KR102556507B1 - 신규한 이세파마이신 유사체 및 이의 항균 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 이세파마이신 유사체 화합물 및 이의 항균 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 이세파마이신 유사체 및 이의 항균 용도{Novel isepamicin analogs and antibacterial use thereof}

본 발명은 신규한 이세파마이신 유사체 화합물 및 이의 항균 용도에 관한 것이다.

가장 오래된 종류의 항생제 중 하나인 아미노글리코시드(aminoglycoside(s); AG(s))는, 박테리아 리보솜에 작용함으로써 단백질의 생합성에 간섭하므로, 그램-양성(Gram-positive) 및 그램-음성(Gram-negative) 박테리아 병원체(bacterial pathogens)에 대해 강력한 항균활성을 갖는다. 그러나, AGs의 장기간 및 광범위한 임상적 사용의 결과로 심각한 항균 내성이 나타나고 있다. AG-항생제의 주된 내성 기전은 AG-개질 효소(AG-modifying enzymes; AMEs)에 의한 AG 구조의 화학적 개질이다. 이는 관련된 AMEs를 회피하고 약리학적 프로파일을 향상시킬 수 있는 반-합성적 AGs를 개발하기 위한 실질적 노력을 유도하였다. 예를 들어, 아미카신(amikacin), 아르베카신(arbekacin), 이세파마이신(isepamicin; ISP), 네틸마이신(netilmicin), 및 플라조마이신(plazomicin)은 임상적으로 중요한 AMEs의 작용에 덜 민감하도록 특이적으로 설계되었다(engineered)(도 1). AGs의 반-합성적 개질은 AG-내성 병원체에 대한 보다 탄탄한 새로운 항균 약물의 개발을 위한 여전히 효율적인 접근법일 수 있다.

AG 스캐폴드의 다양한 구조적 모티프는 향상된 생물학적 활성 및 감소된 독성을 갖는 새로운 항생제의 개발을 위해 개질될 수 있다. C1 또는 C6' 위치의 N-아실 모이어티는, 가장 최근에 승인된 항생제인 플라조마이신을 포함하여, 현재 임상에 사용되고 있는 반-합성적 항생제의 공통적인 구조이다. N-아실 모이어티를 갖는 AG 유사체는 현저한 약리학적 장점을 가지나, 구조적 복합성(structural complexity)으로 인해 특정한 아민 위치에서의 원하는 화학적 개질이 불가능(impractical)할 수 있다.

효소적 합성은 차세대 항생제 개발을 위한 대안적 접근법일 수 있다. 부티로신(Butirosin)은 C1-아민에, 아실전달효소(acyltransferase) BtrH 및 이의 파트너 BtrG에 의해 도입된, (S)-4-아미노-2-히드록시부티르산((S)-4-amino-2-hydroxybutyric acid; AHBA) 치환기를 갖는다. 독특한 AHBA 모이어티는 항균활성을 향상시키고 AMEs에 의해 유발되는 내성 기전으로부터 AG를 보호한다. 이에 따라, 비자연성(non-native) AGs 상에 위치 특이적으로 AHBA 측쇄를 성공적으로 도입하기 위하여 BtrH 및 BtrG의 기질 내성(substrate tolerance)을 이용하였으며, 이는 AHBA 모이어티가 부착된 신규한 AGs의 효소적 합성의 가능성을 제안한다. AMEs를 이용하는 N-아실화된 AGs를 생성하기 위한 다른 효소적 접근법이 보고되었다. 3-N-AG 아세틸전달효소(AAC(3)) 및 6'-N-아세틸전달효소-2"-O-인산전달효소(phosphotransferase) 활성을 갖는 AAC(6')-APH(2")를 포함한 2가지 AG 아세틸전달효소(acetyltransferases; AACs)는 다양한 아실-CoAs는 물론 AGs에 대한 기질 유연성(promiscuity)을 나타내므로, 신규한 모노- 및 헤테로-디-N-아실화된 AGs의 생성을 유도하였다. 그러나, 대부분의 생성된 유사체의 내성 박테리아 병원체에 대한 생물학적 활성은 보고된 바 없다. 따라서, 치료적으로 개선된 AG 물질의 개발을 위해 AMEs의 사용 가능성을 입증하기 위하여, 임상적으로 중요한 AGs의 보다 다양한 유사체의 제조 및 생물학적 평가가 요구된다.

K. M. Krause et al., Cold Spring Harb Perspect Med., 2016, 6(6): a027029; A. W. Serio et al., EcoSal Plus, 2018, 8(1): doi: 10.1128/ecosalplus.ESP-0002-2018.

본 발명자들은 이세파마이신-감수성 병원체는 물론 이세파마이신-내성 병원체에 대해 우수한 항균 활성을 나타내는 이세파마이신 유사체를 발굴하고자 예의 연구 노력한 결과, AAC(6')-APH(2")에 의한 이세파마이신과 아실-CoA의 효소적 반응에 의해 C6'-아민 위치에 다양한 아실 체인이 부가된 일련의 이세파마이신 유사체를 발굴하였으며, 이들 유사체가 이세파마이신-내성 병원균에 대해 우수한 항균 활성을 나타냄은 물론 감소된 신독성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

아울러, 본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

본 발명의 제1양태는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁은 메틸카보닐, 에틸카보닐, 또는 카르복시메틸카보닐임.

상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물들은 그램-음성 균주에 항균 활성을 갖는 것으로 알려진 이세파마이신(Isepamicin, 상기 화학식 1에서 R₁이 수소인 화합물)의 유사체일 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "이세파마이신"은 CAS.# 58152-03-7로 분류되는 IUPAC 명 (2S)-3-아미노-N-[(1R,2S,3S,4R,5S)-5-아미노-4-[(2R,3R,4S,5S,6R)-6-(아미노메틸)-3,4,5-트리히드록시옥산-2-일]옥시-2-[(2R,3R,4R,5R)-3,5-디히드록시-5-메틸-4-(메틸아미노)옥산-2-일]옥시-3-히드록시사이클로헥실]-2-히드록시프로판아미드((2S)-3-amino-N-[(1R,2S,3S,4R,5S)-5-amino-4-[(2R,3R,4S,5S,6R)-6-(aminomethyl)-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-2-[(2R,3R,4R,5R)-3,5-dihydroxy-5-methyl-4-(methylamino)oxan-2-yl]oxy-3-hydroxycyclohexyl]-2-hydroxypropanamide)의 화합물이다. 상기 이세파마이신은 젠타마이신(gentamicin) 및　아미카신(amikacin)과 구조적으로 연관된 아미노글리코시드계(aminoglycosides) 광범위항생제(broad-spectrum antibiotics)로서, 아미카신과 유사한 활성을 가지나, 6'-N-아미노글리코시드 아세틸전달효소(6'-N-aminoglycoside acetyltransferase)를 생산하는 균주와 같은, 다른 아미노글리코시드에 내성을 갖는 균주에 대해 보다 나은 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 1988년 의약적 사용이 승인되었으며, 세계보건기구(World Health Organization; WHO)에 의해 인체에 사용을 위한 매우 중요한 항균제로 인식되었다. 이세파마이신은 아미노글리코시드 계열의 항생제 중 상대적으로 독성이 낮은 물질 중 하나이나, 신독성(nephrotoxicity), 전정독성(vestibular toxicity), 및　이독성(ototoxicity)을 야기할 수 있다.

본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산가염이 유용하다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.

산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 이세파마이신 유사체 화합물의 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 이세파마이신 유사체 화합물과 동등한 약리활성을 나타내는 이세파마이신 유사체의 염이면 제한없이 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 이의 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 수화물 등의 용매화물 및 가능한 모든 입체 이성질체를 제한없이 포함한다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 용매화물 및 입체이성질체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학식 1로 표시되는 화합물로부터 제조할 수 있다.

나아가, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 결정 형태 또는 비결정 형태로 제조될 수 있으며, 결정 형태로 제조될 경우 임의로 수화되거나 용매화될 수 있다. 본 발명에서는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 화학양론적 수화물뿐만 아니라 다양한 양의 물을 함유하는 화합물이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 용매화물은 화학양론적 용매화물 및 비화학양론적 용매화물 모두를 포함한다.

본 발명의 제2양태는 6'-아미노글리코시드 아세틸기전달효소/2"-아미노글리코시드 인산기전이효소(6'-aminoglycoside acetyltransferase/2"-aminoglycoside phosphotransferase; AAC(6')-APH(2")) 존재 하에 이세파마이신을 아실 조효소 A(acyl coenzyme A; acyl-CoA)와 반응시키는 단계를 포함하는, 제1양태의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법을 제공한다.

예컨대, 상기 AAC(6')-APH(2")는 aac(6')-aph(2") 유전자를 포함하는 DNA 단편을 삽입한 발현 플라스미드를 미생물에 도입하여 발현시켜 준비할 수 있다. 예컨대, aac(6')-aph(2") 유전자를 코돈 최적화하고, 제한효소서열을 포함하는 DNA 단편을 pET-21c(+) 내로 복제하여 히스티딘-태그된 구조물을 부호화하고, 상기 발현 플라스미드를 E. coli에 도입하여 배양하였다. 상기 균주에서 과발현을 유도하고, 이를 분리 정제하여 수득한 AAC(6')-APH(2")를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

예컨대, 상기 아실-CoA는 아세틸-CoA(acetyl-CoA), 프로피오닐-CoA(propionyl-CoA) 또는 말로닐-CoA(malonyl-CoA)일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 아실-CoA로서 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 말로닐-CoA, 부티릴-CoA(), 크로토닐-CoA, 메틸말로닐-CoA, 및 이소발레릴-CoA와 반응시켜 화학효소적(chemoenzymatic) 합성을 수행하였으며, 이중 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 및 말로닐-CoA와의 반응에서 이세파마이신 유사체가 합성된 것을 확인하고, 이를 분리, 정제 및 동정하여 화학식 1의 구조를 갖는 것을 확인하였다.

본 발명의 제3양태는 제1양태의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어 "항균"은 미생물을 포함하는 균의 생육 또는 증식을 억제하여 균의 감염을 예방 또는 치료하는 활성을 의미한다.

본 발명의 항균용 조성물은 그램-음성 균주에 대해 항균활성을 나타내는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 그램-음성 균주는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; E. coli, 대장균), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa, 녹농균), 클레브시엘라(Klebsiella), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae, 임질구균), 또는 엔테로박테리아시에(Enterobacteriaceae, 장내세균)일 수 있다. 구체적으로, 상기 그램-음성 균주는 이세파마이신-감수성 병원체 또는 이세파마이신-내성 병원체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제4양태는 제1양태의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "감염"은 질병을 일으킬 수 있는 병원체가 숙주에 침투하여, 병원체의 증식을 진행하는 과정을 가리키는 것으로, 발열이나 기침 등은 감염된 숙주에서 병원체에 의해 독성 물질들이 발현되어 숙주의 방어 기제로 나타나는 감염 증상에 해당한다. 예컨대, 감염 질환은 면역 체계가 약화되어 있거나 병원체의 독성이 강한 경우, 또는 대량의 병원체에 노출된 경우 인체의 면역 체계가 제 기능을 못하게 되고 감염 증상을 보이게 된다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 상기 감염 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 상기 감염 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 유효성분은 그램-음성 균주 특히, 이세파마이신 감수성 병원체 나아가 이세파마이신 내성 병원체에 대한 우수한 항균 활성을 나타내는 바, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 그램-음성 균주 특히, 이세파마이신 감수성 병원체 나아가 이세파마이신 내성 병원체에 의한 다양한 감염 질환에 적용할 수 있다.

본 발명의 이세파마이신 유사체들은 그램-음성 균주 특히, 이세파마이신 감수성 병원체에 대해 항균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 이세파마이신-내성 병원체에 대해 이세파마이신에 비해 현저히 향상된 항균 활성을 나타내는 바, 이들 균주의 감염에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 이세파마이신 유사체를 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 이세파마이신을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 비해 정도의 차이는 있으나 모두 신독성이 감소되었는 바, 이들 조성물의 사용에 따른 부작용의 우려가 적다.

상기 그램-음성 균주에 의한 감염 질환은 식중독(food poisoning), 요로감염증(urinary tract infections), 위장염(gastroenteritis), 신생아 뇌수막염(newborn meningitis), 뇌수막염, 폐감염증(lung infections), 혈류감염증(bloodstream infections), 임질(gonorrhea) 등의 성병(sexually transmitted disease), 브루셀라병(Brucellosis), 캄필로박터(Campylobacter) 감염증, 고양이할큄병(Cat-scratch disease), 콜레라(Cholera), 대장균 감염증, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 감염증, 클렙시엘라(Klebsiella) 감염증, 재향군인병(Legionnaires' disease, 악성 폐렴의 일종), 백일해(Pertussis), 전염병(Plague), 슈도모나스(Pseudomonas) 감염증, 살모넬라(Salmonella), 적리(Shigellosis), 야토병(Tularemia), 장티푸스(Typhoid fever), 폐렴(pneumonia), 복막염(peritonitis), 상처(wound) 감염, 또는 수술부위(surgical site) 감염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

이때, 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 조성물에서 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 kg 당 1 내지 100 mg, 바람직하게는 5 내지 60 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 제4양태의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 그램-음성 균주에 의한 감염 질환이 발명하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 이세파마이신 유사체 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 입체이성질체의 혼합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 예방 또는 치료하고자 하는 질환의 종류에 따라, 유효성분으로서 이세파마이신 유사체 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 입체이성질체의 혼합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 이외의 공지된 각 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 공지의 약물을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 경우 유효성분으로서 이세파마이신 유사체 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 입체이성질체의 혼합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 이외에 공지된 약물을 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.

본 발명의 제5양태는 제1양태의 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 "개선"은 피부에 발생하는 세균감염의 증상을 억제 또는 저해하거나, 이미 나타난 감염 증상을 완화시키는 것을 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군에서 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.

본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일, 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 제6양태는 제1양태의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 식품학적으로 허용가능한 염은 식품학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 유용하다. 하나의 예로, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 푸마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다..

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 상기 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함할 수 있는 성분으로는, 필수 성분으로 유효성분을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물에서 유효성분의 함량은 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 건강보조식품은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함할 수 있다.

상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물을 포함하는 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

본 발명의 제7양태는 제1양태의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치, 예방 또는 개선할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 의미하며, 피부외용제 및 개인위생용품도 포함한다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 이세파마이신 유사체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로써 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

AG-내성 병원체(pathogens)의 AG-개질효소(AG-modifying enzymes; AMEs)의 내성 기전을 극복하기 위하여 신규한 아미노글리코시드(aminoglycoside; AG) 항생제(antibiotics)의 개발이 요구되고 있다. 다양한 AGs 및 acyl-CoAs에 대해 기질 유연성(substrate promiscuity)을 나타내는 가장 전형적인 AMEs 중의 하나인, AG 아세틸전달효소(acetyltransferase), AAC(6')-APH(2")을 신규한 6'-N-아실화된 이세파마이신(isepamicin; ISP) 유사체(analogs), 6'-N-아세틸/-프로피오닐/-말로닐 ISPs의 효소적 합성에 사용하였다. 이들 유사체는 모두 테스트한 ISP-내성 그램-음성 박테리아에 대해 활성을 나타내었으며, 6'-N-아세틸 ISP는 시험관 내에서 ISP에 비해 감소된 신독성을 나타내었다. 이러한 결과는 AG-내성을 회피하는데 있어서 6'-아미노 그룹의 개질의 중요성 및 보다 견고한(robust) AG 항생제의 개발을 위한 AG 스캐폴드의 위치선택적(regioselective) 효소적 개질의 잠재성을 나타낸다.

도 1은 현재 임상에 사용되고 있는 AG 항생제 및 본 발명에 따른 6'-N-아실화된 이세파마이신(isepamicin; ISP) 유사체의 화학 구조를 나타낸 도이다. 반 합성적 AGs의 화학적 특징을 파란 색으로 나타내었다. 빨간 색은 AAC(6')-APH(2")-촉매된 효소적 합성에 의해 형성된 작용기를 나타낸다.
도 2는 정제된 C-말단 헥사히스티딘 태그된 AAC(6')-APH(2")의 쿠마시 블루(Coomassie blue)-염색된 SDS-PAGE 젤을 나타낸 도이다.
도 3은 ISP 및 AAC(6')-APH(2")을 이용한 효소적 합성에 의해 생산된 이의 유사체에 대한 UPLC-qTOF-HR-MS 분석 결과를 나타낸 도이다. 크로마토그램은 ISP(A, [M+H]⁺ = 570.2908), A-ISP(B, [M+H]⁺ = 612.3087), P-ISP(C, [M+H]⁺ = 626.3243), 및 M-ISP(D, [M+H]⁺ = 656.2985)의 선택된 m/z 값에 대해 나타내었다.
도 4는 6'-N-아세틸 이세파마이신의 구조 결정을 위한 (A) MS/MS 분절(fragmentation) 패턴 및 (B) MS/MS 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 5는 6'-N-아세틸 이세파마이신의 구조 결정을 위한 (A) ¹H NMR 데이터 및 (B) ¹³C NMR 데이터를 나타낸 도이다.
도 6은 6'-N-아세틸 이세파마이신의 구조 결정을 위한 (A) ¹H-¹H gCOSY NMR 데이터, (B) ¹H-¹³C gHSQC NMR 데이터 및 (C) ¹H-¹³C gHMBC NMR 데이터를 나타낸 도이다.
도 7은 6'-N-프롤릴 이세파마이신의 구조 결정을 위한 (A) MS/MS 분절(fragmentation) 패턴 및 (B) MS/MS 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 8은 6'-N-프롤릴 이세파마이신의 구조 결정을 위한 (A) ¹H NMR 데이터 및 (B) ¹³C NMR 데이터를 나타낸 도이다.
도 9는 6'-N-프롤릴 이세파마이신의 구조 결정을 위한 (A) ¹H-¹H gCOSY NMR 데이터, (B) ¹H-¹³C gHSQC NMR 데이터 및 (C) ¹H-¹³C gHMBC NMR 데이터를 나타낸 도이다.
도 10은 6'-N-말로닐 이세파마이신의 구조 결정을 위한 (A) MS/MS 분절(fragmentation) 패턴 및 (B) MS/MS 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 11은 6'-N-말로닐 이세파마이신의 구조 결정을 위한 (A) ¹H NMR 데이터 및 (B) ¹³C NMR 데이터를 나타낸 도이다.
도 12는 6'-N-말로닐 이세파마이신의 구조 결정을 위한 (A) ¹H-¹H gCOSY NMR 데이터, (B) ¹H-¹³C gHSQC NMR 데이터 및 (C) ¹H-¹³C gHMBC NMR 데이터를 나타낸 도이다.
도 13은 새롭게 합성된 ISP 유사체의 3가지 상이한 포유류 신장 세포주에 대한 세포독성을 나타낸 도이다. (A) 내지 (C)는 각각 HEK-293, LLC-PK1, 및 A-498 세포에 대한 ISP 유사체의 LD₅₀(μM)을 나타낸다. 데이터를 평균(n = 3) ± 표준 편차로 적절한 분산분석(analysis of variance)과 함께 대응 또는 비대응 양측 t-테스트(paired or unpaired two-tailed t-test)를 이용하여 유의성을 테스트하였다. n은 생물학적으로 독립적인 실험의 수를 나타낸다. *P < 0.05인 결과를 유의한 것으로 간주하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<물질>

ISP를 Toku-E(Bellingham, WA, USA)로부터 획득하였다. Acyl-CoAs(아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 말로닐-CoA, 부티릴-CoA, 크로토닐-CoA, 메틸말로닐-CoA, 및 이소발레릴-CoA), 암피실린(ampicillin), 이소프로필 b-D-1-티오갈락토피라노사이드(isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG), 염산(HCl), 트리플루오로아세트산(TFA), 중수(deuterium oxide; D₂O), 및 5 mm Shigemi advanced NMR 마이크로튜브는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 헵타플루오로부티르산(heptafluorobutyric acid; HFBA) 및 포름산(formic acid)은 Fluka(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. HPLC-등급 아세토니트릴(MeCN), 메탄올(MeOH), 및 물은 JT Baker(Philipsburg, NJ, USA)로부터 입수하였다. ODS SPE 카트리지(Bond Elut-C18, 3 mL/200 mg)는 Agilent Technologies(Santa Clara, CA, USA)로부터 구입하였다. 시료 준비 SPE 카트리지(Sep-Pak^® C18 3 cc Vac cartridge, 200 mg Sorbent), Xselect^® SH 컬럼 XP(2.1×100 mm, 2.5 μm), 류신 엔케팔린(leucine enkephalin), 및 진공 매니폴드(vacuum manifold)는 Waters Inc.(Milford, MA, USA)의 제품이다. 재조합 단백질 발현을 위해 Escherichia coli BL21(DE3) 및 플라스미드 pET-21c(+)(Novagen, Madison, WI, USA)를 사용하였다. Ni-니트릴로트리아세트산(Ni-nitrilotriacetic acid; NTA) 아가로스(Qiagen, Valencia, California, USA), PD10 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), 및 Amicon Ultracel 10K 분자량 컷오프 스핀 필터(Millipore, Bedford, MA, USA)를 사용하여 히스티딘-태그된 재조합 단백질을 준비하였다.

실시예 1: AAC(6')-APH(2")의 과발현 및 정제

E. coli에서 발현을 위해 Staphylococcus aureus(GenBank accession no. NC_002774)로부터 유도된 aac(6')-aph(2") 유전자를 코돈 최적화하고(codon-optimized), 제한효소서열(restriction enzyme sequences, NdeI 및 XhoI)을 포함하는 DNA 단편(fragments)을 DNA 2.0(Menlo Park, CA, USA)에서 합성하였다. 합성된 DNA 단편을 pET-21c(+) 내로 복제하여 히스티딘-태그된 구조물(construct)을 부호화(encode)하였다. AAC(6')-APH(2")의 발현 및 정제를 위하여, 발현 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 도입하였다. 재조합 계통(recombinant strain)을 50 μg/mL 앰피실린(ampicillin)을 함유한 LB 배지에서 성장시켰다. 1 L의 배양에 10 mL의 밤샘 종균 배양(overnight starter culture)을 접종하였다. 상기 배양을 37℃에서 광학밀도(optical density; OD₆₀₀) 0.6까지 성장시키고, 이후 추가적인 3시간 동안 0.5 mM IPTG에 의한 과발현을 유도하였다.

원심분리(20,000 rpm에서 2분)하여 세포를 회수하여 용해 완충액(lysis buffer, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)에 재현탁시키고, 2 s on/2 s off 순환으로 5분 동안 초음파처리하여 용해시켰다. 원심분리(20,000 rpm에서 30분)하여 용해물을 투명하게 하고(clarified), 투명해진 세포 용해물을 NTA 아가로스 컬럼에 통과시켰다. 세척 완충액(washing buffer, 300 mM NaCl, 40 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)으로 컬럼을 세척한 후, 히스티디-태그된 단백질을 용리 완충액(elution buffer, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)으로 용출하였다. PD10 컬럼을 이용하여 트리스 완충액(Tris buffer, 20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.9)으로 정제된 재조합 단백질 용액으로부터 이미다졸을 제거하였다. 정제된 AAC(6')-APH(2")을 Amicon Ultracel 10K 분자량 컷-오프 스핀 필터로 농축하여 80℃에 보관하였다. 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE) 분석으로 단백질의 순도를 확인하였다. 단백질 농도는 표준물질로 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 사용한 브래드포드 단백질 어세이(Bradford protein assay)로 결정하였다. 1 L의 배양으로부터 약 10 mg의 정제된 AAC(6')-APH(2")을 수득하였다(도 2).

실시예 2: 6'-아실화된(acylated) ISP 유사체(analogs)의 화학효소적(chemoenzymatic) 합성

100 μM ISP, 20 μM 아실-CoA(아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 말로닐-CoA, 부티릴-CoA, 크로토닐-CoA, 메틸말로닐-CoA, or isovaleryl-CoA) 함유 50 mM MOPS 완충액(pH 6.5)에 5 μM AAC(6')-APH(2")를 첨가하여 37℃에서 12시간 동안 반응시킴으로써 AAC(6')-APH(2")에 의한 6'-N-아실화를 수행하였다. 대규모 효소 반응에 의한 신규한 ISP 유사체의 생산을 위하여, 정제된 AAC(6')-APH(2")(50 μM)을 위와 동일한 조건 하에 20 mM ISP 및 2 mM 아실-CoA와 인큐베이션하였다. 상기 반응을 4% HFBA로 종결하고 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 그 결과로 얻은 표적 생성물을 함유하는 상층액을 ODS SPE 카트리지를 이용하여 추출하였다. ODS 카트리지를 0.7% HFBA 용액(다음과 같이 용리: MeOH 3 mL → 50% aq. MeOH (0.7% HFBA) 3 mL → 0.7% HFBA 3 mL)으로 조절하고(conditioned), 0.7% HFBA 함유 상층액을 로딩하여 다음의 조건으로 용출시켰다: 3 mL의 5% aq. MeOH(0.7% HFBA), 3 mL의 10% aq. MeOH(0.7% HFBA) 및 3 mL의 MeOH. MeOH 용리액(eluents)을 진공에서 건조시키고, 200 μL의 증류수에 용해시킨 후, UPLC-qTOF-HR-MS 분석에 적용하였다. 기질이 완전히 전환될 때까지 추가적인 반응을 수행하였다.

실시예 3: 신규한 이세파마이신(isepamicin) 유사체의 UPLC-qTOF-HR-MS 분석 및 구조적 동정

각각의 신규한 ISP 유사체를 Acquity I-클래스 시스템을 구성하는 Xselect^® CSH 컬럼 XP를 구비한 Waters Acquity UPLC^® 시스템과 결합된 Waters XEVO^® G2-S qTOF 질량분광계로 동정하였다. 40℃에서 0.2 mL/min의 유속으로 이동상으로 용매 A(50 mM ammonium-TFA, pH 2.0) 및 용매 B(50% aq. MeCN with 50 mM ammonium-TFA, pH 2.0) 이용한 구배용리를 적용하였다. 양의(positive) 이온화 모드를 갖는 ESI에서 MS 시스템을 가동하였다. 대표적인 운전 변수(typical operating parameters)는 다음과 같다: 분석기, 해상도 모드(resolution mode); 모세관 전압(capillary voltage, volt.), 3.0 kV; 시료추출 원추 전압(sampling cone volt.), 30 V; 원천 온도(source temperature, temp.), 120℃, 원천 오프셋 온도(source offset temp.), 80℃; 탈용매화 온도(desolvation temp.), 300℃; 원추 가스 흐름(cone gas flow), 10 L/h; 탈용매화 가스 흐름, 600 L/h: 헬륨 충돌 가스. 0.1초의 수집 시간(acquisition time)으로 60,000 해상도(resolution, FWHM at m/z 556)에서 확장된 다이나믹 레인지로 분석기를 운전하였다. 질량 보정을 위해 락스프레이(lockspray)로서 류신 엔케팔린(Leucine enkephalin, 400 pg/mL, 0.1% 포름산 함유 50% aq. 아세토니트릴)을 5 mL/min 속도로 주입하였다(infused). 질량 스펙트럼을 0.1 s의 주사 속도로 50-600 amu의 스캔 범위에서 획득하였다. MS/MS 분석을 위해, 제조업자의 제안에 따라 헬륨 충돌 가스를 도입하였다. 기기 통제(instrument control), 획득(acquisition), 및 시료 분석을 위해 MassLynx V4.1 소프트웨어(Waters Co., Milford, USA)를 사용하였다.

100 mL의 0.2 N NaOH 및 800 mL의 중성화된 물로 미리 조절된 Dowex^® MAC-3 양이온 교환 컬럼(cation exchange column)에 전환된 ISP 시료를 적용하였다. 0.1-0.12 N NaOH 완충액으로의 용리에 의해 양이온 교환 수지를 이용한 전환된 ISP 유사체의 분리를 수행하였다. 이후, 전환된 ISP의 각 용리액을 Sep-Pak^® C18 Vac 카트리지에 주입하고 HFBA 용액으로 용출시켰다.

¹H 핵에 대해 500 MHz에서, ¹³C 핵에 대해 125 MHz에서 구동하는 Varian INOVA 500 분광계(Palo Alto, CA, USA)와 ¹H 핵에 대해 500 MHz에서, ¹³C 핵에 대해 125 MHz에서 구동하는 Jeol JNM 500 ECZR 분광계(Tokyo, USA)를 이용하여 신규한 ISP 유사체의 NMR 스펙트럼을 획득하였다. 각 화합물을 250 μL의 D₂O에 용해시키고 상기 용액을 상기 용매에 매치되는 5 mm Shigemi advanced NMR 마이크로튜브에 위치시켜 NMR 분석을 위한 시료를 준비하였다. 모든 NMR 데이터 처리(data processing)에는 Mnova 소프트웨어(Mestrelab Research S.L., Santiago de Compostela, Spain)를 사용하였다.

실시예 4: 항균성(antibacterial) 민감성(susceptibility) 테스트

E. coli(ATCC 25922) 및 Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)를 American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA, USA)으로부터 획득하였다. 본 연구를 위하여 항생제-내성 E. coli를 한국 인체자원은행 네트워크(KoreaBiobank Network)-KNUH의 일원인 경북대학교병원(Kyungpook National University Hospital; KNUH, Republic of Korea)의 국립 생명자원은행(National Biobank)으로부터 제공받았다. 이들을 연구윤리위원회(institutional review board; IRB)-승인된 프로토콜 하에 (사전 동의에 의해) 획득하였다. 5개 임상적 다약제 내성(clinical multi-drug resistant) P. aeruginosa(MDRPA) 분리주(isolates)를 KNUH에서 환자로부터 획득하였다. 상기 분리주를 API20NE 키트(BioMerieux, Marcy-l'Etoile, France)를 사용하여 동정하였다.

박테리아를 배양하고 분광광도계(DU530; Beckman, Fullerton, CA, USA)로 탁도(turbidity)를 측정함으로써 표준화된 밀도(standardized populations)를 얻기 위하여 세포 현탁액을 조절하였다. 대수증식기(exponential phase)의 박테리아 균주(bacterial strains)(1×10⁶ cells/mL)를 접종하고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 웰 당 100 μL 씩 분주하였다. 임상검사실표준협회(Clinical and Laboratory Standards Institute; CLSI) 지침에 따라 테스트 화합물의 2배 표준 배지 미량희석(two-fold standard broth-microdilution)에 의해 감수성 검사(susceptibility tests)를 수행하였다. 37℃에서 18시간의 인큐베이션 후, 주어진 테스트 유기체의 성장을 저해하지 않기 위해 요구되는 최소 농도를 최소 저해 농도(minimum inhibitory concentration; MIC)로 정의하였다. 상기 성장은 600 nm에서 광학 밀도를 모니터링하여 마이크로타이터 ELISA 리더(BioTek ELx800; BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)로 분석하였다.

실시예 5: 포유류 신장 세포주(mammalian renal cell lines)에 대한 시험관 내 신독성(nephrotoxicity) 어세이

3개 ISP 유사체의 시험관 내 신독성을 평가하기 위하여, ATCC로부터의 3가지 신장-유래(kidney-derived) 포유류 세포주, i.e., HEK-293(인간), LLC-PK1(돼지), 및 A-498(인간)을 이용하여 일련의 세포 독성 어세이를 수행하였다. 시그마플롯 소프트웨어 패키지 10.0.1(Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)을 이용하여 최소한 2개 독립적인 실험으로부터 획득한 데이터에 대해 농도 감응성 곡선(concentration response curves)을 최적화함으로써 세포에 대한 반수치사용량(half-maximal lethal dose)의 농도(LC₅₀)를 도출하였다. 데이터는 평균(n = 3) ± 표준 편차로 나타내고, 적절한 분산분석(analysis of variance)과 함께 대응 또는 비대응 양측 t-테스트(paired or unpaired two-tailed t-test)를 이용하여 유의성을 테스트하였다. P < 0.05인 결과를 유의한 것으로 간주하였다.

실험예 1: AAC(6')-APH(2") 효소에 의한 ISP의 6'- N -아실화

AAC(6')-APH(2")의 기질 유연성(substrate promiscuity)은 AHBA-부착된 아미카신(amikacin) 및 아르베카신(arbekacin)을 포함한 몇몇 AG 스캐폴드 상의 특정 아민 자리의 다양한 개질을 가능하게 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, C1-아민에서 AHBA 대신에 AHPA 측쇄 및 3번째 고리로서 육탄당(hexose) 대신에 오탄당(pentose sugar)을 갖는 ISP에 대한 이의 활성은 확인되지 않았다. 따라서, ISP 및 다양한 아실 CoAs에 대한 AAC(6')-APH(2")의 특이성을 먼저 확인하였다. S. aureus로부터 유래된 58-kDa AAC(6')-APH(2")을 E. coli에서 발현시키고 정제하였다(도 2). C-말단 헥사히스티딘 태그된 AAC(6')-APH(2")를 다양한 아실-CoAs 존재 하에 ISP와 밤새도록 인큐베이션한 후, UPLC-qTOF-HR-MS를 이용하여 N-아실화된 ISP의 형성을 모니터하였다. 부티릴-CoA, 크로토닐-CoA, 메틸말론닐-CoA, 및 이소발레릴-CoA를 아실 공여체로 사용했을 때에는 어떠한 ISP의 유도체도 동정할 수 없었다. 그러나, AAC(6')-APH(2")의 보조기질(cosubstrates)로서 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 및 말로닐-CoA와의 인큐베이션은 6'-N-아실화된 생성물, 즉, 6'-N-아세틸 ISP(A-ISP), 6'-N-프로피오닐 ISP(P-ISP), 및 6'-N-말로닐 ISP(M-ISP)에 상응하는 새로운 UPLC 피크의 형성을 유도하였으며, 각각의 전환율은 약 100%, 100%, 및 25%였다(도 1 및 도 3). 상기와 동일한 효소는 아미카신에 대해서도 작용하여 6'-N-아실화에 의해 6'-N-아세틸/-프로피오닐/-말로닐 아미카신을 생산하는 것으로 보고된 바 있었다. 흥미롭게도, AAC(6')-APH(2") 효소는, 보조기질로서 동일한 아실-CoA를 사용했을 때, ISP 및 아미카신에 대해 거의 동등한 촉매적 활성을 나타내었다. 이는 아실-CoAs 중의 아실기의 탄소 원자 수 또는 탄소 사슬 길이가 AAC(6')-APH(2")의 6'-N-아실화 활성에 매우 중요함을 나타내는 것이다. 새롭게 합성된 ISP 유사체를 대규모의(large-scale) 효소 반응으로부터 분리하여 그 구조를 NMR 및 UPLC-qTOF-HR-MS 분광법으로 확인하였다.

실험예 2: 신규한 ISP 유사체의 구조적 특성분석

UPLC-qTOF-HR-MS 분석에 의해 검출된(도 3), 새로운 6'-N-아실화된 생성물, A-ISP, P-ISP, 및 M-ISP의 구조를 결정하기 위하여, 각 화합물을 양이온 교환 수지 컬럼 및 C-18 시료 전처리 카트리지(sample preparation cartridge)를 통해 분리하였다.

옅은 노란색 고체인 A-ISP의 분자식은 HR-qTOF-MS 데이터의 분석에 의해 C₂₄H₄₅N₅O₁₃으로 결정되었다: m/z 612.3077 [M+H]⁺ (calculated for C₂₄H₄₆N₅O₁₃ ⁺, 612.3087); characteristic fragment ions generated by 4,6-glycosidic link cleavages at [M+H-garosamine (GrsN)]⁺ 453.2208, [1-N-AHPA-2-deoxystreptamine (DOS)+H]⁺ 250.1411, [6-N-acetyl-aminoglucose (6-N-acetyl-aminoGlc)+H-H₂O]⁺ 204.0866, and [GrsN+H-H₂O]⁺ 160.0955 (도 4A 및 4B). D₂O에서의 ¹H, ¹³C, 및 HSQC NMR 스펙트럼(도 5A, 도 5B, 도 6B, 및 표 1)은, 추가적인 아세틸기를 갖는 ISP의 전형적인 특징을 나타내는, 2개의 카보닐 탄소(δ_C 173.0; δ_C 174.8), 2개의 아노머 신호(δ_H 5.31/δ_C 98.2; δ_H 5.03/δ_C 98.4), 2개의 N-메틸렌 신호(δ_H 3.15 및 3.21/δ_C 42.0; δ_H 3.36 및 3.43/δ_C 39.9), 3개의 N-메틴(methane) 신호(δ_H 4.08/d_C 48.8; δ_H 3.42/δ_C 48.8; δ_H 3.21/δ_C 64.6), 하나의 N-메틸 신호(δ_H 2.78/δ_C 35.3), 하나의 산소화된(oxygenated) 메틸렌 신호(δ_H 4.07 및 3.24/δ_C 67.1), 9개의 산소화된 메틴 신호(δ_H 3.68/δ_C 80.6; δ_H 3.74/δ_C 73.1; δ_H 3.67/δ_C 79.5; δ_H 4.35/δ_C 67.9; δ_H 3.52/δ_C 71.3; δ_H 3.72/δ_C 71.5; δ_H 3.61/δ_C 72.5; δ_H 3.22/δ_C 70.6; δ_H 3.88/δ_C 66.3), 하나의 산소화된 4차(quaternary) 탄소 신호(δ_C 70.1), 하나의 메틸렌 신호(δ_H 1.68 및 2.12/δ_C 30.5) 및 2개의 메틸 신호(δ_H 1.94/δ_C 20.6; δ_H 1.21/δ_C 21.1)를 나타내었다. COSY 및 HMBC NMR 데이터(도 6A 및 6C)의 추가적인 설명은 ISP가 DOS의 C1 상에 AHPA, 6-아미노Glc, GrsN, 및 아세테이트를 보유함을 입증하였다. 아세틸기의 메틸 양성자(δ_H 1.94) 및 산소화된 양성자(δ_H 3.36 및 3.43)로부터 각각 A-ISP의 C6'a(δ_C 174.8)로의 HMBC 상관관계는 C6'의 아민기 상에 아세틸기의 부착을 확인하였다. 예상되는 바와 같이, A-ISP의 구조는 C6'에 N-아세틸기를 갖는 신규한 ISP 유사체임이 확인되었다.

2번째 새로운 화합물인, P-ISP는, HR-qTOF-MS에 의해 주어진 C₂₅H₄₇N₅O₁₃의 분자식을 갖는, 옅은 노란색 고체로 분리되었다: m/z 626.3245 [M+H]⁺ (calculated for C₂₅H₄₈N₅O₁₃ ⁺, 626.3243); characteristic fragment ions generated by 4,6-glycosidic link cleavages at [M+H-GrsN]⁺ 467.2337, [1-N-AHPA-DOS+H]⁺ 250.1379, [6-N-propionyl-aminoGlc+H-H₂O]⁺ 218.1025, and [GrsN+H-H₂O]⁺ 160.0955 (도 7A 및 7B). D₂O에서의 ¹H, ¹³C, 및 HSQC NMR 스펙트럼(도 8A, 도 8B, 도 9B, 및 표 1)은 2개의 카보닐 탄소(δ_C 173.0; δ_C 178.8), 2개의 아노머 신호(δ_H 5.30/δ_C 98.0; δ_H 5.03/δ_C 98.4), 2개의 N-메틸렌 신호(δ_H 3.15 및 3.21/δ_C 42.0; δ_H 3.36 및 3.43/δ_C 39.8), 3개의 N-메틴 신호(δ_H 4.08/δ_C 48.8; δ_H 3.42/δ_C 48.8; δ_H 3.21/δ_C 64.6), 하나의 N-메틸 신호(δ_H 2.78/δ_C 35.3), 하나의 산소화된 메틸렌 신호(δ_H 4.06 및 3.25/δ_C 67.9), 9개의 산소화된 메틴 신호(δ_H 3.68/δ_C 80.5; δ_H 3.72/δ_C 73.1; δ_H 3.67/δ_C 79.5; δ_H 4.34/δ_C 67.9; δ_H 3.53/δ_C 71.3; δ_H 3.71/δ_C 71.5; δ_H 3.61/δ_C 72.5; δ_H 3.22/δ_C 70.6; δ_H 3.88/δ_C 66.3), 하나의 산소화된 4차 탄소 신호(δ_C 70.1), 2개의 메틸렌 신호(δ_H 1.68 및 2.12/δ_C 30.5; δ_H 2.15/δ_C 29.3) 및 2개의 메틸 신호(δ_H 0.97/δ_C 9.8; δ_H 1.21/δ_C 21.1)를 나타내었다. 이러한 MS 및 NMR 데이터는 상기 화합물이 추가적인 프로피오닐기를 갖는 ISP 유사체임을 입증하였다. H6'b(δ_H 2.15)와 H6'c(δ_H 0.97) 간의 COSY 상관관계(도 9A)는 추가적인 프로피온산염의 에틸 잔기를 나타내었다. HMBC 스펙트럼(도 9C)에서, P-ISP의 C6'a(δ_C 178.8)에 대해 프리피오닐기의 메틸 양성자(δ_H 1.21) 및 메틸렌 양성자(δ_H 2.15)와 산소화된 양성자(δ_H 3.36 및 3.43)는 각각 C6'의 아민기 상에 프로피오닐의 부착을 나타내는 크로스피크를 나타내었다. 따라서, P-ISP의 구조는 C6'에 N-프로피오닐기를 갖는 신규한 ISP 유사체로 정의되었다.

옅은 노란색 고체로 정제된 M-ISP에 대한 HR-qTOF-MS 분석으로부터, 분자식은 C₂₅H₄₅N₅O₁₅로 주어졌다: m/z 656.2983 [M+H]⁺ (calculated for C₂₅H₄₆N₅O₁₅ ⁺, 656.2985); characteristic fragment ions generated by 4,6-glycosidic link cleavages at [M+H-GrsN]⁺ 497.2111, [1-N-AHPA-DOS+H]⁺ 250.1400, [6-N-malonyl-aminoGlc+H-H₂O]⁺ 248.0771, and [GrsN+H-H₂O]⁺ 160.0955 (도 10A 및 10B). D₂O에서의 ¹H, ¹³C NMR, 및 HSQC NMR 스펙트럼(도 11A, 도 11B, 도 12B, 및 표 1)은, 추가적인 말로닐기를 갖는 ISP의 전형적인 특징을 나타내는, 말로네이트의 2개의 카보닐을 포함한 3개의 카보닐 탄소(δ_C 172.9; δ_C 174.7; δ_C 176.7), 2개의 아노머 신호(δ_H 5.31/δ_C 98.4; δ_H 5.03/δ_C 98.2), 2개의 N-메틸렌 신호(δ_H 3.15 및 3.21/δ_C 41.8; δ_H 3.36 및 3.43/δ_C 39.7), 3개의 N-메틴 신호(δ_H 4.08/δ_C 48.6; δ_H 3.42/δ_C 48.5; δ_H 3.21/δ_C 64.4), 하나의 N-메틸 신호(δ_H 2.76/δ_C 35.1), 하나의 O-메틸렌 신호(δ_H 4.07 및 3.24/δ_C 67.7), 9개의 O-메틴 신호(δ_H 3.68/δ_C 80.4; δ_H 3.74/δ_C 73.0; δ_H 3.67/δ_C 79.2; δ_H 4.35/δ_C 66.8; δ_H 3.52/δ_C 71.1; δ_H 3.72/δ_C 71.3; δ_H 3.61/δ_C 72.3; δ_H 3.22/δ_C 70.4; δ_H 3.88/δ_C 66.2), 하나의 O-4차 탄소 신호(δ_C 69.9), 2개의 메틸렌 신호(δ_H 1.68 및 2.12/δ_C 30.3; δ_H 1.88/δ_C 21.9) 및 하나의 메틸 신호(δ_H 1.19/δ_C 20.9)를 나타내었다. HMBC 스펙트럼(도 12C)에서, 각각 말로닐기의 메틸렌 양성자(δ_H 1.88)로부터 C6'a(δ_C 174.7) 및 C6'c(δ_C 176.7)로의, 그리고 산소화된 양성자(δ_H 3.36 및 3.43)로부터 C6'a(dδ_C 174.7)로의 크로스피크가 나타났다. 이러한 크로스피크의 상관관계는 C6' 아민기 상에서 말로닐기의 부착을 나타내었으며, M-ISP의 구조는 C6' 상에 N-말로닐을 포함하는 신규한 M-ISP 구조임을 확인하였다.

실험예 3: 6'- N -아실화된 ISP 유사체의 항박테리아 활성 및 세포독성

일반적으로, 플라조마이신(plazomicin)과 같은 아미카신, 아르베카신, ISP, 및 1-N-6'-N-디-아실화된 AG를 포함하는 1-N-아실화된 AGs는 AG-내성 박테리아에 모약물(parent drug)에 비해 보다 효율적이다. 6'-N-아실화된 ISP 유사체가 ISP-내성 병원체에 대해 향상된 항균활성을 갖는지 확인하기 위하여, CLSI의 지침에 따라 ISP, A-ISP, P-ISP, 및 M-ISP에 대해 약물민감성 테스트를 수행하였다. ISP-민감성 및 -내성 박테리아(E. coli 및 P. aeruginosa)를 사용하여 새로운 유사체의 항균 스펙트럼을 결정하였다(표 2). 현저하게, 모든 신규한 ISP 유사체는 총 10개 ISP-내성 병원균에 대해 ISP에 비해 현저히 감소된 MIC 값을 나타내었다. 이들 테스트한 화합물 중에, M-ISP는 모든 테스트한 균주에 대해 가장 강한 항균 활성을 나타내었다. A-ISP 및 P-ISP는 ISP-민감성 E. coli 및 P. aeruginosa에 대해 ISP에 비해 낮거나 유사한 활성을 나타내었음에도 불구하고, 내성 박테리아에 대한 항균 활성은 상당히 개선되었다. 이러한 결과는, 테스트한 균주의 구체적인 내성 기전은 현재까지 알려지지 않았음에도 불구하고, 테스트한 내성 병원체들의 AG 내성을 피하기 위해 AAC(6')-APH(2")에 의한 1-N-아실화된 AG의 C6'-아민 자리의 추가적인 N-아실화가 효과적임을 나타내는 것이다.

AGs의 주된 치료상의 단점(therapeutic disadvantages)은 높은 신독성 및 내이독성(ototoxicity)이므로, 새롭게 합성된 ISP 유사체들이 치료적 잠재력을 평가하기 위해, 3가지의 포유류 신장 세포주 HEK-293, LCC-PK1, 및 A-498을 사용하여 독성을 분석하였다. 3종 ISP 유사체에 대한 LC₅₀ 값이 테스트한 3가지 세포주에서 ISP에 대한 값에 비해 증가하는 경향(upward tendency)을 나타내었음에도 불구하고(도 13), 독성 프로파일에서 통계적으로 유의한 차이는 A-ISP에 대해서만 관찰되었다: A-ISP의 독성은 ISP 대조군에 비해 약 1.3 ~ 1.4배 더 낮았다. 이러한 결과는 E. coli 및 P. aeruginosa의 ISP-내성 분리주에 대한 효능(potency)을 갖는 A-ISP 또한 ISP에 비해 감소된 독성을 가짐을 나타내는 것이다.

최근 승인된, 천연 AG 시소마이신(sisomicin)의 C1- 및 C6'-아민 위치에 각각 AHBA 측쇄 및 히드록시에틸기를 갖는, 반합성 AG 플라조마이신은 광범위한 그램-음성 병원체에 대해 우수한 활성을 나타내며 세포독성 프로파일에서 안전성이 향상되었다. 플라조마이신의 변경된 구조적 모티프는 AAC(6'), AAC(3), ANT(2") 및 APH(2")를 포함한 임상적으로 관련된(clinically relevant) AMEs에 의해 AG 불활성화(inactivation)를 차단하는 것으로 알려져 있다. 또한, 플라조마이신의 낮은 수준의 신독성 및 내이독성이 동물 연구에서 관찰되었다. 나아가, C1-아민 자리에 AHBA 모이어티의 도입은 AGs의 독성을 감소시키는데 효과적인 것으로 보고되었다. 흥미롭게도, 단순 효소 반응에 의해 새롭게 합성된, 플라조마이신에 대해서와 비슷한 방식으로 개질된, ISP 유사체는 감소된 시험관 내 신독성을 갖는 ISP-내성 병원체에 대한 잠재적 항균 활성을 갖는다. 따라서, AG 스캐폴드의 C1 및 C6' 자리에서 아민기의 아실화는 약리학적 성질(pharmacological properties)에 중요하다.

<결론>

토양 미생물 방선균류(actinomycetes)로부터 생산된 천연 AGs는 구조적으로 복합적인 분자이며, AMEs에 의한 불활성화(deactivation)를 극복하고 세포독성을 감소시키기 위한 이들의 위치 특이적 개질(regiospecific modifications)은 여전히 도전적이다. 본 발명에서는 ISP 및 다양한 아실-CoAs에 대한 AAC(6')-APH(2")의 특이성을 연구하였다. AAC(6')-APH(2")의 기질 유연성은 ISP 스캐폴드 상의 C6'-아민 자리에서 다양한 아실화를 유도하였다. 새롭게 효소적으로 합성된 ISP 유사체인, A-ISP, P-ISP, 및 M-ISP는 시험한 ISP-내성 그램-음성 박테리아에 대해 잠재적 항균활성을 갖는다. 이들 유사체 중, A-ISP는 시험관 내에서 ISP에 비해 개선된 항균활성을 갖는 신독성에서 통계적으로 유의미한 감소를 나타내었다. 이러한 효소적 합성에 의한 위치 특이적 구조적 개질은 향상된 치료적 효능을 갖는 신규한 AG 유사체의 생성에 사용될 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   [화학식 1]
   
   상기 화학식 1에서,
   R₁은 메틸카보닐, 에틸카보닐, 또는 카르복시메틸카보닐임.
   
2. 6'-아미노글리코시드 아세틸기전달효소/2"-아미노글리코시드 인산기전이효소(6'-aminoglycoside acetyltransferase/2"-aminoglycoside phosphotransferase; AAC(6')-APH(2")) 존재 하에 이세파마이신을 아실 조효소 A(acyl coenzyme A; acyl-CoA)와 반응시키는 단계를 포함하는, 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 아실-CoA는 아세틸-CoA(acetyl-CoA), 프로피오닐-CoA(propionyl-CoA) 또는 말로닐-CoA(malonyl-CoA)인 것인, 제조방법.
   
4. 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   이세파마이신-감수성 병원체 또는 이세파마이신-내성 병원체에 대한 항균 활성을 갖는 것인, 조성물.
   
6. 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   이세파마이신을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 비해 신독성이 감소된 것인, 약학적 조성물.
   
8. 제1항의 화합물 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
9. 제1항의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
10. 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 그램-음성 균주에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.