KR20210050044A - 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 주름 개선과 암세포 독성과 같은 생물학적 활성을 나타내는 테르펜 당쇄 부가 유도체 및 이들 유도체의 효소적 제조방법에 관한 것으로, 피부 주름 개선 효과 및 항암 효과를 가지며, 신규한 당쇄를 포함하는 테르펜 당쇄 부가 유도체에 관한 것이다.

Description

테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물{Terpene glycosidic analogs, manufacturing method thereof and compositions containing the same as active ingredients}

본 발명은 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 약학적 조성물 등에 관한 것이다.

식품 내 설탕을 줄이기 위한 노력은 글로벌 보건 이슈라 할 것이다. 즉 비만과 당뇨와 같은 대사 질환들의 주요 원인으로 지목되고 있는 과도한 당류 섭취량을 적정 수준 이하로 낮출 수 있는 저감화 대책이 필요한 상황에서, 설탕의 감미효과를 대체 가능한 저칼로리 감미제(Sweetener) 및 그 구조적 유사체(Analogs) 혹은 모방체(Mimics)의 개발은 당연하다 할 것이다. 인공 감미제인 사카린은 1878년 개발되어 설탕 대비 약 500배의 감미효과를 제공하여, 특히 1차 세계대전 시 설탕 수급 부족에 대한 대안인 최초의 인공 감미제였다. 두 번째로 개발된 인공 감미제 시클라메이트(Cyclamate)와 사카린의 혼용은 그 권장 사용량을 준수할 경우 그 인체 위해성은 무해함이 밝혀졌으나 여전히 방광암등의 유해성 논란은 여전하다. 1960년대 이후 디펩타이드(Dipeptide)구조인 아스파탐(Aspartame)과 설탕 분자 내 3개의 수산기를 염소로 치환시킨 유기 합성 화합물인 수크랄로스(Sucralose), 그리고 전합성으로 만들어진 아세설팜포타슘(Acesulfame potassium)등이 개발되어 시판 중이다. 특히 아스파탐은 열에 민감하여 가열처리 과정이 필요치 않는 청량음료, 껌 및 일부 주류 등 가공식품에 현재까지 널리 사용되고 있으나, 여전히 동물 실험 상 나타난 뇌암 등의 인체 유해 가능성 문제 역시 끊임없이 제기되고 있다.

이와 같은 인공 감미제들을 문제를 해결할 수 있는 저칼로리 천연 감미제들이 1980년대 이후 개발되어 오고 있다. 우선 스테비아(Stevia)는 남미에 자생하는 국화과 다년생 초본 스테비아(Stevia rebaudiana) 잎의 추출물로 분리되었다. 화학 구조 상, 스테비아는 디테르펜(Diterpene) 구조의 스테비올(Steviol) 분자 구조 내 수산기와 카르복실기에 글루코오스가 2개 이상 5개까지 결합된 당쇄 부가 테르펜 혼합물로서, 설탕 대비 약 300배의 감미를 제공한다. 스테비아의 주 성분은 스테비오시드(Stevioside)와 레바우디오시 A(Rebaudioside A)로서, 그 뛰어난 감미도와 저칼로리 특성과 더불어 기존 인공 감미제인 사카린의 끝맛이나 아스파탐의 열 및 pH 불안정 등 기존 인공 감미제의 단점을 일부 해결할 수 있는 저칼로리 천연 감미제가 등장하였다. 다음으로, 또 다른 천연 감미제로서 모그로시드(Mogroside 혹은 mogrol glycosides)는 남중국과 북태국을 원산지로 하는 다년생 덩굴식물의 열매로서 개여주(Monk fruit)에서 얻어지며, 감미도는 설탕의 300배쯤으로 알려져 있다. 화학 구조 상 모그로시드 역시 티르테르펜(Triterpene) 분자 구조인 모그롤(Mogrol) 내 수산기에 글루코오스가 2-5개 추가적으로 결합된 당쇄 부가 테르펜 화합물로서, 1990년대 후반 미국의 다국적 식품회사인 프록터앤갬블사(Procter & Gamble)는 개여주로 부터 유용 감미제인 모그로시드의 단리 및 제조에 대한 특허를 공개한 바 있다. 또한, 2011년 이후 미국의 테이트앤라일사(Tate & Lyle) 이외의 여러 기업에서 개여주 추출물을 천연 감미제로 하여 시판하고 있다. 이상과 같이 감미제 시장은 설탕에 대한 대안으로 인공 감미제 개발이, 이후 그에 대한 대안으로 저칼로리 천연 감미제 개발이 이루어지고 있다. 현재까지의 감미제들은 여전히 설탕에 비하여 쓴맛과 같은 끝맛을 제공하고 있는 바, 그에 대한 해결책으로 여러 감미제들의 혼합 및 배합과 같은 가공기법의 개발 뿐만 아니라, 생명공학을 이용한 이들 감미제의 제조법 및 설탕을 대체할 수 있는 유도체 혹은 감미제 모방체의 개발이 현재까지도 경주되고 있는 실정이다.

그러나, 기존에는 당쇄 부가 전의 테르펜 구조인 디테르펜인 스테비올 및 트리테르펜인 모그롤을 기질로 하여 당쇄를 부가할 수 있는 당전이 효소를 이용한 신규한 구조의 테르펜 당쇄 부가 유도체의 생합성에 대한 연구는 극히 제한적이었다.

대한민국 등록특허 제10-1559478호

이에, 본 발명자들은 저칼로리 천연 감미제의 테르펜 구조에 당을 부가한 신규한 구조의 당쇄 유도체들을 제공한다. 이를 생산하기 위하여, 우선 마이크로모노스포라 이노엔시스(Micromonospora inoyensis) 균주의 유전체(genome)로부터 기존 보고된 바 없는 테르펜 당전이 효소 암호화 유전자를 분리하고 이를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 대장균을 제작하였다. 또한, 이를 이용하여 상기 발현된 당전이 효소(Micromonospora inoyensis Terpene glycosyltransferase, MiTGT)와 당 전이 수용체로서 테르펜 구조인 스테비올과 모그롤 화합물들을 당 전이 공여체인 핵산당을 반응시켜 당쇄 부가 유도체를 생합성하고, 이후 질량분석기(mass spectrometry)와 핵 자기 공명 스펙트로미트리(nuclear magnetic resornance spectrometry) 기기분석을 통하여 그 구조의 신규성을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,

R은 글루코스(glucose), 2-데옥시-글루코스(2-deoxy-glucose) 또는 갈락토스(galactose)이다.

본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 테르펜 당쇄 부가 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다:

a) 재조합 테르펜 당전이 효소와 테르펜 화합물을 반응시켜 효소반응 산물을 수득하는 단계; 및

b) 효소반응 산물로부터 테르펜 당쇄 부가 유도체를 분리 또는 정제하는 단계.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,

R은 글루코스(glucose), 2-데옥시-글루코스(2-deoxy-glucose) 또는 갈락토스(galactose)이다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 테르펜 당쇄 부가 유도체의 제조방법을 제공한다:

a) 재조합 테르펜 당전이 효소와 테르펜 화합물을 반응시켜 효소반응 산물을 수득하는 단계; 및

b) 효소반응 산물로부터 테르펜 당쇄 부가 유도체를 분리 또는 정제하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 주름 개선 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부 주름 개선 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 췌장암의 예방 및/또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염의 피부 주름 개선에 이용되는 화장료를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 췌장암 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체는 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

모그롤-3-글루코시드(Mogrol-3-glucoside);

모그롤-3-데옥시글루코시드(Mogrol-3-deoxyglucoside);

모그롤-3-갈락토시드(Mogrol-3-galactoside);

스테비올-13-글루코시드(Steviol-13-glucoside);

스테비올-13-데옥시글루코시드(Steviol-13-deoxyglucoside); 및

스테비올-13-갈락토시드(Steviol-13-galactoside).

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 재조합 테르펜 당전이 효소는 대장균으로부터 수득된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 대장균으로부터 수득된 재조합 테르펜 당전이 효소는 Micromonospora inoyensis Terpene glycosyltransferase(MiTGT)로 명명될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 테르펜 화합물은 모그롤(Mogrol) 또는 스테비올(Steviol)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 재조합 테르펜 당전이 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 재조합 테르펜 당전이 효소는 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 :

1) 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; 및

2) 상기 형질전환체로부터 테르펜 당전이 효소를 분리 또는 정제하는 단계.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 테르펜 당쇄 부가 유도체는 엘라스타제(elastase) 저해 활성을 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 테르펜 당쇄 부가 유도체는 피부 주름개선 활성과 췌장샘암 세포주 대상 항암 활성을 보여주고 있는 바, 피부 주름 개선용 기능성 화장품 뿐만 아니라 췌장암 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 모그롤 또는 스테비올로부터 본 발명의 테르펜 당쇄 부가 유도체의 생합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 테르펜 당쇄 부가 유도체들의 ¹³C-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 테르펜 당쇄 부가 유도체들의 엘라스타제 저해 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 테르펜 당쇄 부가 유도체들의 인간 췌장샘암종 세포주에 대한 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 엘라스타제 저해 활성 및 췌장암 증식을 억제하는 효과가 뛰어난 화합물들을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 테르펜 당쇄 부가 유도체를 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,

R은 글루코스(glucose), 2-데옥시-글루코스(2-deoxy-glucose) 또는 갈락토스(galactose)이다.

상기 화학식 1 또는 화학식 2로 이루어진 군에서 선택된 화학식을 갖는 화합물은 본 발명자에 의하여 처음으로 규명된 것으로서, 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.

상기 화합물은 보다 구체적으로, 도 1에 나타난 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1에 개시된 화합물의 구체적인 구조는 다음과 같다:

화합물	구조식
1 (M3G)
2 (M3DG)
3 (M3GAL)
4 (S13G)
5 (S13DG)
6 (S13GAL)

상기 화합물은 비방향족 이중 결합 및 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있다. 따라서, 이들은 라세미체 및 라세미체 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별적인 부분입체이성질체, 부분입체이성질체 혼합물 및 시스- 또는 트랜스-이성질체로서 발생할 수 있다. 모든 이러한 이성질체 형태가 고려된다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물의 수화물 또는 각각의 곁사슬에 당(glucose) 등의 화합물이 결합된 배당체와 같은 유도체 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화합물의 화학적 합성법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 및 이의 유도체는 모그롤 또는 스테비올을 MiTGT 효소와 반응시켜 수득한 효소반응 산물을 분리 정제함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물은 하기와 같은 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:

a) 재조합 테르펜 당전이 효소와 테르펜 화합물을 반응시켜 효소반응 산물을 수득하는 단계; 및

b) 효소반응 산물로부터 본 발명의 화합물을 분리 및/또는 정제하는 단계.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 테르펜 화합물은 모그롤(Mogrol) 또는 스테비올(Steviol)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 재조합 테르펜 당전이 효소는 대장균으로부터 수득된 MiTGT일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 재조합 테르펜 당전이 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 MiTGT는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 4으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 서열번호 4의 서열과 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 MiTGT는 서열번호 3의 염기서열을 포함하거나 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 서열번호 3의 서열과 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 서열번호 3의 염기서열은 마이크로모노스포라 이노엔시스(Micromonospora inoyensis)로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 a) 단계에서 모그롤 또는 스테비올에 UDP-글루코스, TDP-2-데옥시글루코스 및 UDP-갈락토스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 분리 또는 정제는 크로마토그래피를 이용하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 중압 액체 크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC)를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 중압액체크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography, MPLC)는 액체크로마토그래피 분석기술 중 하나로, 고정상으로 고체를 사용하고 고정상에 시료를 가한 다음 높은 압력 조건에서 액체 이동상 을 사용하는 크로마토그래피 기술이다. 중압액체크로마토그래피의 압력조건 보다 더 높은 압력에서 이동상을 흘려 보내는 기술은 고압액체크로마토그래피(high pressure liquid chromatography, HPLC)라고 한다. 압력이 셀수록 분리 속도가 빨라지기 때문에 고속LC(high speed liquid chromatography) 또는 고성능LC(high performance liquid chromatography)라고도 한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 크로마토그래피로는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그래피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다.

상기 b) 단계에서 MPLC 방법에 사용되는 이동상은 아세토나이트릴:메탄올:물:개미산 30:50:19.9:0.1(v/v/v/v) 혼합액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 b) 단계에서 MPLC 유지 시간(Retention time)은 5 내지 30분, 바람직하게는 10 내지 14 분일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 재조합 테르펜 당전이 효소는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

1) 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; 및

2) 상기 형질전환체로부터 테르펜 당전이 효소를 분리 또는 정제하는 단계.

상기 형질전환체는 무상 유도 물질(예를 들어, 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 같은 탄수화물의 유사 물질)이 처리된 배지에서 배양될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 무상 유도 물질은 재조합 테르펜 당전이 효소의 발현을 유도하기 위한 것일 수 있다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로써, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 발현 조절 서열과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 상기 발현 조절 서열에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 즉, 발현 조절 서열의 조절 하에 폴리뉴클레오티드의 서열이 발현되어 원하는 폴리펩티드가 형성되도록 정확한 해독프레임을 유지시키는 것을 포함한다. 이와 같이 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드와 발현 조절 서열은 프로모터, 전사 종결부위, 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 벡터 내에 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시부위에 인접하는, 유전자의 5' 비-코딩 부위에 위치한다. 본상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 형질전환체는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 한다. 상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함 하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다. 상기 미생물은 이에 한정되지 않지만 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스 (Staphylococcus)로 이루어진 군에서 선택된 세균일 수 있으며 가장 바람직하게는 대장균일 수 있다.

미생물 내로 본 발명의 벡터를 도입 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당 분야에 서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예들 들어, 원형질체(protoplast) 형질전환, 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 미세주입법 (microinjection), 인산 칼슘공동-침전법(calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태 또는 플라스미드를 제거한 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다. 형질전환체는 선별마커, 예를 들어 전술한 바와 같이 재조합 벡터와 연관된 항생물질 저항성을 발현시키는 세포를 선택하는 방법과 같은 표준 절차에 따라 선택할 수 있다.

형질전환된 세균의 배양은 균주의 생육과 효소의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원, 인원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 발현 벡터가 유도성 촉진자를 포함하는 경우에는, 온도 변화, 영양원의 고갈, 무상 유도 물질(예를 들어, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 같은 탄수화물의 유사 물질)의 첨가, 과잉 대사 부산물의 축적 등과 같은 적절한 유도 조건은 발현을 유도하는데 필요에 따라 적용될 수 있다.

상기 본 발명의 재조합 벡터를 상기 세균에 도입하는 공지된 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, CaCl2 및 열쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.

상술한 방법에 의해 제조된 본 발명의 형질전환 세균은 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 세균의 배양은 통상의 세균 배양 조건상에서 가능하며 예를 들어, 온도범위 15℃ 내지 45℃에서 1시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 분리하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

본 명세서에 기재된 유전자 서열 및 아미노산 서열은 기능성 동등성을 유지하는 한, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 경우를 포함하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 그 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말하여, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "피부 주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "피부 주름 개선"이란, 이에 한정되는 것은 아니지만, 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "췌장암"은 위장 뒤쪽에 위치한 췌장에서 발생한 종양으로서, 주로 췌장관의 세포에서 발생한다. 췌장은 위장의 뒤쪽, 몸의 가운데에 있으며 길이가 20cm정도이다. 위, 십이지장, 소장, 대장, 간, 담낭, 비장 등의 장기에 둘러싸여 있고 그런 위치 때문에 암의 발견이 어렵고 절제해 내기도 어려운 편이다. 췌장암과 같이 초기 진단이 어려우며, 그 증상을 쉽게 구분할 수 없는 암의 경우에는 사망률이 다른 암보다 월등히 높은 것으로 알려져 있으며, 췌장암은 진단을 하였을 경우 5년 생존율이 5% 이하로 알려져 있다.

본 발명에서 용어, "엘라스타제(elastase)"란 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소이다. 엘라스틴은 콜라겐과 마찬가지로 피부의 탄력성을 좌우하는 주요 섬유조직으로서 그 양은 약 2% 정도로 콜라겐과 비교하여 적은 양이지만 표피를 지탱하는 연결망 조직을 형성하고 있으므로 피부 탄력에 매우 중요한 역할을 한다. 18~19세까지는 섬유아세포에 의하여 계속 생성되지만 그 이후부터는 생성이 중단되고 이미 생성된 엘라스틴만으로 피부 탄력을 담당해야 하므로 엘라스틴이 한번 약화되면 그 탄력성을 회복하기가 매우 어렵다. 즉, 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 엘라스타아제의 활성도의 현격한 증가는 피부 주름생성의 주요 요인이다.

본 발명에서 조성물은 사용목적 내지 양상에 따라 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들면 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 화합물을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA).

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 췌장암의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다.

상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 건강기능성식품 조성물에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼,마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지, 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 화합물, 이의 유도체 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 화합물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만, 예를 들어, 최종적으로 제조된 식품 중 0.001 내지 30 중량% 일 수 있다. 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 20 중량%일 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클렌저의 형태일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가 대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01-5% 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01-3% 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 제형이 로션, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "개체(individual)"란 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다. 본 발명의 개체는 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으며, 예를 들어, 인간, 마우스, 랫, 원숭이, 고양이, 개, 소, 돼지 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 췌장암을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 췌장암 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 췌장암과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 마이크로모노스포라 이노엔시스로부터 MiTGT 암호화 유전자 분리, 대장균 내 발현 및 MiTGT 효소반응 산물의 분리·정제

실시예 1-1. 마이크로모노스포라 이노엔시스 유전체로부터 MiTGT 암호화 유전자 분리

본 발명은 마이크로모노스포라 이노엔시스(Micromonospora inoyensis)균주로부터 유래한 테르펜 화합물을 기질로 이용 가능한 테르펜 당전이 효소 MiTGT를 분리하기 위하여, 우선 마이크로모노스포라 이노엔시스 균주에서 분리한 유전체를 주형으로 사용하고 그 유전체의 염기서열을 기초로 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머(primer)로 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)을 다음과 같이 실시하였다. 포워드(forward) 프라이머는 하기 서열번호 1의 서열이고, 리벌스(reverse) 프라이머는 하기 서열번호 2의 서열이다.

서열번호 1: 5' - GG CATATG AGCGAGCCTGACACGGGTG - 3' (NdeI 제한위치)

서열번호 2: 5' - CGTGGTGGGCCGA CTCGAG GAGAACAC - 3' (XhoI 제한위치)

상기 균주의 유전체 DNA 및 상기 프라이머들을 Taq DNA 중합효소 (Taq DNA polymerase)와 함께 혼합하고 전체 32 사이클로 수행하였다(초기 불활성 98℃에서 5분, 52.8 에서 69.3℃로 기울기 반응 후, 72℃에서 5분 동안 반응 후 종결). PCR 산물을 정제한 후, pGEMR-T 이지 벡터(pGEMR-T easy vector, Promega, Madison, WI, USA)에 접합한 다음, 대장균 XL1 블루(XL1 blue, Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 42℃에서 45초간 열처리한 후, 형질전환을 수행하였다. 선발된 형질전환 대장균으로부터 T-이지 벡터를 분리, 정제한 후 그 염기서열(서열번호 3) 및 이로부터 유추한 아미노산 서열(서열번호 4)을 결정하였다. 전체 염기서열은 1539 bp이며, 번역 후 단백질은 512개의 아미노산으로 구성(총 57.23 kDa)되어 있다.

실시예 1-2. 대장균에서 MiTGT 재조합 당전이 효소의 발현 확인

상기 T-이지 벡터를 NdeI과 XhoI 제한효소로 처리한 MiTGT DNA 절편을 동일한 제한효소들로 처리한 단백질 발현 벡터인 pET-28(a+)(Novagen, Madison, WI, USA)에 삽입한 후, 대장균 BL21(DE3)(Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 형질전환시켰다. 이때, 형질전환체의 선발을 위하여 카나마이신 항생제 50 ppm을 사용하였다.

상기 재조합 대장균을 전술한 항생제와 최종 농도 1 M의 소르비톨(sorbitol) 및 2.5 mM 베타인(betaine)이 첨가된 LB 배지(Luria Bertani)에 1% 부피비로 접종한 후, 37℃에서 배양하였고, 광학농도(optical density) 0.6 ~ 0.8 사이로 성장이 확인될 때, 단백질 발현을 유도시키고자, 최종농도 0.5 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(isopropyl-D-thiogalactopyranoside, IPTG; Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가하였다. 재조합 대장균 균주를 20℃에서 24시간 추가적으로 배양하였다. 배양 후 배양액을 2000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 균체를 회수한 후, 50 mM 인산나트륨 용균(lysis) 완충용액(300 nM NaCl, 10 mM imidazole, 10% glycerol, 1% Triton X-100)에 균체를 용해시키고, 초음파 분해(sonication)를 실시하였다. 이 후, 12000 rpm에서 20분간 냉장 원심 분리하고, 상등액을 따로 모아 일부 시료를 12% SDS-PAGE로 분석하여 재조합 테르펜 당전이 효소 MrGT1의 발현 정도를 확인하였다. 발현이 확인된 재조합 단백질을 정제하기 위하여, 전술한 상등액을 50 mM 인산 완충용액(0.3 M NaCl, 20 mM imidazole)에 평형화된 탈론-금속 친화성 수지(Talon-metal affinity resin, Clontech, Mountain View, CA, USA)와 섞은 후 4℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 2000 rmp에서 5분간 냉장 원심 분리하는 한편 수지를 일회용 컬럼에 도입한 후, 수지 10배 용량의 20 mM 이미다졸을 포함하는 인산 완충용액으로 세척하였다. 최종적으로 150 mM 이미다졸을 포함한 인산 완충용액 3 ml로 수지에 결합된 재조합 테르펜 당전이 효소 MiTGT를 정제하였다.

실시예 1-3. 테르펜 화합물 스테비올과 모그롤을 각각 기질로 하여 MiTGT 재조합 효소 반응에 의한 테르펜 당쇄 부가 유도체의 생합성, 분리 및 정제

스테비올(steviol; Sigma, St. Louis, MO, USA)과 모그롤(Mogrol; ChemScene, Monmouth Junction, NJ, USA) 테르펜을 각각 100 mM 수준으로 20% DMSO에 용해한 후, 반응 완충용액(50 mM 인산 완충용액, 10 mM 염화마그네슘, 1 mg/ml 소 혈청 알부민)으로 희석하여 당 전이 수용체 기질을 최종 2 mM의 농도가 되게 한 후, MiTGT 테르펜 당전이 효소 50 μM와 당 전이 공여 기질인 핵산당 UDP-글루코스(UDP-glucose; Sigma), TDP-2-데옥시글루코스(TDP-2-deoxy-glucose; Sigma) 및 UDP-갈락토스(UDP-galactose; Sigma)를 각각 4 mM 수준으로 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 당전이 효소 반응을 실시하였다. 반응 후, 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 상층의 유기용매층만을 모아서 진공건조를 실시하였다. 상기 추출물 내 목적 당쇄 부가 화합물의 생합성 여부를 확인하기 위하여 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 하였다. 즉, 이동상으로 아세토나이트릴:메탄올:물:개미산 30:50:19.9:0.1(v/v/v/v) 혼합액을 분당 150 μl 속도로, 고정상 컬럼으로는 Acquity CSH C18 (Waters, 50 x 1.0 mm, 1.7 μm; Milford, MA, USA)을 사용하여 기기분석을 실시하였다. 한편, 상기 조추출물로부터 목적하는 테르펜 당쇄 부가 유도체들의 분리 및 정제를 위하여 하기 콤비플래시 Rf MPLC 시스템을 사용하였다. 즉, 역상(reverse-phase) C18 카트리지에 아세토나이트릴:메탄올:물:개미산 30:50:19.9:0.1(v/v/v/v) 혼합액을 이동상으로 분당 7 ml의 속도로 흘러가는 MPLC 시스템에, 동일한 이동상 3 ml에 용해시킨 전술한 조추출물을 주입한 후, 크로마토그램 상 검출된 피크를 자동 분취하였다. 개별 분획을 다시 감압하여 농축한 후, 이온트랩 질량 분석기(LCQ ion-trap mass spectrometer, ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA)로 질량 스펙트럼을 분석함으로써 목적하는 테르펜 당쇄 부가 유도체들을 분리하였다. 기질로 사용된 2종의 테르펜 화합물들은 MPLC 시스템 상 15 ~ 17분의 유지 시간으로 분취되었고, 목적하는 테르펜 당쇄 부가 유도체들은 당쇄 부가에 따른 친수성 증가로 기질인 테르펜보다 빠른 유지 시간인 10 ~ 14분 사이로 각각 검출되었다. 이들 정제된 테르펜 당쇄 부가 유도체들 중 당전이 공여 기질로 UDP-글루코스를 이용한 경우 기존에 모그로시드와 스테비아의 생합성 중간 대사체로 보고된 바 있는 모그로시드 IE1(Mogrol-3-glucoside, 이하 M3G)와 스테비올모노시드(Steviol-13-monoglucoside, 이하 S13G) 2종이 각각 생합성 되었으며, 신규 유도체들은 각각 모그롤-3-데옥시글루코시드(Mogrol-3-deoxyglucoside, 이하 M3DG), 모그롤-3-갈락토시드(Mogrol-3-galactoside, 이하 M3GAL), 스테비올-13-데옥시글루코시드(Steviol-13-deoxyglucoside, 이하 S13DG) 그리고 스테비올-13-갈락토시드(Steviol-13-galactoside, 이하 S13GAL)로 밝혀지었고, 도 1에 각각의 당쇄 부가 유도체들의 구조들이 나타나 있다. 상기 4종의 신규 화합물들은 각각 6.1 mg, 4.6 mg과 5.3 mg, 그리고 3.7 mg 으로 최종 정제되었다.

핵 자기 공명 스펙트로미트리(NMR) 시료들은 200 ul의 CD₃OD에 각각의 당쇄 부가 유도체들을 용해시킨 후, 5 mm 시게미 어드밴스드 NMR 마이크로튜브(Shigemi advanced NMR microtube; Sigma)에 상기 용매를 방치시킴으로써 제조하였다. ¹³C NMR 스펙트럼은 배리언(Varian) INOVA 500 분광광도계를 이용하여 298 K에서 획득하였고, 화학적 이동은 내부 준거로서 TMS를 이용하여 ppm으로 기록되었다. 모든 NMR 데이타 산출은 Mnova Suite 5.3.2 소프트웨어를 이용하여 수행하였고, 테르펜 당쇄 부가 유도체들의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 반응 전 테르펜 2종의 화합물들과 비교하였다(도 2 참조).

실시예 2. 당쇄 부가 테르펜 유도체들과 테르펜 화합물들, 어솔릭산 ( ursolic acid) 및 아스코르브산의 엘라스타제 ( elastase ) 저해 활성 확인

상기 실시예에 의해 생합성된 단순 페놀릭 배당 유도체들의 엘라스타제(elastase) 저해 활성 비교를 통한 주름개선 효과의 검정을 실시하였다. 엘라스타제는 돼지 췌장 유래의 엘라스타제(Sigma)를, 기질로는 N-succinyl-[L-alanine-alanine-alanine]-p-nitro -anilide(Sigma)을 사용하여 25℃에서 20분 반응 후, 405 nm 마이크로플레이트 리더(Microplate reader; Molecular Devices)로 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 어솔릭산(ursolic acid; Sigma)와 아스코르브산 2종을 그리고 당전이 반응 전의 테르펜 화합물들을 양성 비교군으로, 그리고 음성대조군으로는 시료 용해용 DMSO를 사용하였다. 엘라스타제 저해 정도는 음성대조군 대비 흡광도 50% 감소시키는데 필요한 화합물의 농도(IC₅₀)로 표시하였고, 그 결과를 도 3에 나타냈다.

도 3에 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 어솔릭산은 IC₅₀이 약 0.25 mM로 나타난 한편, 아스코르브산은 약 4.87 mM로 나타났다. 비교군인 테르펜 화합물 2종은 IC₅₀이 모두 1.2 mM 이상으로 나타났으며, 당쇄 부가 유도체들은 0.29 에서 2.5 mM 사이로 나타났다. 특히, 신규 당쇄인 데옥시글루코스가 부가된 테르펜 유도체 스테비올-13-디옥시글루코시드(S13DG) 유도체의 경우 양성 대조군인 어솔릭산의 IC₅₀ 에 매우 근접한 농도를 제시하였다.

이와 같이, 글루코스 혹은 갈락토스가 부가된 테르펜 유도체에 비하여 디옥시글루코스 부가된 일부 테르펜 유도체에서 유의미하게 낮은 IC₅₀ 농도가 나타난 결과로부터 관련 당쇄 구조가 엘라스타제와의 결합 시 저해 활성에 영향을 주는 것으로 예측되었다.

상기 실험 결과로부터 당쇄 부가 전의 테르펜 화합물에 비하여 당쇄 부가된 테르펜 유도체들의 엘라스타제 저해 활성이 향상되었음을 확인할 수 있으므로, 테르펜 당쇄 부가 유도체들을 피부 주름 개선에 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 3. 당쇄 부가 유도체들과 테르펜 화합물들의 인간 췌장샘암종 세포주에 대한 세포 독성 확인

상기 실시예에 의해 생성된 당쇄 부가 테르펜 화합물의 항암 활성을 검정하기 위하여, 인간 유래 췌장샘암종(pancreatic adenocarcinoma)세포주인 PANC-1을 대상으로 하여 MTT 방법으로 그 항암 활성을 확인하였다.

우선, 상기 사람 암세포주 PANC-1을 활성화시켰다. 세포주를 RPMI1640 배지(0.2% sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum, 스트렙토마이신 100 ppm, 페니실린 10 ppm, glutamine 4 mM)에 전 배양시킨 후, 원심 분리하고 T-플라스크에 분주하여 본 배양을 5일간 수행하였다. 배양 조건은 5% 이산화탄소 대기 내, 37℃에서 실시하였다. 배양 3일째에 실시예 당쇄 부가 화합물들 및 당쇄 부가 전의 테르펜들을 개별적으로 10% DMSO에 용해하여 최종 1, 10, 50, 100 및 200 μM 수준이 되도록 처리한 후, 3일간 추가 배양을 실시하였고, 필요할 경우 하루 간격으로 처리 세포주들을 분리하여 샘플링을 실시하였다. 최종 MTT로 정색 반응을 실시하여 대조군인 10% DMSO 처리와 비교하여 각 화합물들의 PANC-1 세포 저해 결과를 도 4에 나타냈다.

도 4에 나타난 바와 같이, 당쇄 부가 모그롤 화합물들 3종이 당쇄 부가 스테비올 화합물들에 비하여 상대적으로 높은 PANC-1 암세포주 저해 활성을 보여주었다. 특히 당쇄 부가되기 전의 모그롤 테르펜에 비하여 전 농도 구간에서 향상된 저해 활성을 나타냈다. 당쇄 부가 모그롤 유도체들인 모그롤-3-글루코스(M3G), 모그롤-3-데옥시글루코시드(M3DG) 그리고 모그롤-3-갈락토시드(M3GAL) 사이에서는 췌장샘암종 세포주 대상 항암 활성에 큰 차이를 확인할 수는 없었다.

따라서, 당쇄 부가 모그롤 유도체들을 췌장암에 대한 항암제로서 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Terpene glycosidic analogs, manufacturing method thereof and compositions containing the same as active ingredients <130> MP19-249 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ggcatatgag cgagcctgac acgggtg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 cgtggtgggc cgactcgagg agaacac 27 <210> 3 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MiTGT coding sequence [Micromonospora inoyensis] <400> 3 atgcgcattc tgattgcgac cgcgggcagc cgcattaaat atcgcccgca gccgctgcgc 60 ggcgcggcgc tgcgccgcgc gggctatgat gtggcggtgg cgaccaccga tacctttgcg 120 ccgatggtgc gcgatgcggg cctgggcttt cgccgcctgc cggcggatac ccgcggccat 180 gcgggcgtgc gcagcaaccg cgaagtgatg cgcgcggcgg cggcgtttac cgcggaactg 240 ggccagggct ttgcggatgc ggtgagcgaa ggcaccgatc tgctgctgct gagcaccacc 300 attcgcgaaa gcctgctgcg cagcgaaggc gcgaccggca ttccgagcct gggcgtgtat 360 ctgcagccga ccgcgccgac cggcgatttt ccgccggtgg tgaccggcgc gcgcagcctg 420 ggccgcctgg gcaaccgcac cgcgggccgc gaatttggca ttccggtgat tgcgtttctg 480 gcggaagcgg tggcgggcct gcgcgaacgc ctgcgcctgc cgccgctgag cgcggcggcg 540 atgcgcgcgc gccaggaacg cgcgggctgg ccggtgctgc atggctttgg caccgcgctg 600 gtgccgcgcc cggcggattg gcgcccgggc ctggaagtgg tgggcccgtg gtggccgcat 660 catgatgcgg gcgaacgcct gccgagcgaa ctggaagatt ttctggatgc gggcccgcgc 720 ccggtgctgg tgggctttgg cagcatggcg gcgggcgatg gcgaacgcct gagcgaactg 780 gcggtgcgcg cgctgcgccg cgcgggcctg cgcggcattc tgcagagcgg caacgcgggc 840 ctggcggcgg aaggcgatga tgtgctgacc tttctgtgga ttattcgcag caacctggtg 900 tgggtgaaag aagatcgcgc gtgcatgagc ggcgcgggca ccagcgcgac cctgcgcgcg 960 gcggtgccga gcgtggcggt gccggtgacc gcggatcagc cgttttgggc gggccgcctg 1020 gcgcgcattg gcgcggcgcc ggcgccggtg ccgtttacca ccctgaccgc ggatggcaaa 1080 ctggcgcgca ttgcgagcat tgcgccggat gaagcgtatg cgcgcgcgga aaaagcgcgc 1140 catctggcgg aagatggcgc gcgcgtggtg gaagcggtgc gcctgacccg cgcgtga 1197 <210> 4 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MiTGT [Micromonospora inoyensis] <400> 4 Met Arg Ile Leu Ile Ala Thr Ala Gly Ser Arg Ile Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Gln Pro Leu Arg Gly Ala Ala Leu Arg Arg Ala Gly Tyr Asp Val Ala 20 25 30 Val Ala Thr Thr Asp Thr Phe Ala Pro Met Val Arg Asp Ala Gly Leu 35 40 45 Gly Phe Arg Arg Leu Pro Ala Asp Thr Arg Gly His Ala Gly Val Arg 50 55 60 Ser Asn Arg Glu Val Met Arg Ala Ala Ala Ala Phe Thr Ala Glu Leu 65 70 75 80 Gly Gln Gly Phe Ala Asp Ala Val Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Leu 85 90 95 Leu Ser Thr Thr Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Glu Gly Ala Thr 100 105 110 Gly Ile Pro Ser Leu Gly Val Tyr Leu Gln Pro Thr Ala Pro Thr Gly 115 120 125 Asp Phe Pro Pro Val Val Thr Gly Ala Arg Ser Leu Gly Arg Leu Gly 130 135 140 Asn Arg Thr Ala Gly Arg Glu Phe Gly Ile Pro Val Ile Ala Phe Leu 145 150 155 160 Ala Glu Ala Val Ala Gly Leu Arg Glu Arg Leu Arg Leu Pro Pro Leu 165 170 175 Ser Ala Ala Ala Met Arg Ala Arg Gln Glu Arg Ala Gly Trp Pro Val 180 185 190 Leu His Gly Phe Gly Thr Ala Leu Val Pro Arg Pro Ala Asp Trp Arg 195 200 205 Pro Gly Leu Glu Val Val Gly Pro Trp Trp Pro His His Asp Ala Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Pro Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Asp Ala Gly Pro Arg 225 230 235 240 Pro Val Leu Val Gly Phe Gly Ser Met Ala Ala Gly Asp Gly Glu Arg 245 250 255 Leu Ser Glu Leu Ala Val Arg Ala Leu Arg Arg Ala Gly Leu Arg Gly 260 265 270 Ile Leu Gln Ser Gly Asn Ala Gly Leu Ala Ala Glu Gly Asp Asp Val 275 280 285 Leu Thr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Ser Asn Leu Val Trp Val Lys Glu 290 295 300 Asp Arg Ala Cys Met Ser Gly Ala Gly Thr Ser Ala Thr Leu Arg Ala 305 310 315 320 Ala Val Pro Ser Val Ala Val Pro Val Thr Ala Asp Gln Pro Phe Trp 325 330 335 Ala Gly Arg Leu Ala Arg Ile Gly Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Phe 340 345 350 Thr Thr Leu Thr Ala Asp Gly Lys Leu Ala Arg Ile Ala Ser Ile Ala 355 360 365 Pro Asp Glu Ala Tyr Ala Arg Ala Glu Lys Ala Arg His Leu Ala Glu 370 375 380 Asp Gly Ala Arg Val Val Glu Ala Val Arg Leu Thr Arg Ala 385 390 395

Claims (12)

1. 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   [화학식 1]
   

   

   
   [화학식 2]
   

   

   
   상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
   R은 글루코스(glucose), 2-데옥시-글루코스(2-deoxy-glucose) 또는 갈락토스(galactose)이다.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 테르펜 당쇄 부가 유도체는 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   모그롤-3-글루코시드(Mogrol-3-glucoside);
   모그롤-3-데옥시글루코시드(Mogrol-3-deoxyglucoside);
   모그롤-3-갈락토시드(Mogrol-3-galactoside);
   스테비올-13-글루코시드(Steviol-13-glucoside);
   스테비올-13-데옥시글루코시드(Steviol-13-deoxyglucoside); 및
   스테비올-13-갈락토시드(Steviol-13-galactoside).
   
3. 하기 단계를 포함하는 제1항의 테르펜 당쇄 부가 유도체의 제조방법:
   a) 재조합 테르펜 당전이 효소와 테르펜 화합물을 반응시켜 효소반응 산물을 수득하는 단계; 및
   b) 효소반응 산물로부터 제1항의 테르펜 당쇄 부가 유도체를 분리 또는 정제하는 단계.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 재조합 테르펜 당전이 효소는 대장균으로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 테르펜 화합물은 모그롤(Mogrol) 또는 스테비올(Steviol)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
6. 제3항에 있어서,
   상기 재조합 테르펜 당전이 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
7. 제3항에 있어서,
   상기 재조합 테르펜 당전이 효소는 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는, 제조방법 :
   1) 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; 및
   2) 상기 형질전환체로부터 테르펜 당전이 효소를 분리 또는 정제하는 단계.
   
8. 제1항의 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 테르펜 당쇄 부가 유도체는 엘라스타제(elastase) 저해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
   
10. 제1항의 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 식품 조성물.
    
11. 제1항의 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
12. 제1항의 테르펜 당쇄 부가 유도체, 이의 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    

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