KR20170041426A - 나린제닌의 생물전환을 통한 사쿠라네틴의 제조방법 - Google Patents

나린제닌의 생물전환을 통한 사쿠라네틴의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나린제닌(Naringenin)의 생물전환을 통한 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 O-메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자 및 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 SAM 합성효소(SAM synthetase) 유전자가 도입되어 있는 미생물 변이체를 이용하여 나린제닌으로부터 사쿠라네틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 O-메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자 및 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 SAM 합성효소(SAM synthetase) 유전자가 도입된 미생물 변이체를 이용하여 나린제닌(Naringenin)으로부터 높은 전환율로 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 제조할 수 있다.

Description

나린제닌의 생물전환을 통한 사쿠라네틴의 제조방법{Method for Preparing Sakuranetin Using Biotransformation of Naringenin}
본 발명은 나린제닌(Naringenin)의 생물전환을 통한 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 O-메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자 및 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 SAM 합성효소(SAM synthetase) 유전자가 도입되어 있는 미생물 변이체를 이용하여 나린제닌으로부터 사쿠라네틴을 제조하는 방법에 관한 것이다.
플라보노이드는 식물에 존재하는 저분자 폴리페놀릭 화합물로, 식물체를 포식자나 병원균, 자외선으로부터 보호하는 역할을 하고(Dixon et al., Mol. Plant Pathol., 3:371, 2002), 식물의 성장과 발달에 있어 중요한 역할을 한다(Frick et al., Phytochem ., 56:1, 2001). 또한, 라디칼제거, 항염증, 항돌연변이, 항에이즈, 항알레르기, 항혈소판, 산화방지, 항신경퇴화 활성을 포함하는 몇몇의 생물학적 활성을 가지고 있어, 만성질병 예방효과를 나타낸다(Manach et al., Curr . Opin . Lipidol., 16:77, 2005; Heo and Lee, J. Agric . Food Chem ., 53:1445, 2005; Heo and Lee, J. Agric . Food Chem., 52:7514, 2004; Mojzisova and Kuchta, Physiol . Res, 50:529 2001; Middleton et al., Pharmacol . Rev ., 52:673, 2000).
플라보노이드에 의해 나타나는 기능적 다양성은 플라본 중심에 있는 수산기에 글루코실트랜스페라아제, 메틸전이효소, 프레닐전달효소, 설포트렌스페라아제와 같은 다양한 수산화효소에 의해 발생되는 핵심 구조의 변형에 의한 것이다(Martens et al., Phytochem., 71:1040, 2010; Prescott et al ., Annual Rev Plant Physiol Plant Mol . Biol., 47:245, 1996). 페놀릭 화합물의 생물학적 역할은 플라보노이드 복합체에 붙는 작용기의 타입과 위치에 따라 규정되며 반응성과, 용해성, 그리고 다른 화학 물질이나 단백질 구조와 상호작용하는 능력을 변화시킨다(Buer et al., J. Integr . Plant Biol., 52:98, 2010).
이소플라보노이드(isoflavonoids)는 플라보노이드의 서브구룹에 속해 있으며, 식물에 의해 2차 대사산물(metabolities)로 생산되며, 이의 15-탄소(C6-C3-C6) 백본이 1,2-diphenylpropane 골격으로 정렬되어 있다. 이소플라보노이드는 대두(Soybeans) 및 기타 콩과(leguminous) 식물에 주로 포함되어 있으며, Iris(Iridaceae), Prunus(Rosaceae), Podocarpus(Podocarpaceae), Maclura(Moraceae), 및 Iresine(Amaranthaceae)에 존재하는 것으로 알려져 있다(Ollis WD, The isoflavonoids in: T.A. Geissman (Ed.), The chemistry of flavonoid compounds. Pergamom Press LTD, Oxford pp, 353-399, 1962; Lapcik O et al ., Plant Sci, 148:111-119, 1999).
일부 이소플라보노이드는 미생물에 존재하는 것으로 밝혀진 바 있으며(Matthies A et al ., Appl Envrion Microbiol, 74:1847-1852, 2008), 이들은 식물-미생물간 상호작용시 피토알렉신(phytoalexins)을 형성시키는 전구체로서 중요한 기능을 수행한다(Aoki T et al ., J Plant Res, 113:475-488, 2000). 이소플라보노이드의 대사는 고정된 탄소가 페닐프로파노이드 경로(phenylpropanoid pathway)를 통해서 개시된다. 몇가지의 효소과정을 거친 후 페놀 화합물(phenolic compounds) 및 이소플라보노이드가 생성된다(Weisshaar B et al ., Curr Opin Plant Biol, 1:251-257, 1998).
사쿠라네틴(Sakuranetin), 7-O-메틸 나린제닌(7-O-methyl naringenin)는 벼(Oryza sativa L.), fingerroot(Boesenbergia pandurata), yerba santa(Eriodictyon californicum), spiked pepper(Piper aduncum) 및 Populous davidiana에 존재하는 키랄 플라바논으로, 라세미 사쿠라네틴을 생쥐에 경구 투여하였을 때, 혈소판 응집을 저해하고, 혈류를 감소시킬 뿐만 아니라 엘라스타아제를 분비시키는 것으로 보고되었다(Tamogami S et al ., Phytochem ., 54:689-694, 2000; Ogawa Y et al., Chem . Pharm . Bull ., 55:675-678, 2007). 또한, 사쿠라네틴은 비-인두 암종세포인 KB 세포에 세포독성을 나타내는 것으로 나타났다(Orjala J. et al, J. Nat . Prod ., 57:18-26, 1994). 사쿠라네틴은 여러 가지 식물방어 역할을 하며 항균, 항진균 항 미생물 및 항염증 효과를 가진다고 알려져 있다(Danelutte AP et al, Phytochem ., 64:555-559, 2003; Rakwal R et al, Biochem . Biophys . Res. Commun ., 24:732-745, 1996; Tamogami S. et al, FEBS Lett., 410:239-242, 1997; Tamogami S et al ., Phytochem ., 54:689-694, 2000).
사쿠라네틴은 여러 경로로 합성될 수 있으며, 나린제닌으로부터 사쿠라네틴을 합성하는 경우 7-O-메틸전이효소가 관여한다. 벼 세포와 벼 잎에서의 사쿠라네틴의 합성은 자스모닉산, 에틸렌 및 ethrphon의 내부적 공급에 의하여 수행되며, 자외선 처리된 벼로부터 사쿠라네틴을 분리한 바 있다(Kim BG et al , J. Agric . Food . Chem., 54:823-828, 2006). 또한, 메틸 전이효소로 형질전환된 대장균을 이용하여 나린제닌으로부터 사쿠라네틴을 분리한 연구도 보고된 바 있으나, 그 전환율은 매우 낮은 실정이었다.
메틸전이효소는 천연물의 번역 후 변형 뒤에 중요한 역할을 한다. 효소에 의한 O-메틸화(O-methylation)는 여러 O-메틸전이효소(O-methyltransferases, OMTs)에 의해 촉매되며, 메틸에테르(methyl ether) 유도체와 S-아데노실-호모시스테인(S-adenosyl-L-homocysteine)을 형성시키면서 S-아데노실-L-메티오닌(S-adenocyl-L-methionine; AdoMet)의 메틸그룹을 수용체 화합물의 특정 수산기로 이동시킨다(Ibrahim et al., Plant Mol . Biol ., 36:1, 1998; Joshi et al ., Plant , Mol. Biol ., 37:663, 1998). 플라보노이드의 O-메틸화는 페놀릭 수산기의 화학적 반응성을 변화시켜 항균력(Middleton et al, Champman & Hall , London, 619, 1994(harborne, J.B.(Ed))뿐만 아니라 세포 내 구획을 증가시키고 막 수송 능력을 높여줌으로써 화합물의 흡수가 가능하도록 친유성을 증가시킨다(Wen et al ., Drug Metab. Dispos., 34:1786-1792, 2006; Walle, Int . J. Mol . Sci ., 10:5002-5019, 2009).
본 발명자들의 최근 연구에 의하면 메틸화되지 않은 7,8-디하이드록시프라본(7,8-dihydroxyflavone)과는 달리, 7-하이드록시-8-메톡시플라본(7-hydroxy-8-methoxyflavone)은 내피세포의 생존성에 영향을 미치지 않는 농도에서 항산화 활성(antioxidant activity)을 나타내는 것으로 확인되었다(Koirala N et al ., J Biotech, 184:128-137, 2014a). 또한, 메틸화된 이소플라보노이드(isoflavonoids)인 람네틴(rhamnetin) 및 사쿠라네틴(sakuranetin)은 메틸화되지 않은 형태보다 항암 및 항신생혈관 작용이 높은 것으로 나타나, 메틸화된 형태는 높은 대사 안정성, 경구 생체이용률(oral bioavailability) 및 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
몇몇 메틸화된 플라보노이드는 발암물질 활성 효소(Carcinogen activating enzyme)에 대한 저해 효과, MRPs(Multidrug resistance proteins)에 대한 효과, 살진균(fungicidal) 특성 및 기타 약제학적 응용이 가능한 것으로 나타났다(Wen X et al., Drug Metab . Dispos, 34:1786-1792, 2006; Bernini R et al ., Molecule s, 16;1418-1425, 2011; Middleton E. Jr et al ., Pharmacol Rev ., 52:673-751, 2000; Harborne JB et al ., Phytochemistry, 55:481-504, 2000).
한편, 식물이 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 자연적인 근원처임에도 불구하고, 식물 추출법에 의한 대량 생산이나 조직배양, 화학합성법을 이용한 대량 생산은 아직 실용화되지 못하고 있다.
다른 이차 대사산물과 마찬가지로, 대량생산을 위한 플라보노이드의 합성은 복잡한 과정이 요구된다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 플라보노이드 합성에 필요한 유전자를 보유한 미생물을 이용한 생물학적 변형이 성공적으로 수행되었다(Trantas E, et al ., Metab . Eng., 11:355-366, 2009; Shimkhada D et al ., Mol . Cells., 28:397-401, 2009; Malla S et al ., Appl . Environ . Microbiol., 78:684-694, 2011; Thuan NH et al ., Appl . Biochem . Biotechnol ., 171:1956-1967, 2013).
대장균(E. coli)이나 효모(Saccharomyces cerevisiae) 등과 같은 미생물을 형질전환시켜 화합물을 생합성하는 방법이 연구되고 있으며(Lim EK et al., Biotechnol Bioeng, 87:623631, 2004; Trantas E et al., Metab Eng, 11:355-366, 2009), 일례로 플라본 합성효소(flavone synthase: PFNS-1)와 플라본-7-O-메틸전이효소(flavone-7-O-methyltransferase: POMT-7)로 형질전환된 대장균을 이용하여, 나린제닌(Naringein)으로부터 겐크와닌(Genkwanin)을 생산한 연구가 보고되었다(Jeon MY et al ., J. Microbiol . Biotechnol ., 19:491-494, 2009).
인체에서 생물학적 효과를 가지는 보다 복잡한 플라보노이드의 생합성을 위해서 반응물질로서 아피제닌(Apigenin)을 일반적으로 사용하여 생물전환을 통한 유용한 물질을 제조한다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 복합 플라보노이드 제조에 일반적으로 사용되는 나린제닌(Naringenin)을 이용하여, 나린제닌의 생물전환을 통한 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 미생물에 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 O-메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자 및 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 SAM 합성효소(SAM synthetase) 유전자가 도입된 미생물 변이체를 이용하여 나린제닌으로부터 높은 전환율로 사쿠라네틴을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 플라보노이드를 효율적으로 메틸화시킬 수 있는 신규 O-메틸전이효소(SaOMT2) 및 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 SAM 합성효소(SAM synthetase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 미생물 변이체를 이용하여 나린제닌으로부터 사쿠라네틴을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 O-메틸전이효소(O-methyltransferase: SaOMT2)를 코딩하는 유전자와 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 S-아데노신-L-메티오닌 합성효소(S-adenosine-L-methionine synthetase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물 변이체를 나린제닌(Naringenin)을 함유하는 배지에서 배양하여 나린제닌(Naringenin)을 사쿠라네틴(Sakuranetin)으로 전환하는 단계; 및 (b) 상기 전환된 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 수득하는 단계를 포함하는 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 유효성분으로 함유하는 암치료용 의약조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 O-메틸전이효소(O-methyltransferase)를 코딩하는 SaOMT2 유전자 및 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 SAM 합성효소(SAM synthetase) 유전자가 도입된 미생물 변이체를 이용하여 나린제닌(Naringenin)으로부터 높은 전환율로 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 제조할 수 있다.
도 1은 형질전환된 미생물 변이체내에서 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 제조하는 방법에 관한 모식도이다.
도 2는 제조된 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 크로마토그래피 및 분광 방법을 이용해 분석한 크로마토그램(chromatogram)을 나타낸 것이다.
도 3은 제조된 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 QTOF-ESI/MS로 질량분석한 데이터이다.
도 4는 250mL 배양 플라스크의 50mL 배지상에서 형질전환된 미생물 변이체인 E. coli M 또는 E. coli MS를 이용하여, 200μM 나린제닌(Naringenin)을 48시간 동안 처리하여 제조된 사쿠라네틴(Sakuranetin) 제조량(생산량)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 발효조(fermentor)를 이용한 온도, pH 및 TB 배지에 용해된 산소 레벨을 조절하는 가운데, 200μM 나린제닌(Naringenin)을 48시간 동안 처리하여 제조된 사쿠라네틴(Sakuranetin) 제조량(생산량)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 다양한 암세포주의 성장에 미치는 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 멜라닌 합성과 멜라닌자극호른몬에 의해 자극된 B16F10 피부 흑색종 세포에서의 티로시나제(tyrosinase) 활성에 미치는 사쿠라네틴의 영향을 나타낸 그래프이다.
본 발명에서는 SaOMT2 메틸전이효소 유전자 및 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 SAM 합성효소(SAM synthetase)를 코딩하는 유전자를 미생물에 도입하여 나린제닌(Naringenin)으로부터 높은 전환율로 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 제조할 수 있는, 발효조 수준(fermentor scale)에서 97%의 전환효율(194μM(55.48mg/L) 사쿠라네틴)을 갖는 미생물 변이체를 제작하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 O-메틸전이효소(O-methyltransferase: SaOMT2)를 코딩하는 유전자와 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 S-아데노신-L-메티오닌 합성효소(S-adenosine-L-methionine synthetase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물 변이체를 나린제닌(Naringenin)을 함유하는 배지에서 배양하여 나린제닌(Naringenin)을 사쿠라네틴(Sakuranetin)으로 전환하는 단계; 및 (b) 상기 전환된 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 수득하는 단계를 포함하는 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, O-메틸전이효소(O-methyltransferase: SaOMT2)를 코딩하는 유전자는 스트렙토마이시스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, S-아데노신-L-메티오닌 합성효소(S-adenosine-L-methionine synthetase)를 코딩하는 유전자는 대장균 K12 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 O-메틸전이효소(O-methyltransferase)인 SaOMT2는 S-아데닌-L-메티오닌 생합성 경로를 통해 생산된 S-아데닌-L-메티오닌을 이용하여 나린제닌(Naringenin)을 사쿠라네틴(Sakuranetin)으로 메틸화하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 나린제닌(Naringenin)은 100~1000μM 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "이소플라보노이드 메톡시드(isoflavonoid methoxides)"는 이소플라보노이드(isoflavonoids)의 메틸화된 화합물을 의미하며, 이소플라보노이드인 나린제닌(Naringenin)의 메틸화된 화합물을 의미하는 용어 "사쿠라네틴(Sakuranetin)"과 "나린제닌 메톡시드(Naringenin methoxides)"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 발명의 일 양태에서, 대장균 변이체는 S-아데닌-L-메티오닌 생합성과 관련된 효소에 의해서 S-아데닌-L-메티오닌이 생성되고, 나린제닌(Naringenin)을 첨가하여 반응하면 대장균 변이체 내에서 발현된 메틸전이효소는 상기에서 생성된 S-아데닌-L-메티오닌을 메틸공여체로 사용하여 나린제닌을 사쿠라네틴(Sakuranetin)으로 전환시키는 과정을 거쳐 최종적으로 사쿠라네틴을 제조할 수 있다(도 1).
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 대장균 변이체가 나린제닌(Naringenin)으로부터 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 생산하는지 확인하기 위하여 대장균 변이체에 나린제닌을 첨가하여 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 나린제닌(Naringenin)의 표준물질 및 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 잔류 시간(tR)은 10.6분 및 11.8분으로 전환율이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 제조된 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 양적 확인을 위해, QTOF-ESI/MS 방법을 통해 분석한 결과, 분리된 화합물의 총 m/z값은 사쿠라네틴의 경우는 287.0994로 대장균 변이체에 의해 사쿠라네틴이 메틸화된 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 대장균 변이체를 이용하여 나린제닌(Naringenin)으로부터 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 전환수율을 높이기 위해 나린제닌을 100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM 및 1000μM으로 첨가하여 사쿠라네틴의 전환수율을 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 200μM의 나린제닌을 첨가하여 48시간 동안 반응하였을 때 170μM 농도의 사쿠라네틴이 생산되는 것을 확인하였다.
한편, 배지 종류에 따른 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조량(생산량)을 비교하기 위해 LB 배지, TB 배지 및 M9 배지를 이용하여 대장균 변이체를 200μM 나린제닌(Naringenin)을 첨가하여 48시간 동안 배양한 결과, TB 배지에서 나린제닌의 전환수율이 91%로 가장 높게 나타났으며, OD600nm(세포 밀도) 또한 TB 배지에서 가장 높게 나타났다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 발효조를 이용한 스케일업(Scale-up) 시스템에서 나린제닌(Naringenin)으로부터 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조에 따른 사쿠라네틴의 제조량(생산량)을 분석하고자 하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 200μM 나린제닌(Naringenin)을 배양액에 첨가하고 대장균 변이체인 E. coli MS를 48시간 배양한 경우, 약 97%가 사쿠라네틴(Sakuranetin)으로 전환(194μM(55.48mg/L))되었다.
본 발명은 다른 관점에서, 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 유효성분으로 함유하는 암치료용 의약조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 암의 종류는 위암, 간암, 뇌종양, 피부암, 유방암, 폐암, 대장암 등 종래 알려져 있는 모든 종류의 암을 포괄한다. 또한 암의 예방 또는 치료라는 것은, 내피세포의 증식을 저해함으로써 암의 성장과 전이를 동시에 막을 수 있고, 더 나아가서는 암을 예방할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는 상기 암은 위암, 간암, 흑색종, 교모세포종이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 생물학적 활성(효능) 분석을 위해 흑색종(B16F10), 위암(AGS), 간암(HepG2) 및 교모세포종(U87MG) 세포주에 사쿠라네틴을 처리한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 사쿠라네틴(Sakuranetin)은 각 암세포주에서 다른 범위의 세포성장 저해 범위를 가지고, 특히 B16F10 및 U87MG 암세포주에서 세포증식을 억제하였다.
본 발명의 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 포함하는 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료"란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
용어 "약제학적 조성물(pharmaceutical composition)" 또는 "의약조성물"은 본 발명의 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 함유하는 화합물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.
용어 "약리학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 담체 또는 희석제로 정의된다.
용어 "담체(carrier)" 또는 "비이클(vehicle)"은 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
여기에 사용된 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제학적 조성물로서, 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 의약조성물 또는 약제학적 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 량으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 량을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 당업자의 능력 범위 내에 있다.
본 발명의 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 함유하는 화합물에 대한 치료적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 측정될 수 있다. 예를 들어, 선량(dose)은 세포 배양에서 결정된 IC50(half maximal inhibitory concentration) 또는 EC50(half maximal effective concentration)를 포함하는 순환 농도 범위를 얻기 위하여 동물 모델에서 계산될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서의 유용한 선량을 더욱 정확히 결정하는데 사용될 수 있다.
사쿠라네틴(Sakuranetin)의 투여량은 채용된 투여 형태와 이용된 투여 루트에 따라 상기 범위에서 변화될 수 있다. 정확한 산정, 투여 루트 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, Fingl et al., 1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. 1 참조).
본 발명의 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 통상적으로, 환자에게 투여되는 조성물의 선량 범위는 환자 체중의 약 0.5 내지 1000 mg/kg 일 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 사쿠라네틴은 1일 0.0001 내지 200mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 경구 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 사쿠라네틴(Sakuranetin)은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 사쿠라네틴(Sakuranetin) 외에 다른 성분이 첨가된 혼합물로 제공되는 경우, 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 방향성 정유를 함유하는 사쿠라네틴을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량 %, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약제학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 용어 "수화물", "용매화물" 및 "이성질체" 역시 상기와 같은 의미를 가진다. 상기 약제학적 염은, 본 발명의 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 함유하는 화합물을, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 석신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명의 사쿠라네틴을 함유하는 화합물을 염기와 반응시켜, 암모니움 염, 나트륨 또는 칼륨 염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘 염 등의 알칼리 토금속염 등의 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염, 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있다.
본 발명에 따른 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 포함하는 약학 조성물 또는 의약조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 사쿠라네틴을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈,수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 사쿠라네틴(Sakuranetin)에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 멜라닌 합성 억제 능력을 나린제닌(Naringenin)과 비교하여 측정하기 위해서, B16F10 흑색종 세포에 멜라닌 세포 자극 호르몬을 처리하고 멜라닌 합성을 유도하여 각각의 억제 활성을 측정한 결과, 도 7B에 나타난 바와 같이, 사쿠라네틴을 처리하면 α-MSH에 의해 유도되는 멜라닌 생성이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 사쿠라네틴의 멜라닌 형성 억제 활성은 동일한 농도의 나린제닌보다 우수하였다.
멜라닌 색소는 멜라닌세포 내에 존재하는 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)이 티로시나제(tyrosinase)라는 효소와 작용함으로써 만들어진다. 티로시나제에 의해 산화되어 DOPA로 변하고, DOPA가 산화하여 최종적으로 흑갈색의 멜라닌을 만들어낸다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 티로시나제에 의해 촉진된 L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)의 산화 억제 정도로 사쿠라네틴(Sakuranetin)과 나린제닌(Naringenin)의 티로시나제 활성 억제 능력을 측정하였다. 그 결과, 도 7C에 나타난 바와 같이, 나린제닌 처리 세포의 타이로시네이즈 활성은 표시된 농도에서 증가한 반면, 사쿠라네틴 처리 세포의 타이로시네이즈 활성은 현저히 감소하였다. 이는 사쿠라네틴이 B16F10 세포에서 멜라닌세포자극 호르몬인 α-MSH에 의해 유도되는 멜라닌 합성을 타이로시네이즈 활성을 억제하여 저해한다는 것을 의미한다.
본 발명의 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있으며, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다.
본 발명의 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제형으로는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구제적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1: O - 메틸전이효소 ( SaOMT2 ) 및 SAM 합성효소( EcSAM synthetase )를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물 제작
1-1: O - 메틸전이효소(SaOMT2)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작 및 SaOMT2 생산능을 가지는 재조합 미생물의 제작
본 실시예에서 사용된 O-메틸전이효소(SaOMT2, O-methyltransferase; GenBank Accession NP_823558)를 코딩하는 유전자는 공지된 서열에 기반하여 스트렙토마이시스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)로부터 클로닝 하였다(Kim et al ., Agric . Food . Chem ., 54:823-828, 2006). 상기 유전자 염기 서열에 근거하여 SaOMT2-F'(서열번호 1) 및 SaOMT2-R'(서열번호 2)의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR를 통하여 aOMT2 단편을 수득하였다.
[서열번호 1] SaOMT2-F'-5'-GGATCCGATGAGCTGCCGCACCGGCA-3' BamHI
[서열번호 2] SaOMT2-R'-5'-GAATTCTCAGCCAACCGCGCGCAGTTCGA-3' EcoRI
(밑줄 친 부분은 제한효소 부위를 나타낸다)
상기 프라이머쌍을 이용한 PCR은 초기 변성을 95℃로 한 다음, 변성 단계(95℃, 1분), 어닐링 단계(60℃, 1분) 및 연장 단계(72℃, 1분)를 1싸이클로 하여 30싸이클 및 최종 연장 단계(72℃, 10분)로 실시하였다.
상기 수득된 SaOMT2 단편을 pRSF-Duet-1 벡터(Novagen, USA)에 클로닝하여 pRSF-Duet-SaOMT2를 제작하고, 상기 벡터를 대장균에 형질전환시켜 대장균 변이체(strain)인 E. coli M를 제조한 다음, 상기 변이체의 SaOMT2 단백질 발현을 SDS-PAGE로 확인하였다.
1-2: SAM synthase ( EcSAM synthetase )를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
본 실시예에서 사용된 SAM 합성효소(SAM synthase, EcSAM synthetase; GenBank Accession No. K02129)를 코딩하는 유전자는 공지된 서열에 기반하여 E. coli K12으로부터 클로닝 하였다(Markham et al ., J. Biol . Chem ., 259:14505-14507, 1984). 상기 EcSAM synthetase는 EcSAM-F'(서열번호 3) 및 EcSAM-R'(서열번호 4)의 프라이머쌍을 이용하여 실시예 1-1과 같은 조건에서 PCR을 수행하여 SAM synthase(EcSAM synthetase) 유전자의 DNA를 증폭시켰다:
[서열번호 3] EcSAM-F'-5'-GATATCATGGCAAAACACCTTTTTACGTCC-3' EcoRV
[서열번호 4] EcSAM-R-5'-CTCGAGTTACTTCAGACCGGCAGCATC-3' Xho I
(밑줄 친 부분은 제한효소 부위를 나타낸다)
증폭된 PCR 산물인 SAM 합성효소(EcSAM synthetase)의 염기 단편은 pGEM®-T 벡터(프로메가, Madison, WI, 미국)에 서브클론하였고, 대장균 발현 벡터 pRSFDuet-1(Novagen, USA)의 NdeI/XhoI 자리에 다시 클로닝하여 재조합 벡터 pRSF-Duet-SaOMT2-EcSAM를 제작하였다. 상기 벡터는 리스트릭션 멥핑, PCR, PCR 증폭산물의 서열확인을 통해 입증하였다.
1-3: 재조합 O - 메틸전이효소 ( SaOMT2 ) 및 SAM synthase ( EcSAM synthetase ) 생산능을 가지는 재조합 미생물 제작
재조합 O-메틸전이효소(SaOMT2) 및 SAM 합성효소(EcSAM synthetase)의 제조를 위해 실시예 1-2의 SaOMT2 유전자 및 EcSAM synthetase를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 재조합 미생물을 제작하였다. DNA 염기서열이 확인된 재조합 벡터(pRSF-Duet-SaOMT2-EcSAM)를 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)로 형질전환시켜 대장균 변이체(strains)인 E. coli MS를 제조하였다.
1-4: 재조합 O - 메틸전이효소 ( SaOMT2 ) 및 SAM 합성효소( EcSAM synthetase ) 생 산능을 가지는 재조합 미생물을 이용한 기질( 나린제닌 ( Naringenin ))의 생물전 환( biotransformation ) 및 공정 최적화
배지 및 시약
실시예 1-3에서 제조된 pRSF-Duet-SaOMT2-EcSAM을 함유한 E. coli BL21(DE3) 변이체의 배양용 배지는 LB(Luria Bertani broth)(Bacto, Sparks, MD, USA), TB(Terrific broth)(Bacto, Sparks, MD, USA) 또는 M9 최소 배지(1L 당, 6g Na2HPO4, 3g K2HPO4, 0.5g NaCl, 0.1% NH4CL, 1% 포도당, 1mM MgSO4.7H2O, 100μM CaCl2)에 카나마이신(kanamycin)의 최종 농도가 50μg/mL가 되도록 첨가하여 나린제닌(Naringenin)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로부터 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 제조하였다. 3L 발효조를 이용하는 경우, 1% 마니톨(mannitol), 1% 포도당 및 1% 글리세롤을 첨가하였다.
실시예 1-3에서 제조된 pRSF-Duet-SaOMT2-EcSAM을 함유한 E. coli BL21(DE3) 변이체를 이용하여 나린제닌(Naringenin)으로부터 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 생산하기 위한 최적반응 조건을 확립하기 위해, 대장균 변이체는 항생제를 포함하는 LB 액상 배지 3mL에 접종시킨 후, 하룻밤 동안 37℃, 220rpm에서 배양하였다. 배양된 미생물 변이체 200μL를 취해 항생제를 포함하는 LB 액상 배지 50mL에 접종한 후, OD600값이 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 최종 농도가 0.5mM이 되도록 IPTG(isopropyl--D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 20℃에서 3시간 동안 배양하였다. 나린제닌은 20% DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시키고, 생물전환반응의 최적 조건을 확인하기 위하여 다양한 농도로 넣은 후 20℃에서 60시간 동안 220rpm으로 진탕반응하였다. 반응하는 동안 12시간마다 500μL 배양액을 취하여 두배 부피의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 처리한 후 용매를 증발시키기 위해 건조시켜서 농축하였다. 농축된 물질은 500μL의 메탄올에 용해시켜 실시예 3의 크로마토그래피 분석에 사용하였다.
나린제닌(Naringenin)을 100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM 또는 1000μM으로 pRSF-Duet-SaOMT2-EcSAM을 함유한 E. coli BL21(DE3) 변이체가 포함된 배지에 첨가한 다음, 배양하고 12시간 간격으로 수득한 상기 배양액의 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 전환수율을 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 200μM의 나린제닌(Naringenin)을 첨가하여 48시간 동안 반응하였을 때 170μM 농도의 사쿠라네틴(Sakuranetin)이 생산(85% 나린제닌 전환수율)되는 것을 확인하였다.
한편, 배지 종류에 따른 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조량(생산량)을 비교하기 위해 LB 배지, TB 배지 및 M9 배지를 이용하여 대장균 변이체를 200μM 나린제닌(Naringenin)을 첨가하여 48시간 동안 배양한 결과, TB 배지에서 나린제닌의 전환수율이 각각 91%로 가장 높게 나타났으며, OD600nm(세포 밀도) 또한 TB 배지에서 가장 높게 나타났다(데이터 미도시).
실시예 2: 발효조를 이용한 스케일업 ( Scale - up ) 시스템에서 나린제닌( Naringenin)으로부터 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조
실시예 2의 기질 농도, 배양 시간 및 배지 조건으로 E. coli MS을 이용하여 3L 발효조에서 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 제조하고자 하였다.
발효는 5L 부피의 용기가 장착된 BioTron(BioTron Ltd., Incheon, suto-gwon, South Korea) 장비에서 3L 부피로 실시하였다. 온도, pH, 회전자 속도는 각각 25℃, 7.5, 400rpm으로 지속적으로 유지하였다.
실시예 1-3에서 제조된 pRSF-Duet-SaOMT2-EcSAM을 함유한 E. coli BL21(DE3) 변이체는 3%(w/v) 포도당을 포함한 TB 배지에서 나린제닌(Naringenin)을 사쿠라네틴(Sakuranetin)으로 생물전환시키는데 사용하였다. 상기 배지의 용존 산소는 70% 이상으로 유지하였다. 배양된 변이체는 파장 600nm에서 흡광도가 5가 되었을 때, L-유당(L-lactose)의 최종농도가 0.15M이 되도록 첨가해 주고, D-포도당은 세포의 밀도와 성장을 높게 유지하기 위하여 매 시간마다 넣어 주었다(Koirala N et al., J Ind Microbiol Biotechnol, 41(11):1647-1658, 2014).
나린제닌(Naringenin)을 첨가하고 6시간 간격으로 배양액을 수확하여 실시예 3의 HPLC 분석을 통해 나린제닌(Naringenin)의 생물전환을 확인하였다. 반응 48시간 후에 상기 배양액을 수득하였고, 에틸아세테이트를 첨가하여 추출, 건조 후, 메탄올에 녹여 HPLC 분석을 통하여 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 분리하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 200μM 나린제닌(Naringenin)을 배양액에 첨가하고 대장균 변이체인 E. coli MS를 48시간 배양한 경우, 약 97%가 사쿠라네틴(Sakuranetin)으로 전환(194μM(55.48mg/L))되었다.
실시예 3: 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 정제 및 분석
HPLC 및 QTOF - ESI / MS 를 이용한 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 정제 및 분석
실시예 1에서 대장균 변이체를 이용하여 제조된 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 함유하는 배양액을 두배 부피의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 처리한 후 용매를 증발시키기 위해 건조시켜서 농축하였다. 상기 농축액의 추가 정제는 ACN 20%(0-5분), 40%(5-10분), 40%(10-15분), 90%(15-25분), 90%(25-30분) 및 10%(30-35분)을 유속 10mL/min으로 진행하는 36분 binary 프로그램을 이용하는 UV 검출기(270㎚)가 연결된 C18컬럼(YMC-Pack ODS-AQ(250 x 20mm I. D., 10μm))을 사용하는 preparative HPLC에 의해서 수행되었다.
상기 정제된 사쿠라네틴(Sakuranetin)은 UV 검출기(254㎚)가 연결된 역상 C18컬럼(Mightysil RP-18 GP, 250 x 4.6㎜, kanto chemical, Japan)을 이용하는 HPLC-PDA(high-performance liquid chromatography coupled with photo diode array, shimadzu, Japan; SPD-M20A Detector)로 검출, 분석 및 정량하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, HPLC-PDA 분석에 따르면 나린제닌(Naringenin)의 표준물질 및 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 잔류 시간(tR)은 10.6분 및 11.8분으로 전환율이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 제조된 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 양적 확인을 위해, QTOF-ESI/MS [ACQUITY(UPLC, Waters Corp., USA)-SYNAPT G2-S(Waters Corp., USA)] 방법을 통해 분석한 결과, 분리된 화합물의 총 m/z값은 사쿠라네틴의 경우 287.0994로 대장균 변이체에 의해 사쿠라네틴이 메틸화된 것을 확인하였다.
실시예 4: 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 생물학적 활성(효능) 분석
본 실시예에서 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 암 관련 화학요법제로서의 약학적 잠재성을 확인하기 위한 생물학적 활성 효과를 평가하기 위하여 인간의 피부 흑색종, 위암, 간암, 뇌암 세포 및 내피세포를 사용하였고, 사쿠라네틴의 모체이며, 현재 암의 예방 및 항암치료 보조제로서 잘 알려져 있는 나린제닌(Naringenin)을 비교물질로 하여 사쿠라네틴의 세포 증식 효과를 평가하였다. 또한, 암과 같은 혈관형성 의존적인 질병에 대해서 항신생혈관제로서, 혈관형성 표현형(angiogenic phenotypes)인 chemoinvasion 및 미세관 형성(capillary tube formation)에 미치는 사쿠라네틴의 효과를 평가하였다. 아울러, 멜라닌합성 및 티로시나제 활성에 미치는 사쿠라네틴의 효과를 평가하였다.
사람의 제대정맥내피세포(HUVECs)는 계대가 4번에서 8번 사이로 이루어진 것을 이용하였으며, 10% FBS(Fetal bovine serum, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 첨가한 EGM2(Endothelial growth medium-2, Lonza, Walkersville, MD, USA) 배지에서 배양하였다. B16F10(흑색종, melanoma)과 HepG2(간암, hepatoma) 세포들은 10% FBS를 첨가한 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium, Invitrogen) 배지에서 배양하였다. AGS(위암, gastric carcinoma)와 U87MG(교모세포종) 세포들은 10% FBS를 첨가한 RPMI 1640(Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 배지에서 배양하였다. 모든 세포들은 5% CO2 가습 배양기에서 37℃로 유지하였다.
(1) 세포성장 분석
세포성장 분석을 위해서, 세포들은 96칸 배양접시(SPL Lifesciences, Gyeonggi, Korea) 한 칸당 2 x 103 세포들을 옮긴 후, 72시간 동안 나린제닌(Naringenin)과 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 각각 1~100μM의 다양한 농도로 세포에 처리하였다. 암세포 성장은 MTT 분석법(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide colorimetric assay)을 이용하였다. 여기서, MTT 분석법은 세포내에 존재하는 산화환원효소에 의해 tetrazolium 계열의 발색 시약이 노란색에서 보라색으로 변하는 정도를 흡광도로 측정하여 세포의 성장을 측정하는 방법이다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이, 사쿠라네틴(Sakuranetin)은 각 암세포주에서 다른 범위의 세포성장 저해 범위를 가지고, 특히 B16F10 및 U87MG 암세포주에서 세포증식을 억제하였다.
(2) 멜라닌 합성 분석
사쿠라네틴의 피부에 대한 약리활성을 확인하기 위하여, 멜라노마 세포에서 α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH, α-melanocyte stimulating hormone) 유도에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하고자 하였다.
먼저, B16F10 멜라노마 세포를 24웰 플레이트에서 배양하고, 200nM의 α-MSH(Sigma aldrichi, USA)의 존재 또는 부존재 하에서, 5μM 또는 10μM의 나린제닌 또는 사쿠라네틴을 각각 처리하여 3일간 배양하였다. PBS로 세척 후 세포를 수확하여 80℃에서 1시간 동안 1N NaOH에서 용해시킨 후, ELISA 리더로 405nm 파장에서 멜라닌 양을 측정하였다.
그 결과, 도 7B에 나타난 바와 같이, 사쿠라네틴을 처리하면 α-MSH에 의해 유도되는 멜라닌 생성이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 사쿠라네틴의 멜라닌 형성 억제 활성은 동일한 농도의 나린제닌보다 우수하였다.
(3) Tyrosinase 활성 분석
나린제닌 또는 사쿠라네틴이 멜라닌 생성에서 타이로신을 멜라닌 색소로 전환하는 역할을 하는 효소인 타이로시네이즈의 활성에 미치는 영향을 확인하였다.
먼저, 항 타이로시네이즈 활성 측정을 위하여, L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)의 산화를 촉매하는 타이로시네이즈 활성을 억제하는지 확인하였다. B16F10 세포를 24웰 플레이트에서 200nM의 α-MSH의 존재 또는 부존재 하에서 5μM 또는 10μM의 나린제닌 또는 사쿠라네틴을 각각 처리하여 72시간 배양한 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 0.1M의 소듐포스페이트(pH 6.8), 1% Triton X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche Diagnostics GmbH, Germany)을 포함하는 용해버퍼로 처리하였다. 세포 용해물을 4℃, 12,000g에서 20분간 원심분리 하고, 상층액을 수득하였다. 상기 상층액의 단백질 양을 정량하고, L-DOPA 용액(2mg/mL, Sigma aldrichi, USA)와 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시키고, ELISA 리더로 475nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7C에 나타난 바와 같이, 나린제닌 처리 세포의 타이로시네이즈 활성은 표시된 농도에서 증가한 반면, 사쿠라네틴 처리 세포의 타이로시네이즈 활성은 현저히 감소하였다. 이는 사쿠라네틴이 B16F10 세포에서 α-MSH에 의해 유도되는 멜라닌 합성을 타이로시네이즈 활성을 억제하여 저해한다는 것을 의미한다.
통계학적 분석
실험데이터는 평균±SEM(표준평균오차)로 나타내었다. Unpaired Student's t-tests로 그룹간 비교하였다. p값이 0.05 이하인 경우 통계학적으로 유효한 것으로 간주하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Sun Moon University <120> Method for Preparing Sakuranetin Using Biotransformation of Naringenin <130> P15-B104 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SaOMT2-F <400> 1 ggatccgatg agctgccgca ccggca 26 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SaOMT2-R <400> 2 gaattctcag ccaaccgcgc gcagttcga 29 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcSAM-F <400> 3 gatatcatgg caaaacacct ttttacgtcc 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcSAM-R <400> 4 ctcgagttac ttcagaccgg cagcatc 27

Claims (7)

  1. 다음 단계를 포함하는 사쿠라네틴(Sakuranetin)의 제조방법:
    (a) 플라보노이드의 7-하이드록실 그룹(7-hydroxyl group)으로 메틸(methyl)을 전달하는 O-메틸전이효소(O-methyltransferase: SaOMT2)를 코딩하는 유전자와 상기 효소의 보조인자인 S-아데노신-L-메티오닌(S-adenosine-L-methionine)을 합성하는 S-아데노신-L-메티오닌 합성효소(S-adenosine-L-methionine synthetase)를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물 변이체를 나린제닌(Naringenin)을 함유하는 배지에서 배양하여 나린제닌(Naringenin)을 사쿠라네틴(Sakuranetin)으로 전환하는 단계; 및
    (b) 상기 전환된 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, O-메틸전이효소(O-methyltransferase: SaOMT2)를 코딩하는 유전자는 스트렙토마이시스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) 유래인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, S-아데노신-L-메티오닌 합성효소(S-adenosine-L-methionine synthetase)를 코딩하는 유전자는 대장균 K12 유래인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 나린제닌(Naringenin)은 100~1000μM 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 유효성분으로 함유하는 암치료용 의약조성물.
  7. 사쿠라네틴(Sakuranetin)을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물.
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