PO4を3g、NaCl5g、MgSO4・7H2Oを0.1g、CaCl
2・2H2Oを15mg、チアミン塩酸塩0.1g、プロリン0.1g、
トリプトフアン0.01g、グルコース5g、カザミノ酸2.5
g、酵母エキス1.5g、蒸留水１、pH7.0である。なお、
本培地には複合プラスミドを保持する大腸菌のみを増殖
させるため、アンピシリン（Ap）を50mg/添加した。 流加用培地：グルコース200g、プロリン4g、カザミノ酸
100g、酵母エキス60g、トリプトフアン0.4g、Ap 1g、蒸
留水１、pH7.0である。 培養条件：複合プラスミドを保持する大腸菌を50mgのM9
−カザミノ酸培地を入れた500ml容振とうフラスコ４本
に接種し、振とう培養機により、振幅7cm、振とう回数1
15回/min、37℃で一晩培養した。この種菌液200mlをM9
−カザミノ酸培地の入つた５ジヤーフアーメンタに接
種し、初発液量２で37℃、pH7.0通気量２/minで培
養を開始した。培養液中の酢酸濃度は培養上清液をPEG6
00＋フルシンＰ（FlusinP）（ガスクロ工業製）を充て
んしたガスクロマトグラフ装置に導入することにより測
定し、酢酸濃度が2g/に達した時点で基質流加を停止
した。 結果：結果を第７図に示す。すなわち第７図は本実施例
による培養結果の１例を、培養時間（ｈ、横軸）と、酢
酸濃度（g/）、菌体濃度（g/）、β−gal量（U/m
l）及び流加速度（ml/min）〔縦軸〕との関係で示すグ
ラフである。 第７図に示すように、基質の流加により酢酸が生成さ
れたが、基質流加を停止すると酢酸は菌体に資化され、
培養液中の酢酸濃度が低下した。このように培養液中の
酢酸濃度を低く抑えて培養することにより、培養30時間
目には菌体濃度は29g/の高密度に達した。トリプトフ
アンプロモータの働きを抑えるため、流加用培地中にト
リプトフアンを添加したので、培養22時間目まではβ−
gal生産を抑えることができた。しかし、培養22時間目
以降はトリプトフアン濃度の低下により脱抑制され、β
−galの生成が開始し、最終的にβ−gal生産量は104U/m
lに達した。本実施例ではトリプトフアン濃度低下によ
る脱抑制によりβ−galが生産されたのであるが、誘導
剤であるIAの添加によつてもβ−galの生産を開始でき
る。以上、培養液中の酢酸濃度を抑えることで、菌体濃
度は29g/の高密度に達し、菌体収率を0.57g・細胞/g
・グルコースの高い値に維持できた。 実施例３ 菌体培養液中の酢酸をガルクロマトグラフ装置により
検知し、培養液中の酢酸濃度が2g/以下になるように
基質流加量を制御した。培地へのトリプトフアン添加は
せずに、菌体増殖と連動したβ−galの生産を行つた。 トリプトフアンの無添加培地を用いた以外は、使用菌
株、培養条件共に実施例２と同様にして流加培養を行つ
た。 結果：培養結果の１例を、第７図と同様な関係で第８図
に示す。 第８図に示すように、菌体増殖と連動してβ−galが
生産された。培養30時間目には菌体濃度は36g/の高密
度に達し、菌体収率は0.54g・細胞/g・グルコースであ
つた。しかし、この時のβ−gal生産量は59U/mlであ
り、実施例１よりは低い値であつた。 実施例４ 菌体培養液中の酢酸をガスクロマトグラフ装置により
検知し、培養液中の酢酸濃度が2g/以下になるように
基質流加量を制御した。培養前期は流加用培地にトリプ
トフアンを添加し、β−gal生産を抑え、培養後期はト
リプトフアンを含まない流加用培地を用いて、β−gal
生産を行つた。 初発培地と培養前期に用いた流加用培地は実施例１と
同様な培地を用いたが、培養後期は実施例１の流加用培
地から酵母エキスとトリプトフアンを除いた流加用培地
を用いた。以上に述べた培地以外は、使用菌株、培養条
件共に実施例２と同様にして流加培養を行つた。 結果：培養結果の１例を、第７図と同様な関係で第９図
に示す。 第９図に示すように、培養12時間目にトリプトフアン
を含まない流加用培地を用いて流加を開始したところ、
β−gal生産が急激に始まり最大70U/mlのβ−galが生産
された。菌体濃度は18.6g/、菌体収率は0.52g・細胞/
g・グルコースであつた。 比較例１ 培養液中のグルコース濃度を実施例２及び３と同様に
1g/以下の低濃度になるように基質を流加した以外、
酢酸の生成を抑制する措置は採られなかつた。 使用菌株、培養条件共に実施例２と同様にして流加培
養を行つた。 結果：培養結果の１例を、第７図と同様な関係で第10図
に示す。 第10図に示すように、菌体増殖と連動して酢酸が生成
し、酢酸濃度が21g/になつた培養20時間目には菌体増
殖が停止した。この時の菌体濃度は21g/であつたが、
菌体収率は036g・細胞/g・グルコースと低く、非常に生
産効率が悪かつた。更に、β−gal生産量も8U/mlと極め
て低かつた。 〔発明の効果〕 以上説明したように、本発明によれば、培養液中の酢
酸濃度を抑えることができるので、容易に高密度培養、
高菌体収率及び目的物質の高生産量を達成できるという
顕著な効果が奏せられる。例えば、β−gal生産の場
合、25g/以上の高密度培養、0.5g・細胞/g・グルコー
ス以上の高菌体収率50U/以上の高いβ−gal生産量を達
成できる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の培養装置の１例を示す概要図、第２図
は遺伝子組換え大腸菌を用いて流加培養を行つた結果の
１例を示すグラフ、第３図は培養液中の酢酸濃度と比増
殖速度との関係の１例を示すグラフ、第４図は培養液中
の酢酸濃度とβ−gal生産量との関係の１例を示すグラ
フ、第５図は遺伝子組換え大腸菌の酢酸資比の１例を示
すグラフ、第６図は第５図の各条件における菌体増殖の
１例を示すグラフ、第７図〜第９図は本発明による酢酸
を指標とした遺伝子組換え大腸菌の流加培養結果の１例
を示すグラフ、第10図は比較例の培養結果の１例を示す
グラフである。 1:培養槽、2:かくはん装置、3:基質槽、 4:基質流加用ポンプ、5:試料調製装置、 6:酢酸濃度分析装置、7:制御用計算機、 ８〜11:導管
は遺伝子組換え大腸菌を用いて流加培養を行つた結果の
１例を示すグラフ、第３図は培養液中の酢酸濃度と比増
殖速度との関係の１例を示すグラフ、第４図は培養液中
の酢酸濃度とβ−gal生産量との関係の１例を示すグラ
フ、第５図は遺伝子組換え大腸菌の酢酸資比の１例を示
すグラフ、第６図は第５図の各条件における菌体増殖の
１例を示すグラフ、第７図〜第９図は本発明による酢酸
を指標とした遺伝子組換え大腸菌の流加培養結果の１例
を示すグラフ、第10図は比較例の培養結果の１例を示す
グラフである。 1:培養槽、2:かくはん装置、3:基質槽、 4:基質流加用ポンプ、5:試料調製装置、 6:酢酸濃度分析装置、7:制御用計算機、 ８〜11:導管
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 西村 信子
国分寺市東恋ヶ窪１丁目280番地 株式
会社日立製作所基礎研究所内
(72)発明者 緒田原 蓉二
国分寺市東恋ヶ窪１丁目280番地 株式
会社日立製作所基礎研究所内
(56)参考文献 特開 昭60−224484（ＪＰ，Ａ)
相田浩ほか４名編「アミノ酸発酵」学
会出版センター（1986−５−30）Ｐ77−
88，199−200
Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ，58（３），ｐ．259−266，1980
Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２
（10），ｐ．891−896，1984
Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ，65（１），Ｐ．７−10，1987
Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ，64（６），Ｐ．503−510，1986
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．微生物に基質を流加して培養し、代謝物を生産する
培養方法において、基質の流加による微生物の増殖と連
動して酢酸が生成された培養液中の酢酸濃度を検知し、
該酢酸濃度が設定値を超えたときは、基質の流加量を低
下し、該微生物により該培養液中の酢酸を資化して該酢
酸濃度を設定値よりも低下させる処理を包含することを
特徴とする培養方法。 ２．酢酸濃度が設定値を超えたときは、基質の流加を停
止又は流加速度を遅くすることにより流加量を低下する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の培養方
法。 ３．酢酸濃度が設定値より低くなつたときは、基質の流
加を開始又は流加速度を速くすることにより流加量を増
加することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の培
養方法。 ４．上記酢酸濃度の設定値は15g/以下の値であること
を特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか
１項に記載の培養方法。 ５．微生物が、遺伝子組換え大腸菌であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記
載の培養方法。 ６．該遺伝子組換え大腸菌が保持する発現ベクターが、
トリプトフアンプロモータを含有するものであることを
特徴とする特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１
項に記載の培養方法。 ７．誘導剤として３−β−インドールアクリル酸を用い
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第６項のい
ずれか１項に記載の培養方法。 ８．トリプトフアンを含まない、又はトリプトフアン濃
度が低い培地を用いて物質生産を誘導することを特徴と
する特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記
載の培養方法。 ９．基質を貯留するための基質槽、培養を行う培養槽、
基質の流加による微生物の増殖と連動して酢酸が生成さ
れた培養液中の酢酸濃度を検知する分析装置、基質を基
質槽から培養槽に流加するための流量可変式の基質流加
装置、及び酢酸濃度が設定値を超えたことを該分析装置
が検知したとき該基質流加装置に基質流量を低下する信
号を出力する制御装置を包含することを特徴とする培養
装置。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62065710A JP2676511B2 (ja) | 1987-03-23 | 1987-03-23 | 酢酸を指標とした培養方法及びその装置 |
| KR1019880001409A KR900007630B1 (ko) | 1987-03-23 | 1988-02-13 | 아세트산을 지표로한 배양방법 및 그 장치 |
| US07/157,719 US5139938A (en) | 1987-03-23 | 1988-02-19 | Production of substances with an acetic acid-producing and assimilating bacterium inhibited by acetic acid |
| EP88102463A EP0283726B1 (en) | 1987-03-23 | 1988-02-19 | Method for cultivation with acetate concentration monitoring and apparatus for the same |
| DE8888102463T DE3871573T2 (de) | 1987-03-23 | 1988-02-19 | Verfahren zur zuechtung durch kontrollieren der acetatkonzentration und apparat dafuer. |
| CN88101483A CN1040459C (zh) | 1987-03-23 | 1988-03-22 | 以醋酸浓度作为指标的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62065710A JP2676511B2 (ja) | 1987-03-23 | 1987-03-23 | 酢酸を指標とした培養方法及びその装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63233780A JPS63233780A (ja) | 1988-09-29 |
| JP2676511B2 true JP2676511B2 (ja) | 1997-11-17 |
Family
ID=13294845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62065710A Expired - Lifetime JP2676511B2 (ja) | 1987-03-23 | 1987-03-23 | 酢酸を指標とした培養方法及びその装置 |
Country Status (6)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0283726B1 (ja) |
| JP (1) | JP2676511B2 (ja) |
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| CN (1) | CN1040459C (ja) |
| DE (1) | DE3871573T2 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2686108B2 (ja) * | 1988-10-07 | 1997-12-08 | 株式会社日立製作所 | 微生物の流加培養方法及び装置 |
| KR0132666B1 (en) * | 1989-03-14 | 1998-04-14 | Hitachi Kk | Method for controlling cultivation conditions for animal cells |
| AU702567B2 (en) * | 1996-03-13 | 1999-02-25 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Fermentation control |
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