CN114774298A

CN114774298A - 合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用

Info

Publication number: CN114774298A
Application number: CN202210439148.XA
Authority: CN
Inventors: 黄和; 林铭鑫; 顾洋; 陆蕙芝; 柳隐芳; 杨碧茹; 卢雪瑶; 闫怡静; 杨英昊
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2022-04-25
Filing date: 2022-04-25
Publication date: 2022-07-22

Abstract

本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域，公开了一种合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用。该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；构建方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；发酵合成樱花素的方法包括：将前述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；或者，按照前述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。该重组菌株发酵合成樱花素的产量较高，为樱花素的微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。

Description

合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域和微生物发酵领域，具体地，涉及一种合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用。

背景技术

樱花素(4,5-二羟-7-甲氧黃烷酮)是一种复杂的天然产物，属于类黄酮家族，由一些植物(如灌木和水稻)合成。樱花素已被发现具有多种生物活性，包括抗菌、抗炎、抗诱变、抗幽门螺杆菌、抗利什曼病和抗锥虫等。由于樱花素具有潜在的营养和医药市场价值，开发高效的生物合成方法具有重要的研究意义，其中，利用微生物作为宿主进行樱花素的生产，可以有效规避天然樱花素生产过程中生长速度慢、产品效价低的问题，因此具有很强的研究和应用价值。

解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是食品安全级菌株，是应用最广泛、研究最多的非常规酵母之一，具有理化特征和遗传背景较清晰、分子操作相对成熟、代谢调控可控等优势，且由于其抗逆性强、耐酸碱环境、底物谱广、胞内乙酰辅酶A和三羧酸循环代谢通量高等特殊的理化性质和代谢特征，被广泛地认为具有卓越的生物技术工业应用价值，因此已被开发作为诸多精细化学品和天然产物的潜在微生物细胞工厂，产品包括二十二碳六烯酸、赤藓糖醇、柠檬酸、2-苯乙醇、番茄红素、虾青素、法尼烯、芳樟醇、花生四烯酸和紫色杆菌素等。

但是，目前解脂耶氏酵母应用于合成樱花素的研究报道较少，且微生物合成樱花素的产量较低，难以满足实际生产的需求。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的微生物合成樱花素的产量较低的问题，提供一种合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法，该重组菌株发酵合成樱花素的产量较高，为樱花素的微生物发酵生产提供了更优的潜在选择。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种合成樱花素的重组菌株，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；其中，所述重组菌株中的至少部分预苯酸脱氢酶基因被敲除。

优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述出发菌株为解脂耶氏酵母。

优选地，所述出发菌株为敲除基因Ku70并过表达柚皮素甲基转移酶的解脂耶氏酵母，其中，所述基因Ku70的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述柚皮素甲基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明第二方面提供一种构建重组菌株的方法，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；其中，所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活的方式为基因敲除。

优选地，所述出发菌株为解脂耶氏酵母。

优选地，所述基因敲除的过程包括：先构建重组载体，再经同源重组，用所述重组载体中的尿嘧啶筛选标记URA替代所述出发菌株中的预苯酸脱氢酶基因。

优选地，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述尿嘧啶筛选标记URA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明第三方面提供如前所述的重组菌株或如前所述的方法在合成樱花素中的应用。

本发明第四方面提供一种发酵合成樱花素的方法，该方法包括：将如前所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；

或者，按照如前所述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。

优选地，所述发酵的条件包括：接种量为4-6体积％，温度为25-35℃，转速为 150-300rpm，时间为80-160h。

优选地，所述发酵的过程包括：在发酵40-55h时向发酵液中加入L-酪氨酸。

优选地，所述发酵液中L-酪氨酸的添加量为4-6g/L。

优选地，所述发酵培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤和至少一种氨基酸。

优选地，所述发酵培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、 L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L- 色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。

优选地，所述发酵培养基含有：葡萄糖30-50g/L，硫酸铵1-1.3g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.5-2g/L，腺嘌呤0.01-0.02g/L，L-精氨酸0.02-0.08g/L，L-天门冬氨酸0.05-1g/L， L-组氨酸0.01-0.03g/L，L-异亮氨酸0.02-0.08g/L，L-亮氨酸0.05-0.15g/L，L-赖氨酸0.02-0.08g/L，L-甲硫氨酸0.01-0.03g/L，L-苯丙氨酸0.02-0.08g/L，L-苏氨酸0.05-0.15g/L， L-色氨酸0.02-0.08g/L，L-酪氨酸0.02-0.08g/L，L-缬氨酸0.05-0.25g/L。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明提供的重组菌株可促进樱花素在微生物细胞的胞外合成与积累，有效提高樱花素的产量，为代谢工程改造高效生产樱花素奠定了基础，为樱花素的微生物发酵生产提供了更优的潜在选择；本发明提供的重组菌株构建方法简单，便于使用，具有良好的应用前景。

在本发明最优选实施方式中，重组解脂耶氏酵母菌株发酵120h得到的发酵液中樱花素的含量为1521.2mg/L，更加显著提高了发酵效果，以及樱花素的产量。

附图说明

图1是实施例2中验证预苯酸脱氢酶编码基因YALI0F17644g的电泳图，1、2、3 和4分别为4个单菌落；

图2是实施例3和对比例1获得的发酵液的上清液中樱花素的含量图；

图3是樱花素的标准品和实施例3获得的重组解脂耶氏酵母菌株发酵上清液的液相检测图谱。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明使用的术语“增加”或“提高”通常都意味着统计学显著量的增加。然而，为避免疑义，术语“增加”或“提高”表示相比参比水平(例如出发菌株中的水平)增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或相比参比水平增加在10％到100％之间的任意量；或相比参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意量的增加、或是更大量的增加。

本发明使用的术语“减弱”或“失活”指的是酶催化反应的能力降低至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％、或完全失去催化反应的能力。

第一方面，本发明提供了一种合成樱花素的重组菌株，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活。

根据本发明，优选地，所述出发菌株为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。更优选地，所述出发菌株为敲除基因Ku70并过表达柚皮素甲基转移酶(来源于Oryza sativa)的解脂耶氏酵母，其中，所述基因Ku70的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述柚皮素甲基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。解脂耶氏酵母中敲除基因Ku70并过表达柚皮素甲基转移酶(来源于Oryza sativa)可以参考现有文献中公开的方法自行制备，例如，可参见文献Y.Gu,et al.,Refactoring Ehrlich Pathway for High-Yield 2-Phenylethanol Production in Yarrowia lipolytica[J].ACS Synth Biol,2020.9(3):623-633，以获得解脂耶氏酵母po1fkpYLXP’-NOMT，作为本发明的出发菌株。

根据本发明，为了提高所述重组菌株合成樱花素的产量，优选地，所述重组菌株中的至少部分预苯酸脱氢酶基因被敲除。更优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。进一步优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的发明人发现，敲除出发菌株是解脂耶氏酵母 po1fkpYLXP’-NOMT中编码序列如SEQ ID NO：1所示的预苯酸脱氢酶的基因能够更加显著的提高发酵产物樱花素的产量。

本发明中，敲除即基因敲除，指的是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。进一步优选地，所述重组菌株中的至少部分预苯酸脱氢酶基因被敲除从而使得所述重组菌株中的敲除的预苯酸脱氢酶基因被替换为尿嘧啶筛选标记URA的基因。

本发明第二方面提供一种构建重组菌株的方法，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活。

根据本发明，优选地，所述出发菌株为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。更优选地，所述出发菌株为敲除基因Ku70并过表达柚皮素甲基转移酶的解脂耶氏酵母，其中，所述基因Ku70的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述柚皮素甲基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

根据本发明，优选地，所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活的方式为基因敲除。更优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1 所示。进一步优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明中，优选通过基因敲除的方式敲除解脂耶氏酵母的基因组中的特定开放阅读框序列或启动子序列。

本发明中，所述基因敲除使用的同源序列片段可以通过如下方式获得：根据本领域公知的数据库(例如GenBank数据库，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中公开的解脂耶氏酵母中的靶基因(例如预苯酸脱氢酶编码基因YALI0F17644g)上下游片段序列进行人工合成作为同源臂；或者利用PCR的方法从出发菌株(如解脂耶氏酵母)的基因组上扩增靶基因的上下游片段序列作为同源臂，从而获得靶基因的初始同源序列片段，但本发明不限于此。靶基因的部分或全部初始同源序列是指含有上述靶基因的序列。

本发明中，可以先构建重组载体，该重组载体能够将出发菌株(如解脂耶氏酵母po1fkpYLXP’-NOMT)的预苯酸脱氢酶基因敲除。本领域已知构建重组载体的各种方法，以用来将目的基因片段连接至载体来制备基因敲除重组载体，例如但不限于，经典的“酶切-连接”方法、Invitrogen公司开发的Gateway克隆系统、Clontech公司开发的Creator 克隆系统、StephenElledge实验室开发的Univector克隆系统以及基于IIs型限制性内切酶的GoldenGate克隆法。

例如，可采用重组酶方法构建得到本发明的重组载体：基于出发菌株(如解脂耶氏酵母po1fkpYLXP’-NOMT)的基因组，采用PCR方法扩增得到靶向插入部位的上下游同源臂序列；将待插入基因序列、上下游同源臂序列及抗性基因表达盒等串联连接，得到重组载体，但本发明不限于此。

随后，可采用本领域的常规方法将该重组载体导入出发菌株(如解脂耶氏酵母po1fkpYLXP’-NOMT)中，例如但不限于显微注射、基因枪、转化(例如电转化)、感染或转染。上述显微注射、基因枪、转化、感染或转染均为本领域常规操作。例如，转化是指通过采用分子生物学和基因工程中的一些已知方法处理细胞，使经处理后的细胞处于感受态，并由此与外源DNA接触，从而使外源DNA进入处于感受态的细胞中。常用的转化方法包括原生质体转化法、化学转化法和电穿孔转化法。感染是指用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，将该载体与目的DNA序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，从而以感染的方式使重组DNA进入宿主细胞中。转染是指通过CaCl₂、电穿孔等方法将细胞处理成感受态细胞，然后使该感受态细胞接受重组的噬菌体DNA。

在将重组载体导入出发菌株(如解脂耶氏酵母po1fkpYLXP’-NOMT)中之后，可通过筛选标记(例如抗性基因)筛选出阳性克隆，并通过基因组PCR进行验证、或者通过对基因组DNA测序进行验证，从而得到所述的合成樱花素的重组菌株。

本发明中，优选地，所述基因敲除的过程包括：先构建重组载体，再经同源重组，用所述重组载体中的尿嘧啶筛选标记URA替代所述出发菌株中的预苯酸脱氢酶基因。更优选地，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述尿嘧啶筛选标记URA 的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

根据本发明，优选地，先将所述重组菌株制备成种子液，然后将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。

根据本发明，优选地，所述种子液的制备方法包括：挑取所述重组菌株的单菌落接种于种子培养基中进行种子培养，得到所述种子液。

本发明中，对所述种子培养基没有特别的限制，可以为本领域常规使用的种子培养基。优选地，出发菌株为解脂耶氏酵母时，种子培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤和至少一种氨基酸。

更优选地，所述种子培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L- 色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。

进一步优选地，所述种子培养基含有：葡萄糖15-25g/L，硫酸铵4-6g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.5-2g/L，腺嘌呤0.01-0.02g/L，L-精氨酸0.02-0.08g/L，L-天门冬氨酸0.05-1g/L，L-组氨酸0.01-0.03g/L，L-异亮氨酸0.02-0.08g/L，L-亮氨酸0.05-0.15g/L，L-赖氨酸0.02-0.08g/L，L-甲硫氨酸0.01-0.03g/L，L-苯丙氨酸0.02-0.08g/L，L-苏氨酸0.05-0.15g/L，L-色氨酸0.02-0.08g/L，L-酪氨酸0.02-0.08g/L，L-缬氨酸0.05-0.25g/L。

本发明中，对所述种子培养的条件(包括温度、转速、时间等)没有特别的限制，可以为本领域常规的培养条件。优选情况下，出发菌株为解脂耶氏酵母时，所述种子培养的条件包括：温度为25-35℃，优选为28-30℃，转速为150-300rpm，优选为200-250rpm，时间为40-60h。

本发明中，所述重组菌株的单菌落可以选自新鲜制备的所述重组菌株或低温冻存的所述重组菌株(例如在甘油冻存管中冻存于-80℃冰箱中的合成樱花素的重组菌株)。

本发明中，对所述发酵的方法没有特别的限制，可以为本领域常规使用的发酵合成樱花素的方法，例如将所述种子液接种至所述发酵培养基中(例如装有所述发酵培养基的摇瓶或发酵罐中)进行发酵培养得到发酵液。

本发明中，为了提高樱花素的产量，优选地，相对于100体积份的所述发酵培养基，所述种子液的接种量为4-6体积份。

本发明中，为了提高樱花素的产量，优选地，所述发酵的条件包括：温度为25-35℃，优选为28-30℃，转速为150-300rpm，优选为200-250rpm，时间为80-160h，优选为100-150h。

本发明中，为了进一步提高樱花素的产量，优选地，所述发酵的过程包括：在发酵40-55h时向发酵液中加入L-酪氨酸。进一步优选地，所述发酵液中L-酪氨酸的添加量为 4-6g/L。

根据本发明，优选地，所述发酵培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤和至少一种氨基酸。

更优选地，所述发酵培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L- 色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。

进一步优选地，所述发酵培养基含有：葡萄糖30-50g/L，硫酸铵1-1.3g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.5-2g/L，腺嘌呤0.01-0.02g/L，L-精氨酸0.02-0.08g/L，L-天门冬氨酸0.05-1g/L，L-组氨酸0.01-0.03g/L，L-异亮氨酸0.02-0.08g/L，L-亮氨酸0.05-0.15g/L，L-赖氨酸0.02-0.08g/L，L-甲硫氨酸0.01-0.03g/L，L-苯丙氨酸0.02-0.08g/L，L-苏氨酸0.05-0.15g/L，L-色氨酸0.02-0.08g/L，L-酪氨酸0.02-0.08g/L，L-缬氨酸0.05-0.25g/L。

本发明中，可以通过已知的方法分离所得发酵液中的樱花素，例如，先将所述发酵液中的细胞除去，然后将除去细胞后的发酵液进行浓缩使产物结晶，或进行离子交换层析等诸如此类的方法分离樱花素。

本发明中，还可以通过已知方法对所述发酵液中的樱花素或从所述发酵液中分离得到的樱花素进行检测。例如，可以通过高效液相色谱法和诸如此类的方法来对樱花素的含量进行检测。

根据本发明一种特别优选的实施方式，重组菌株发酵合成樱花素的方法，包括：挑取所述重组菌株的单菌落接种于种子培养基中，在温度为28-30℃，转速为200-250rpm 的条件下进行种子培养40-60h，得到所述种子液；再将所述种子液以体积比4-6体积％的接种量接种至所述发酵培养基中，在温度为28-30℃，转速为200-250rpm的条件下进行发酵培养40-55h，向发酵液中加入L-酪氨酸使得其添加量为4-6g/L，再进行发酵培养 45-110h，得到发酵液；

其中，种子培养基含有葡萄糖15-25g/L，硫酸铵4-6g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.5-2g/L，腺嘌呤0.01-0.02g/L，L-精氨酸0.02-0.08g/L，L-天门冬氨酸0.05-1g/L，L-组氨酸0.01-0.03g/L，L-异亮氨酸0.02-0.08g/L，L-亮氨酸0.05-0.15g/L，L-赖氨酸0.02-0.08g/L， L-甲硫氨酸0.01-0.03g/L，L-苯丙氨酸0.02-0.08g/L，L-苏氨酸0.05-0.15g/L，L-色氨酸 0.02-0.08g/L，L-酪氨酸0.02-0.08g/L，L-缬氨酸0.05-0.25g/L；发酵培养基含有葡萄糖 30-50g/L，硫酸铵1-1.3g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.5-2g/L，腺嘌呤0.01-0.02g/L，L- 精氨酸0.02-0.08g/L，L-天门冬氨酸0.05-1g/L，L-组氨酸0.01-0.03g/L，L-异亮氨酸 0.02-0.08g/L，L-亮氨酸0.05-0.15g/L，L-赖氨酸0.02-0.08g/L，L-甲硫氨酸0.01-0.03g/L， L-苯丙氨酸0.02-0.08g/L，L-苏氨酸0.05-0.15g/L，L-色氨酸0.02-0.08g/L，L-酪氨酸 0.02-0.08g/L，L-缬氨酸0.05-0.25g/L。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。但这些实施例仅用于说明本发明而不用来限制本发明的范围。以下实施例中，除非另有说明，所使用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法。

以下实施例中，解脂耶氏酵母po1f为解脂耶氏酵母ATCC20460的衍生菌株，由马里兰大学Peng Xu教授直接提供，其购自中国台湾Yeastern Biotech(益生生技)公司；pYLXP’-URA-loxP、pYLXP’等质粒为自行构建；除非特别说明，所用试剂、培养基均为市售商品，所用方法均为常规方法。

1、培养基与试剂

尿嘧啶缺陷型平板：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.7g/L，半硫酸腺嘌呤10mg/L，L-精氨酸0.05g/L，L-天门冬氨酸0.08g/L，L-组氨酸0.02g/L，L- 异亮氨酸0.05g/L，L-亮氨酸0.1g/L，L-赖氨酸0.05g/L，L-甲硫氨酸0.02g/L，L-苯丙氨酸0.05g/L，L-苏氨酸0.1g/L，L-色氨酸0.05g/L，L-酪氨酸0.05g/L，L-缬氨酸0.14g/L。

亮氨酸缺陷型平板：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，无氨基酵母氮源YNB 1.7g/L，半硫酸腺嘌呤10mg/L，L-精氨酸0.05g/L，L-天门冬氨酸0.08g/L，L-组氨酸0.02g/L，L-异亮氨酸0.05g/L，L-赖氨酸0.05g/L，L-甲硫氨酸0.02g/L，L-苯丙氨酸0.05g/L，L-苏氨酸 0.1g/L，L-色氨酸0.05g/L，L-酪氨酸0.05g/L，L-缬氨酸0.14g/L。

YPD培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。

种子培养基：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.7g/L，腺嘌呤0.01g/L，L-精氨酸0.05g/L，L-天门冬氨酸0.08g/L，L-组氨酸0.02g/L，L-异亮氨酸0.05g/L， L-亮氨酸0.1g/L，L-赖氨酸0.05g/L，L-甲硫氨酸0.02g/L，L-苯丙氨酸0.05g/L，L-苏氨酸0.1g/L，L-色氨酸0.05g/L，L-酪氨酸0.05g/L，L-缬氨酸0.14g/L。

发酵培养基：葡萄糖40g/L，硫酸铵1.1g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.7g/L，腺嘌呤0.01g/L，L-精氨酸0.05g/L，L-天门冬氨酸0.08g/L，L-组氨酸0.02g/L，L-异亮氨酸0.05g/L， L-亮氨酸0.1g/L，L-赖氨酸0.05g/L，L-甲硫氨酸0.02g/L，L-苯丙氨酸0.05g/L，L-苏氨酸0.1g/L，L-色氨酸0.05g/L，L-酪氨酸0.05g/L，L-缬氨酸0.14g/L。

2、樱花素含量采用高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1200，VWD检测器，ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×100mm，3.5μm，Agilent)，流动相：以50％(v/v) 甲醇水溶液为流动相，流速为0.5mL/min，检测光谱为250nm，柱温为40℃，进样体积为10μL，樱花素的保留时间为11.25min左右(具体可参见图3)。

制备例1

(1)使用AvrII和SalI将质粒pYLXP’-URA-loxP(核苷酸序列如SEQ ID NO：7 所示)进行酶切线性化，再采用引物Ku70_Up_F/Ku70_Up_R(核苷酸序列如SEQ ID NO： 16和SEQID NO：17所示)和Ku70_Dw_F/Ku70_Dw_R(核苷酸序列如SEQ ID NO： 18和SEQ ID NO：19所示)，以解脂耶氏酵母基因组为模板分别扩增得到Ku70的上游臂Ku70_Up和下游臂Ku70_Dw(核苷酸序列如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示，各1000bp)，之后采用Gibson组装的方式将线性化的pYLXP’-URA-loxP、Ku70_Up和 Ku70_Dw进行组装，获得重组质粒pYLXP’-URA-loxP-ku70(核苷酸序列如SEQ ID NO： 22所示)，将重组质粒pYLXP’-URA-loxP-Ku由上海生工测序验证正确后用于基因敲除；

(2)以解脂耶氏酵母po1f为原始菌株，将po1f菌株在2mL的YPD培养基中培养至指数生长期(16-24h)，收集1mL的发酵液中的po1f菌体，离心弃上清后，加入含 90μL的50体积％的PEG4000溶液，5μL醋酸锂(2M)，5μL的单链DNA(鲑鱼精子) 和5μL步骤(1)获得的重组质粒pYLXP’-URA-loxP-ku70，混匀后在39℃下孵浴1h后，涂布尿嘧啶缺陷型平板，筛选得到尿嘧啶筛选标记URA(核苷酸序列如SEQ ID NO：6 所示)替代Ku70基因(核苷酸序列如SEQID NO：3所示)的重组菌株单菌落；

(3)挑选步骤(2)中尿嘧啶缺陷型平板上的单菌落进行菌落PCR验证，使用引物对Ku70_ChkUp_F/TEF_R(核苷酸序列如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示)和 Ku70_ChkDw_R/XPR_F(核苷酸序列如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示)验证重组质粒pYLXP’-URA-loxP-Ku整合的上游位点和下游位点，两个位点都正确则证明重组质粒pYLXP’-URA-loxP-Ku敲除框整合的上游和下游位点，两个位点都正确证明重组质粒pYLXP’-URA-loxP-Ku整合至po1f菌体的敲除位点，得到的重组工程菌为Ku70基因敲除的解脂耶氏酵母菌株po1fk；

(4)使用SnaBI和KpnI将质粒pYLXP’(核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示) 线性化，同时使用SnaBI和KpnI酶切基因合成的获得来源于Oryza sativa的柚皮素甲基转移酶NOMT(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，通过酶切连接的方式获得重组质粒pYLXP’-NOMT；

(5)采用醋酸锂法的转化方法将重组质粒pYLXP’-NOMT转化至步骤(3)得到的po1fk菌株中，具体过程如下：将po1fk菌株在2mL的YPD培养基中培养至指数生长期(16-24h)，的收集1mL发酵液中的po1fk菌体，离心弃上清后，加入含90μL的50体积％PEG4000溶液，5μL醋酸锂(2M)，5μL的单链DNA(鲑鱼精子，购买于Sigma-Aldrich，货号D7656)和5μL的重组质粒pYLXP’-NOMT，混匀后在39℃和孵浴1h后，涂布亮氨酸缺陷型平板，筛选得到解脂耶氏酵母po1fk pYLXP’-NOMT。

实施例1重组质粒构建

使用AvrII和SalI将质粒pYLXP’-URA-loxP(核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示) 进行酶切线性化，再采用引物YALI0F17644g_Up_F/YALI0F17644g_Up_R(核苷酸序列如SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9所示)和YALI0F17644g_Dw_F/YALI0F17644g_Dw_R (核苷酸序列如SEQID NO：10和SEQ ID NO：11所示)，以解脂耶氏酵母基因组为模板分别扩增得到YALI0F17644g的上游臂YALI0F17644g_Up和下游臂 YALI0F17644g_Dw(核苷酸序列如SEQID NO：14和SEQ ID NO：15所示，各1000bp)，之后采用Gibson组装的方式将线性化的pYLXP’-URA-loxP、YALI0F17644g_Up和 YALI0F17644g_Dw进行组装，获得重组质粒pYLXP’-URA-loxP-YALI0F17644g(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)，将重组质粒pYLXP’-URA-loxP-YALI0F17644g由上海生工测序验证正确后用于实施例2中进行基因敲除。

实施例2

(1)菌株同源重组

以制备例1得到的解脂耶氏酵母po1fk pYLXP’-NOMT为出发菌株，将po1fkpYLXP’-NOMT菌株在2mL的YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖 20g/L)中培养至指数生长期(16-24h)，收集1mL的发酵液中的po1fk pYLXP’-NOMT 菌体，离心弃上清后，加入含90μL的50体积％的PEG4000溶液，5μL醋酸锂(2M)， 5μL的单链DNA(鲑鱼精子)和5μL实施例1获得的重组质粒 pYLXP’-URA-loxP-YALI0F17644g，混匀后在39℃下孵浴1h后，涂布尿嘧啶缺陷型平板，筛选得到尿嘧啶筛选标记URA(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)替代预苯酸脱氢酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)的重组菌株单菌落。

(2)重组菌株的验证

挑选步骤(1)中尿嘧啶缺陷型平板上随机的4个单菌落(分别编号为单菌落1、单菌落2、单菌落3和单菌落4)，使用引物对YALI0F17644g_ChkUp_F/TEF_R(核苷酸序列如SEQ IDNO：12和SEQ ID NO：13所示)和YALI0F17644g_ChkDw_R/XPR_F(核苷酸序列如SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示)进行菌落PCR验证(结果见图1)；利用引物对YALI0F17644g_ChkUp_F/TEF_R和YALI0F17644g_ChkDw_R/XPR_F验证重组质粒pYLXP’-URA-loxP-YALI0F17644g整合的上游位点和下游位点，两个位点都正确则证明重组质粒pYLXP’-URA-loxP-YALI0F17644g正确整合至po1fk pYLXP’-NOMT菌体的敲除位点，图1的结果显示，单菌落2的重组菌株为YALI0F17644g基因敲除的解脂耶氏酵母菌株，作为重组解脂耶氏酵母进行发酵合成樱花素。

实施例3

重组菌株发酵合成樱花素

挑取实施例2中得到的重组解脂耶氏酵母，接种于种子培养基，在温度为29℃、转速为220rpm的条件下培养48h，得到重组解脂耶氏酵母种子液；

将重组解脂耶氏酵母种子液以5体积％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为29℃，转速为220rpm的条件下进行发酵培养48h，向发酵液中加入L-酪氨酸使得其添加量为5g/L，再进行发酵培养72h，得到发酵液；发酵结束后通过高效液相色谱方法测定发酵上清液中樱花素的含量为1521.2mg/L(具体参见图3)。

实施例4

重组菌株发酵合成樱花素

将重组解脂耶氏酵母种子液以5体积％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为29℃，转速为220rpm的条件下进行发酵培养120h，得到发酵液；发酵结束后通过高效液相色谱方法测定发酵上清液中樱花素的含量。

实施例5

按照实施例3的方法发酵合成樱花素，不同的是，将种子培养基和发酵培养基均替换为YPD培养基。发酵结束后通过高效液相色谱方法测定发酵上清液中樱花素的含量。

对比例1

按照实施例3的方法发酵合成樱花素，不同的是，将重组解脂耶氏酵母替换为制备例1得到的出发菌株解脂耶氏酵母po1fk pYLXP’-NOMT，得到的发酵液的上清液中樱花素的含量为287.0mg/L。

参见图2，比较实施例3与对比例1可以看出，实施例2中得到的重组解脂耶氏酵母经发酵获得的发酵液中胞外樱花素的产量明显提高。采用本发明的构建方法对出发菌株(解脂耶氏酵母po1fk pYLXP’-NOMT)基因敲除进行遗传改造得到的重组菌株发酵合成樱花素能够更显著提升的发酵效果，得到的发酵上清液中樱花素的含量可达到 1521.2mg/L，与出发菌株解脂耶氏酵母po1fk pYLXP’-NOMT相比提高了5.3倍。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京师范大学

<120> 合成樱花素的重组菌株及其构建方法和发酵合成樱花素的方法及应用

<130> 2022.4.24

<160> 29

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ser Ile Glu Glu Trp Lys Lys Thr Lys Leu Val Gly Val Ile Gly

1 5 10 15

Met Gly Asp Met Gly Arg Leu Phe Ala Asn His Trp Asn Ser Gln Gly

20 25 30

Trp Lys Val Leu Ala Cys Asp Gln Glu Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys

35 40 45

Glu Glu Phe Ala Asp Ser Glu Ile Glu Ile Val Gln Asn Gly His Tyr

50 55 60

Val Ser Arg Lys Cys Asp Tyr Ile Leu Tyr Cys Val Glu Ala Glu Asn

65 70 75 80

Ile Gly Lys Ile Val Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Thr Lys Val Gly Ser

85 90 95

Ile Val Gly Gly Gln Thr Ser Cys Lys Ala Pro Glu Met Ala Ala Phe

100 105 110

Glu Ala His Leu Pro Ser Asp Val Asp Ile Ile Ser Cys His Ser Leu

115 120 125

His Gly Pro Lys Val Asn Pro Glu Gly Met Pro Leu Val Ile Ile Arg

130 135 140

His Arg Asn Thr Glu Glu Trp Lys Phe Glu Phe Val Gln Ser Leu Leu

145 150 155 160

Glu Ser Leu Lys Ser Lys Ile Val Tyr Leu Ser Ala Glu Gln His Asp

165 170 175

Lys Ile Thr Ala Asp Thr Gln Ala Val Thr His Ala Ala Phe Leu Thr

180 185 190

Met Gly Lys Ala Trp Gln Ala Asn Gly Gln Tyr Pro Trp Gln Ile Ser

195 200 205

Arg Trp Ile Gly Gly Leu Glu Asn Ala Lys Met Asn Ile Ser Leu Arg

210 215 220

Ile Tyr Ser Asn Lys Trp His Val Tyr Ala Gly Leu Ala Ile Ser Asn

225 230 235 240

Pro Ala Ala Lys Val Gln Ile Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Ala Gly Asp

245 250 255

Leu Tyr Lys Leu Met Ile Thr Gly Lys Glu Gln Glu Leu Leu Asp Arg

260 265 270

Leu Thr Ala Ala Arg Asp Phe Val Phe Gly Gly Leu Lys Lys Glu His

275 280 285

Ser Leu Leu Leu Ser Asp Glu Ile Leu Glu Lys Phe Ser Leu Gly Thr

290 295 300

Lys Pro Leu Gly Glu Thr Gln Lys Pro Asn Ser His Leu Ser Leu Leu

305 310 315 320

Ser Ile Val Asp Ser Trp His Lys Leu Lys Ile Asn Pro Tyr Asp His

325 330 335

Val Ile Cys Ser Thr Pro Leu Phe Arg Ile Trp Leu Gly Val Thr Glu

340 345 350

Tyr Val Phe Cys Thr Pro Gly Leu Leu Glu Gln Cys Ile Lys His Ser

355 360 365

Ile Thr Asn Gln Asp Phe Arg Pro Asp Asp Leu Glu Phe Val Val Ala

370 375 380

Ala Arg Thr Trp Ser Lys Val Val Ser Tyr Gly Ser Tyr Lys Leu Tyr

385 390 395 400

Glu Gln Glu Phe Asn Asp Thr Gln Lys Tyr Phe Ala His Met Phe Pro

405 410 415

Glu Ala Thr Arg Ile Gly Asn Glu Met Ile Asn Thr Ile Leu Ser Thr

420 425 430

Thr

<210> 2

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgtctattg aggaatggaa gaaaaccaag ctagtgggtg tgattggcat gggcgacatg 60

ggccgtctgt ttgctaacca ctggaactct cagggctgga aagtgctggc ctgtgatcag 120

gaatcccact atgagaagct caaggaggaa tttgccgatt cggagattga aatcgtccag 180

aatggccact atgtgtctcg aaagtgcgat tacattctct actgcgtcga ggccgagaat 240

atcggcaaga ttgtcagcat ctacggtccc tctacaaagg tcggttccat tgtaggtggt 300

caaacgtcct gtaaggctcc cgagatggct gcgttcgagg cacatctgcc ctctgacgtg 360

gatatcatct cgtgccactc actacacggc cccaaagtca accccgaggg catgcctctg 420

gtgattatcc gacacagaaa caccgaggag tggaagttcg agtttgtgca gtcactgctg 480

gagtcactca agtccaagat tgtctacctg tcggcagagc aacacgacaa aatcactgcc 540

gacacacagg ctgtgactca cgccgcattt ctgaccatgg gcaaggcctg gcaggcgaac 600

ggacagtacc cctggcagat aagccgttgg atcggaggtc tggaaaacgc aaagatgaac 660

atctcgctgc gaatctactc caataaatgg cacgtctatg ccggtctggc catctcaaac 720

cccgctgcca aggttcagat ccagcagtac gcatccagtg ccggcgatct gtacaaactc 780

atgatcacag gcaaggagca ggagttgctt gaccgcctta cggctgcccg agactttgtg 840

tttggaggcc tcaagaagga acactcgctg ctgctgtccg atgagattct cgaaaagttt 900

tcgctcggaa ccaaacccct gggagaaaca caaaagccga actcgcatct gtcactgctg 960

tccattgtcg actcgtggca caaactcaag atcaacccct acgaccacgt catctgctcg 1020

acacctctgt tccgaatctg gctgggtgtc actgaatacg tcttttgcac tccaggactg 1080

ctcgaacagt gcatcaaaca ctccattact aaccaggact tccgacccga cgatctggag 1140

tttgtggtgg ctgctcgaac gtggtctaag gtcgtttctt acggctccta caaactgtac 1200

gagcaggagt tcaacgacac ccaaaaatac tttgctcaca tgttccctga agccactcga 1260

attggcaacg agatgatcaa caccattctg tcaaccactt aa 1302

<210> 3

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atggaatgga tttcacatct ggagaacgat gacgatgtgc tggaaatcga ggactacaag 60

gtgcgcaagg acgcgctgct gatcgccatt caagtaaccc agaacgccat taacaacgga 120

actcttcata aggccttgga ggcagccttc gatgctgtga ctgacagaat cgtcatatcg 180

ccgcaagatt acaccggcgt tatgctgttc ggtgcctcca tgcagtctga ggacgacggt 240

gacgagttcg atgatgagtc agatacacat ttcattctca agctgggcct tcctaccgct 300

gctcagatca aacgactcaa acgactggca gaggaccctg atctgggtga gaggttcaag 360

gtgcaggaag agcctcacct gatggacgtg tttttcgaca tgaaccgcca ttttatcaac 420

atggcaccca acttcgcgtc cagacgaatc atctatatca cagacgacga tacccccacg 480

acgaatgagg acgatatcaa caagacacga gttcgaattg aggatctaag ccatctcaag 540

gtgaaggtcg agcctctttt gatcaaccct tcggaagaca agacgttcga ctcctccaaa 600

ttctacgctc ttgtgttcaa cgaagacaca tctgtggagc cggttgaggc gatcgatttg 660

aagcagttta tcaacaaaag aaacgtgctc aatcgatcac tgttcaatgt caaaatggaa 720

atcggagaag gtcttgttgt cggagtaaga ggataccttc tttatgcgga acaaaaggct 780

acttcaacaa cccgaaaggc ctgggtttac actggaggtg agaaacccga gattgccaaa 840

ttagaatcgc aggccgtcac tattgaaagt ggcagaagcg tggacaaggc agatctgaga 900

aagactttca agtttggaaa tgactatgtt cctttcacag aagaacagct gacgcaaatc 960

cggtactttg gagagccaat tattcgaatt ctcggcttcc acaattcctc ggacttctcc 1020

gagctcttca tccacagtgt ccgatcgtca atgttcctat atcccactga tgagaagctt 1080

gtgggttcga ttcgagcctt ttcagcactc tatcagagtc tcaagaacaa ggataagatg 1140

gctctggcct gggttattgt ccgcaagggc gccaaaccta ttctggctct tcttattcct 1200

tcaactaagg agatcgaagg tcttcatatg gtcttcttgc cttttacaga tgatattcga 1260

caagaaccaa agactgaact tgtgtctgcc gcccctgagc tcgtggacgc aaccaagaat 1320

attttcactc gtctacgcat gcctggcgga tttgagtcgc aaagataccc caacccccgt 1380

ctacagtggc attaccgagt tgtacgagcc atggcccttc aggaggaggt tcccaaggta 1440

cccgaagaca agacgacacc aaagtatcgg tctattgata ctcgagttgg tgatgccatc 1500

gaggaatgga acaaggtgtt gcagagcagc tccaagcgac ctgcggagga tatctgtaag 1560

gctgagaaga aagtcaagag ttctgacgcg ggccctccgt ccaacgagca aatgcaaaat 1620

atggttgaga atgacattgt cggcaagctg accgtcgcag aactcagggc ttggggtgct 1680

gctaacaatg ttgagcccaa tggtagcaag ttgaagaagg actgggttga ggtggtcaaa 1740

aagtactatg ggaagtga 1758

<210> 4

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgggtgata tggtcagccc cgttgtccac cggcatgccg caggcggagg tagcggagga 60

gatgatgacg accaagcctg catgtatgct ctcgaacttc tgggaggatc cgtggtcagc 120

atgaccctga aagcagctat tgagctggga ctcgtcgatg agctcctggc tgcagcagga 180

gcagccgtga cagcagaaga gcttgccgcc cggcttcgtc ttcctgctgc cgtggccgct 240

gccgccgctg ttgatagaat gcttcggctc ctcgcctcgt acggcgtcgt tcggtgtgcc 300

actgaagcag gccctgatgg caaagctcga cgtagctatg ctgctgctcc tgtgtgtaag 360

tggctggctg ctggatctag ctcgggagaa ggttcgatgg cccccctggg cctccttaat 420

ctggacaagg tgtttatgga aaactggtat tatctgaaag aagccgtctc ggagggcggt 480

acggcatttg ataaagccta cggtacttcc ctgtttcaat atctgggtca agatggcaac 540

gaacctagca acaccctgtt taatcaagca atggcctctc actccgtggt gattacgaac 600

aagctgctgc agttctttcg gggattcgat gccggtgccg gcgtggacgt tctcgttgac 660

gtcggtggag gtgtgggcgc tactcttcgt atgatcaccg cacgacaccc ccaccttcgg 720

ggtgttaatt acgatctgcc tcacgtcatt gctcaagcac cccccgttga aggagttgag 780

cacatcggcg gttctatgtt cgatcatgtt ccttctggat ccgcaatcct tctcaaatgg 840

atcctgcacc tgtggggtga tgaagaatgc gtgaaaattc ttaagaactg ttacaaagcc 900

ctccccgcta agggaaaggt cattcttgtt gaatacgtcc tccctgcaag ccccgaggca 960

acccttgcag cacaggaggc attccggctc gatgttatga tgcttaaccg gcttgccgga 1020

ggtaaagaac gtacccaaca agaatttaca gaccttgcag ttgacgcagg tttttctgga 1080

gattgtaaac ccacctacat ctttacgaat gtctgggcac tggaattcac gaagtaa 1137

<210> 5

<211> 3942

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ggacagagtg tccaacaagc caatgatgtc gttagtctgg tccagcagct tggagcacgt 60

cagcgagtac gacgtggcct gcatgtacat ggtggtggcc ctttggagct gtggcgtgtt 120

tgtttcttgt gatgacgatg ctgattgttg tagggagctg tttccggaag gagaaaagag 180

ctcttccact tctctcctcg agaatggcca ttctgtgcgc agtttctcaa cctcgggtct 240

ctccagcgag cccacattga cgctctgtgt ccgtcgacgc aaaggaggca cctccagcac 300

atctgtctgg gtcacttgga ccaccttctc cacggccacg gactgaatga tgcttttggc 360

acgtgatctc ttcgggctta ccggctttgg agccggcttc gccgcgtcca tgtatgccca 420

ttcgtcgtac atctctcttg ctgtgtaacc acgtctatcc tccgggtgtg ggtatggaga 480

gctgtaccac gtatgtcgga tgtgcaaata gagttgcgcg tgtgtttgga gtgacatgag 540

aagtaggaga acaaatgtag tgggtaactg ggtaaaggag tttgaataac aacaggtaat 600

ttacatacaa aaaaagacca gtcaacccct cggcttatgt ttcagtttct tccgaatcag 660

atcaccgtgg tagatggaag ttcaaggtgg tccgtttagt tgaatatact tcagcataag 720

ctaaaagttt gttaatgatt ttaggaaagt acaaactcga caatgacagg ggtaaaagat 780

atgttatgag aaatagaaat gtcaaatttc aatcacaacc aattcaagat ccagaaatta 840

aaaattcagt tctaaaatac cacgttttaa gccccctata ccttcacctc cattccacct 900

cggagtttca ctatccgcat aaggttttag tctcaatatg gagatccgga aacaccattt 960

ctacgacacg atacattgta ctttcgccac gctctacaac gataacttcg tatagcatac 1020

attatacgaa gttatgacga cagagaccgg gttggcggcg catttgtgtc ccaaaaaaca 1080

gccccaattg ccccaattga ccccaaattg acccagtagc gggcccaacc ccggcgagag 1140

cccccttctc cccacatatc aaacctcccc cggttcccac acttgccgtt aagggcgtag 1200

ggtactgcag tctggaatct acgcttgttc agactttgta cttgtttctt tgtctggcca 1260

tccgggtaac ccatgccgga cgcaaaatag actactgaaa atttttttgc tttgtggttg 1320

ggactttagc caagggtata aaagaccacc gtccccgaat tacctttcct cttcttttct 1380

ctctctcctt gtcaactcac acccgaaatc gttaagcatt tccttctgag tataagaatc 1440

attcaaatct agaatggtga gtttcagagg cagcagcaat tgccacgggc tttgagcaca 1500

cggccgggtg tggtcccatt cccatcgaca caagacgcca cgtcatccga ccagcacttt 1560

ttgcagtact aaccgcagcc ctcctacgaa gctcgagcta acgtccacaa gtccgccttt 1620

gccgctcgag tgctcaagct cgtggcagcc aagaaaacca acctgtgtgc ttctctggat 1680

gttaccacca ccaaggagct cattgagctt gccgataagg tcggacctta tgtgtgcatg 1740

atcaagaccc atatcgacat cattgacgac ttcacctacg ccggcactgt gctccccctc 1800

aaggaacttg ctcttaagca cggtttcttc ctgttcgagg acagaaagtt cgcagatatt 1860

ggcaacactg tcaagcacca gtacaagaac ggtgtctacc gaatcgccga gtggtccgat 1920

atcaccaacg cccacggtgt acccggaacc ggaatcattg ctggcctgcg agctggtgcc 1980

gaggaaactg tctctgaaca gaagaaggag gacgtctctg actacgagaa ctcccagtac 2040

aaggagttcc tggtcccctc tcccaacgag aagctggcca gaggtctgct catgctggcc 2100

gagctgtctt gcaagggctc tctggccact ggcgagtact ccaagcagac cattgagctt 2160

gcccgatccg accccgagtt tgtggttggc ttcattgccc agaaccgacc taagggcgac 2220

tctgaggact ggcttattct gacccccggg gtgggtcttg acgacaaggg agacgctctc 2280

ggacagcagt accgaactgt tgaggatgtc atgtctaccg gaacggatat cataattgtc 2340

ggccgaggtc tgtacggcca gaaccgagat cctattgagg aggccaagcg ataccagaag 2400

gctggctggg aggcttacca gaagattaac tgttagggta ccgactagtt ccatggcctg 2460

tccccacgtt gccggtcttg cctcctacta cctgtccatc aatgacgagg ttctcacccc 2520

tgcccaggtc gaggctctta ttactgagtc caacaccggt gttcttccca ccaccaacct 2580

caagggctct cccaacgctg ttgcctacaa cggtgttggc atttaggcaa ttaacagata 2640

gtttgccggt gataattctc ttaacctccc acactccttt gacataacga tttatgtaac 2700

gaaactgaaa tttgaccaga tattgttgta aatagaaaat ctggcttgta ggtggcaaaa 2760

tgcggcgtct ttgttcatca attccctctg tgactactcg tcatcccttt atgttcgact 2820

gtcgtatttc ttattttcca tacatatgca agtgagatgc ccgtgtccgt tatcaaatct 2880

agttaataac ttcgtatagc atacattata cgaagttatg ctagcgagac aataacggag 2940

gagacacact tgcaggtcta aaagttccta gaaaacaata gtttcaataa tagagtgact 3000

atgatgatga ttattatgag gatgaggagg atgatgatga tacaaaaagt attacttata 3060

caaatctatt atagtagttt accactgttc tggtttttgt tatatatagt taactgacag 3120

ccatcaagct accggtactt gtactgtctc tctatcgtcg cttgtaaatg caaggcttga 3180

gcaaccactc gccctcagcc tgcttctttc gtctcttctc gagctgctcg ccgtcctcgg 3240

gtcccttctt ttcctcctca tctccatagt caatgaactt tcgctttggc accttcttct 3300

ttcgttgggc gagaatctct tgggtgggtt tgaagaactc gaaccgcaca aagtgcgtgt 3360

tttcgtcgtc tgtgagcttg tggaagaagc tgaggctctt gagcaccttg atgaactcgt 3420

cggtctggcc gtcggtgaat cgagacttaa tctcggcgat ccacagctct ccattgggcc 3480

gcagaattcg catggcctcc ttgatgaagt ccaggaagtt ggttcccata agagccagac 3540

agaagacgac aatgtcagcg gagttgtctt ccatgggcac attcttcaca tctgccactg 3600

tcactcgctc gttggccttc ttcagatcaa acgactgggt ctcgaccacc aggttcttgt 3660

tctgggggtt gacgcccttc ttcttgaagt tgatcttgct cagatccagc gccagctgcg 3720

cctctccaca gcccatatcg gccaccacaa tcttgttctc gcgcttgtga gcaggcagcc 3780

ctccaggaga acacacaggc ttgttgagcc tctcggtaaa ccgcttgaca aaggtgtcca 3840

cggggttctc gggccaaccc tgcacctggt ttcggaatcc agcatgatac tcgtcaaaaa 3900

tctcggggtt gtcggtaatc attttgagag cctcttcgga gg 3942

<210> 6

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atgccctcct acgaagctcg agctaacgtc cacaagtccg cctttgccgc tcgagtgctc 60

aagctcgtgg cagccaagaa aaccaacctg tgtgcttctc tggatgttac caccaccaag 120

gagctcattg agcttgccga taaggtcgga ccttatgtgt gcatgatcaa gacccatatc 180

gacatcattg acgacttcac ctacgccggc actgtgctcc ccctcaagga acttgctctt 240

aagcacggtt tcttcctgtt cgaggacaga aagttcgcag atattggcaa cactgtcaag 300

caccagtaca agaacggtgt ctaccgaatc gccgagtggt ccgatatcac caacgcccac 360

ggtgtacccg gaaccggaat cattgctggc ctgcgagctg gtgccgagga aactgtctct 420

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ccctctccca acgagaagct ggccagaggt ctgctcatgc tggccgagct gtcttgcaag 540

ggctctctgg ccactggcga gtactccaag cagaccattg agcttgcccg atccgacccc 600

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taccagaaga ttaactgtta g 861

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cgatgctttt cgtagataat ggaatacaaa tggatatcca gagtatacac atggatagta 60

tacactgaca cgacaattct gtatctcttt atgttaacta ctgtgaggcg ttaaatagag 120

cttgatatat aaaatgttac atttcacagt ctgaactttt gcagattacc taatttggta 180

agatattaat tatgaactga aagttgatgg catccctaaa tttgatgaaa gcctaggata 240

acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tgacgacaga gaccgggttg gcggcgcatt 300

tgtgtcccaa aaaacagccc caattgcccc aattgacccc aaattgaccc agtagcgggc 360

ccaaccccgg cgagagcccc cttctcccca catatcaaac ctcccccggt tcccacactt 420

gccgttaagg gcgtagggta ctgcagtctg gaatctacgc ttgttcagac tttgtacttg 480

tttctttgtc tggccatccg ggtaacccat gccggacgca aaatagacta ctgaaaattt 540

ttttgctttg tggttgggac tttagccaag ggtataaaag accaccgtcc ccgaattacc 600

tttcctcttc ttttctctct ctccttgtca actcacaccc gaaatcgtta agcatttcct 660

tctgagtata agaatcattc aaatctagaa tggtgagttt cagaggcagc agcaattgcc 720

acgggctttg agcacacggc cgggtgtggt cccattccca tcgacacaag acgccacgtc 780

atccgaccag cactttttgc agtactaacc gcagccctcc tacgaagctc gagctaacgt 840

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cgccgagtgg tccgatatca ccaacgccca cggtgtaccc ggaaccggaa tcattgctgg 1200

cctgcgagct ggtgccgagg aaactgtctc tgaacagaag aaggaggacg tctctgacta 1260

cgagaactcc cagtacaagg agttcctggt cccctctccc aacgagaagc tggccagagg 1320

tctgctcatg ctggccgagc tgtcttgcaa gggctctctg gccactggcg agtactccaa 1380

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caagggagac gctctcggac agcagtaccg aactgttgag gatgtcatgt ctaccggaac 1560

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caagcgatac cagaaggctg gctgggaggc ttaccagaag attaactgtt agggtaccga 1680

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tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc 2400

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gcatggcggc cgacgcgctg ggctacgtct tgctggcgtt cgcgacgcga ggctggatgg 2640

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tgctgtccag gcaggtagat gacgaccatc agggacagct tcaaggatcg ctcgcggctc 2760

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cgagcacatg gaacgggttg gcatggattg taggcgccgc cctatacctt gtctgcctcc 2880

ccgcgttgcg tcgcggtgca tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca 2940

cctcgctaac ggattcacca ctccaagaat tggagccaat caattcttgc ggagaactgt 3000

gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg 3060

cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct 3120

gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc 3180

gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac 3240

atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg 3300

caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac 3360

atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat 3420

ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt 3480

aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa 3540

tcccccttac acggaggcat cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg 3600

ctttatcaga agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga 3660

acaggcagac atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagcagatc 3720

cgcggccgca taggccaata gtggatctgc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 3780

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 3840

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 3900

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tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 4500

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aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 5040

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 5100

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ttgccattgc tgcaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 5340

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 5400

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 5460

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 5520

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ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 5700

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ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 5820

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gtttcgggtt ccattgtgga tgtgtgtggt tgtatgtgtg atgtggtgtg tggagtgaaa 8100

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ctaaacctcc gaagattgtg actcaggtag tgcggtatcg gctagggacc caaaccttgt 8220

cgatgccgat agcgctatcg aacgtaccca gccggccggg agtatgtcgg aggggacata 8280

cgagatcgtc aagggtttgt ggccaactgg taaataaatg atgactcagg cgacgacgga 8340

attctcatgt ttgacagctt atcat 8365

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

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<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aatgtatgct atacgaagtt atgttgtaga gcgtggcgaa agtacaat 48

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

agcgagacaa taacggagga gtcgacgaca cacttgcagg tctaaaagtt cc 52

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ttacatcctt ttatcagaca taaagatgaa agagaagctg gccgg 45

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cttgatgaag ttgtgactgc ctcc 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

tttgatatgt ggggagaagg gggct 25

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

caatgatgtc gttagtctgg tccagcagct tggagcacgt cagcgagtac gacgtggcct 60

gcatgtacat ggtggtggcc ctttggagct gtggcgtgtt tgtttcttgt gatgacgatg 120

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<212> DNA

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gacacacttg caggtctaaa agttcctaga aaacaatagt ttcaataata gagtgactat 60

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gtctggccgt cggtgaatcg agacttaatc tcggcgatcc acagctctcc attgggccgc 540

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tcggggttgt cggtaatcat tttgagagcc tcttcggagg gaacagtata cagctgctcg 1020

ttgatccatc ggaaccgcga tccggccagc ttctctttca tctt 1064

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<400> 16

ggcatcccta aatttgatga aagtgtacca ttctacccgg ggtctg 46

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<212> DNA

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taatgtatgc tatacgaagt tattttcaaa aagcggcggt tcgtg 45

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<212> DNA

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acatcctttt atcagacata gagtgaacga ccaagactaa agggt 45

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<212> DNA

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<400> 20

tgtaccattc tacccggggt ctgccggctt gtacacaccg acagcactcg tactctccca 60

cgaatgctcc ggctgccgac atcaacacga tctcaaaagc gcatactgag cttcctttcc 120

tagctcttcc ttccttcaac tcgataaata cattggatat atacatgtgt ggcgactgtc 180

gacttgatgt ttagagtgtc cagatccgca agatcggctc gcacttgtgt tgtgttgttt 240

caaatcagcc tgtcgttttg tgtcgtttga gatcattctg tctcactctt aggctcgctt 300

agaaccgaca acggagaatc cgggctcggt ttttcggtcg gccttgatct gggccttgga 360

cttgtactgg tcggccatct ccacgttgac cagctccttg accttgtaga gctgaccggc 420

gataccagga gacaccttgt agtacttctg ggagccgacc ttgcccagac cgagggtctt 480

gagcacgtca cgtgttctcc acggcattcg caggatagat cggacctgtg tgactttgta 540

gaacatggcg tttcaggtgg ttgcgtgagt gtgtaaaatc gtgtctttca gaagttacaa 600

atttcaccgc atttagagtt tatgcagatg ggcggtgtgt ggttgggagt tcgatttccg 660

tgcgtgcatt tgatcttgat gaattggatt tgtacatgag gaagagcacg tcaagcaccg 720

cctactgcaa actcgtgaat attgagatta ttgaggaaat tcaaggaaaa ttcagatcag 780

atttgagagc aaagtccaac aatactacac aatccctttc ctgtattctt ccaccatcgt 840

catcgtcgtc tgtcttctct tcagcttttt aatttcactc cccacaaacc caaatttagc 900

tgcatcattc atcaacctcc aattataact atacatcgcg acacgaacac gaaacacgaa 960

ccacgaaccg ccgctttttg aaa 983

<210> 21

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

ctagggaggc acatctaaac gaataacgaa tattaatgat accatcatat ctcagaacat 60

gtatgactgc tgcttccaaa cgatatgagg atgagtcctc tttcagatta agatagagta 120

caaatatatt atctatatac tggtgtctgt gcgatgtcgt atgagcggtg aatcatgtga 180

ctgtcacgtg gtttggccca agttacaccg tagctacgcc tttcttgacc gtctccatgg 240

tcttctgggc gggttgacag tttccactgg atgagcgtcc gcctcctgtt cctgtcgttg 300

tccctgcagc tcagcctcaa tcttctgacc gagctcggag tccagggaaa tgccaacagg 360

ttgtccaagc aacatcatgg tttggtgggc agccgtgatc tcatcgtcgt tggataccat 420

tcggtacttg gcctcaatct gcacaaagta gcggtaccac tggtttcgag caaaccgctc 480

caattgagcc tctccgtcga gagagagagt aggtgattgc tccaacttgc ggccaaaatg 540

aagttctcga ctcacctttt tgaagcggtt cttcttgccc atcttggtgg cgaaagtagt 600

ggctagtggt ggatgacttt gtataatgta ccgatgaaga gggttgtatt tgctcagtaa 660

gaagtagcga gtgaaatcag atgacttaac gagagcaaag ggcaatggaa tacctgctgc 720

ctgattaaca acagcttctg tgtcgtttct ctcttgtgaa tgagtgtgtt gctagaggta 780

ggttggcact ccaatgttac gacacacaat agtctataga gcactacaaa gggctatatc 840

gtcaactgct ctattgtagc tacagtacag tacataccat caagtgaaca atggaccacc 900

aaactcggca ctaagccaat agaacctttg cggcctcctt tatcacgttt ctatatacct 960

tgtccattta tgtgccaccc tttagtcttg gtcgttcact 1000

<210> 22

<211> 3924

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

tgtaccattc tacccggggt ctgccggctt gtacacaccg acagcactcg tactctccca 60

cgaatgctcc ggctgccgac atcaacacga tctcaaaagc gcatactgag cttcctttcc 120

tagctcttcc ttccttcaac tcgataaata cattggatat atacatgtgt ggcgactgtc 180

gacttgatgt ttagagtgtc cagatccgca agatcggctc gcacttgtgt tgtgttgttt 240

caaatcagcc tgtcgttttg tgtcgtttga gatcattctg tctcactctt aggctcgctt 300

agaaccgaca acggagaatc cgggctcggt ttttcggtcg gccttgatct gggccttgga 360

cttgtactgg tcggccatct ccacgttgac cagctccttg accttgtaga gctgaccggc 420

gataccagga gacaccttgt agtacttctg ggagccgacc ttgcccagac cgagggtctt 480

gagcacgtca cgtgttctcc acggcattcg caggatagat cggacctgtg tgactttgta 540

gaacatggcg tttcaggtgg ttgcgtgagt gtgtaaaatc gtgtctttca gaagttacaa 600

atttcaccgc atttagagtt tatgcagatg ggcggtgtgt ggttgggagt tcgatttccg 660

tgcgtgcatt tgatcttgat gaattggatt tgtacatgag gaagagcacg tcaagcaccg 720

cctactgcaa actcgtgaat attgagatta ttgaggaaat tcaaggaaaa ttcagatcag 780

atttgagagc aaagtccaac aatactacac aatccctttc ctgtattctt ccaccatcgt 840

catcgtcgtc tgtcttctct tcagcttttt aatttcactc cccacaaacc caaatttagc 900

tgcatcattc atcaacctcc aattataact atacatcgcg acacgaacac gaaacacgaa 960

ccacgaaccg ccgctttttg aaaataactt cgtatagcat acattatacg aagttatgac 1020

gacagagacc gggttggcgg cgcatttgtg tcccaaaaaa cagccccaat tgccccaatt 1080

gaccccaaat tgacccagta gcgggcccaa ccccggcgag agcccccttc tccccacata 1140

tcaaacctcc cccggttccc acacttgccg ttaagggcgt agggtactgc agtctggaat 1200

ctacgcttgt tcagactttg tacttgtttc tttgtctggc catccgggta acccatgccg 1260

gacgcaaaat agactactga aaattttttt gctttgtggt tgggacttta gccaagggta 1320

taaaagacca ccgtccccga attacctttc ctcttctttt ctctctctcc ttgtcaactc 1380

acacccgaaa tcgttaagca tttccttctg agtataagaa tcattcaaat ctagaatggt 1440

gagtttcaga ggcagcagca attgccacgg gctttgagca cacggccggg tgtggtccca 1500

ttcccatcga cacaagacgc cacgtcatcc gaccagcact ttttgcagta ctaaccgcag 1560

ccctcctacg aagctcgagc taacgtccac aagtccgcct ttgccgctcg agtgctcaag 1620

ctcgtggcag ccaagaaaac caacctgtgt gcttctctgg atgttaccac caccaaggag 1680

ctcattgagc ttgccgataa ggtcggacct tatgtgtgca tgatcaagac ccatatcgac 1740

atcattgacg acttcaccta cgccggcact gtgctccccc tcaaggaact tgctcttaag 1800

cacggtttct tcctgttcga ggacagaaag ttcgcagata ttggcaacac tgtcaagcac 1860

cagtacaaga acggtgtcta ccgaatcgcc gagtggtccg atatcaccaa cgcccacggt 1920

gtacccggaa ccggaatcat tgctggcctg cgagctggtg ccgaggaaac tgtctctgaa 1980

cagaagaagg aggacgtctc tgactacgag aactcccagt acaaggagtt cctggtcccc 2040

tctcccaacg agaagctggc cagaggtctg ctcatgctgg ccgagctgtc ttgcaagggc 2100

tctctggcca ctggcgagta ctccaagcag accattgagc ttgcccgatc cgaccccgag 2160

tttgtggttg gcttcattgc ccagaaccga cctaagggcg actctgagga ctggcttatt 2220

ctgacccccg gggtgggtct tgacgacaag ggagacgctc tcggacagca gtaccgaact 2280

gttgaggatg tcatgtctac cggaacggat atcataattg tcggccgagg tctgtacggc 2340

cagaaccgag atcctattga ggaggccaag cgataccaga aggctggctg ggaggcttac 2400

cagaagatta actgttaggg taccgactag ttccatggcc tgtccccacg ttgccggtct 2460

tgcctcctac tacctgtcca tcaatgacga ggttctcacc cctgcccagg tcgaggctct 2520

tattactgag tccaacaccg gtgttcttcc caccaccaac ctcaagggct ctcccaacgc 2580

tgttgcctac aacggtgttg gcatttaggc aattaacaga tagtttgccg gtgataattc 2640

tcttaacctc ccacactcct ttgacataac gatttatgta acgaaactga aatttgacca 2700

gatattgttg taaatagaaa atctggcttg taggtggcaa aatgcggcgt ctttgttcat 2760

caattccctc tgtgactact cgtcatccct ttatgttcga ctgtcgtatt tcttattttc 2820

catacatatg caagtgagat gcccgtgtcc gttatcaaat ctagttaata acttcgtata 2880

gcatacatta tacgaagtta tgctagcgag acaataacgg aggactaggg aggcacatct 2940

aaacgaataa cgaatattaa tgataccatc atatctcaga acatgtatga ctgctgcttc 3000

caaacgatat gaggatgagt cctctttcag attaagatag agtacaaata tattatctat 3060

atactggtgt ctgtgcgatg tcgtatgagc ggtgaatcat gtgactgtca cgtggtttgg 3120

cccaagttac accgtagcta cgcctttctt gaccgtctcc atggtcttct gggcgggttg 3180

acagtttcca ctggatgagc gtccgcctcc tgttcctgtc gttgtccctg cagctcagcc 3240

tcaatcttct gaccgagctc ggagtccagg gaaatgccaa caggttgtcc aagcaacatc 3300

atggtttggt gggcagccgt gatctcatcg tcgttggata ccattcggta cttggcctca 3360

atctgcacaa agtagcggta ccactggttt cgagcaaacc gctccaattg agcctctccg 3420

tcgagagaga gagtaggtga ttgctccaac ttgcggccaa aatgaagttc tcgactcacc 3480

tttttgaagc ggttcttctt gcccatcttg gtggcgaaag tagtggctag tggtggatga 3540

ctttgtataa tgtaccgatg aagagggttg tatttgctca gtaagaagta gcgagtgaaa 3600

tcagatgact taacgagagc aaagggcaat ggaatacctg ctgcctgatt aacaacagct 3660

tctgtgtcgt ttctctcttg tgaatgagtg tgttgctaga ggtaggttgg cactccaatg 3720

ttacgacaca caatagtcta tagagcacta caaagggcta tatcgtcaac tgctctattg 3780

tagctacagt acagtacata ccatcaagtg aacaatggac caccaaactc ggcactaagc 3840

caatagaacc tttgcggcct cctttatcac gtttctatat accttgtcca tttatgtgcc 3900

accctttagt cttggtcgtt cact 3924

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

tgtaccattc tacccggggt ctg 23

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

tttgatatgt ggggagaagg gggct 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

agtgaacgac caagactaaa gggtg 25

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

taacctccca cactcctttg acataacg 28

<210> 27

<211> 7461

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

cgatgctttt cgtagataat ggaatacaaa tggatatcca gagtatacac atggatagta 60

tacactgaca cgacaattct gtatctcttt atgttaacta ctgtgaggcg ttaaatagag 120

cttgatatat aaaatgttac atttcacagt ctgaactttt gcagattacc taatttggta 180

agatattaat tatgaactga aagttgatgg catccctaaa tttgatgaaa gcctagggac 240

gacagagacc gggttggcgg cgcatttgtg tcccaaaaaa cagccccaat tgccccaatt 300

gaccccaaat tgacccagta gcgggcccaa ccccggcgag agcccccttc tccccacata 360

tcaaacctcc cccggttccc acacttgccg ttaagggcgt agggtactgc agtctggaat 420

ctacgcttgt tcagactttg tacttgtttc tttgtctggc catccgggta acccatgccg 480

gacgcaaaat agactactga aaattttttt gctttgtggt tgggacttta gccaagggta 540

taaaagacca ccgtccccga attacctttc ctcttctttt ctctctctcc ttgtcaactc 600

acacccgaaa tcgttaagca tttccttctg agtataagaa tcattcaaat ctagaatggt 660

gagtttcaga ggcagcagca attgccacgg gctttgagca cacggccggg tgtggtccca 720

ttcccatcga cacaagacgc cacgtcatcc gaccagcact ttttgcagta cgtatctaca 780

cgcgtgctat gcatctgagt gaggtaccga ctagttccat ggcctgtccc cacgttgccg 840

gtcttgcctc ctactacctg tccatcaatg acgaggttct cacccctgcc caggtcgagg 900

ctcttattac tgagtccaac accggtgttc ttcccaccac caacctcaag ggctctccca 960

acgctgttgc ctacaacggt gttggcattt aggcaattaa cagatagttt gccggtgata 1020

attctcttaa cctcccacac tcctttgaca taacgattta tgtaacgaaa ctgaaatttg 1080

accagatatt gttgtaaata gaaaatctgg cttgtaggtg gcaaaatgcg gcgtctttgt 1140

tcatcaattc cctctgtgac tactcgtcat ccctttatgt tcgactgtcg tatttcttat 1200

tttccataca tatgcaagtg agatgcccgt gtccgttatc aaatctagtt agctagcgag 1260

acaataacgg aggagtcgac tatgtctgat aaaaggatgt aacataggca agctgctcgt 1320

gagtgttgag tacgaacctt agatccaaat cacccgcacc cacggatata cttgcttgaa 1380

tatacagtag tatgctcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg 1440

gtgggcgcgg ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact 1500

cgtaggacag gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct ttcgctggag 1560

cgcgacgatg atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc tcgctcaagc 1620

cttcgtcact ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta tcgccggcat 1680

ggcggccgac gcgctgggct acgtcttgct ggcgttcgcg acgcgaggct ggatggcctt 1740

ccccattatg attcttctcg cttccggcgg catcgggatg cccgcgttgc aggccatgct 1800

gtccaggcag gtagatgacg accatcaggg acagcttcaa ggatcgctcg cggctcttac 1860

cagcctaact tcgatcactg gaccgctgat cgtcacggcg atttatgccg cctcggcgag 1920

cacatggaac gggttggcat ggattgtagg cgccgcccta taccttgtct gcctccccgc 1980

gttgcgtcgc ggtgcatgga gccgggccac ctcgacctga atggaagccg gcggcacctc 2040

gctaacggat tcaccactcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag aactgtgaat 2100

gcgcaaacca acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag cagccgcacg 2160

cggcgcatct cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcgt gctcctgtcg 2220

ttgaggaccc ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga atcaccgata 2280

cgcgagcgaa cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc aacaacatga 2340

atggtcttcg gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc gccctgcacc 2400

attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac acctacatct 2460

gtattaacga agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg ccgcatccat 2520

accgccagtt gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc atcagtaacc 2580

cgtatcgtga gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa cagaaatccc 2640

ccttacacgg aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat ggcccgcttt 2700

atcagaagcc agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc ggatgaacag 2760

gcagacatct gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag cagatccgcg 2820

gccgcatagg ccaatagtgg atctgctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 2880

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 2940

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc 3000

agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt 3060

actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg 3120

catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 3180

gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 3240

cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 3300

gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 3360

aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 3420

ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 3480

cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 3540

ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 3600

cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 3660

agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 3720

gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 3780

gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 3840

tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 3900

agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 3960

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 4020

atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 4080

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 4140

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 4200

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 4260

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 4320

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 4380

cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 4440

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 4500

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 4560

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 4620

tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 4680

ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 4740

aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 4800

gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 4860

gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 4920

ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 4980

catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 5040

atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 5100

taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa ttcatgtcac acaaaccgat 5160

cttcgcctca aggaaaccta attctacatc cgagagactg ccgagatctg ttcggaaatc 5220

aacggatgct caaccgattt cgacagtaat aatttgaatc gaatcggagc ctaaaatgaa 5280

cccgagtata tctcataaaa ttctcggtga gaggtctgtg actgtcagta caaggtgcct 5340

tcattatgcc ctcaacctta ccatacctca ctgaatgtag tgtacctcta aaaatgaaat 5400

acagtgccaa aagccatggc actgagctcg tctaacggac ttgatataca accaattaaa 5460

acaaatgaaa agaaatacag ttctttgtat catttgtaac aattaccctg tacaaactaa 5520

ggtattgaaa tcccacaata ttcccaaagt ccaccccttt ccaaattgtc atgcctacaa 5580

ctcatatacc aagcactaac ctaccaaaca ccactaaaac cccacaaaat atatcttacc 5640

gaatatacag taacaagcta ccaccacact cgttgggtgc agtcgccagc ttaaagatat 5700

ctatccacat cagccacaac tcccttcctt taataaaccg actacaccct tggctattga 5760

ggttatgagt gaatatactg tagacaagac actttcaaga agactgtttc caaaacgtac 5820

cactgtcctc cactacaaac acacccaatc tgcttcttct agtcaaggtt gctacaccgg 5880

taaattataa atcatcattt cattagcagg gcagggccct ttttatagag tcttatacac 5940

tagcggaccc tgccggtaga ccaacccgca ggcgcgtcag tttgctcctt ccatcaatgc 6000

gtcgtagaaa cgacttactc cttcttgagc agctccttga ccttgttggc aacaagtctc 6060

cgacctcgga ggtggaggaa gagcctccga tatcggcggt agtgatacca gcctcgacgg 6120

actccttgac ggcagcctca acagcgtcac cggcgggctt catgttaaga gagaacttga 6180

gcatcatggc ggcagacaga atggtggcaa tggggttgac cttctgcttg ccgagatcgg 6240

gggcagatcc gtgacagggc tcgtacagac cgaacgcctc gttggtgtcg ggcagagaag 6300

ccagagaggc ggagggcagc agacccagag aaccggggat gacggaggcc tcgtcggaga 6360

tgatatcgcc aaacatgttg gtggtgatga tgataccatt catcttggag ggctgcttga 6420

tgaggatcat ggcggccgag tcgatcagct ggtggttgag ctcgagctgg gggaattcgt 6480

ccttgaggac tcgagtgaca gtctttcgcc aaagtcgaga ggaggccagc acgttggcct 6540

tgtcaagaga ccacacggga agaggggggt tgtgctgaag ggccaggaag gcggccattc 6600

gggcaattcg ctcaacctca ggaacggagt aggtctcggt gtcggaagcg acgccagatc 6660

cgtcatcctc ctttcgctct ccaaagtaga tacctccgac gagctctcgg acaatgatga 6720

agtcggtgcc ctcaacgttt cggatggggg agagatcggc gagcttgggc gacagcagct 6780

ggcagggtcg caggttggcg tacaggttca ggtcctttcg cagcttgagg agaccctgct 6840

cgggtcgcac gtcggttcgt ccgtcgggag tggtccatac ggtgttggca gcgcctccga 6900

cagcaccgag cataatagag tcagcctttc ggcagatgtc gagagtagcg tcggtgatgg 6960

gctcgccctc cttctcaatg gcagctcctc caatgagtcg gtcctcgaac acaaactcgg 7020

tgccggaggc ctcagcaaca gacttgagca ccttgacggc ctcggcaatc acctcggggc 7080

cacagaagtc gccgccgaga agaacaatct tcttggagtc agtcttggtc ttcttagttt 7140

cgggttccat tgtggatgtg tgtggttgta tgtgtgatgt ggtgtgtgga gtgaaaatct 7200

gtggctggca aacgctcttg tatatatacg cacttttgcc cgtgctatgt ggaagactaa 7260

acctccgaag attgtgactc aggtagtgcg gtatcggcta gggacccaaa ccttgtcgat 7320

gccgatagcg ctatcgaacg tacccagccg gccgggagta tgtcggaggg gacatacgag 7380

atcgtcaagg gtttgtggcc aactggtaaa taaatgatga ctcaggcgac gacggaattc 7440

tcatgtttga cagcttatca t 7461

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

ccaaggcttc tgagactgaa gagg 24

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

taacctccca cactcctttg acataacg 28

Claims

1.一种合成樱花素的重组菌株，其特征在于，该重组菌株由出发菌株经遗传改造获得，相比于所述出发菌株，所述重组菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；

其中，所述重组菌株中的至少部分预苯酸脱氢酶基因被敲除。

2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述出发菌株为解脂耶氏酵母；

4.一种构建重组菌株的方法，其特征在于，该方法包括：对出发菌株进行遗传改造以使得所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活；

其中，所述出发菌株的预苯酸脱氢酶的活性减弱或失活的方式为基因敲除。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述出发菌株为解脂耶氏酵母；

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

优选地，敲除的所述预苯酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

优选地，所述基因敲除的过程包括：先构建重组载体，再经同源重组，用所述重组载体中的尿嘧啶筛选标记URA替代所述出发菌株中的预苯酸脱氢酶基因；

7.权利要求1至3中任意一项所述的重组菌株或权利要求4至6中任意一项所述的方法在合成樱花素中的应用。

8.一种发酵合成樱花素的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1至3中任意一项所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵；

或者，按照权利要求4至6中任意一项所述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件包括：接种量为4-6体积％，温度为25-35℃，转速为150-300rpm，时间为80-160h；

优选地，所述发酵的过程包括：在发酵40-55h时向发酵液中加入L-酪氨酸；

优选地，所述发酵液中L-酪氨酸的添加量为4-6g/L。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤和至少一种氨基酸；

优选地，所述发酵培养基含有：碳源、氮源、腺嘌呤、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸；

优选地，所述发酵培养基含有：葡萄糖30-50g/L，硫酸铵1-1.3g/L，YNB(无氨基酵母氮源)1.5-2g/L，腺嘌呤0.01-0.02g/L，L-精氨酸0.02-0.08g/L，L-天门冬氨酸0.05-1g/L，L-组氨酸0.01-0.03g/L，L-异亮氨酸0.02-0.08g/L，L-亮氨酸0.05-0.15g/L，L-赖氨酸0.02-0.08g/L，L-甲硫氨酸0.01-0.03g/L，L-苯丙氨酸0.02-0.08g/L，L-苏氨酸0.05-0.15g/L，L-色氨酸0.02-0.08g/L，L-酪氨酸0.02-0.08g/L，L-缬氨酸0.05-0.25g/L。