ES2384275T3 - Compuestos fenólicos con aplicaciones cosméticas y terapéuticas - Google Patents

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Abstract

Un método para producir un O-α-glucósido fenólico, que comprende incubar sacarosa y una glucansacarasa de Leuconostoc species con un compuesto fenólico que tiene la siguiente fórmula: en la que R2 es H o OH; y R1 se selecciona del grupo que consiste en - en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condición de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH; - en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR, y R8 es H o OH, a condición de que al menos uno entre R7 y R8 representa OH; - -(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un número entero de 0 a 2; - -(CR12>=CH)-COOR o -(CR12>=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal, ramificado o cíclico; - -(CH2)n-COR o -(CH>=CH)n-COR, siendo n un número entero de 0 a 2; - -H; - - en donde R es H o un grupo hidrocarbonado C1-C10 lineal, ramificado o cíclico, aromático o no, saturado o insaturado, opcionalmente interrumpido por al menos un heteroátomo, en donde dicho grupo hidrocarbonado comprende un alquilo, un alquenilo o un alquinilo, que puede estar sustituido por uno o varios sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: un arilo (C5-C9), un heterociclo (C4-C9), un alcoxi (C1-C3), un acilo (C2-C3), un alcohol (C1-C3), un grupo carboxílico (-COOH), un éster (C2-C3), una amina (C1-C3), un grupo amino (-NH2), una amida (-CONH2), una imina (C1-C3), un nitrilo, un hidroxilo (-OH), un grupo aldehído (-CHO), un halógeno, un halogenoalquilo (C1-C3), un tiol (-SH), un tioalquilo (C1-C3), una sulfona (C1-C3), un sulfóxido (C1-C3), y una combinación de los mismos.

Description

Compuestos fen6licos con aplicaciones cosmeticas y terapeuticas
Campo de la invenci6n
La presente invenci6n se refiere a la preparaci6n de derivados fen6licos, composiciones farmaceuticas y cosmeticas 5 que comprenden tales derivados fen6licos, y su uso para la belleza de la piel y para tratar enfermedades.
Antecedentes de la invenci6n
Compuestos fen6licos y sus propiedades
Los compuestos fen6licos (tambien llamados fen6licos), o polifenoles, constituyen uno de los grupos mas numerosos y ampliamente distribuidos de sustancias en el reino vegetal, con mas que 8.000 estructuras fen6licas conocidas 10 actualmente. Los polifenoles son productos del metabolismo secundario de las plantas. La expresi6n "compuestos fen6licos" abarca un intervalo considerable de sustancias que poseen un anillo aromatico que lleva uno o mas sustituyentes hidroxilo. La mayorfa de las clases principales de polifenoles vegetales se enumeran en la Tabla 1, segun el numero de atomos de carbono de la cadena principal basica. La estructura de los polifenoles naturales varfa desde moleculas simples, tales como acidos fen6licos, hasta compuestos altamente polimerizados, tales como
15 taninos condensados (HARBORNE JB (1980) Plant phenolics. En: BELL EA, CHARLWOOD BV (eds) Encyclopedia of Plant Physiology, volumen 8, Secondary Plant Products, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York. Pp: 329395).
Los tres grupos importantes para los seres humanos son los acidos fen6licos (C6-C1, C6-C2 y C6-C3), los flavonoides (C6-C3-C6) y los polifenoles de alto peso molecular (mas que 30 atomos de carbono). De hecho, los
20 fen6licos, particularmente los polifenoles, exhiben una amplia variedad de actividades biol6gicas beneficiosas en los mamfferos, que incluyen acciones antivirales, antibacterianas, inmunoestimulantes, antialergicas, antihipertensivas, antiisquemicas, antiarrftmicas, antitromb6ticas, hipocolesterolemicas, antilipoperoxidantes, hepatoprotectoras, antiinflamatorias, anticarcinogenicas, antimutagenicas, antineoplasicas, antitromb6ticas, y vasodilatadoras. Son poderosos antioxidantes in vitro.
25 TABLA 1 : Las principales clases de compuestos fen6licos (o fen6licos) en las plantas (HARBORNE JB, 1980)
NUMERO DE ATOMOS DE CARBONO
CADENA PRINCIPAL BASICA CLASE EJEMPLOS
6
C6 Fenoles simples Benzoquinonas Catecol, hidroquinona, 2,6dimetoxibenzoquinona
7
C6-C1 Acidos fen6licos Galico, salicflico
8
C6-C2 Acetofenonas Derivados de tirosina Acidos fenilaceticos 3-Acetil-6-metoxibenzaldehfdo Tirosol p-Hidroxi-fenilacetico
9
C6-C3 Acidos hidroxicinamicos Fenilpropenos Cumarinas Isocumarinas Cromonas Cafeico, ferulico Miristicina, eugenol Umbeliferona, aesculetina Bergenona Eugenina
10
C6-C4 Naftoquinonas Juglona, plumbagina
13
C6-C1-C6 Xantonas Mangiferina
14
C6-C2-C6 Estilbenos Antraquinonas Resveratrol Emodina
15
C6-C3-C6 Flavonoides Quercetina, cianidina
Isoflavonoides
Genistefna
18
(C6-C3)2 Lignanos Neolignanos Pinoresinol Eusiderina
30
(C6-C3-C6)2 Biflavonoides Amentoflavona
n
(C6-C3)n (C6)n (C6-C3-C6)n Ligninas Melaninas de catecol Flavolanos (Taninos condensados)
Entre los acidos fen6licos, las estructuras carbonadas constitutivas mas importantes son las estructuras hidroxibenzoicas (C6-C1) e hidroxicinamicas (C6-C3). El contenido de acido hidroxibenzoico de las plantas comestibles es generalmente muy bajo, con la excepci6n de ciertas frutas rojas, rabanos negros y cebollas, que pueden tener concentraciones de varias decenas de miligramos por kilogramo de peso fresco. Los acidos hidroxibenzoicos son componentes de estructuras complejas tales como taninos hidrolizables (galotaninos en mangos y elagitaninos en frutas rojas tales como fresas, frambuesas y moras). Los acidos hidroxicinamicos son mas comunes que los acidos hidroxibenzoicos, y consisten principalmente en los acidos p-cumarico, cafeico, ferulico y sinapico. Estos acidos raramente se encuentran en la forma libre, excepto en alimentos procesados que hayan sufrido congelaci6n, esterilizaci6n o fermentaci6n. Las formas enlazadas son derivados glicosilados o esteres de acido qufnico, acido siqufmico y acido tartarico. El acido cafeico y el acido qufnico se combinan para formar acido clorogenico, que se encuentra en muchos tipos de frutas y en alta concentraci6n en el cafe. El acido cafeico, tanto libre como esterificado, es generalmente el acido fen6lico mas abundante, y representa entre 75% y 100% del acido hidroxicinamico total de la mayorfa de las frutas (MANACH C, SCALBERT A, MORAND C, REMESY C, JIMENEZ L (2004) Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr 79: 727-747).
Los flavonoides consisten en un grupo numeroso de sustancias polifen6licas de bajo peso molecular, derivados de benzo-y-pirona que son diversos en estructura qufmica; representan el grupo mas comun y ampliamente distribuido de fen6licos vegetales. La estructura comun de los flavonoides es la de los difenilpropanos (C6-C3-C6); consiste en dos anillos aromaticos (ciclos A y B) enlazados mediante tres carbonos que usualmente forman un heterociclo oxigenado (ciclo C). La Figura 1 muestra la estructura basica y el sistema usado para la numeraci6n de carbonos del nucleo del flavonoide. Las variaciones estructurales dentro de los anillos subdividen a los flavonoides en varias familias: flavonoles, flavonas, flavanoles, isoflavonas, antocianidinas y otros. Estos flavonoides a menudo aparecen como glic6sidos, glicosilaci6n que hace a la molecula mas soluble en agua y menos reactiva hacia los radicales libres. El azucar mas comunmente implicado en la formaci6n de glic6sidos es la glucosa, aunque tambien aparecen galactosa, ramnosa, xilosa y arabinosa, asf como disacaridos tales como rutinosa. Todas las variantes de flavonoides estan relacionadas por una ruta de biosfntesis comun, que incorpora precursores tanto de la ruta del siquimato como del acetato-malonato (CROZIER A. BURNS J, AZIZ AA, STEWART AJ, RABIASZ HS, JENKINS GI, EDWARDS CA, LEAN MEJ (2000) Antioxidant flavonols from fruits, vegetables and beverages: measurements and bioavailability. Biol Res 33: 79-88). Se producen modificaciones adicionales en diversas etapas, dando como resultado una alteraci6n en el grado de hidroxilaci6n, metilaci6n, isoprenilaci6n, dimerizaci6n y glicosilaci6n (produciendo O-o C-glic6sidos). Los compuestos fen6licos actuan como antioxidantes, con mecanismos que implican tanto eliminaci6n de radicales libres como quelaci6n de metales. En efecto, niveles en exceso de cationes metalicos de hierro, cinc y cobre en el cuerpo humano pueden promover la generaci6n de radicales libres y contribuir al dano oxidativo de las membranas celulares y del ADN celular; formando complejos con estos iones metalicos reactivos, pueden reducir su absorci6n y reactividad. Se tiene que subrayar que, aunque la mayorfa de los flavonoides quelan al Fe2+, hay grandes diferencias en la actividad quelante. En particular, el dihidroflavonol taxifolina quela mas eficazmente al Fe2+ que el correspondiente flavonol quercetina (VAN ACKER SABE, VAN DER BERG DJ, TROMP MNJL, GRIFFIOEN DHG, VAN BENNEKOM, VAN DER VIJGH WJF, BAST A (1996) Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids. Free Radic Biol Med 20 331-342).
Los flavonoides tienen una qufmica estructural ideal para actividades de eliminaci6n de radicales libres (varios estudios han mostrado que los flavonoides actuan como eliminadores de aniones super6xido, oxfgeno singlete, radicales hidroxilo y radicales peroxilo lfpidos por donaci6n rapida de un atomo de hidr6geno). Un importante hallazgo a partir de los estudios de la relaci6n entre las caracterfsticas estructurales de los flavonoides y su actividad antirradicales es que se requiere un resto catecol (3',4'-dihidroxifenol) en el anillo B para una buena actividad de eliminaci6n. Recientemente, esta afirmaci6n fue confirmada con, no obstante, una modulaci6n: en un estudio sobre la relaci6n entre las caracterfsticas estructurales de 29 flavonoides y su actividad antirradicales, se observ6 de hecho que la estructura de catecol en el anillo B no es siempre una condici6n sine qua non para conseguir una alta actividad de eliminaci6n de radicales libres, y que flavonoides altamente activos poseen un anillo B 3',4'-dihidroxi y/o un grupo 3-OH (AMIC D, DAVIDOVIC-AMIC D, BESLO D, TRINAJSTIC N (2003) Structure radical scavenging
activity relationships of flavonoids. Croatica Chem Acta 76: 55-61). Se ha demostrado que los flavonoides son antioxidantes mas eficaces in vitro que las vitaminas E y C en una base molar (RICE-EVANS CA, MILLER NJ, PAGANGA G (1997) Antioxidant properties os phenolic compounds. Trends in Plant Science 2: 152-159). Hay tambien informes de flavonoides que inhiben la actividad de enzimas tales como oxigenasas.
Se debe subrayar que la hidrofobicidad de los polifenoles es intermedia entre la de la vitamina C (altamente hidr6fila) y la de la vitamina E (altamente hidr6foba); por tanto, se espera que los polifenoles actuen en interfaces agua-lfpido, y pueden estar implicados en rutas de regeneraci6n oxidativa con la vitamina C y E.
Derivados fenolicos y su preparacion
Debido a su baja solubilidad en agua y/o su alta sensibilidad hacia la oxidaci6n, el uso defen6licos en preparaciones farmaceuticas o cosmeticas requiere formulaciones adaptadas y especfficas. Dado que estas formulaciones tambien deben satisfacer las restricciones asociadas a su uso final, el compromiso entre aceptabilidad, concentraci6n y estabilidad es a menudo diffcil de alcanzar.
Las formas de fen6licos mas solubles en agua y/o mas resistentes a la oxidaci6n, tales como los glic6sidos, no estan siempre disponibles en la naturaleza y pueden requerir, cuando existen, procedimientos complejos de extracci6n y purificaci6n a partir del material vegetal. Se han intentando metodos tanto qufmicos como bioqufmicos (enzimaticos) para aumentar la solubilidad en agua y/o la estabilidad. Como los compuestos fen6licos tienen varios grupos hidroxilo libres, los intentos de modificaciones qufmicas de los compuestos fen6licos conducen a reacciones no selectivas, que generan un abanico de moleculas diferentes. Se requieren entonces etapas de purificaci6n adicionales para recuperar el (los) producto(s) deseado(s).
En lo que se refiere al metodo bioqufmico, se han investigado hasta la fecha tres vfas para obtener glic6sidos fen6licos, y basicamente glic6sidos de flavonoides.
La primera vfa se basa en glicosiltransferasas capaces de transferir el resto de azucar de un nucle6tido de azucar a un aceptor (en el caso de UDP-glucosa:glucosiltransferasas (UGT), la glucosa es transferida desde uridina 5'difosfoglucosa). Estas enzimas, que contribuyen en la sfntesis del metabolismo secundario en las plantas, tienen amplias especificidades de sustrato aceptor (LIM EK, HIGGINS GS, BOWLES DJ (2003) Regioselectivity of glucosylation of caffeic acid by UDP-glucose:glucosyltransferase is maintained in planta. Biochem J 373: 987-92; LIM EK, ASHFORD DA, HOU B, JACKSON RG, BOWLES DJ (2004) Arabidopsis glycosyltransferases as biocatalysts in fermentation for regioselective synthesis of diverse quercetin glucosides. Biotechnol. Bioeng. 87(5): 623-31). No obstante, este metodo es afectado por el muy alto coste de los nucle6tidos de azucar, y porque la regeneraci6n del sustrato del nucle6tido de azucar, que es un modo de disminuir el coste del sustrato, es diffcil de dominar a gran escala.
La segunda vfa se basa en enzimas transferidoras de sacaridos, capaces de transferir glucosa de un aglucosilsacarido. Dichas enzimas se seleccionan de las hidrolasas a-glucosidasa (EC 3.2.1.20) y a-amilasa (EC 3.2.1.1), y de la transferasa ciclodextrin-glucanotransferasa (EC 2.4.1.19). Sus sustratos son amilosa, dextrinas, ciclodextrinas, maltooligosacaridos e hidrolizados parciales de almid6n, que contienen todos ellos, principal o exclusivamente, residuos glucosilo enlazados unos a otros mediante un enlace a 1-4 osfdico. Segun este metodo, la patente de EE.UU. 5.565.435 afirma que se obtiene a-glucosilquercetina. Se tiene que subrayar que las enzimas que degradan el almid6n enlazan el residuo glucosilo al flavonoide mediante un enlace a-osfdico, mientras que la UDP-glucosa:glucosiltransferasa investigada por LIM et al. enlaza el residuo glucosilo al flavonoide mediante un enlace �-osfdico. Se tiene que subrayar tambien que, en las condiciones descritas en la patente de EE.UU. 5.565.435, la molecula de quercetina podrfa ser solubilizada ajustando el pH a 8,5 y manteniendo el medio de reacci6n a 60°C. La solubilizaci6n de fen6licos en medios alcalinos es debida a la formaci6n de fenolatos; en estas condiciones de pH y temperatura, la estabilidad del sustrato se consigui6 operando bajo condiciones anaer6bicas. Parece por tanto que este modo de preparaci6n es sumamente diffcil de controlar y manejar, y que serfa valioso un modo simple de preparaci6n.
La tercera vfa implica glucosiltransferasas usando sacarosa (�-D-fructofuranosil-a-D-glucopiran6sido) como donador de glucosilo y produciendo glucanos con la liberaci6n de fructosa. Se han hecho varios intentos con esta clase de enzimas para intentar conseguir gluc6sidos de fen6licos. Primero, se demostr6 que la glucosiltransferasa de Streptococcus sobrinus (referenciada por los autores como cepa 6715, serotipo g) cataliza la sfntesis de 4'-O-a-Dglucopiranosil-(+)-catequina en un medio estrictamente acuoso (catequina a 1 g/L en tamp6n fosfato 100 mM, pH 6,0, conteniendo sacarosa al 2%) (NAKAHARA K, KONTANI M, ONO H, KOMADA T, TANAKA T, OOSHIMA T, HAMADA S (1995) Glucosyltransferase from Streptococcus sobrinus catalyzes glucosylation of catechin. Appl. Environ. Microbiol. 61(7): 2768-70). Se demostr6 que una enzima similar, la glucosiltransferasa-D de Streptococcus mutans GS-5, es menos regioselectiva, ya que cataliza no s6lo la sfntesis de 4'-O-a-D-glucopiranosil-(+)-catequina sino tambien la sfntesis de 7-O-a-D-glucopiranosil-(+)-catequina y del derivado diglucosilado 4',7-O-a-Dglucopiranosil-(+)-catequina (MEULENBELD GH, ZUILHOF H, VAN VELDHUIZEN A, VAN DEN HEUVEL RHH, HARTMANS S (1999) Enhanced (+)-catechin transglucosylating activity of Streptococcus mutans GS-5 glucosyltransferase-D due to fructose removal. Appl Environ Microbiol 65(9): 4141-7). Aunque varias investigaciones con respecto a la especificidad de aceptor de la glucosiltransferasa de Streptococcus mutans GS-5 conducen a los
autores a inferir que los aceptores aromaticos parecen requerir dos grupos hidroxilo aromaticos adyacentes (MEULENBELD GH, HARTMANS S (2000) Transglycosilation by Streptococcus mutans GS-5 glucosyltransferase-D: acceptor specificity and engineering reaction conditions. Biotechnol Bioeng 70(4): 363-9), esta afirmaci6n fue contradicha por la identificaci6n de glucosilaci6n en la posici6n 7 en la catequina (MEULENBELD et al., 1999) y por la sfntesis de derivados distintos al pirocatecol. En efecto, la pinosilvina y el resveratrol, respectivamente 3,5dihidroxi-trans-estilbeno y 3,4',5-trihidroxi-trans-estilbeno, fueron glucosilados por una preparaci6n de glucosiltransferasa en bruto producida por Streptococcus mutans para formar respectivamente 3-O-a-D-glucopiranosil-(E)-pinosilvina y 3-O-a-D-glucopiranosil-(E)-resveratrol (SHIM H, HONG W, AHN Y (2003) Enzymatic preparation of phenolic glucosides by Streptococcus mutans. Bull Korean Chem Soc 24(11): 1680-2). Muy recientemente, se ha afirmado que los flavonoles quercetina y miricetina y la flavona luteolina podrfan ser glucosilados por glucansacarasas especiales, a saber, la dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F (sacarosa:1,6-a-D-glucano 6-a-D-glucosiltransferasa, EC 2.4.1.5) y la alternansacarasa de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-23192 (sacarosa:1,6(1,3)-a-D-glucano 6(3)-a-D-glucosiltransferasa, EC 2.4.1.140) (BERTRAND A, MOREL S, LEFOULON F, ROLLAND Y, MONSAN P, REMAUD-SIMEON M (2006) Leuconostoc mesenteroides glucansucrase synthesis of flavonoid glucosides by acceptor reactions in aqueous-organic solvents. Carbohydr Res 341: 855-63). Convencionalmente, en presencia de sacarosa, la primera produce un glucano (dextrano) en el que el 95% de los enlaces glucosfdicos son a-(1-6) (cadena principal del polisacarido) y el 5% a(1-3) (puntos de ramificaci6n), y la segunda un glucano (alternano) en el que los enlaces glucosfdicos son alternativamente a-(1-6) y a-(1-3). Los derivados flavonoides obtenidos fueron: luteolin-3'-O-a-D-glucopiran6sido, luteolin-4'-O-a-D-glucopiran6sido, quercetin-3'-O-a-D-glucopiran6sido, quercetin-4'-O-a-D-glucopiran6sido, quercetin-3'-4'-O-a-D-diglucopiran6sido, miricetin-3'-O-a-D-glucopiran6sido y miricetin-4'-O-a-D-glucopiran6sido. Este trabajo demuestra que los rendimientos de la sfntesis de derivados glic6sidos no s6lo se basan en la propia enzima (la sfntesis de luteolin-O-glic6sidos cay6 de 44% a 8% entre dextransacarasa y alternansacarasa), sino tambien en ligeras diferencias qufmicas entre dos aceptores (no se observ6 conversi6n con la dextransacarasa sobre diosmetina y diosmina).
A partir del significativo (aunque no exhaustivo) estado de la tecnica anterior con respecto alas vfas experimentadas para obtener derivados glucosilados de polifenoles en general (y flavonoides en particular) para vencer los principales inconvenientes convencionales de los flavonoides (escasa solubilidad en agua en condiciones fisiol6gicas, en particular a pH que oscila de 5 a 7 y 30°C, y alta sensibilidad a la autooxidaci6n en estas condiciones biol6gicas), parece claro que no se pueden deducir pautas precisas para establecer la producci6n enzimatica de un glic6sido fen6lico especffico. Al contrario, se ve que no hay manera de que el experto en la tecnica pueda predecir que flavonoide puede ser glucosilado con que enzima y en que condiciones para obtener altas concentraciones de gluc6sido (vease el resumen en la Tabla 2). En efecto, aunque se han hecho intentos para establecer una relaci6n entre las estructuras fen6licas y la posibilidad de su uso como aceptor de glicosilo por glicosiltransferasas, parece sin embargo que la obtenci6n de fen6licos glicosilados depende en gran medida de la naturaleza de la sustancia fen6lica y de la enzima usada para la reacci6n de condensaci6n. Esto es particularmente cierto con glucosiltransferasas que sintetizan convencionalmente a-D-glucanos a partir de sacarosa (EC 2.4.1.5), para las que s6lo un numero muy pequeno de estructuras polifen6licas han sido reportadas con exito. Ademas, en el caso de las principales glucosiltransferasas estudiadas, a saber, glucosiltransferasa-D de S. mutans GS-5 y dextransacarasa de
L. mesenteroides NRRL B-512F, se tiene que mencionar que la primera sintetiza un a-glucano soluble en agua de una manera estimulada y dependiente de cebador (HAMADA N, KURAMITSU HK (1989) Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtff gene, coding for primer-dependant soluble glucan synthesis. Infect Immun 56: 1999-2005), mientras que la segunda no (ROBYT JF, WALSETH TF (1978) The mechanism of acceptor reactions of Leuconostoc mesenteroides NRRL B 512F. Carbohydr Res 61: 433-45). Estas glucosiltransferasas tienen un mecanismo distinto de acci6n, y por consiguiente moleculas que son aceptoras para una enzima no son necesariamente aceptoras para la otra; en otras palabras, como se muestra en los trabajos citados anteriormente, no hay justificaci6n para considerar que las sustancias que actuan como aceptor de glucosilo en el caso de la glucosiltransferasa D de S. mutans GS -5 actuen tambien como aceptor de glucosilo en el caso de la dextransacarasa de L. mesenteroides NRRL B-512F, y vice versa.
Mas aun, la informaci6n de la tecnica anterior muestra que, a pesar del interes y abundancia de fen6licos, se han obtenido pocos glic6sidos de fen6licos por reacciones enzimaticas.
Tabla 2
POLIFENOL
ORIGEN DE LA ENZIMA PRODUCTO(S) Y REFERENCIA
Enziias y sustratos: Glicosiltransferasas capaces de transferir el resto de azucar de un nucleotido de azucar (p.ej., UDP-glucosa)
Acido cafeico (OH en 3 y 4)
Arabidopsis thaliana Cafeoil-3-O--gluc6sido -LIM et al. 2003
Acidos o-y m-cumaricos (OH en 2 y 3, respectivamente)
Arabidopsis thaliana 2-O y 3-O--gluc6sidos de acidos oy m- cumaricos - LIM et al. 2003
Acido isoferulico (OH en 3; OCH3 en 4)
Arabidopsis thaliana 3-O--gluc6sido -LIM et al. 2003
Acido p-cumarico (OH en 4), acido ferulico (OH en 4 y OCH3 en 3) y acido sinapico (OH en 4 y OCH3 en 3 y 5)
Arabidopsis thaliana Ningun gluc6sido -LIM et al. 2003
Quercetina (flavonol; OH en 3, 5, 7, 3' y 4')
Arabidopsis thaliana 3-O-, 7-O-, 3'-O-, 4'-Omonogluc6sidos y 3,7-di-O y 7,3'-diO-gluc6sidos -LIM et al. 2003; LIM et al. 2004
Luteolina (flavona; OH en 5, 7, 3' y 4')
Arabidopsis thaliana Gluc6sidos -LIM et al. 2003
Eriodictiol (flavanona; OH en 5, 7, 3' y 4')
Arabidopsis thaliana Ningun gluc6sido -LIM et al. 2003
Catequina (flavanol; OH en 3, 5, 7, 3' y 4') y cianidina (antociano; OH en 5, 7, 3', 4')
Arabidopsis thaliana Ningun gluc6sido -LIM et al. 2003
Enziias y sustratos: Enziias degradantes del aliidon (a-glucosidasa, ciclodextrina glucanotransferasa o CGTasa, a-aiilasa) y aliidon ylo hidrolizados de aliidon
Quercetina (flavonol; OH en 5, 7, 3' y 4')
a-glucosidasa: hfgado de cerdo, semilla de alforf6n, Mucor, Penicillium, Saccharomyces CGTasa: Bacillus, Klebsiella a-amilasa: Aspergillus a-glucosilquercetina (pat. de EE.UU. 5.565.435) (OH glucosilado no mencionado)
Enziias y sustratos: Glicosiltransferasas capaces de transferir el resto de azucar de la sacarosa
Catequina (flavanol; OH en 3, 5, 7, 3' y 4')
Streptococcus sobrinus 4'-O-a-D-glucopiranosil-(+)catequina (NAKAHARA et al. 1995)
Resveratrol (OH en 3, 5, 4') y pinosilvina (OH en 3,5)
Streptococcus mutans 3-O-a-D-glucopiranosil-(E)pinosilvina y 3-O-a-D-glucopiranosil(E)-resveratrol (SHIM et al. 2003)
Catequina (flavanol; OH en 3, 5, 7, 3' y 4')
Streptococcus mutans GS-5 (glucosiltransferasa D) 4'-O-a-D-glucopiranosil-(+)catequina, 7-O-a-D-glucopiranosil(+)-catequina y 4',7-O-a-Ddiglucopiranosil-(+)-catequina (MEULENBELD et al. 1999)
Catecol (OH en 1 y 2), 3metoxicatecol (OCH3 en 3), 3metilcatecol (CH3 en 3), 4metilcatecol (CH3 en 4)
Streptococcus mutans GS-5 (glucosiltransferasa D) Gluc6sidos (MEULENBELD y HARTMANS, 2000)
Fenol, 3-hidroxifenol, alcohol bencflico, alcohol 2-hidroxibencflico, alcohol 2-metoxibencflico, 1-fenil1,2-etanodiol
Streptococcus mutans GS-5 (glucosiltransferasa D) Ningun gluc6sido (MEULENBELD y HARTMANS, 2000)
Quercetina (flavonol; OH en 3, 5, 7, 3' y 4'), luteolina (flavona; OH en 5, 7, 3' y 4'), miricetina (flavonol; OH en 3, 5, 7, 3', 4' y 5')
L. mesenteroides NRRL B-512F L. mesenteroides NRRL B-512F Gluc6sidos (3' y 4' con luteolina y L. mesenteroides NRRL B-512F) (BERTRAND et al. 2006)
Diosmetina (flavona; OH en 5 y 3'; OCH3 en 4')
L. mesenteroides NRRL B-512F L. mesenteroides NRRL B-512F Ningun gluc6sido (BERTRAND et al. 2006)
Otro punto clave a considerar en la sfntesis enzimatica de glic6sidos de fen6licos es la posibilidad de crear derivados de fen6licos que permitan recuperar los fen6licos iniciales mediante una reacci6n de hidr6lisis en condiciones suaves.
En efecto, para un polifenol dado, las propiedades ventajosas que se conocen en el presente corresponden a una estructura especffica, y se tiene que demostrar por tanto que el derivado valioso, con propiedades de solubilidad en agua y estabilidad aumentadas, puede ser convertido en la parte sacarida por un lado y la parte aglicona por otro lado. MISHRA et al. dan un ejemplo de disminuci6n de la actividad antioxidante debido a glicolaci6n (MISHRA B, PRIYADARSINI KI, KUMAR MS, UNNIKRISHNAN MK, MOHAN H (2003) Effect of O-glycosylation on the antioxidant activity and free radical reactions of a plant flavonoid, chrysoeriol. Bioorg Med Chem 11:2677-85). El crisoeriol y su glic6sido (crisoeriol-6-OG-acetil-4'--D-gluc6sido) son dos flavonoides extrafdos de la planta tropical Coronopus didymus; el crisoeriol muestra mejor efecto protector que el glic6sido cuando se ensaya su capacidad de inhibir la peroxidaci6n de lfpidos inducida por radiaci6n gamma, Fe (III) y Fe (II). Hasta la fecha, esta reversibilidad es conocida s6lo para la a-glucosilquercetina obtenida con enzimas degradantes del almid6n in vitro (patente de EE.UU. 5.565.435). Por tanto, si la funcionalizaci6n de fen6licos como derivados glicosfdicos es una manera (i) de facilitar su formulaci6n en cosmeticos, productos farmaceuticos o cualquier otra preparaci6n hecha por el hombre debido a una solubilidad en agua mas alta que la de la aglicona, y (ii) de aumentar la estabilidad de estos fen6licos en dichas f6rmulas, siendo ambas ellas propiedades universales de las formas glucosiladas de los polifenoles, estos derivados glicosfdicos deben ser hidrolizables en condiciones biol6gicas.
Hay por lo tanto una necesidad de crear:
-
nuevos derivados de compuestos fen6licos valiosos con solubilidad en agua (en las mismas condiciones fisicoqufmicas (pH, salinidad, temperatura...)) y estabilidad aumentadas; y/o,
-
nuevos derivados de compuestos fen6licos valiosos que puedan ser convertidos facilmente en su precursor, glucosa y sustancia fen6lica, en el lugar donde tienen que ejercer su actividad biol6gica y no durante su almacenamiento en una f6rmula comercial; y/o,
-
nuevos derivados de compuestos fen6licos valiosos que se puedan obtener mediante un procedimiento en el que las etapas de sfntesis y purificaci6n se puedan llevar a cabo de una manera reproducible y en cualquier escala dependiente de la demanda del mercado.
Debido al hecho de que la estructura del pirocatecol (presencia de dos grupos hidroxilo vecinos) es reconocida como particularmente importante para la actividad eliminadora de los polifenoles, los compuestos fen6licos que parecen particularmente eficaces son los que contienen una estructura de catecol; entre los compuestos fen6licos que son de particular interes, estan los siguientes compuestos:
-
acido protocatecuico (acido 3,4-dihidroxibenzoico, Figura 2) y sus derivados esteres; y/o,
-
acido cafeico (acido 3,4-dihidroxicinamico, Figura 3) y sus derivados esteres, especialmente acido rosmarfnico (ester (R)-1-carboxi-2-(3,4-dihidroxifenil)etflico del acido 3,4-dihidroxicinamico), acido clorogenico (acido 3-O(3,4-dihidroxicinamoil)-D-qufnico), acido chic6rico, equinac6sido, verbasc6sido y ester fenetflico del acido cafeico, y su forma reducida acido hidrocafeico y sus derivados esteres; y/o,
-
estructuras especiales no estrechamente relacionadas con el acido protocatecuico ni el acido cafeico y que contienen el anillo de pirocatecol: acido 3,4-dihidroximandelico (Figura 4) y su sustancia relacionada acido 3,4dihidroxifenilacetico y 3,4-dihidroxifenilglicol con una cadena principal C2-C6, y esculetina (6,7dihidroxicumarina, Figura 5) con una cadena principal C6-C3; y/o,
-
las flavanonas taxifolina (3,5,7,3',4'-pentahidroxiflavanona, Figura 6), fustina (3,7,3',4'-tetrahidroxiflavanona), eriodictiol (5,7,3',4'-tetrahidroxiflavanona); y/o,
-
los flavonoles fisetina (3,7,3',4'-tetrahidoxiflavona) y ramnetina (3,5,3',4'-tetrahidroxi-7-metoxiflavona); y/o,
-
las flavonas cirsiliol y 3',4',7-trihidroxiflavona y la isoflavona 3'-hidroxidaidzeina.
Se incluye a continuaci6n informaci6n mas detallada sobre estos fen6licos de interes.
Acido protocatecuico (tambien llamado acido 3,4-dihidroxibenzoico, o (acido 3,4-dihidroxibenzoico)) se encuentra en muchas plantas comestibles y medicinales, aunque la mayorfa de las veces en concentraciones mas bajas que los derivados del acido cinamico. Aunque ligeramente menos potente que el acido cafeico, el acido protocatecuico mostr6 un efecto inhibitorio dependiente del tiempo y dependiente de la dosis sobre el crecimiento de celulas de cancer de mama humano T47D. Tambien se demostr6 que el acido protocatecuico y el acido cafeico interactuan directamente con el receptor arilhidrocarbonado, inhiben la 6xido nftrico sintasa y tiene un efecto pro-apopt6tico (KAMPA M, ALEXAKI VI, NOTAS G, NIFLI AP, NISTIKAKI A, HATZOGLOU A, BAKOGEORGOU E, KOUIMTZOGLOU E, BLEKAS G, BOSKOU D, GRAVANIS A, CASTANAS E (2004) Antiproliferative and apoptotic effects of selective phenolic acids on T47D human breast cancer cells; potential mechanisms of action. Breast
Cancer Res 6: R63-R74). LIU et al. (LIU KS, TSAO SM, YIN MC (2005) In vitro antibacterial activity of roselle calyx and protocatechuic acid. Phytother Res 19(11): 942-5) demostraron in vitro un efecto inhibitorio del acido protocatecuico sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumanii resistentes a la meticilina. Los datos de la zona de inhibici6n y los valores de concentraci6n inhibitoria mfnima (CIM) mostraron que el acido protocatecuico inhibi6 eficazmente el crecimiento de todos los pat6genos bacterianos ensayados. Estudios recientes indican que se podrfa usar el acido protocatecuico como agente protector contra enfermedades cardiovasculares y neoplasmas (SZUMILO J. (2005), Postepy Hig Med Dosw (Online) 59: 608-15). El mecanismo de su acci6n esta asociado principalmente con la actividad antioxidante, incluyendo la inhibici6n de la generaci6n asf como la eliminaci6n de radicales libres y regulaci6n en ascenso de enzimas que participan en su neutralizaci6n.
Tambien se demostr6 que el acido protocatecuico es un posible agente quimiopreventivo para la carcinogenesis del colon mediante la supresi6n de la manifestaci6n de biomarcadores intermedios inducidos por carcinogenesis de colon inducida por azoximetano (AOM) en ratas (TANAKA T, KOJIMA T, SUZUI M, MORI H (1993) Chemoprevention of colon carcinogenesis by the natural product of a simple phenolic compound protocatechuic acid: suppressing effects on tumor development and biomarkers expression of colon tumorigenesis. Cancer Res. Sep 1; 53(17): 3908-13). El acido protocatecuico es tambien por lo tanto un valioso compuesto fen6lico activo, pero su biodisponibilidad se debe incrementar mediante funcionalizaci6n para obtener derivados mas solubles en agua.
Acido cafeico (tambien llamado acido 3,4-dihidroxicinamico), un derivado del acido trans-cinamico (acido trans-3fenilacrflico) contiene un grupo -CH=CH-COOH que asegura mayor capacidad donadora de H y la posterior estabilizaci6n de radicales que el grupo carboxilato en los acidos benzoicos (RICE-EVANS CA, MILLER NJ, PAGANDA G (1996) Structure -antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic Biol Med 20(7): 933-56). Ademas de sus posibles efectos beneficiosos sobre la salud humana (los acidos cafeico y 3metoxicafeico o ferulico reaccionan con el nitrito in vitro e inhiben la formaci6n de nitrosaminas in vivo; tambien inhiben la nitraci6n de tirosina mediada por peroxinitrito), el acido cafeico demostr6 recientemente ser eficaz en proteger la piel humana del eritema inducido por UVB (SVOBODOVA A, PSOTOVA J, WALTEROVA D (2003) Natural Phenolics in the prevention of UV-induced skin damage. A review. Biomed Papers 147: 137-145). El acido cafeico se encuentra frecuentemente en la forma de derivados, con 1-carboxi-2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol para formar acido rosmarfnico, con acido qufnico para formar acido clorogenico y con feniletanol para formar ester fenetflico del acido cafeico.
Acido rosmarfnico (tambien llamado acido 3-(3,4-dihidroxifenil)-2-[3-(3,4-dihidroxifenil)prop-2-enoiloxi]propanoico) se encuentra en la familia de plantas Lamiaceae, que incluye albahaca, salvia, menta, romero y hoja de perilla (AL SEREITI MR, ABU-KAMER KM, SEN P (1999) Pharmacology of rosemary and its therapeutic potentials. Indian J. Exp Biol 37(2): 124-30). Se ha demostrado que la suplementaci6n oral con hojas de perilla o extractos de acido rosmarfnico suprime reacciones alergicas en ratones y, mas recientemente, en humanos (MAKINO T, FURUTA A, FUJII H, NAKAGAWA T, WAKUSHIMA H, SAITO K, KANO Y (2001) Biol Pharm Bull 24(10): 1206-9 - TAKAKANO H, OSAKABE N, SANBONGI C, YANAKASIWA R, INOUE KI, YASUDA A, NATSUME M, BABA S, ICHIISHI EI, YOSHIKAWA T (2004) Extract of Perilla frutescens enriched for rosmarinic acid inhibits seasonal allergic rhinoconjunctivitis in humans. Exp Biol Med 229(3): 247-54). El acido rosmarfnico alivia los sfntomas de alergia impidiendo la activaci6n de celulas con respuesta inmune e induciendo la ap6ptosis, o suicidio celular, en celulas con respuesta inmune ya activadas (HUR YG, YUN Y, WON J (2004) Rosmarinic acid induces p561ck-dependent apoptosis in jurkat and peripheral T cells via mitochondrial pathway independent from fas/fas ligand interaction. J immunol 172(1): 79-87). Tambien se ha demostrado que el acido rosmarfnico mata linfocitos T y neutr6filos activados por alergia durante reacciones alergicas sin afectar a los linfocitos T o los neutr6filos en su estado de reposo (SANBONGI C, TAKANO H, OSAKABE N (2003) Rosmarinic acid inhibits lung injury induced by diesel exhaust particles. Free Radic Biol Med 34(8): 1060-9).
El acido rosmarfnico fue el primero que demostr6 reducir reacciones alergicas en ratones usando la reacci6n de anafilaxis cutanea pasiva en la oreja del rat6n (MAKINO T, FURATA Y, WAKUSHIMA H, FUJII H, SAITO K, KANO Y (2003) Anti-allergic effect of Perilla frutescens and its active constituents. Phytoter Res 17(3): 240-3). Un estudio demostr6 que el acido rosmarfnico inhibi6 la activaci6n del promotor IL-2 de los linfocitos T en un cribado a gran escala de extractos de plantas (WON J, HUR YG, HUR EM, PARK SH, KANG MA, CHOI Y, PARK C, LEE KH, YUN Y (2003), Rosmarinic acid inhibits TCR-induced T cell activation and proliferation in a Lck-dependent manner. Eur J Immunol 33(4): 870-9). Otro estudio demostr6 que el acido rosmarfnico, inhibiendo tanto la activaci6n como la proliferaci6n de los linfocitos T, tuvo potentes efectos inmunosupresores cuando se combin6 con rapamicina, un farmaco anti-rechazo (YUN SY, HUR YG, KANG MA, LEE J, AHN C, WON J (2003) Synergistic immunosuppressive effects of rosmarinic acid and rapamycin in vitro and in vivo. Transplantation 75(10): 1758-60).
Acido clorogenico (tambien llamado 3-(3,4-dihidroxicinamato) del acido 1,3,4,5-tetrahidroxiciclohexanocarboxflico) es el fen6lico soluble principal en especies solanaceas tales como patata, tomate, y berenjena. Tambien se acumula en niveles sustanciales en manzanas, peras, ciruelas y cafe. SAWA et al. (SAWA T, NAKAO M, AKAIKE T, ONO K, MAEDA H (1999) Alkilperoxyl radical-scavenging activity of various flavonoids and other phenolic compounds: implications for the anti-tumor prompted effect of vegetables. J Agric Food Chem 47: 397-402) observaron que retira especies reactivas particularmente t6xicas eliminando los radicales alquilperoxilo, y puede prevenir la carcinogenesis reduciendo el dano en el ADN que causan.
Ester fenetflico del acido cafeico (CAPE) es uno de los componentes principales del pr6polis de abeja, el material resinoso de color oscuro que es recogido por las abejas en los capullos de plantas vivas mezclado con cera de abejas y secreciones salivares. El CAPE es un potente y especffico inhibidor de la activaci6n de miembros de la familia de factores de transcripci6n NF-KB, y esto puede proporcionar la base molecular para sus multiples actividades inmunomodulatorias y antiinflamatorias (NATARAJAN K, SINGH S, BURKE TR, GRUNBERGER D, AGGARWAL BB (1996) Caffeic acid phenethyl ester is a potent and specific inhibitor of activation of nuclear transcription factor NF-KB. Proc Natl Acad Sci USA 93: 9090-5). Mas recientemente, fue probado el papel del CAPE como potente agente antimetastasico que puede inhibir notablemente la capacidad metastasica e invasiva de las celulas malignas (HWANG HJ, PARK HJ, CHUNG HJ, MIN HY, PARK EJ, HONG JY, LEE SK (2006) Inhibitory effects of caffeic acid phenethyl ester on cancer cell metastasis mediated by the down-regulation of matrix metalloproteinase expression in human HT1080 fibrosarcoma cells. J Nutri Biochem 17: 356-62).
Esculetina (o aesculetina, tambien llamada 6,7-dihidroxicumarina), un miembro de la familia de los fen6licos C6-C3, tiene una estructura de cumarina que se deriva del acido trans-cinamico por orto-hidroxilaci6n (hay que recordar que el acido cafeico es el acido 3,4-dihidroxicinamico), isomerizaci6n trans-cis del doble enlace de la cadena lateral y lactonizaci6n. Mientras que la forma trans es estable y no puede ciclarse, la forma cis es muy inestable y la ciclaci6n es por tanto favorecida. La glucosa es un buen grupo saliente que ayuda en la transformaci6n cis-trans. Una enzima especffica encontrada en Melilotus alba (Leguminosae) hidroliza especfficamente el gluc6sido cis ( -glucosidasa). Algunas de sus propiedades son la inhibici6n de la proliferaci6n celular mediada por Ras y la atenuaci6n de la restenosis vascular despues de angioplastia en ratas (PAN SL, HUANG YW, GUH JH, CHANG YL, PENG CY, TENG CM (2003). Esculetin inhibits Ras-mediated cell proliferation and attenuates vascular restenosis following angioplasty in rats. Biochem Pharmacol 65: 1897-1905) y la inhibici6n de la tirosinasa de champin6n (MASAMOTO Y, ANDO H, MURATA Y, SHOMOISHI Y, TADA M, TAKAHATA K (2003) Mushroom tyrosinase inhibitory activity of esculetin isolated from seeds of Euphorbia lathyris L. Biosci Biotechnol Biochem 67(3): 631-4). Se tiene que mencionar que la esculetina se encuentra frecuentemente como gluc6sido, esculina (esculetin-6--Dglucopiran6sido), con un enlace -glucosfdico en la posici6n 6. Los miembros de fen6licos C6-C2 se encuentran basicamente en el metabolismo de la catecolamina, y las sustancias 3,4-dihidrofenflicas relacionadas podrfan tener propiedades interesantes (EISENHOFER G, KOPIN IJ, GOLDSTEIN DS (2004) catecholamine metabolism: a contemporary view with implications for physiology and medicine. Parmacol Rev 56(3): 331-49).
Taxifolina (o dihidroquercetina, o 3,5,7,3',4'-pentahidroxiflavanona, o (2R,3S) -2-(3,4-dihidroxifenil)-3,5,7-trihidroxicroman-4-ona) aparece en diversas cortezas (Larix sibirica Lebed, Pinus pinaster ssp atlantica) y en las semillas de Silybum marinum (usadas para la preparaci6n del complejo de silimarina y que contiene flavonolignanos de silimarina que son formados biogeneticamente por adici6n oxidativa de alcohol coniferflico a la taxifolina). Tiene un enlace quiral entre el ciclo B y los dos otros ciclos. Relacionada con el grupo de la vitamina PP, posee un amplio espectro de actividades biol6gicas (MIDDLETON E, KANDASWAMI C, THEOHARIDES TC (2000) The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease and cancer. Pharmacol Rev 52(4): 673-752). Muestra acci6n protectora de los capilares, antiinflamatoria y gastroprotectora, disminuye los espasmos de los musculos lisos del intestino, aumenta las funciones del hfgado, y posee actividad protectora anti-radiaci6n. La taxifolina tambien ha mostrado tener aplicaciones potenciales en la reducci6n de la inflamaci6n de la piel (BITO T, ROY S, SEN CK, SHIRAKAWA T, GOTOH A, UEDA M, ICHIHASHI M, PACKER L (2002) Flavonoids differentially regulate IFN-gamma-induced ICAM-1 expression in human keratinocytes: molecular mechanisms of action. FEBS Lett. 520(1-3): 145-52). Sin embargo, la taxifolina es escasamente soluble en disoluci6n acuosa (alrededor de 1 g/l), lo que impide su utilizaci6n para algunas aplicaciones cosmeticas y terapeuticas.
Siendo reconocido que la glicosilaci6n hace a los polifenoles, en celulas vegetales asf como in vitro, mas solubles en agua y menos reactivos hacia los radicales libres, si existen gluc6sidos de estos fen6licos de particular interes, entonces podrfan representar derivados polifen6licos con solubilidad en agua y estabilidad aumentadas, y por tanto con un valor anadido aumentado.
Tambien serfa util obtener derivados de estos fen6licos que puedan ser convertidos durante su uso final en la estructura fen6lica inicial metabolizable. Este objetivo puede ser conseguido por medio de la presente invenci6n.
Compendio de la invenci6n
El alcance de la presente invenci6n esta definido por las reivindicaciones, y cualquier informaci6n que no caiga dentro de las reivindicaciones se proporciona para informaci6n solamente.
La presente invenci6n se refiere a un metodo para producir un O-a-gluc6sido fen6lico que comprende incubar sacarosa y una glucansacarasa de Leuconostoc species, preferiblemente de Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F, preferiblemente en agua tamponada a un pH conveniente para la actividad enzimatica (bien conocido por un experto) o en un agua tamponada a un pH conveniente para la mezcla actividad enzimatica-codisolvente, con un compuesto fen6lico que tiene la siguiente f6rmula:
en la que: R2 es O o OH; y R1 se selecciona del grupo que consiste en
5 -
en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH; y,
-
en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR, y R8 es H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R7 y R8 representa OH; --(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2; --(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o alquilo o alquenilo C1-C6 lineal, ramificado o 15 cfclico, preferiblemente metilo, etilo, propilo, ciclohexilo o fenilo, mas preferiblemente metilo o fenilo; --(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2;
-H; -
20 -
en donde R es H o un grupo hidrocarbonado C1-C10 lineal, ramificado o cfclico, aromatico o no, saturado o insaturado, opcionalmente interrumpido por al menos un heteroatomo, en donde dicho grupo hidrocarbonado comprende un alquilo, un alquenilo o un alquinilo, preferiblemente un alquilo o un alquenilo, que puede estar sustituido por uno o varios sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: un arilo (C5-C9), un heterociclo (C4-C9), un alcoxi (C1-C3), un acilo (C2-C3), un alcohol (C1-C3), un grupo carboxflico (-COOH), un ester (C2-C3), una amina (C1-C3), un grupo amino (-NH2), una amida (-CONH2), una imina (C1-C3), un nitrilo, un hidroxilo (-OH), un grupo aldehfdo (-CHO), un hal6geno, un halogenoalquilo (C1-C3), un tiol (-SH), un tioalquilo (C1-C3), una sulfona (C1-C3), un sulf6xido (C1-C3), y una combinaci6n de los mismos.
Preferiblemente, el agua tamponada a un pH conveniente para la actividad enzimatica usada bien sin codisolvente o bien en una mezcla con un codisolvente consiste en tamp6n acetato de sodio o potasio a una concentraci6n que oscila de 20 a 500 mM en agua, pero se puede usar cualquier otra sustancia amortiguadora sin ningun efecto negativo sobre la actividad enzimatica. Preferiblemente, el agua tamponada a un pH conveniente para la mezcla actividad enzimatica-codisolvente consiste en una mezcla de agua, preferiblemente un agua tamponada como se describi6 anteriormente, y dimetilsulf6xido (DMSO) con una relaci6n menor que 35% de DMSO (volumen/volumen), preferiblemente entre 15-25%, mas preferiblemente aproximadamente 15%.
En una primera realizaci6n, R1 del compuesto fen6lico es
en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH. En particular, el compuesto fen6lico se puede seleccionar del grupo que consiste en la taxifolina, el eriodictiol, la dihidrorobinetina y la fustina.
En una segunda realizaci6n, R1 del compuesto fen6lico es
en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR, y R8 es H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R7 y R8 representa OH. En particular, el compuesto fen6lico se puede seleccionar del grupo que consiste en la catequina, la epicatequina, el galato de catequina, el galato de epicatequina, la galocatequina, la epigalocatequina, el galato de galocatequina y el galato de epigalocatequina.
En una tercera realizaci6n, R1 del compuesto fen6lico es -(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2. En particular, el compuesto fen6lico se puede seleccionar del grupo que consiste en el acido homoprotocatecuico, el acido dihidrocafeico, el ester etflico del acido protocatecuico, el galato de propilo, el acido galico, la hamamelitanina (2',5-di-O-galoil-hamamelosa) y el acido protocatecuico.
En una cuarta realizaci6n, R1 del compuesto fen6lico es -(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H
o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal o cfclico, preferiblemente metilo, etilo, propilo, ciclohexilo o fenilo. En particular, el compuesto fen6lico se puede seleccionar del grupo que consiste en el acido cafeico, el acido rosmarfnico, la esculetina, la 4-metilesculetina, la nordalbergina (6,7-dihidroxifenilcumarina), el acido clorogenico, el ester fenetflico del acido cafeico, el acido chic6rico (acido dicafeoiltartarico), el equinac6sido (O-6-desoxi-alfa-L-manopiranosil(1-3)-O-(beta-D-glucopiranosil-(1-6))-, 4-(3-(3,4-dihidroxifenil)-2-propenoato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo), beta-D
5 glucopiran6sido) y el verbasc6sido.
En una quinta realizaci6n, R1 del compuesto fen6lico es -(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2. En particular, el compuesto fen6lico se puede seleccionar del grupo que consiste en la maclurina, el 3,4dihidroxibenzaldehfdo, la 3,4-dihidroxibenzofenona, la butefna (2',3,4,4'-tetrahidroxichalcona), la 3,4-dihidroxiaceto fenona, la marefna (2',3,3',4,4'-pentahidroxi-4'-glucosilchalcona) y la eriodictiolchalcona (2',4',6',3,4
10 pentahidroxichalcona).
En una sexta realizaci6n, R1 del compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en
En particular, el compuesto fen6lico se puede seleccionar del grupo que consiste en el pirocatecol, el acido 15 nordihidroguaiaretico, y la oleuropefna, respectivamente.
La presente invenci6n tambien se refiere a los O-a-gluc6sidos fen6licos obtenibles por el metodo de la invenci6n. Por consiguiente, la presente invenci6n se refiere a un O-a-gluc6sido fen6lico que tiene la siguiente f6rmula:
en la que
20 A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo; R2 es H o OH; y, R1 se selecciona del grupo que consiste en
-
en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa
OH; y,
-
en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR, y R8 es H o OH, a condici6n de que, 5 cuando R2 es H, R7 y R8 no son ambos OH, y al menos uno entre R7 y R8 es OH; --(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2; --(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal, ramificado o cfclico, preferiblemente metilo, etilo, propilo, ciclohexilo o fenilo, mas preferiblemente metilo o fenilo; --(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2; 10 -H; -
-
15 en donde R es H o un grupo hidrocarbonado C1-C10 lineal, ramificado o cfclico, aromatico o no, saturado o insaturado, opcionalmente interrumpido por al menos un heteroatomo, en donde dicho grupo hidrocarbonado comprende un alquilo, un alquenilo o un alquinilo, preferiblemente un alquilo o un alquenilo, que puede estar sustituido por uno o varios sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: un arilo (C5-C9), un heterociclo (C4-C9), un alcoxi (C1-C3), un acilo (C2-C3), un alcohol (C1-C3), un grupo carboxflico (-COOH), un ester (C2-C3), una
20 amina (C1-C3), un grupo amino (-NH2), una amida (-CONH2), una imina (C1-C3), un nitrilo, un hidroxilo (-OH), un grupo aldehfdo (-CHO), un hal6geno, un halogenoalquilo (C1-C3), un tiol (-SH), un tioalquilo (C1-C3), una sulfona (C1-C3), un sulf6xido (C1-C3), y una combinaci6n de los mismos.
Un primer O-a-gluc6sido fen6lico preferido de la f6rmula (II) tiene R1 que es y preferiblemente el O-a-gluc6sido fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de taxifolina, el O-a-gluc6sido de eriodictiol, el O-a-gluc6sido de dihidrorobinetina y el O-a-gluc6sido de fustina.
Un segundo O-a-gluc6sido fen6lico preferido de la f6rmula (II) tiene R1 que es
y preferiblemente el O-a-gluc6sido fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de galato de catequina, el O-a-gluc6sido de galato de epicatequina, el O-a-gluc6sido de galocatequina, el O-a-gluc6sido de epigalocatequina, el O-a-gluc6sido de galato de galocatequina y el O-a-gluc6sido de galato de epigalocatequina.
Un tercer O-a-gluc6sido fen6lico preferido de la f6rmula (II) tiene R1 que es -(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR,
10 siendo n un numero entero de 0 a 2, y preferiblemente el O-a-gluc6sido fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de acido homoprotocatecuico, el O-a-gluc6sido de acido dihidrocafeico, el O-agluc6sido del ester etflico del acido protocatecuico, el O-a-gluc6sido de galato de propilo, el O-a-gluc6sido de acido galico, el O-a-gluc6sido de hamamelitanina y el O-a-gluc6sido de acido protocatecuico.
Un cuarto O-a-gluc6sido fen6lico preferido de la f6rmula (II) tiene R1 que es -(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)15 CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal o cfclico, preferiblemente metilo, etilo, propilo, ciclohexilo
o fenilo, y preferiblemente el O-a-gluc6sido del compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el O-agluc6sido de acido cafeico, el O-a-gluc6sido de acido rosmarfnico, el O-a-gluc6sido de esculetina, el O-a-gluc6sido de 4-metilesculetina, el O-a-gluc6sido de nordalbergina (6,7-dihidroxifenilcumarina), el O -a-gluc6sido de acido clorogenico, el O-a-gluc6sido del ester fenetflico del acido cafeico, el O-a-gluc6sido de acido chic6rico (acido
20 dicafeoiltartarico), el O-a-gluc6sido de equinac6sido (2-(3,4-dihidroxifenil)etil O-6-desoxi-alfa-L-manopiranosil-(1-3)O-(beta-D-glucopiranosil-(1-6))-, 4-(3-(3,4-dihidroxifenil)-2-propenoato), el O-a-gluc6sido de beta-D-glucopiran6sido y el O-a-gluc6sido de verbasc6sido.
Un quinto O-a-gluc6sido fen6lico preferido de la f6rmula (II) tiene R1 que es -(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2, y preferiblemente el O-a-gluc6sido del compuesto fen6lico se selecciona del grupo que
25 consiste en el O-a-gluc6sido de maclurina, el O-a-gluc6sido de 3,4-dihidroxibenzaldehfdo, el O-a-gluc6sido de 3,4dihidroxibenzofenona, el O-a-gluc6sido de buteina (2',3,4,4'-tetrahidroxichalcona), el O-a-gluc6sido de 3,4dihidroxiacetofenona, el O-a-gluc6sido de marefna (2',3,3',4,4'-pentahidroxi-4'-glucosilchalcona) y el O-a-gluc6sido de eriodictiolchalcona (2',4',6',3,4-pentahidroxichalcona).
Un sexto O-a-gluc6sido fen6lico preferido de la f6rmula (II) tiene R1 que se selecciona del grupo que consiste en
El O-a-gluc6sido fen6lico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de pirocatecol, el O-a-gluc6sido de acido nordihidroguaiaretico, y el O-a-gluc6sido de oleuropefna.
En una realizaci6n preferida, el O-a-gluc6sido fen6lico de la presente invenci6n tiene un residuo a-glucosilo que es un mon6mero de glucosa.
Preferiblemente, los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente invenci6n tienen una solubilidad 20 veces mas alta que la correspondiente aglicona en las mismas condiciones fisiol6gicas.
Los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente invenci6n pueden ser escindidos por una enzima para liberar la correspondiente aglicona.
La presente invenci6n se refiere ademas a O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente invenci6n como medicamentos.
La presente invenci6n se refiere tambien a una composici6n farmaceutica o cosmetica que comprende un O-agluc6sido fen6lico de la presente invenci6n.
La presente invenci6n se refiere tambien al uso de un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente invenci6n para preparar una composici6n farmaceutica o cosmetica para ser administrada por vfa t6pica, oral, rectal, nasal o vaginal, en donde enzimas emitidas por microorganismos asociados a la piel, boca, tracto intestinal, sistema respiratorio superior o tracto genital femenino liberan la correspondiente aglicona.
La presente invenci6n se refiere tambien al uso de un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente invenci6n para preparar una composici6n farmaceutica o cosmetica para tratar o prevenir un cancer, una enfermedad cardiovascular, una infecci6n bacteriana, un eritema inducido por UVB, una alergia, un trastorno inflamatorio o inmunitario.
Breve descripci6n de los dibujos Figura 1 -Flavonoides: estructura basica y numeraci6n de atomos de carbono. Figura 2 -Acido protocatecuico. Figura 3 -Acido cafeico (acido 3,4-dihidroxicinamico). Figura 4 - Acido 3,4-dihidroximandelico. Figura 5 - Esculetina (6,7-dihdroxicumarina). Figura 6 -Taxifolina. Figura 7 -Gluc6sido de derivados de acido cafeico. Figura 8 -Gluc6sido de acido 3,4-dihidroxibenzoico y otros acidos fen6licos. Figura 9 -Gluc6sido de flavanol. Figura 10 -Gluc6sido de flavonol, isoflavona, flavona y dihidroflavonol. Figura 11 -Gluc6sido de polifenol neutro. Figura 12 -Cromatograma de HPLC del medio de reacci6n que contiene taxifolina como aceptor de gluc6sido (289
nm). Duraci6n de la incubaci6n: 0.
Figura 13 -Cromatograma de HPLC del medio de reacci6n que contiene taxifolina como aceptor de gluc6sido (289 nm). Duraci6n de la incubaci6n: 22 horas. Figura 14 -Espectro de masas de la sustancia eluida a alrededor de 8,13 minutos. Duraci6n de la incubaci6n: 22
horas. Figura 15 - Espectro de UV de la sustancia eluida a alrededor de 8,13 minutos. Duraci6n de la incubaci6n: 22 horas. Figura 16 -Espectro de masas de la sustancia eluida a alrededor de 6,15 minutos. Duraci6n de la incubaci6n: 22
horas. Figura 17 - Espectro de UV de la sustancia eluida a alrededor de 6,15 minutos. Duraci6n de la incubaci6n: 22 horas. Figura 18 -Cromatograma de HPLC de una disoluci6n acuosa de taxifolina y gluc6sido de taxifolina (289 nm).
(eluci6n con una concentraci6n inicial de metanol de 10% -metodo 1). Figura 19 -Cromatograma de HPLC de una preparaci6n de gluc6sido de taxifolina altamente purificada (289 nm; metodo 2).
Figura 20 -Crecimiento microbiano en presencia o ausencia de gluc6sido de taxifolina (micro-flora de la piel humana).
Figura 21 - Evoluci6n de las concentraciones de gluc6sido de taxifolina y taxifolina en presencia de microflora de piel humana.
Las estructuras mostradas en las figuras 7-11 se dan como ilustraciones. Otros is6meros de gluc6sido estan tambien contemplados en la presente invenci6n.
Descripci6n detallada de la invenci6n
Definiciones
Compuesto fen6lico o fen6licos: compuesto que posee un anillo aromatico que lleva uno o mas sustituyentes hidroxilo.
Flavonoides: compuestos polifen6licos que poseen 15 atomos de carbono, dos anillos de benceno unidos por una cadena de tres carbonos lineal que da un sistema C6-C3-C6. El primer anillo de benceno (anillo A) forma con un atomo de oxfgeno y los tres atomos de carbono que unen los dos anillos de benceno una cadena principal de cromano (anillos A y C). La cadena principal de cromano lleva el segundo anillo aromatico B en la posici6n 2, 3 o 4. En algunos casos, el anillo C heterocfclico de seis miembros aparece en una forma abierta isomerica o esta reemplazado por un anillo de cinco miembros. Tanto el estado de oxidaci6n del anillo C heterocfclico como la posici6n del anillo B son importantes en la clasificaci6n de los flavonoides:
-
antocianinas: el anillo C es un pirano que participa en una cadena principal de 3-hidroxicromeno sustituida en 2,
-
sustancias catequicas (flavanoles): el anillo C es un tetrahidropirano hidrogenado que participa en una cadena principal de 3-hidroxi-o 3,4-dihidroxicromano sustituida en 2 (catequina, epicatequina, galocatequina y epigalocatequina, que forman los taninos condensables),
-
flavonas: el anillo C es una pirona sustituida en 2,
-
flavonoles: el anillo C es una pirona hidroxilada en 3 y sustituida en 2,
-
flavanonas: el anillo C es una dihidropirona sustituida en 2,
-
dihidroflavonoles: el anillo C es una dihidropirona hidroxilada en 3 y sustituida en 2,
-
isoflavonas: flavonas con la sustituci6n en 3 en lugar de 2,
-
chalconas y dihidrochalconas: el anillo C esta abierto y con un doble enlace C2C3 (chalconas) o no (dihidrochalconas),
-
auronas: el anillo C es un anillo de cinco miembros.
Enzima: molecula de protefna que cataliza reacciones qufmicas sobre moleculas (llamadas sustratos) para obtener otras moleculas (llamadas productos). Se asigna a cada enzima un nombre recomendado, un nombre sistematico que remarca el tipo de reacci6n y un numero de c6digo de la Comisi6n de Enzimas (EC). Estos numeros de c6digo, con prefijo EC, contienen cuatro elementos separados por puntos. El primer numero muestra a cual de las seis divisiones principales (clases) pertenece la enzima: oxidorreductasas (EC 1), transferasas (EC 2), hidrolasas (EC 3), liasas (EC 4), isomerasas (EC 5) y ligasas (EC 6). El segundo numero indica la subclase, el tercero la sub-subclase y el cuarto es el numero de serie de la enzima en su sub-subclase.
Biodisponibilidad: el grado al que, o velocidad a la que, una molecula u otra sustancia es absorbida o llega a estar disponible en el sitio de actividad fisiol6gica despues de su administraci6n o aplicaci6n.
Glucansacarasas: nombre comun de las glucosiltransferasas con el numero EC 2.4.1.5 (vease en lo sucesivo; KRALJ S, VAN GEEL-SCHUTTEN GH, DONDORFF MMG, KIRSANOVS S, VAN DER MAAREL MJEC, DIJKHUIZEN L (2004) Glucan synthesis in the genus Lactobacillus: isolation and characterization of glucansucrase genes, enzymes and glucan products from six different strains. Microbiology 150: 3681-90).
Glicosiltransferasa: enzima que cataliza la transferencia de grupo(s) glicosilo de un compuesto (llamado donador) a otro (llamado aceptor). Las glicosiltransferasas se clasifican como transferasas, con el numero EC 2.4. Las transferasas que transfieren hexosas (moleculas de carbohidratos que tienen seis atomos de carbono por molecula) estan incluidas en la sub-subclase EC 2.4.1. Las transferasas que transfieren el resto glucosa de la sacarosa a un aceptor son EC 2.4.1.4 (sacarosa: 1,4-a-D-glucan 4-a-D-glucosiltransferasa; nombre recomendado: amilosacarosa). EC 2.4.1.5 (sacarosa: 1,6-a-D-glucan 6-a-D-glucosiltransferasa; nombre recomendado: dextransacarosa), EC 2.4.1.7 (sacarosa: ortofosfato a-D-glucosiltransferasa; nombre recomendado: sacarosa fosforilasa).
Glicona: parte qufmica de un derivado glicosfdico que pertenece a la familia de los carbohidratos. Si el grupo
glicona es glucosa, entonces la molecula es un glic6sido; si es fructosa, entonces la molecula es un fruct6sido; si es acido glucur6nico, entonces la molecula es un glucur6nido.
Enlace glicosidico: enlace qufmico entre una glicona y otra glicona o una aglicona. Dependiendo de si el enlace glicosfdico esta "por debajo" o "por encima" del plano de la molecula de carbohidrato cfclica cuando se considera la proyecci6n de HAWORTH, los glic6sidos se clasifican como a-glic6sidos y -glic6sidos.
Aglicona: parte qufmica de un derivado glicosfdico que no es la glicona.
Donde se usa "que comprende", esto puede ser reemplazado preferiblemente por "que consiste esencialmente en", mas preferiblemente "que consiste en".
En el contexto de la presente invenci6n, el termino "alquilo" significa mas especfficamente un grupo tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo, eicosilo, heneicosilo, docosilo y las otras formas isomericas de los mismos. Alquilo (C1-C6) significa mas especfficamente metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo y las otras formas isomericas de los mismos. Alquilo (C1-C3) significa mas especfficamente metilo, etilo, propilo o isopropilo.
El termino "alquenilo" se refiere a un grupo alquilo definido anteriormente que tiene al menos un enlace de etileno insaturado, y el termino "alquinilo" se refiere a un grupo alquilo definido anteriormente que tiene al menos un enlace de acetileno insaturado. Alquenilo (C2-C3) incluye un etenilo, un propenilo (1-propenilo o 2-propenilo).
Los grupos "arilo" son hidrocarburos aromaticos mono-, bi-o tricfclicos que tienen de 5 a 9 atomos de carbono. Los ejemplos incluyen un fenilo, en particular.
Los grupos "heterociclo" son grupos que contienen 1 a 3 anillos que comprenden uno o mas heteroatomos, preferiblemente 1 a 5 heteroatomos endocfclicos. Pueden ser mono-, bi-o tricfclicos. Pueden ser aromaticos o no. Los ejemplos de heterociclos aromaticos incluyen grupos piridina, piridazina, pirimidina, pirazina, furano, tiofeno, pirrol, oxazol, tiazol, isotiazol, imidazol, pirazol, oxadiazol, triazol, tiadiazol y triazina. Los ejemplos de biciclos incluyen en particular grupos quinolina, isoquinolina y quinazolina (para dos anillos de 6 miembros) e indol, bencimidazol, benzoxazol, benzotiazol e indazol (para un anillo de 6 miembros y un anillo de 5 miembros). Los heterociclos no aromaticos comprenden en particular piperazina, piperidina, etc.
Alcoxi (C1-C3) incluye metoxi, etoxi, propoxi e isopropoxi.
Acilo (C2-C3) incluye acetilo, propilacilo e isopropilacilo.
Alcohol (C1-C3) incluye metanol, etanol, propanol e isopropanol.
Ester (C2-C3) incluye ester metflico y ester etflico.
Amina (C1-C3) incluye metilamina, etilamina y propilamina.
Imina (C1-C3) incluye metilimina, etilimina y propilimina.
El hal6geno puede ser Cl, Br, I o F.
Halogenoalquilo (C1-C3) incluye halogenometilo, halogenoetilo y halogenopropilo.
Tioalquilo (C1-C3) incluye tiometilo, tioetilo y tiopropilo.
Sulfona (C1-C3) incluye metilsulfona, etilsulfona y propilsulfona.
Sulf6xido (C1-C3) incluye metilsulf6xido, etilsulf6xido, propilsulf6xido e isopropilsulf6xido.
"Heteroatomo" denota N, S o O.
Esta descripci6n tambien se refiere a un procedimiento para preparar O-a-gluc6sidos de compuestos fen6licos que contienen una estructura de catecol y seleccionados por ejemplo entre acido protocatecuico y sus derivados esteres, acido cafeico y sus derivados esteres, especialmente acido rosmarfnico, acido clorogenico y ester fenetflico de acido cafeico, y acido hidrocafeico o acido 3,4-dihidroxihidrocinamico, 3,4-dihidroxifenilglicol, esculetina, taxifolina, fustina, eriodictiol, fisetina y ramnetina. En particular, los compuestos fen6licos que contienen una estructura de catecol se pueden seleccionar del grupo que consiste en el galato de epicatequina, el eriodictiol, la esculetina, la epicatequina, la fisetina, la fustina, el acido homoprotocatecuico, el acido protocatecuico, el ester etflico del acido protocatecuico, el hidroxitirosol, la maclurina, el acido nordihidroguaiaretico, la oleuropefna, el pirocatecol, la ramnetina, el acido rosmarfnico, la taxifolina, la 3-hidroxidaidzefna, la 3,4-dihidroxibenzofenona, el acido cafeico, el acido dihidrocafeico, el ester fenetflico de acido cafeico, la catequina, el cirsiliol, el acido clorogenico, la gosipetina, la orientina, la homoorientina, el 3,4-dihidroxibenzaldehfdo, la butefna, la 3,4-dihidroxiacetofenona, la marefna, la maritimefna, la eriodictiolchalcona, la 4-metilesculetina, la nordalbergina, el salsolinol, el acido chic6rico, el equinac6sido, el verbasc6sido, la antrarobina, la epigalocatequina, la dihidrorobinetina, la galocatequina, el acido galico, el galato de propilo, el galato de epigalocatequina, la hamamelitanina y la robinetina. El procedimiento para preparar O-agluc6sidos de compuestos fen6licos que contienen una estructura de catecol tambien se puede realizar con cirsiliol, 3',4',7-trihidroxiflavona y 3'-hidroxidaidzefna (flavonas e isoflavona).
5 Para este fin, se consigue una reacci6n enzimatica usando sacarosa, una sustancia abundante y bastante barata usada en los campos de los alimentos y alimentaci6n. Esta reacci6n consiste en la transferencia de la parte de glucosa de la sacarosa a un grupo hidroxilo del anillo de catecol mediante una glicosiltransferasa (EC 2.4.1) o, una vez que un primer residuo glucosilo ha sido unido a un grupo hidroxilo del anillo de catecol, la transferencia de la parte de glucosa de la sacarosa a un grupo hidroxilo de la glucosa fijada, dependiendo la posici6n de este grupo
10 hidroxilo de la especificidad de la enzima. Como cada compuesto fen6lico citado anteriormente lleva dos grupos hidroxilo en dicho anillo, se pueden obtener dos derivados mediante esta reacci6n enzimatica. Cuando una poblaci6n de derivados glic6sido resulta de la reacci6n de sfntesis (por poblaci6n, se entienden los compuestos para los cuales el anillo de catecol tiene uno de sus grupos hidroxilo sustituido o ambos de sus grupos hidroxilo sustituidos por un residuo glucosilo o un oligosacarido), a la poblaci6n entera se le llama producto.
15 La presente descripci6n se refiere a un metodo para producir un O-a-gluc6sido fen6lico que comprende incubar sacarosa y una glucansacarasa de Leuconostoc species, preferiblemente de Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F, en agua tamponada a un pH conveniente para la actividad enzimatica (bien conocido por un experto) o en un agua tamponada a un pH conveniente para la mezcla actividad enzimatica-codisolvente, con un compuesto fen6lico que tiene la siguiente f6rmula:
en la que: R2 es O o OH; y R1 se selecciona del grupo que consiste en
-
en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH; y,
-
30 en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR, y R8 es H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R7 y R8 representa OH;
-
en donde R5 es OH o OCH3; R6 es H o OH, R9 es H o OH, R10 es H, OCH3 o C6H11O5, y R11 es H, OH o C6H11O5, a condici6n de que R10 y R11 no pueden ser ambos H cuando R5 y R6 son ambos OH y que cuando R10 es C6H11O5 entonces R11 es H.
5 --(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2; --(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal, ramificado o
cfclico, preferiblemente metilo, etilo, propilo, ciclohexilo o fenilo, mas preferiblemente metilo o fenilo; --(CH2)n-OR o (CH2)n-NHR, siendo n un numero entero de 0 a 2; --(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2;
10 -H; -
-
15 -
-
-
un grupo hidrocarbonado C1-C10 que forma con el anillo representado de la f6rmula (I) un anillo aromatico condensado (bi-o tricfclico) junto con el carbono orto de R1;
en donde R es H o un grupo hidrocarbonado C1-C10 lineal, ramificado o cfclico, aromatico o no, saturado o
5 insaturado, opcionalmente interrumpido por al menos un heteroatomo, en donde dicho grupo hidrocarbonado comprende un alquilo, un alquenilo o un alquinilo, preferiblemente un alquilo o un alquenilo, que puede estar sustituido por uno o varios sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: un arilo (C5-C9), un heterociclo (C4-C9), un alcoxi (C1-C3), un acilo (C2-C3), un alcohol (C1-C3), un grupo carboxflico (-COOH), un ester (C2-C3), una amina (C1-C3), un grupo amino (-NH2), una amida (-CONH2), una imina (C1-C3), un nitrilo, un hidroxilo (-OH), un
10 grupo aldehfdo (-CHO), un hal6geno, un halogenoalquilo (C1-C3), un tiol (-SH), un tioalquilo (C1-C3), una sulfona (C1-C3), un sulf6xido (C1-C3), y una combinaci6n de los mismos.
En un primer aspecto de la descripci6n, R2 es H. En este aspecto, el compuesto fen6lico puede ser por ejemplo el galato de epicatequina, el eriodictiol, la esculetina, la epicatequina, la fisetina, la fustina, el acido homoprotocatecuico, el acido protocatecuico, el ester etflico del acido protocatecuico, el hidroxitirosol, la maclurina,
15 el acido nordihidroguaiaretico, la oleuropefna, el pirocatecol, la ramnetina, el acido rosmarfnico, la taxifolina, la 3hidroxidaidzefna, la 3,4-dihidroxibenzofenona, el acido cafeico, el acido dihidrocafeico, el ester fenetflico del acido cafeico, la catequina, el cirsiliol, el acido clorogenico, la gosipetina, la orientina, la homoorientina, el 3,4dihidroxibenzaldehfdo, la butefna, la 3,4-dihidroxiacetofenona, la marefna, la maritimefna, la eridictiolchalcona, la 4metilesculetina, la nordalbergina, el salsolinol, el acido chic6rico, el equinac6sido, el verbasc6sido y la antrarobina.
20 En un aspecto alternativo de la descripci6n, R2 es OH. En este aspecto, el compuesto fen6lico puede ser por ejemplo la epigalocatequina, la dihidrorobinetina, la galocatequina, el acido galico, el galato de propilo, el galato de epigalocatequina, la hamamelitanina y la robinetina.
En un aspecto particular del metodo acorde con la presente descripci6n, el compuesto fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que
R2 es H o OH; y
R1 es en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH.
En un aspecto preferido de la descripci6n, R3 y R4 son OH. En otro aspecto preferido R3 es H y R4 es OH. En un aspecto preferido mas, R3 es OH y R4 es H. En un aspecto particularmente preferido, R2 es H y R3/R4 se seleccionan en las siguientes combinaciones: OH/OH; H/OH; OH/H. En otro aspecto preferido, R2 es OH y R3/R4 se seleccionan en las siguientes combinaciones: OH/OH; H/OH; OH/H. Preferiblemente, el compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en la taxifolina, el eriodictiol, la dihidrorobinetina y la fustina.
En otro aspecto particular del metodo acorde con la presente descripci6n, el compuesto fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que R2 es H o OH; y R1 es
15 en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR y R8 es H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R7 y R8 representa OH. En un aspecto preferido, R8 es OH y R7 es OH o OCOR. En un aspecto mas preferido, R7 y R8 son ambos OH. En otro aspecto preferido, R7 es -OCOR y R8 es OH. En un aspecto preferido particular, R2 es H y R3/R4 se seleccionan en las siguientes combinaciones: H/OH, OH/H, OH/OH y OCOR/OH. En otro aspecto preferido particular, R2 es OH y R3/R4 se seleccionan en las siguientes combinaciones:
20 H/OH, OH/H, OH/OH y OCOR/OH. Mas preferiblemente, R es
Preferiblemente, el compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en la catequina, la epicatequina, el galato de catequina, el galato de epicatequina, la galocatequina, la epigalocatequina, el galato de galocatequina y el galato de epigalocatequina.
25 En un aspecto particular adicional del metodo acorde con la presente descripci6n, el compuesto fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que R2 es H o OH; y R1 es
en donde R5 es OH o OCH3; R6 es H o OH, R9 es H o OH, R10 es H, OCH3 o C6H11O5, y R11 es H, OH o C6H11O5,5 a condici6n de que R10 y R11 no pueden ser ambos H cuando R5 y R6 son ambos OH, y que cuando R10 es C6H11O5 entonces R11 es H. En particular, R6, R5 y R11 se pueden seleccionar de las siguientes combinaciones: a) R6 es OH y R5 es OCH3yR11 es H; b) R6 es OH y R5 es OH y R11 es OH; c) R6 es OH y R5 es OH y R11 es C6H11O5; y 10 d) R6 es H y R5 es OH yR11 es H; y R9 es H o OH, y R10 es H o OCH3 o C6H11O5,
con la condici6n de que cuando R10 es C6H11O5, R11 es H. En un aspecto preferido de la descripci6n, R9 es OH, R10 es H y R11 es H, mientras que R6 es OH y R5 es OCH3, o R6 es H y R5 es O. Preferiblemente, R2 es H. Alternativamente, R2 es OH.
15 En otro aspecto preferido de la descripci6n, R9 es H y R10 es OCH3 o C6H11O5. En un aspecto particular de este
aspecto, R9 y R11 son H, R10 y R5 son OCH3, y R6 es OH. En un aspecto preferido adicional de la descripci6n, R5 y R6 son ambos OH, R9 es H o OH, R10 es OH o C6H11O5 y R11 es H, OH o C6H11O5, a condici6n de que cuando R10 es C6H11O5 entonces R11 es H. En otro aspecto preferido, R5 y R6 son ambos OH, R9 es H o OH, R10 es H, y R11 es OH o C6H11O5.
20 En otro aspecto preferido de la descripci6n, R9 es H y R10 es H. En un aspecto preferido adicional, R9 es H, R10 y
R5 son OCH3, y R6 es OH. En un aspecto particular de la descripci6n, R2, R5, R6, R9, R10 y R11 se pueden seleccionar de las combinaciones mencionadas a continuaci6n.
R2
R5 R6 R9 R10 R11
H
OCH3 OH
H
H
H
H
OCH3 OH H OCH3 H
H
OCH3 OH H C6H11O5 H
H
OCH3 OH OH
H
H
H
OCH3 OH OH OCH3 H
H
OCH3 OH OH C6H11O5 H
H
OH OH H H OH
H
OH OH H OCH3 OH
H
OH OH H C6H11O5 H
H
OH OH OH H OH
H
OH OH OH OCH3 OH
H
OH OH OH C6H11O5 H
H
OH OH H H C6H11O5
H
OH OH H OCH3 C6H11O5
H
OH OH H C6H11O5 H
H
OH OH OH H C6H11O5
H
OH OH OH OCH3 C6H11O5
H
OH OH OH C6H11O5 H
H
OH
H
H
H
H
H
OH H H OCH3 H
H
OH H H C6H11O5 H
H
OH H OH
H
H
H
OH H OH OCH3 H
H
OH H OH C6H11O5 H
OH
OCH3 OH H H H
OH
OCH3 OH H OCH3 H
OH
OCH3 OH H C6H11O5 H
OH
OCH3 OH OH H H
OH
OCH3 OH OH OCH3 H
OH
OCH3 OH OH C6H11O5 H
OH
OH
OH
H H
OH
OH
OH
OH
H OCH3
OH
OH
OH
OH
H C6H11O5 H
OH
OH
OH
OH
H
OH
OH
OH
OH
OH
OCH3
OH
OH
OH
OH
OH
C6H11O5 H
OH
OH
OH
H H C6H11O5
OH
OH
OH
H OCH3 C6H11O5
OH
OH
OH
H C6H11O5 H
OH
OH
OH
OH
H C6H11O5
OH
OH
OH
OH
OCH3 C6H11O5
OH
OH
OH
OH
C6H11O5 H
OH
OH
H H H H
OH
OH
H H OCH3 H
OH
OH
H H C6H11O5 H
OH
OH
H OH H H
OH
OH
H OH OCH3 H
OH
OH
H OH C6H11O5 H
Preferiblemente, el compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en la ramnetina, la fisetina, la robinetina, la gosipetina, la orientina, la homoorientina y el cirsiliol.
En un aspecto particular adicional del metodo acorde con la presente descripci6n, el compuesto fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que
R2 es H o OH; y R1 es -(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2. En un aspecto preferido, R2 es H. Alternativamente, R2 es OH. Preferiblemente, R se selecciona del grupo que consiste en H, un 10 alquilo C1-C3, preferiblemente metilo, etilo o propilo, y
En un primer aspecto mas preferido de la descripci6n, n es 0 y R es preferiblemente H. En un segundo aspecto mas preferido n es 1 y R es preferiblemente H. En un tercer aspecto mas preferido, n es 2 y R es preferiblemente H. En otro aspecto preferido, n es 0 y R es un alquilo C1-C3, preferiblermente metilo, etilo o propilo; o
En un aspecto preferido de la descripci6n, R1 es -(CH2)n-COOR. En un aspecto preferido, R es H.
Preferiblemente, el compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el acido homoprotocatecuico, el acido dihidrocafeico, el ester etflico del acido protocatecuico, el galato de propilo, el acido galico, la hamamelitanina (2',5-di-O-galoil-hamamelosa) y el acido protocatecuico.
20 En un aspecto particular adicional del metodo acorde con la presente descripci6n, el compuesto fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que
R2 es H o OH; y R1 es -(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal o cfclico, preferiblemente metilo, etilo, propilo, ciclohexilo o fenilo, mas preferiblemente metilo o fenilo. Preferiblemente R1 es -(CH=CH)-COOR o -(CH=CH)-CONHR. En un aspecto preferido, R2 es H. Alternativamente, R2 es OH. En un aspecto preferido, R1 es -(CH=CH)-COOR. En un aspecto preferido, R se selecciona del grupo que consiste en H;
y un enlace unido al grupo fenilo de la f6rmula (I) en el carbono en orto de R1.
Cuando R es un enlace unido al grupo fenilo de la f6rmula (I) en el carbono en orto de R1, R12 se puede seleccionar en particular del grupo que consiste en H; metilo y fenilo. Entonces, el compuesto fen6lico puede tener la siguiente f6rmula:
Siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal o cfclico, preferiblemente metilo, etilo, propilo, ciclohexilo o fenilo, mas preferiblemente metilo o fenilo.
Preferiblemente, el compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el acido cafeico, el acido
10 rosmarfnico, la esculetina, la 4-metilesculetina, la nordalbergina (6,7-dihidroxifenilcumarina), el acido clorogenico, el ester fenetflico del acido cafeico, el acido chic6rico (acido dicafeoiltartarico), el equinac6sido (O-6-desoxi-alfa-Lmanopiranosil-(1-3)-O-(beta-D-glucopiranosil-(1-6))-, 4-(3-(3,4-dihidroxifenil)-2-propenoato de 2-(3,4-dihidroxifenil) etilo), beta-D-glucopiran6sido) y el verbasc6sido.
En un aspecto particular adicional del metodo acorde con la presente descripci6n, el compuesto fen6lico tiene la 15 siguiente f6rmula:
en la que
R2 es H o OH; y R1 es -(CH2)n-OR, siendo n un numero entero de 0 a 2. En un aspecto preferido n es 2. Preferiblemente, el compuesto fen6lico es el hidroxitirosol.
20 En un aspecto particular adicional del metodo acorde con la presente descripci6n, el compuesto fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que R2 es H o OH; y R1 es -(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2. 25 En un aspecto preferido de la descripci6n, n es 0 o 1 y R se selecciona del grupo que consiste en H; un alquilo C1-C3, preferiblemente metilo, etilo o propilo,, mas preferiblemente un metilo;
Preferiblemente, n es 0. Alternativamente, n es 1.
Preferiblemente, el compuesto fen6lico se selecciona de la maclurina, el 3,4-dihidroxibenzaldehfdo, la 3,4dihidroxibenzofenona, la butefna (2',3,4,4'-tetrahidroxichalcona), la 3,4-dihidroxiacetofenona, la marefna (2',3,3',4,4'pentahidroxi-4'-glucosilchalcona), y la eriodictiolchalcona (2',4',6',3,4-pentahidroxichalcona).
En un aspecto particular adicional del metodo acorde con la presente descripci6n, el compuesto fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que 10 R2 es H o OH; y R1 se selecciona del grupo que consiste en
Preferiblemente, el compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el pirocatecol, el acido nordihidroguaiaretico, la 3-hidroxidaidzefna, la oleuropefna, y la maritimefna (3',4',6,7-tetrahidroxi-6-Oglucosilaurona).
En este aspecto, R1 del compuesto fen6lico es un grupo hidrocarbonado C1-C10 que forma con el anillo representado de la f6rmula (I) un anillo aromatico condensado (bi-o tricfclico) junto con el carbono orto de R1. En particular, el compuesto fen6lico se puede seleccionar del grupo que consiste en
dicho anillo condensado puede estar opcionalmente interrumpido por al menos un heteroatomo y puede estar sustituido por uno o varios sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: un alcoxi (C1-C3), un acilo (C2-C3), un alcohol (C1-C3), un grupo carboxflico (-COOH), un ester (C2-C3), una amina (C1-C3), un grupo amino (-NH2), una amida (-CONH2), una imina (C1-C3), un nitrilo, un hidroxilo (-OH), un grupo aldehfdo (-CHO), un hal6geno, un halogenoalquilo (C1-C3), un tiol (-SH), un tioalquilo (C1-C3), una sulfona (C1-C3), un sulf6xido (C1-C3), y una combinaci6n de los mismos.
En un aspecto preferido particular, el compuesto fen6lico es
Naturaleza y fuente de la enziia
Las enzimas que se pueden usar para esta reacci6n de condensaci6n son glicosiltransferasas, mas preferiblemente hexosiltransferasas (EC 2.4.1), y de una manera preferida glucansacarasas (EC 2.4.1.5).
En un aspecto preferido de la descripci6n, la enzima usada para la condensaci6n de estos compuestos fen6licos con glucosa es una glucasacarasa de una especie bacteriana, mas precisamente de una especie de Leuconostoc, y mas preferiblemente de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F.
Fuentes alternativas de enzima pueden ser la(s) glucansacarasa(s) de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-742, Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299, Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355, o Leuconostoc mesenteroides NRRL B-23192.
Tales enzimas se pueden obtener mediante una fermentaci6n natural de la cepas de producci6n, seguido de tratamientos celulares y recuperaci6n y purificaci6n de enzimas. Dado que las glucansacarasas son principalmente enzimas extracelulares grandes en disoluci6n en el caldo de cultivo o celulas asociadas, las tecnicas que se pueden usar para la recuperaci6n de la enzima incluyen, pero no se limitan a, centrifugaci6n y microfiltraci6n tangencial, y, si es una enzima asociada a celulas, las tecnicas que tienen como objetivo la rotura celular incluyen, pero no se limitan a, homogeneizaci6n en prensa francesa, perlas de vidrio, sonificaci6n o cualquier metodo equivalente. Las tecnicas que tienen como objetivo la concentraci6n de enzimas incluyen, pero no se limitan a, ultrafiltraci6n con un corte de peso molecular que oscila de 10 kDa a 300 kDa, y las tecnicas que se pueden usar para la purificaci6n de enzimas incluyen, pero no se limitan a, reparto de fases con polietilenglicol, cromatograffa de permeaci6n en gel. Una soluci6n alternativa consiste en la expresi6n recombinante de dichas enzimas en huespedes de expresi6n bien conocidos tales como E. coli, S. cerevisiae, Baculovirus, Y. lipolytica, Bacillus sp., Pseudomonas sp., H. polymorpha
o celulas de mamfferos (vease como referencia "Production of recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic
Expression Systems" Wiley 2004 -Gerd Gellissen Ed.), opcionalmente seguido de una(s) etapa(s) de purificaci6n usando metodos bien conocidos por el experto en la tecnica.
La enzima tambien se puede obtener mediante metodos de mutagenesis aleatoria, mutagenesis dirigida o evoluci6n dirigida, bien conocidos por el experto en la tecnica (MIYAZAKI K, ARNOLD FH (2004), In vitro DNA recombination. In Phage Display: A practical approach. Clarkson T and Lowman H, editores. New York: Oxford University press Inc., 43-60). Estas tecnologfas podrfan permitir obtener enzimas con actividad especffica mas alta, inhibici6n de productos mas baja, regio, quimio y estereo selectividad dedicada, mejor estabilidad, o cualquier combinaci6n de los mismos.
El procedimiento de la descripci6n puede asf ser llevado a cabo bien con celulas enteras o bien con enzima bruta o purificada natural o recombinante. La enzima se puede usar bajo su forma "libre", o como un catalizador inmovilizado. Tales procedimientos de inmovilizaci6n incluyen, pero no se limitan a, encapsulaci6n en gel (alginato de calcio, ...), adsorci6n en resina, reticulaci6n con glutaraldehido, secado por pulverizaci6n en presencia eventualmente de un adyuvante adecuado para obtener una forma insoluble de la enzima, reactores de membrana o cualquier combinaci6n de los mismos, y son bien conocidos por el experto en la tecnica. La elecci6n de un metodo de inmovilizaci6n se basa en su coste econ6mico y en el campo final del procedimiento que implica dicha enzima inmovilizada.
La cantidad de actividad enzimatica de una preparaci6n de enzima se puede estimar usando la hidr6lisis de sacarosa y la medida del azucar reductor liberado (fructosa) por medio de metodos colorimetricos (tales como el que implica acido 3,5-dinitro-salicflico; SUMNER JB, HOWELL SF (1935) A method for determination of invertase activity. J Biol Chem 108: 51-4). Esta actividad enzimatica se expresa en unidades en las que una unidad (U) corresponde a la cantidad de enzima que libera 1 Imol de fructosa por minuto a 30°C, pH 5,2 (sacarosa:100 g/l; tamp6n de acetato de sodio: 50 mM; cloruro de calcio dihidratado: 10 mg/l).
Condiciones de reaccion
La reacci6n se puede conseguir en agua tamponada o en una mezcla de agua tamponada/codisolvente(s). De hecho, los inventores observaron sorprendentemente que la enzima es capaz de glucosilar en ausencia de codisolventes.
Preferiblemente, el agua tamponada a un pH conveniente para la actividad enzimatica usada bien sin codisolvente o bien en una mezcla con un codisolvente consiste en tamp6n acetato de sodio o potasio a una concentraci6n que oscila de 20 a 500 mM en agua, pero se puede usar cualquier otra sustancia amortiguadora sin ningun efecto negativo sobre la actividad enzimatica. Preferiblemente, el agua tamponada a un pH conveniente para la mezcla actividad enzimatica-codisolvente consiste en una mezcla de agua, preferiblemente un agua tamponada como se describi6 anteriormente, y dimetilsulf6xido (DMSO) con una proporci6n menor que 35% de DMSO (volumen/volumen), preferiblemente entre 15-25% mas preferiblemente alrededor de 15%.
La reacci6n se puede conseguir en una mezcla agua/codisolvente(s) que permite tanto una actividad apropiada de la enzima como un buen nivel de solubilidad de los compuestos fen6licos y del donador de glucosa, es decir, sacarosa. Tales codisolventes pueden ser los siguientes disolventes organicos miscibles con el agua: dimetilsulf6xido, dioxano, dimetilformamida, etanol, n-propanol, isopropanol, etilenglicol, glicerol, 1,2-propanodiol, sulfolano, tetrametilurea, lactato de etilo, eter dietflico de dietilenglicol, eter dimetflico de trietilenglicol, usados a diferentes relaciones de peso/volumen. Ademas de estos disolventes organicos simples, tambien pueden contemplarse lfquidos i6nicos (sales de imidazolio, piridinio, fosfonio y amonio). Los codisolventes pueden ser tambien los siguientes disolventes organicos inmiscibles con el agua: acetato de etilo, metiletilcetona, metil-2 butanol-2, y una combinaci6n de disolventes organicos miscibles con el agua con disolventes organicos inmiscibles con el agua.
En un aspecto preferido de la descripci6n, la mezcla esta hecha de agua y dimetilsulf6xido (DMSO), con concentraciones de DMSO que oscilan de 5 a 70% (volumen/volumen). En un aspecto preferido, las concentraciones de DMSO estan entre 5 y 50% (volumen/volumen). En un aspecto mas preferido, la concentraci6n de DMSO esta entre 10 y 35% (volumen/volumen). De hecho, los inventores encontraron sorprendentemente que la reacci6n es sumamente mas eficaz cuando tuvo lugar a una proporci6n de DMSO menor que 40%. La tasa mas alta de producto ha sido registrada para una proporci6n de 15%. Por lo tanto, una proporci6n preferida del metodo acorde con la presente descripci6n esta comprendida entre 15-25%, preferiblemente alrededor del 15% (+/-3%).
Cada compuesto fen6lico es incubado en esta mezcla de reacci6n con sacarosa y la enzima en condiciones de pH y temperatura que permiten a la enzima ser activa y sintetizar el maximo posible del gluc6sido deseado. Preferiblemente, el medio de reacci6n contiene, ademas, cationes de calcio en la forma de cloruro de calcio (o en la forma de cualquier sal de calcio soluble en agua) para mejorar la estabilidad de la enzima. La reacci6n de condensaci6n se puede realizar a un pH que oscila de 4 a 8, y preferiblemente de 5 a 7, introduciendo una baja cantidad de tamp6n acetato en el medio de reacci6n. La temperatura del medio de sfntesis es mantenida a un valor que oscila de 10 a 40 grados Celsius, y preferiblemente de aproximadamente 25 a 33 grados Celsius.
Las condiciones de reacci6n tfpicas con la glucansacarasa de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F consiste en una mezcla de tamp6n acetato a 10 mM a 100 mM, DMSO a 10 a 35%(volumen/volumen), sacarosa a 100 mM a 900 mM y compuesto fen6lico a 2 a 200 mM, sales de calcio a 0,5 mg a 1 g/l y la enzima para una concentraci6n final de 0,5 a 5 U/ml. Esta reacci6n es incubada a 30°C durante varias horas (p.ej., 10 a 48 horas), y la sfntesis del derivado del compuesto fen6lico, asf como la desaparici6n de dicho compuesto fen6lico con el tiempo, es seguida por analisis HPLC. Se puede conseguir una mejor caracterizaci6n de los productos por cromatograffa lfquida de alta resoluci6n acoplada con un detector de matriz de fotodiodos acoplado con un espectr6metro de masas para estimar directamente el numero de restos de glucosa unidos al compuesto fen6lico, y por tanto tener una buena caracterizaci6n analftica de los derivados sintetizados.
En un aspecto de la presente descripci6n, tales condiciones que permiten la caracterizaci6n analftica de los derivados sintetizados puede ser como sigue:
Los medios de sfntesis pueden ser analizados por cromatograffa lfquida de alta resoluci6n acoplada con un detector de matriz de fotodiodos (PDA Waters® 996) y un espectr6metro de masas (Micromass ZQ 2000, Waters®).
i) Condiciones de operaci6n para cromatograffa:
-
Columna: KROMASIL C18 5I, 250 mm x 4,6 mm (referencia: K2185, A.I.T. Chromato; 117 rue de Stalingrad; 78800 Houilles)
-
Eluci6n (metodo 1):
•
Disolvente A: agua desionizada que contiene 1% v/v de acido acetico
•
Disolvente B: metanol de grado HPLC que contiene 1% v/v de acido acetico
•
0 a 10 minutos: 90% a 80% A (lineal); 10% a 20% B (lineal); 1 ml/minuto
•
10 a 25 minutos: 80% a 50% A (lineal); 20% a 50% B (lineal); 1 ml/minuto
•
25 a 30 minutos: 50% A; 50% B; 1 ml/minuto
•
30 a 35 minutos: 50% a 90% A (lineal); 50 a 10% B (lineal); 1 ml/minuto
•
45 minutos: siguiente inyecci6n
-
Temperatura de columna: 30°C
-Volumen de inyecci6n: 10 Il ii) Detector de matriz de fotodiodos
-
Longitud de onda de inicio: 210 nm
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Longitud de onda final: 400 nm
-
Resoluci6n: 1,2 mm
-Tasa de muestreo: 1 espectro/segundo iii) Espectr6metro de masas LC (cuadrupolo simple)
-
Ionizaci6n: electropulverizaci6n en modo negativo
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Voltaje de pulverizaci6n: 3,0 kV
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Temperatura de la fuente: 150°C
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Tensi6n de cono: 20 o 40V
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Extractor: 3,0 V
-
Temperatura de desolvaci6n: 300°C
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Flujo de gas de cono: 30 L/hora
-
Flujo de gas de desolvaci6n: 600 L/hora
-
Espectros de masas de barrido completo: m/z de 100 a 2000
Purificacion
Despues de la sfntesis, los O-a-gluc6sidos fen6licos pueden ser usados bien directamente o bien purificados hasta alcanzar una pureza deseada en terminos de compuesto fen6lico residual no transformado, azucares, enzima y codisolventes.
Por ejemplo, los O-a-gluc6sidos fen6licos pueden ser adsorbidos en una resina adsorbente macroporosa sintetica aprovechando la ventaja de la diferencia de capacidad absorbente de las sustancias. Debido a la presencia de sustancias residuales en el volumen intersticial, la resina con las sustancias fen6licas adsorbidas se lava con agua a fin de retirar completamente la enzima, los azucares y el polisacarido y el co-disolvente. Despues, la resina puede sufrir una etapa de eluci6n con un disolvente apropiado para recuperar el producto sintetizado. El disolvente apropiado es metanol, etanol, n-propanol, 2-propanol, acetona, puros, o una mezcla de ellos o una mezcla de ellos con agua con no mas que 20% volumen/volumen de agua. La disoluci6n que contiene el (los) producto(s) sintetizado(s) puede ser concentrada por evaporaci6n a vacfo a temperatura moderada (no mas alta que 50°C) o con equipos de membrana compatibles para purificaci6n adicional, o ser usada directamente para purificaci6n adicional. Se pueden usar etapas de purificaci6n adicionales tales como extracci6n lfquido/lfquido, HPLC preparativa, u otras rondas de purificaci6n con resina para alcanzar el nivel requerido de pureza para la aplicaci6n final. Los disolventes organicos que se pueden usar para la extracci6n lfquido-lfquido son acetato de etilo, acetato de butilo, metiletilcetona, dependiendo de la diferencia de solubilidad del compuesto fen6lico y el gluc6sido del compuesto fen6lico.
Finalmente, se puede obtener un jarabe que contiene la(s) sustancia(s) deseada(s) retirando el disolvente (agua o disolvente organico) por evaporaci6n a vacfo a temperatura moderada (no mas alta que 50°C) o con equipos de membrana compatibles y concentrar la disoluci6n resultante para dar una concentraci6n prescrita. Este jarabe se puede secar (liofilizacion, secado por pulverizaci6n o cualquier otra manera de secar que preserve la integridad de las moleculas) para obtener un polvo.
La resina adsorbente macroporosa sintetica se puede usar bien en un tanque (se usara un tamiz con una malla conveniente dependiendo de la granulometrfa de la resina para recuperar la resina) o situada en una columna alimentada con una bomba. Por resina adsorbente macroporosa sintetica se entiende resinas sinteticas no i6nicas y porosas que tienen un area superficial relativamente grande, tales como las que contienen copolfmero de estirenodivinilbenceno, polfmeros de fenol-formaldehfdo, polfmero acrflico y polfmero metacrflico. Los ejemplos de tales resinas son Amberlite del tipo XAD (Rohm and Haas Company, EE.UU.), y Diaion de la familia HP (Mitsubishi Chemical Industries, Jap6n).
La descripci6n se refiere a O-a-gluc6sidos de compuestos fen6licos que contienen una estructura de catecol y por ejemplo seleccionados entre acido protocatecuico y sus derivados esteres, acido cafeico y sus derivados esteres, especialmente acido rosmarfnico, acido clorogenico y ester fenetflico de acido cafeico y acido hidrocafeico o acido 3,4-dihidroxihidrocinamico, acido 3,4-dihidroxifenilacetico y 3,4-dihidroxifenilglicol, esculetina, taxifolina, fustina, eriodictiol, fisetina y ramnetina. En particular, la descripci6n se refiere a O-a-gluc6sidos de compuestos fen6licos que contienen una estructura de catecol y seleccionados del grupo que consiste en el galato de epicatequina, el eriodictiol, la esculetina, el O-a-gluc6sido de fisetina, la fustina, el acido homoprotocatecuico, el acido protocatecuico, el ester etflico del acido protocatecuico, el hidroxitirosol, la maclurina, el acido nordihidroguaiaretico, la oleuropefna, el pirocatecol, la ramnetina, el acido rosmarfnico, la taxifolina, la 3-hidroxidaidzefna, la 3,4-dihidroxibenzofenona, el acido cafeico, el acido dihidrocafeico, el ester fenetflico de acido cafeico, el cirsiliol, el c6sido de acido clorogenico, la antrarobina, la epigalocatequina, la dihidrorobinetina, la galocatequina, el acido galico, el galato de propilo y la robinetina. Estos nuevos derivados de compuestos fen6licos tienen una mejor biodisponibilidad mediante una solubilidad en agua mejorada y/o una liberaci6n in situ de las agliconas durante su uso mediante su hidr6lisis por microbiotos naturales humanos, y mas especfficamente de microorganismos de la piel humana, o por una aglucosidasa seleccionada tal como la a-glucosidasa producida por la levadura Saccharomyces cerevisiae.
En particular, la presente descripci6n se refiere a un O-a-gluc6sido fen6lico que tiene la siguiente f6rmula:
en la que
A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo;
R2 es H o OH; y, R1 se selecciona del grupo que consiste en
-
en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH;
-
en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR, y R8 es H o OH, a condici6n de que, 10 cuando R2 es H, R7 y R8 no son ambos OH, y al menos uno entre R7 y R8 es OH;
-
en donde R5 es OH o OCH3; R6 es H o OH, R9 es H o OH, R10 es H, OCH3 o C6H11O5, y R11 es H, OH o C6H11O5, a condici6n de que R10 y R11 no pueden ser ambos H cuando R5 y R6 son ambos OH, y que cuando R10 es 15 C6H11O5 entonces R11 es H; --(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2; - -(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal, ramificado o cfclico, preferiblemente metilo, etilo, propilo, ciclohexilo o fenilo, mas preferiblemente metilo o fenilo; --(CH2)n-OR o -(CH2)n-NHR, siendo n un numero entero de 0 a 2; 20 --(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR siendo n un numero entero de 0 a 2;
-H; -
-
-
5 -
-
un grupo hidrocarbonado C1-C10 que forma con el anillo representado de la f6rmula (I) un anillo condensado (bi o tricfclico) junto con el carbono orto de R1, estando dicho anillo opcionalmente interrumpido por al menos un heteroatomo;
10 en donde R es H o un grupo hidrocarbonado C1-C10 lineal, ramificado o cfclico, aromatico o no, saturado o insaturado, opcionalmente interrumpido por al menos un heteroatomo, en donde dicho grupo hidrocarbonado comprende un alquilo, un alquenilo o un alquinilo, preferiblemente un alquilo o un alquenilo, que puede estar sustituido por uno o varios sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: un arilo (C5-C9), un heterociclo (C4-C9), un alcoxi (C1-C3), un acilo (C2-C3), un alcohol (C1-C3), un grupo carboxflico (-COOH), un ester (C2-C3), una
15 amina (C1-C3), un grupo amino (-NH2), una amida (-CONH2), una imina (C1-C3), un nitrilo, un hidroxilo (-OH), un grupo aldehfdo (-CHO), un hal6geno, un halogenoalquilo (C1-C3), un tiol (-SH), un tioalquilo (C1-C3), una sulfona (C1-C3), un sulf6xido (C1-C3), y una combinaci6n de los mismos.
En un primer aspecto de la descripci6n, R2 es H. En este aspecto, el O-a-gluc6sido fen6lico puede ser por ejemplo el O-a-gluc6sido de galato de epicatequina, el O-a-gluc6sido de eriodictiol, el O-a-gluc6sido de esculetina, el O-a20 gluc6sido de fisetina, el O-a-gluc6sido de fustina, el O-a-gluc6sido de acido homoprotocatecuico, el O-a-gluc6sido de acido protocatecuico, el O-a-gluc6sido de ester etflico de acido protocatecuico, el O-a-gluc6sido de hidroxitirosol, el O-a-gluc6sido de maclurina, el O-a-gluc6sido de acido nordihidroguaiaretico, el O-a-gluc6sido de oleuropefna, el O-a-gluc6sido de pirocatecol, el O-a-gluc6sido de ramnetina, el O-a-gluc6sido de acido rosmarfnico, el O-agluc6sido de taxifolina, el O-a-gluc6sido de 3-hidroxidaidzefna, el O-a-gluc6sido de 3,4-dihidroxibenzofenona, el O-a
25 gluc6sido de acido cafeico, el O-a-gluc6sido de acido dihidrocafeico, el O-a-gluc6sido de ester fenetflico de acido cafeico, el O-a-gluc6sido de cirsiliol, el O-a-gluc6sido de acido clorogenico y el O-a-gluc6sido de antrarobina.
En un aspecto alternativo de la descripci6n, R2 es OH. En este aspecto, el O-a-gluc6sido fen6lico puede ser por ejemplo el O-a-gluc6sido de epigalocatequina, el O-a-gluc6sido de dihidrorobinetina, el O-a-gluc6sido de galocatequina, el O-a-gluc6sido de acido galico, el O-a-gluc6sido de galato de propilo, y el O-a-gluc6sido de robinetina.
En un aspecto particular de la presente descripci6n, el O-a-gluc6sido fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo; 10 R2 es H o OH; y R1 es
en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH.
15 En un aspecto particular de la descripci6n, R2 es H. En otro aspecto, R2 es OH.
En un aspecto preferido de la descripci6n, R3 y R4 son OH. En otro aspecto preferido, R3 es H y R4 es OH. En un aspecto preferido adicional, R3 es OH y R4 es H. En un aspecto particularmente preferido, R2 es H y R3/R4 se seleccionan en las siguientes combinaciones: OH/OH; H/OH; OH/H. En otro aspecto preferido, R2 es OH y R3/R4 se seleccionan en las siguientes combinaciones: OH/OH; H/OH; OH/H.
20 En particular, R2 es H, R3 es H y R4 es OH (dando como resultado O-a-gluc6sido de eriodictiol). Alternativamente, R2 es H, R3 es OH y R4 es H (dando como resultado O-a-gluc6sido de fustina). En un aspecto preferido, R2 es H, y tanto R3 como R4 son OH (dando como resultado O-a-gluc6sido de taxifolina).
Preferiblemente, el O-a-gluc6sido fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de taxifolina, el O-a-gluc6sido de eriodictiol, el O-a-gluc6sido de dihidrorobinetina y el O-a-gluc6sido de fustina.
25 En otro aspecto particular de la presente descripci6n, el O-a-gluc6sido fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que
A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo;
R2 es H o OH; y R1 es
en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR y R8 es H o OH, a condici6n de que, cuando R2 es H, R7 y R8 no son ambos OH, y al menos uno entre R7 y R8 representa OH.
En un aspecto particular de la descripci6n, R2 es H. En otro aspecto, R2 es OH.
En un aspecto preferido de la descripci6n, R2 es OH, R8 es OH y R7 es OH o OCOR. En un aspecto mas preferido, R7 y R8 son ambos OH. En otro aspecto preferido, R2 es H, R8 es OH y R7 es OCOR. En un aspecto preferido adicional, R2 es H o OH, R7 es -OCOR y R8 es OH. Mas preferiblemente, R es
Preferiblemente, la O-a-glucosa fen6lica se selecciona del grupo que consiste en la O-a-glucosa de epigalocatequina, la O-a-glucosa de galocatequina y la O-a-glucosa de galato de epicatequina.
En un aspecto particular adicional de la presente descripci6n, la O-a-glucosa fen6lica tiene la siguiente f6rmula:
15 en la que
A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo; R2 es H o OH; y R1 es
en donde R5 es OH o OCH3; R6 es H o OH, R9 es H o OH, R10 es H, OCH3 o C6H11O5, y R11 es H, OH o C6H11O5, a condici6n de que R10 y R11 no pueden ser ambos H cuando R5 y R6 son ambos OH, y que cuando R10 es C6H11O5 entonces R11 es H. En particular, R6, R5 y R11 se pueden seleccionar de las siguientes combinaciones:
a) R6 es OH y R5 es OCH3yR11 es H;
25 b) R6 es OH y R5 es OH y R11 es OH;
c) R6 es OH y R5 es OH y R11 es C6H11O5; y d) R6 es H y R5 es OH yR11 es H; y R9 es H o OH, y R10 es H o OCH3 o C6H11O5, a condici6n de que cuando R10 es C6H11O5, R11 es H.
5 En un aspecto particular, R2 es H. en otro aspecto, R2 es OH.
En un aspecto preferido, R9 es OH, R10 es H y R11 es H, mientras que R6 es OH y R5 es OCH3, o R6 es H y R5 es OH. Preferiblemente, R2 es H. Alternativamente, R2 es OH. En otro aspecto preferido, R9 es H y R10 es OCH3 o C6H11O5. En un aspecto particular de este aspecto, R9 y R11
son H, R10 y R5 son OCH3, y R6 es OH. 10 En un aspecto preferido adicional, R5 y R6 son ambos OH, R9 es H o OH, R10 es OH o C6H11O5, y R11 es H, OH o
C6H11O5, a condici6n de que cuando R10 es C6H11O5 entonces R11 es H. En otro aspecto preferido, R5 y R6 son ambos OH, R9 es H o OH, R10 es H, y R11 es OH o C6H11O5. En otro aspecto preferido, R9 es H y R10 es H. En un aspecto preferido adicional, R9 es H, R10 y R5 son OCH3, y
R6 es OH. 15 En un aspecto particular, R2, R5, R6, R9, R10 y R11 se pueden seleccionar de las siguientes combinaciones.
R2
R5 R6 R9 R10 R11
H
OCH3 OH
H
H
H
H
OCH3 OH H OCH3 H
H
OCH3 OH H C6H11O5 H
H
OCH3 OH OH
H
H
H
OCH3 OH OH OCH3 H
H
OCH3 OH OH C6H11O5 H
H
OH OH H H OH
H
OH OH H OCH3 OH
H
OH OH H C6H11O5 H
H
OH OH OH H OH
H
OH OH OH OCH3 OH
H
OH OH OH C6H11O5 H
H
OH OH H H C6H11O5
H
OH OH H OCH3 C6H11O5
H
OH OH H C6H11O5 H
H
OH OH OH H C6H11O5
H
OH OH OH OCH3 C6H11O5
H
OH OH OH C6H11O5 H
H
OH
H
H
H
H
H
OH H H OCH3 H
R2
R5 R6 R9 R10 R11
H
OH H H C6H11O5 H
H
OH H OH
H
H
H
OH H OH OCH3 H
H
OH H OH C6H11O5 H
OH
OCH3 OH H H H
OH
OCH3 OH H OCH3 H
OH
OCH3 OH H C6H11O5 H
OH
OCH3 OH OH H H
OH
OCH3 OH OH OCH3 H
OH
OCH3 OH OH C6H11O5 H
OH
OH
OH
H H
OH
OH
OH
OH
H OCH3
OH
OH
OH
OH
H C6H11O5 H
OH
OH
OH
OH
H
OH
OH
OH
OH
OH
OCH3
OH
OH
OH
OH
OH
C6H11O5 H
OH
OH
OH
H H C6H11O5
OH
OH
OH
H OCH3 C6H11O5
OH
OH
OH
H C6H11O5 H
OH
OH
OH
OH
H C6H11O5
OH
OH
OH
OH
OCH3 C6H11O5
OH
OH
OH
OH
C6H11O5 H
OH
OH
H H H H
OH
OH
H H OCH3 H
OH
OH
H H C6H11O5 H
OH
OH
H OH H H
OH
OH
H OH OCH3 H
OH
OH
H OH C6H11O5 H
En un aspecto particular de la descripci6n, R2 es H y R1 es
en donde o bien R6 es OH y R5 es OCH3 (dando como resultado O-a-gluc6sido de ramnetina), o bien R6 es H y R5 es OH (dando como resultado O-a-gluc6sido de fisetina).
Preferiblemente, la O-a-glucosa fen6lica se selecciona del grupo que consiste en la O-a-glucosa de ramnetina, la Oa-glucosa de fisetina, la O-a-glucosa de robinetina, la O-a-glucosa de gosipetina, la O-a-glucosa de orientina, la O-aglucosa de homoorientina y la O-a-glucosa de cirsiliol.
En un aspecto particular adicional de la presente descripci6n, la O-a-glucosa fen6lica tiene la siguiente f6rmula:
en la que
10 A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo; R2 es H o OH; y R1 es -(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2. En un aspecto particular de la descripci6n, R2 es H. En otro aspecto, R2 es OH.
15 Preferiblemente, R se selecciona del grupo que consiste en H, un alquilo C1-C3, preferiblemente metilo, etilo o propilo, y
En un primer aspecto mas preferido, n es 0 y R es preferiblemente H. En un segundo aspecto mas preferido, n es 1 y R es preferiblemente H. En un tercer aspecto mas preferido, n es 2 y R es preferiblemente H. En otro aspecto 20 preferido, n es 0 y R es un alquilo C1-C3, preferiblemente metilo, etilo o propilo, o
En un aspecto preferido de la descripci6n, R1 es -(CH2)n-COOR. En un aspecto preferido, R es H.
Preferiblemente, el compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el acido homoprotocatecuico, el acido dihidrocafeico, el ester etflico del acido protocatecuico, el galato de propilo, el acido galico, la hamamelitanina 25 (2',5-di-O-galoil-hamamelosa) y el acido protocatecuico.
En un aspecto particular de la descripci6n, R2 es H y R1 es -COOH (dando como resultado O-a-gluc6sido de acido protocatecuico). En otro aspecto particular, R2 es H y R1 es -(CH2)n-COOH (dando como resultado O-a-gluc6sido de acido hidrocafeico).
El presente aspecto contempla el ester de los mismos y las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
Preferiblemente, el compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de acido homoprotocatecuico, el O-a-gluc6sido de acido dihidrocafeico, el O-a-gluc6sido del ester etflico del acido protocatecuico, el O-a-gluc6sido de galato de propilo, el O-a-gluc6sido de acido galico, el O-a-gluc6sido de hamamelitanina (2',5-di-O-galoil-hamamelosa) y el O-a-gluc6sido de acido protocatecuico.
En un aspecto particular adicional de la presente descripci6n, la O-a-glucosa fen6lica tiene la siguiente f6rmula:
en la que
A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo;
R2 es H o OH; y
15 R1 es -(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal o cfclico, preferiblemente metilo, etilo, propilo, ciclohexilo o fenilo, mas preferiblemente metilo o fenilo. Preferiblemente R1 es (CH=CH)-COOR o -(CH=CH)-CONHR. En un aspecto preferido, R2 es H. Alternativamente, R2 es OH. En un aspecto preferido, R1 es -(CH=CH)-COOR. En un aspecto preferido, R se selecciona en el grupo que consiste en H; y un enlace unido al grupo fenilo de la f6rmula (I) en el carbono en orto de R1.
En un aspecto particular de la descripci6n, R2 es H y R1 es -(CH=CH)-COOH (dando como resultado O-a-gluc6sido de acido cafeico). La presente descripci6n contempla el ester del mismo y las sales farmaceuticamente aceptables 5 del mismo. En particular, cuando R1 es -(CH=CH)-COOR, R se selecciona de acido 1,3,4,5tetrahidroxiciclohexanocarboxflico, y que esta unido en la posici6n 3 (dando como resultado O-a-gluc6sido de acido clorogenico), (R)-1-carboxi-2-(3,4-dihidroxifenil)etilo (dando como resultado O-a-gluc6sido de acido rosmarfnico), y fenetilo (dando como resultado O-a-gluc6sido de ester fenetflico de acido cafeico). En particular, cuando R1 es (CR12=CH)-COOR, R es un enlace unido al grupo fenilo de la f6rmula (II) por el carbono en meta de OB dando la
10 siguiente f6rmula:
(es decir, cuando R12 es H, entonces O-a-gluc6sido de esculetina, cuando R12 es metilo, entonces O-a-gluc6sido de 4-metilesculetina, y cuando R12 es fenilo, entonces O-a-gluc6sido de nordalbergina). En un aspecto particular, R12 es H.
15 Preferiblemente, la O-a-glucosa fen6lica se selecciona del grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de acido cafeico, el O-a-gluc6sido de acido rosmarfnico, el O-a-gluc6sido de esculetina, el O-a-gluc6sido de 4-metilesculetina, el O-agluc6sido de nordalbergina (6,7-dihidroxifenilcumarina), el O-a-gluc6sido de acido clorogenico, el O-a-gluc6sido del ester fenetflico del acido cafeico, el O-a-gluc6sido de acido chic6rico (acido dicafeoiltartarico), el O-a-gluc6sido de equinac6sido (O-6-desoxi-alfa-L-manopiranosil-(1-3)-O-(beta-D-glucopiranosil-(1-6))-, 4-(3-(3,4-dihidroxifenil)-2propenoato de 2-(3,4-dihidroxifenil)etilo), beta-D-glucopiran6sido) y el O-a-gluc6sido de verbasc6sido.
En un aspecto particular adicional de la presente descripci6n, la O-a-glucosa fen6lica tiene la siguiente f6rmula:
en la que
A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo; R2 es H o OH; y
10 R1 es -(CH2)n-OR, siendo n un numero entero de 0 a 2. En un aspecto particular, R2 es H. En otro aspecto, R2 es OH. En un aspecto preferido n es 2. Preferiblemente, el O-a-gluc6sido fen6lico es el O-a-gluc6sido de hidroxitirosol. En un aspecto particular adicional de la presente descripci6n, el O-a-gluc6sido fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
15 en la que
A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo; R2 es H o OH; y R1 es -(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2.
20 En un aspecto particular, R2 es H. En otro aspecto, R2 es OH. En un aspecto preferido, n es 0 o 1 y R se selecciona en el grupo que consiste en H; un alquilo C1-C3, preferiblemente metilo, etilo o propilo, mas preferiblemente un metilo; Preferiblemente, n es 0. Alternativamente, n es 1.
Preferiblemente, el O-a-gluc6sido fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de maclurina, el O-a-gluc6sido de 3,4-dihidroxibenzaldehfdo, el O-a-gluc6sido de 3,4-dihidroxibenzofenona, el O-a-gluc6sido de butefna (2,3,4,4'-tetrahidroxichalcona), el O-a-gluc6sido de 3,4-dihidroxiacetofenona, el O-a-gluc6sido de marefna (2',3,3',4,4'-pentahidroxichalcona), y el O-a-gluc6sido de eriodictiolchalcona (2',4',6',3,4-pentahidroxichalcona).
En un aspecto particular adicional de la presente descripci6n, el O-a-gluc6sido fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que
10 A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo; R2 es H o OH; y R1 se selecciona del grupo que consiste en
Preferiblemente, el O-a-gluc6sido fen6lico se selecciona del grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de oleuropefna, el O-a-gluc6sido de acido nordihidroguaiaretico, el O-a-gluc6sido de pirocatecol, el O-a-gluc6sido de 3hidroxidaidzefna y el O-a-gluc6sido de maritimefna (3',4',6,7-tetrahidroxi-6-O-glucosilaurona).
En un aspecto particular adicional de la presente descripci6n, el O-a-gluc6sido fen6lico tiene la siguiente f6rmula:
en la que
A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo;
10 R2 es H o OH; y
R1 es un grupo hidrocarbonado C1-C10 que forma con el anillo representado de la f6rmula (I) un anillo aromatico condensado (bi-o tricfclico) junto con el carbono orto de R1. En particular, el O-a-gluc6sido fen6lico se puede seleccionar del grupo que consiste en
15 dicho anillo condensado puede estar opcionalmente interrumpido por al menos un heteroatomo y puede estar sustituido por uno o varios sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: un alcoxi (C1-C3), un acilo (C2-C3), un alcohol (C1-C3), un grupo carboxflico (-COOH), un ester (C2-C3), una amina (C1-C3), un grupo amino (-NH2), una amida (-CONH2), una imina (C1-C3), un nitrilo, un hidroxilo (-OH), un grupo aldehfdo(-CHO), un hal6geno, un halogenoalquilo (C1-C3), un tiol (-SH), un tioalquilo (C1-C3), una sulfona (C1-C3), un sulf6xido (C1-C3), y una
20 combinaci6n de los mismos.
En un aspecto preferido particular, el O-a-gluc6sido del compuesto fen6lico es
El residuo O-a-glucosilo se refiere en la presente memoria a un mon6mero, dfmero, trfmero, tetramero, pentamero o mas de glucosa. Preferiblemente, el residuo O-a-glucosilo es un mon6mero, dfmero o trfmero, a saber glucosilo, diglucosilo o triglucosilo. Aun mas preferiblemente, el residuo O-a-glucosilo es un mon6mero de glucosa. En un aspecto particular el residuo O-a-glucosilo esta unido al compuesto fen6lico por el carbono en la posici6n 1. En un aspecto preferido, OA es OH y OB es un residuo O-a-glucosilo. En otro aspecto preferido, OB es OH y OA es un residuo O-a-glucosilo.
En un aspecto particular, R puede ser un monosacarido. En otro aspecto particular, R es un alquilo (C1-C6) o un alquilo (C1-C3).
Tales sales incluyen sales de adici6n de acido farmaceuticamente aceptables, sales de adici6n de base farmaceuticamente aceptables, sales metalicas farmaceuticamente aceptables, sales de amonio y amonio alquilado. Las sales de adici6n de acido incluyen sales de acidos inorganicos asf como de acidos organicos. Los ejemplos representativos de acidos inorganicos adecuados incluyen clorhfdrico, bromhfdrico, yodhfdrico, fosf6rico, sulfurico, percl6rico, y similares. Los ejemplos representativos de acidos organicos adecuados incluyen f6rmico, acetico, tricloroacetico, trifluoroacetico, propi6nico, benzoico, cinamico, cftrico, fumarico, y similares. Ejemplos adicionales de sales de adici6n de acido inorganico u organico farmaceuticamente aceptables incluyen las sales farmaceuticamente aceptables enumeradas en J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2, y en Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use editado por P. Heinrich stahl y Camille G. Wermuth 2002. Los ejemplos de sales metalicas incluyen sales de litio, sodio, potasio, magnesio y similares. Los ejemplos de sales de amonio y de amonio alquilado incluyen sales de amonio, metilamonio, dimetilamonio, trimetilamonio, etilamonio, hidroxietilamonio, dietilamonio, butilamonio, tetrametilamonio y similares. Los ejemplos de bases organicas incluyen lisina, arginina, guanidina, dietanolaminolina y similares.
Liberacion in situ de las agliconas.
Sorprendentemente, los inventores encontraron que los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n pueden ser escindidos por a-glucosidasas conduciendo a la liberaci6n in situ de los compuestos fen6licos.
Todos los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n tienen al menos un enlace O-a-gluc6sido. Este enlace puede ser hidrolizado especfficamente por enzimas, tales como a-glucosidasas (EC 3.2.1.20) para liberar el residuo glucosilo y la parte aglicona. Cuando se consigue in situ, esta liberaci6n tiene varias ventajas:
-
permite liberar la aglicona escasamente soluble (que puede ser mas activa que el derivado glic6sido) despues de su administraci6n/inyecci6n/aplicaci6n bajo una forma de glic6sido soluble, y/o
-
la liberaci6n in situ puede ser dependiente del tiempo (si se consigue mediante enzimas expresadas por microorganismos: cuanto mas densa sea la poblaci6n bacteriana, mas liberaci6n de agliconas ocurrira), y/o
-
la liberaci6n in situ puede ser controlada por una administraci6n/inyecci6n/aplicaci6n in situ de una aglucosidasa o de un microorganismo que expresa tal actividad enzimatica.
Estas ventajas son importantes en la formulaci6n de fen6licos en preparaciones cosmeticas o dermocosmeticas. En un aspecto preferido de la presente descripci6n, dichos O-a-gluc6sidos fen6licos pueden ser activados in situ por enzima(s) expresadas por microorganismos asociados a humanos, y mas preferiblemente por microorganismos asociados a la piel humana. Los ejemplos conocidos y no exhaustivos de tales microorganismos comensales o no comensales humanos incluyen Streptococcus Species, Staphylococcus Species, Enterococcus Species, Escherichia Coli, Bacilli, Corynebacterium Species, Propionibacterium Species. Cuando se aplican sobre la piel, los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n son convertidos por microorganismos asociados a la piel en la parte aglicona y el residuo glucosilo. Tales bacterias se pueden encontrar en los seres humanos en la boca, tracto intestinal, tracto genital y sistema respiratorio superior.
En otro aspecto preferido de la presente descripci6n, dichos O-a-gluc6sidos fen6licos pueden ser activados in situ por una a-glucosidasa (EC 3.2.1.20), tal como a-glucosidasa de Saccharomyces Cerevisiae.
Asf, los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n tienen un status de pro-farmaco, ya que la parte activa de la molecula (las agliconas) puede ser liberada in situ.
Por lo tanto, la presente descripci6n se refiere a una composici6n farmaceutica o cosmetica que comprende un Oa-gluc6sido fen6lico de la presente descripci6n o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. La presente descripci6n tambien se refiere a O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo como medicamento. El medicamento puede ser terapeutico o profilactico. Los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n tienen varias actividades, entre las cuales hay acciones antivirales, antibacterianas, estimulantes del sistema inmune, antialergicas, antihipertensivas, antiisquemicas, antiarrftmicas, antitromb6ticas, hipocolesterolemicas, antilipoperoxidantes, hepatoprotectoras, antiinflamatorias, anticarcinogenicas, antimutagenicas, antineoplasicas, antitromb6ticas y vasodilatadoras.
En un aspecto particular, la composici6n puede comprender ademas una O-a-glucosidasa (EC 3.2.1.20) o un microorganismo que expresa actividad O-a-glucosidasa. Preferiblemente, la O-a-glucosidasa es de Saccharomyces Cerevisiae. En particular, la O-a-glucosidasa (ES 3.2.1.20) o un microorganismo que exprese actividad O-a-glucosidasa esta presente en la composici6n en una forma inactiva y la O-a-glucosidasa es activada justo en el momento de administraci6n. Por ejemplo, la composici6n puede ser formulada en forma seca, conduciendo la ausencia de agua a la inactivaci6n de la O-a-glucosidasa; despues de la adici6n de agua, la enzima se hara activa y sera capaz entonces de hidrolizar el enlace glucosfdico. La enzima y los O-a-gluc6sidos fen6licos pueden ser puestos en dos preparaciones lfquidas diferentes que seran mezcladas justo en el momento de administraci6n. Si la enzima y los O-a-gluc6sidos fen6licos son puestos en la misma disoluci6n, es posible usar un inhibidor reversible de la enzima que sera diluido despues de la administraci6n, permitiendo asf que la enzima recupere su capacidad de hidrolizar los O-a-gluc6sidos fen6licos. Los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n y la O-a-glucosidasa o un microorganismo que exprese actividad O-a-glucosidasa tambien pueden estar separados ffsicamente (p.ej., microcapsula).
La presente descripci6n se refiere al uso de un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente descripci6n o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo para preparar una composici6n farmaceutica o cosmetica para tratar o prevenir un cancer, una enfermedad cardiovascular, una infecci6n bacteriana, un eritema inducido por UVB, una alergia, un trastorno inflamatorio o inmune. En particular, el cancer es un tumor s6lido, por ejemplo un cancer de mama o colon. En particular, la alergia puede ser rinoconjuntivitis alergica. Por lo tanto, la presente descripci6n tambien se refiere a un metodo para tratar o prevenir un cancer, una enfermedad cardiovascular, una infecci6n bacteriana, un eritema inducido por UVB, una alergia, un trastorno inflamatorio o inmune, que comprende administrar un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente descripci6n o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Ademas, el metodo puede comprender adicionalmente la etapa de administrar secuencial o simultaneamente una Oa-glucosidasa (EC 3.2.1.20) o un microorganismo que expresa actividad O-a-glucosidasa. Preferiblemente, la O-aglucosidasa (EC 3.2.1.20) o un microorganismo que expresa actividad O-a-glucosidasa es administrada por la misma ruta.
En un aspecto particular, la presente descripci6n se refiere al uso de un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente descripci6n para preparar una composici6n farmaceutica o cosmetica para ser administrada por via t6pica (es decir, sobre la piel), en donde enzimas emitidas por microorganismos asociados a la piel liberan la correspondiente aglicona. Ademas, la presente descripci6n se refiere al uso de un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente descripci6n para preparar una composici6n farmaceutica o cosmetica para ser administrada por via oral, en donde enzimas emitidas por microorganismos asociados a la boca y al tracto intestinal liberan la correspondiente aglicona. La presente descripci6n tambien se refiere al uso de un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente descripci6n para preparar una composici6n farmaceutica o cosmetica para ser administrada por via rectal, en donde enzimas emitidas por microorganismos asociados al tracto intestinal liberan la correspondiente aglicona. La presente descripci6n se refiere ademas al uso de un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente descripci6n para preparar una composici6n farmaceutica
o cosmetica para ser administrada por via nasal, en donde enzimas emitidas por microorganismos asociados al sistema respiratorio superior liberan la correspondiente aglicona. La presente descripci6n se refiere ademas al uso de un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente descripci6n para preparar una composici6n farmaceutica o cosmetica para ser administrada por via vaginal, en donde enzimas emitidas por microorganismos asociados al tracto genital femenino liberan la correspondiente aglicona.
La presente descripci6n tambien se refiere a una combinaci6n de un O-a-gluc6sido fen6lico de la presente descripci6n o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo con una O-a-glucosidasa (EC 3.2.1.20) o un microorganismo que expresa actividad o O-a-glucosidasa para una administraci6n simultanea o secuencial. Cuando se realiza una administraci6n simultanea, los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos y la O-a-glucosidasa (EC 3.2.1.20) o un microorganismo que expresa actividad o O-a-glucosidasa pueden ser administrados en la misma o diferentes composiciones.
Tal composici6n puede comprender vehfculos, estabilizantes o excipientes farmaceuticamente aceptables.
Uso de coipuestos fenolicos coio interiedios clave para el desarrollo de otros derivados
Los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n se pueden usar directamente como ingredientes activos como cosmeticos o como sustancias activas, solos o en combinaci6n con otros productos, que incluyen otras moleculas activas con actividades sinergfsticas o complementarias, o con estabilizantes o excipientes. Estos derivados de compuestos fen6licos tambien se pueden usar como materiales de partida para modificaciones
qufmicas, ffsicas o enzimaticas adicionales, a fin de producir una segunda generaci6n de derivados. Como la reacci6n enzimatica usada en la presente descripci6n se refiere a posiciones especfficas del hidroxilo en el anillo de catecol del compuesto fen6lico, los otros grupos hidroxilo se pueden usar por ejemplo en una reacci6n qufmica para crear enlaces ester, enlaces acilo, enlaces sulfato o fosfato. Tales modificaciones pueden mejorar propiedades ya existentes de los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n, o proporcionar nuevas propiedades para aplicaciones especfficas (eficacia terapeutica superior, menor citotoxicidad, mayor estabilidad tras la liberaci6n de la parte glicona por microorganismos...).
Foriulacion de dichos derivados para aplicaciones cosi{ticas o terap{uticas
Las composiciones de la presente descripci6n se pueden administrar por vfa oral, parenteral, por pulverizador de inhalaci6n, por vfa t6pica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un reservorio implantado. El termino "parenteral", como se emplea en la presente memoria, incluye tecnicas de inyecci6n o infusi6n subcutanea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepatica, intralesional e intracraneal. Preferiblemente, la composici6n de la presente descripci6n se administra por vfa oral, mediante pulverizador de inhalaci6n, por vfa t6pica, rectal, nasal, bucal o vaginal. En un aspecto preferido, la composici6n farmaceutica o cosmetica se administra por vfa t6pica.
Se estan desarrollando constantemente nuevos tipos de productos cosmeticos, y se estan anadiendo nuevas materias primas a la selecci6n de ingredientes para el cuidado personal del farmaceutico cosmetico. Los O-agluc6sidos fen6licos descritos en la presente descripci6n pueden ser incorporados facilmente en un gran conjunto de productos cosmeticos. Tales preparaciones son bien conocidas por el experto en la tecnica: pueden ser cremas, barras, champus, geles de ducha, lociones, jabones, emulsiones, geles. Estas formulaciones pueden incluir otros ingredientes tales como, pero que no se limitan a: agua desionizada, silicato de magnesio, silicato de aluminio, goma xantana, nylon-12, PCA de sodio, propilenglicol, 6xidos de hierro rojos, talco, 6xidos de hierro amarillos, 6xidos de hierro negros, di6xido de titanio, estearato de glicerilo, acido estearico, fosfato de DEA-cetilo, metilparabeno, butilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, neopentanoato de isotearilo, palmitato de isopropilo, copolfmeros de etileno/propileno/estireno, copolfmero de butileno/etileno/estireno, palmitato de isopropilo, tocoferilacetato de fenoxietanol, glicerina, trietanolamina, acido estearico, estearato de propilenglicol, aceite mineral, copolfmero de butileno/etileno/estireno, diazolidinilurea, poliisobuteno hidrogenado, palmitato de octilo, neopentanoato de tridecilo, isotearato de isoestearilo, isopropilparabeno, isobutilparabeno, neopentanoato de octildodecilo, acetato de tocoferilo, fragancia, metoxicinamato de octilo, benzofenona, salicilato de octilo, isoestearato de isopropilo, isoceteth-3-acetato de propilenglicol, o cualesquiera combinaciones de los mismos.
Para su uso en aplicaciones terapeuticas, los O-a-gluc6sidos fen6licos de la presente descripci6n pueden ser incorporados en diferentes preparaciones galenicas, tales como pfldoras, comprimidos, jarabes, cremas, lociones, geles, usando por ejemplo envasado, estandarizaci6n, mezcla/homogeneizaci6n, micronizaci6n esteril y no esteril, granulaci6n/compactaci6n, tamizado o cualquier combinaci6n de los mismos. Las preparaciones de dichos O-agluc6sidos fen6licos pueden incluir algunos excipientes de la siguientes lista no exhaustiva: talco, lactosa, estearato de magnesio, monoestearato de glicerol, di6xido de silicio coloidal, di6xido de silicio precipitado, polivinilpirrolidona reticulada, fosfato dibasico de calcio dihidrato, celulosa microcristalina, almid6n de mafz, povidona, carboximetilcelulosa de sodio, polisorbato 80, acido lactico, carb6mero, alcohol cetflico, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, glucosa, dextrosa, trietanolamina, glicerina, fructosa, sacarosa, polfmeros, nanoestructuras.
Las composiciones de esta descripci6n se pueden administrar por vfa oral en cualquier forma de dosificaci6n oral aceptable que incluye, pero no se limita a, capsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los excipientes usados comunmente incluyen lactosa y almid6n de mafz. Tambien se anaden tfpicamente agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para administraci6n oral en una forma de capsula, los diluyentes utiles incluyen lactosa y almid6n de mafz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensi6n. Si se desea, tambien se pueden anadir ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.
Alternativamente, las composiciones de esta descripci6n se pueden administrar en la forma de supositorios para administraci6n rectal. Estos se pueden preparar mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que sea s6lido a temperatura ambiente pero lfquido a la temperatura rectal, y por lo tanto se fundira en el recto para liberar el farmaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
Las composiciones de esta descripci6n tambien se pueden administrar por vfa t6pica, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye areas u 6rganos facilmente accesibles por aplicaci6n t6pica, incluyendo enfermedades del ojo, la piel, o el tracto intestinal inferior. Se preparan facilmente formulaciones t6picas adecuadas para cada una de estas areas u 6rganos.
Para aplicaciones t6picas, las composiciones se pueden formular en una pomada adecuada que contiene el componente activo suspendido o disuelto en uno o mas excipientes. Los excipientes para administraci6n t6pica de los compuestos de esta descripci6n incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, vaselina lfquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones se pueden formular en una loci6n o crema adecuada que contiene los componentes activos
suspendidos o disueltos en uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, monoestearato de sorbitan, polisorbato 60, cera de esteres cetflicos, alcohol cetearflico, 2-octildodecanol, alcohol bencflico y agua.
Para uso oftalmico, las composiciones se pueden formular como suspensiones micronizadas en suero salino esteril de pH ajustado, isot6nico, o, preferiblemente, como disoluciones en suero salino esteril de pH ajustado, isot6nico, bien con o bien sin un conservante tal como cloruro de benzalconio. Alternativamente, para usos oftalmicos, las composiciones se pueden formular en una pomada tal como vaselina.
Las composiciones de esta descripci6n tambien se pueden administrar por aerosol nasal o inhalaci6n. Tales composiciones se preparan segun tecnicas bien conocidas en la tecnica de la formulaci6n farmaceutica, y se pueden preparar como disoluciones en suero salino, empleando alcohol bencflico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorci6n para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarbonos, y/o otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.
Las formas inyectables esteriles de las composiciones de esta descripci6n pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones se pueden formular segun tecnicas conocidas en la tecnica usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensi6n adecuados. La preparaci6n inyectable esteril tambien puede ser una soluci6n o suspensi6n inyectable esteril en un diluyente o disolvente no t6xico parenteralmente aceptable, por ejemplo como una disoluci6n en 1,3-butanodiol. Entre los vehfculos y disolventes aceptables que se pueden emplear estan el agua, disoluci6n de Ringer y disoluci6n de cloruro de sodio isot6nica. Ademas, se emplean convencionalmente aceites esteriles, no volatiles, como disolvente o medio de suspensi6n. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite no volatil suave, incluyendo mono-o digliceridos sinteticos. Los acidos grasos, tales como acido oleico y sus derivados gliceridos, son utiles en la preparaci6n de inyectables, ya que son aceites naturales farmaceuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas tambien pueden contener un diluyente o dispersante alcoh6lico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comunmente en la formulaci6n de formas de dosificaci6n farmaceuticamente aceptables, que incluyen emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos usados comunmente, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes
o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comunmente en la fabricaci6n de formas de dosificaci6n s6lidas, lfquidas u otras, tambien se pueden usar para los fines de la formulaci6n.
Ventajas de la presente descripcion
Las ventajas del metodo de la presente descripci6n sobre los metodos preexistentes aparecen claramente a partir de las descripciones y aspectos previos. Se describe a continuaci6n una lista no exhaustiva de otras ventajas de la presente descripci6n.
La presente descripci6n describe O-a-gluc6sidos fen6licos de
-
acido protocatecuico y sus derivados esteres,
-
acido cafeico y sus derivados esteres, especialmente ester fenetflico del acido rosmarfnico, acido clorogenico y acido cafeico, y acido hidrocafeico o acido 3,4-dihidroxihidrocinamico, acido 3,4-dihidroxifenilacetico y acido 3,4-dihidroxifenilglicol,
-
esculetina,
-
taxifolina,
-
fustina,
-
eriodictiol,
-
fisetina,
-
y ramnetina.
Preferiblemente, los O-a-gluc6sidos fenolfcos de la presente descripci6n se seleccionan en el grupo que consiste en el O-a-gluc6sido de galato de epicatequina, el O-a-gluc6sido de eriodictiol, el O-a-gluc6sido de esculetina, el O-agluc6sido de fisetina, el O-a-gluc6sido de fustina, el O-a-gluc6sido de acido homoprotocatecuico, el O-a-gluc6sido de acido protocatecuico, el O-a-gluc6sido de ester etflico de acido protocatecuico, el O-a-gluc6sido de hidroxitirosol, el O-a-gluc6sido de maclurina, el O-a-gluc6sido de acido nordihidroguaiaretico, el O-a-gluc6sido de oleuropefna, el O-a-gluc6sido de pirocatecol, el O-a-gluc6sido de ramnetina, el O-a-gluc6sido de acido rosmarfnico, el O-agluc6sido de taxifolina, el O-a-gluc6sido de 3-hidroxidaidzefna, el O-a-gluc6sido de 3,4-dihidroxibenzofenona, el O-agluc6sido de acido cafeico, el O-a-gluc6sido de acido dihidrocafeico, el O-a-gluc6sido de ester fenetflico de acido cafeico, el O-a-gluc6sido de cirsiliol, el O-a-gluc6sido de acido clorogenico y el O-a-gluc6sido de antrarobina, el O-agluc6sido de epigalocatequina, el O-a-gluc6sido de dihidrorobinetina, el O-a-gluc6sido de galocatequina, el O-agluc6sido de acido galico, el O-a-gluc6sido de galato de propilo, y el O-a-gluc6sido de robinetina.
Estos O-a-gluc6sidos fen6licos de alto interes en los campos de la cosmetica y la terapia muestran una solubilidad en agua mejorada. En efecto, se ha observado un aumento hasta en al menos 20, 30 o 50 veces de la solubilidad en comparaci6n con la correspondiente aglicona en las mismas condiciones fisiol6gicas.
Estos O-a-gluc6sidos fen6licos tienen una biodisponibilidad aumentada. Estos O-a-gluc6sidos fen6licos pueden ser
5 "activados in situ" mediante su hidr6lisis en la estructura fen6lica inicial por microorganismos comensales humanos, dandoles un status de "profarmaco" de alto interes para aplicaciones tanto de cosmetica como de terapia. Tambien pueden ser activados con una a-glucosidasa, tal como la a-glucosidasa producida por la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Estos O-a-gluc6sidos fen6licos se obtienen mediante un procedimiento enzimatico de "qufmica verde", de bajo
10 coste, fiable, probado, que asegura una alta calidad de estos productos (debido a la especificidad y selectividad de la enzima usada).
EJEMPLOS
Cualesquiera otros aspectos y ventajas de la presente descripci6n apareceran a partir de los siguientes ejemplos, que son ilustrativos de aspectos de la descripci6n.
15 EJEMPLO 1 : Sintesis de taxifolina glucosilada; solubilidad en agua de taxifolina glucosilada altaiente purificada y estabilidad de la iol{cula derivada glucosilada a teiperaturas que oscilan de 4°C a 45°C
Las condiciones que se llevaron a cabo para la sfntesis de taxifolina glucosilada son como sigue (cantidades para 1 litro de medio de reacci6n):
ingrediente
Origen Cantidad Concentraci6n
Disoluci6n de taxifolina a 90 g/L en DMSO puro
Taxifolina: SIGMA T 4512 100 ml Taxifolina: 9 g/L
DMSO
Riedel de Haen 60153 250 ml DMSO total: 350 ml/L
Tamp6n acetato de sodio 500 mM pH 5,2
Acido acetico: Prolabo 20104.298 Hidr6xido de sodio: Riedel de Haen 6203 40 ml Acetato de sodio: 20 mM
Sacarosa a 500 g/L (1,462 M)
Prolabo 27478.296 300 ml 150 g/L 0,439 M
Agua
Desionizada QSP 1,00 L #
Cloruro de calcio, dihidrato
Merck 1.02382.0500 (tambien se puede introducir en el medio de reacci6n en la forma de una disoluci6n a 2 g/L; la dosis es entonces 5 ml/L) 10 mg 10 mg/L
Preparaci6n de dextransacarasa (18 U/ml)
Purificada de caldo de cultivo de L. mesenteroides NRRL B512F 170 ml 3,1 U/ml
20 Se obtuvo primero el medio de reacci6n sin la enzima mezclando las diversas disoluciones en el orden indicado en la tabla. La mezcla se incub6 a 30°C durante un periodo de tiempo suficiente para alcanzar la temperatura deseada de 30°C (mas o menos 0,2°C). Despues, la reacci6n se inici6 introduciendo la preparaci6n de la enzima. El medio de reacci6n puede ser agitado moderadamente.
La preparaci6n de la enzima se ha obtenido como sigue: el caldo de cultivo de Leuconostoc mesenteroides NRRL
25 B512-F, que titulaba una actividad enzimatica que oscilaba de 4 a 6 U/ml, se centrifuga a fin de separar completamente las celulas microbianas del lfquido que contiene la enzima. El sobrenadante de la centrifugaci6n se concentr6 despues 4 a 10 veces por ultrafiltraci6n tangencial (corte de peso molecular de 100 kDa). El retenido se
diluy6 despues 4 veces con tamp6n acetato 20 mM, pH 5,2, que contenfa cloruro de calcio dihidrato a 10 mg/l, y despues se concentro 4 veces a fin de retirar extensivamente los componentes de bajo peso molecular residuales del medio de cultivo celular que contenfa la enzima. La preparaci6n de enzima purificada se ha almacenado despues en forma congelada (-20°C) o liofilizada hasta varios meses sin perdida de actividad. Como procedimiento general, la actividad de la preparaci6n de enzima se ajusta intensificando la concentraci6n del retenido para que el volumen de la preparaci6n de enzima no sea mas alto que 20% del volumen final del medio de reacci6n de sfntesis.
El medio de reacci6n se incub6 a 30°C (mas o menos 0,2°C) durante 22 horas. Se tom6 una alfcuota del medio de reacci6n y se diluy6 50 veces con una disoluci6n que contenfa metanol y agua en las proporciones 40/60. Despues la disoluci6n metan6lica se analiz6 por HPLC.
Las condiciones de analisis fueron las que se describieron previamente, excepto que el perfil de la concentraci6n de metanol fue como sigue (Metodo 2):
-
disolvente A: agua desionizada que contiene acido acetico al 1% v/v
-
disolvente B: metanol de grado HPLC que contiene acido acetico al 1% v/v
-
0 a 10 minutos: 60% A; 40% B; 1 ml/minuto
-
10 a 12 minutos: 60% a 20% A (lineal); 40% a 80% B (lineal); 1 ml/minuto
-
12 a 14 minutos: 20% A; 80% B; 1 ml/minuto
-
14 a 16 minutos: 20% a 60% A (lineal); 80% a 40% B (lineal); 1 ml/minuto
-
16 a 25 minutos: 60% A; 40% B; 1 ml/minuto
-
25 minutos: siguiente inyecci6n
La Figura 7 muestra el cromatograma de HPLC del medio de reacci6n que contiene taxifolina como aceptor de gluc6sido (289 nm) justo en el comienzo de la incubaci6n. El pico principal a 8,15 minutos corresponde a taxifolina.
La Figura 8 muestra el cromatograma de HPLC del medio de reacci6n que contiene taxifolina como aceptor de gluc6sido (289 nm) despues de 22 horas de incubaci6n. Se observ6 un pico con un tiempo de retenci6n de 6,15 minutos.
La Figura 9 muestra el espectro de masas y la Figura 10 el espectro UV del pico eluido a alrededor de 8,15 minutos: la sustancia es taxifolina (m/z [M-H]: 302,96 y m/z [M-H2O]: 284,96) cuyo peso molecular es 304.
La Figura 11 muestra el espectro de masas y la Figura 12 el espectro UV del pico eluido a alrededor de 6,15 minutos: la sustancia correspondiente es gluc6sido de taxifolina (m/z [M-H]: 464,98) dado que su peso molecular es 466.
Las sustancias eluidas a 9,33 y 12,75 minutos son sustancias polifen6licas encontradas en la preparaci6n de taxifolina.
La Figura 13 muestra el cromatograma de HPLC de una disoluci6n acuosa que contiene taxifolina y gluc6sido de taxifolina despues de llevar a cabo la purificaci6n para retirar la enzima, dextrano, fructosa y DMSO y una fracci6n de taxifolina residual. Las condiciones de eluci6n son las descritas previamente, en las que el contenido inicial de metanol es 10% (metodo 1). La taxifolina es eluida a 24,01 minutos y el gluc6sido de taxifolina a 22,33 minutos.
El gluc6sido de taxifolina ha sido purificado extensivamente para reducir tanto como fuera posible la concentraci6n de taxifolina. Se obtuvo finalmente una disoluci6n que titulaba mas que 93 mM de gluc6sido de taxifolina con una concentraci6n residual de taxifolina menor que 2 mM (Figura 14; la taxifolina eluy6 a 8,95 minutos y el gluc6sido de taxifolina eluy6 a 6,55 minutos).
Las concentraciones de gluc6sido de taxifolina se determinaron con sigue: despues de haber establecido la relaci6n entre la concentraci6n molar de taxifolina y las areas de picos con una preparaci6n de taxifolina caracterizada con precisi6n (SIGMA), las concentraciones de gluc6sido de taxifolina se determinaron aplicando la relaci6n entre area y concentraci6n al gluc6sido de taxifolina, dado que la taxifolina y el gluc6sido de taxifolina tienen los mismos espectros UV. Despues, se obtuvieron las concentraciones en g/L multiplicando la concentraci6n molar por el valor del peso molecular del gluc6sido de taxifolina (466). Mientras que la solubilidad de la taxifolina en agua a 25°C se mide a 1,19 g/L (3,91 mM), la solubilidad del gluc6sido de taxifolina en agua a 25°C es mayor que 43,5 g/L (93,2 mM).
Es posible, por tanto, segun el metodo descrito, sintetizar una nueva sustancia, gluc6sido de taxifolina, con un peso molecular de 466 y una solubilidad en agua a alrededor de 25°C mayor que 93 mM, que corresponde a un aumento en la solubilidad en agua con respecto al residuo de taxifolina superior a 23. El gluc6sido de taxifolina se puede purificar segun tecnicas mencionadas previamente (adsorci6n en resinas, eluci6n, concentraci6n, extracci6n lfquido lfquido, retirada de disolvente y concentraci6n y eventualmente secado).
La disoluci6n de gluc6sido de taxifolina se puede almacenar durante un periodo de tiempo largo sin perdida del 5 enlace glucosfdico y con una resistencia a la oxidaci6n muy satisfactoria.
Se realizaron estudios de periodo de conservaci6n acelerado usando camaras de temperatura a 4°C, 22°C, 37°C y 45°C durante 4 meses. El contenido de gluc6sido de taxifolina se midi6 frecuentemente, y el color y olor se controlaron de manera somera. El contenido de gluc6sido de taxifolina se determin6 por HPLC como se describi6 anteriormente (diluci6n 500 veces de una alfcuota de la disoluci6n y analisis usando el metodo 2; detecci6n: 210
10 400 nm).
La siguiente tabla describe la cantidad observada de gluc6sido de taxifolina frente al tiempo de almacenamiento a diferentes temperaturas de almacenamiento.
Dias
Cantidad medida de gluc6sido de taxifolina (en % de la cantidad inicial)
Almacenado a +4°C
Almacenado a +22°C Almacenado a +37°C Almacenado a +45°C
0
100 100 100 100
9
100 100 100 100
23
100 100 100 91
37
100 100 100 94
63
100 95 96 79
118
100 100 91 73
No se han observado cambios de color ni olor cualquiera que fuera la temperatura de almacenamiento.
15 Por lo tanto, el enlace glucosfdico entre la taxifolina y el resto de glucosa es estable en las condiciones ensayadas anteriormente. A 37°C y 45°C, se ha observado una ligera degradaci6n para el gluc6sido de taxifolina, debida probablemente a oxidaci6n: en efecto, no se observ6 un aumento de la concentraci6n de taxifolina que indicara una hidr6lisis del enlace glucosfdico en las correspondientes disoluciones. En las condiciones mencionadas anteriormente, la semivida del gluc6sido de taxifolina se estima en 1,6 anos a 37°C, y 0,67 anos a 45°C.
20 Este ejemplo demuestra que el gluc6sido de taxifolina tiene una alta estabilidad qufmica, incluso en condiciones de almacenamiento duras.
EJEMPLO 2 : Influencia de la concentracion de DMSO sobre la eficacia de las sintesis de glucosido de taxifolina
Se llev6 a cabo la sfntesis enzimatica de gluc6sido de taxifolina como se describe en el Ejemplo 1, con las 25 siguientes excepciones:
•
la concentraci6n de enzima fue 1 U/ml
•
la concentraci6n de DMSO fue 35%, 25%, 15% 6 5%.
Despues de 22 horas de incubaci6n, las concentraciones relativas de gluc6sido de taxifolina en los cuatro medios de reacci6n se presentan en la siguiente tabla.
DMSO, %
35 25 15 5
Gluc6sido de taxifolina (concentraci6n relativa), %
100 133 161 17
La concentraci6n de DMSO 6ptima para la sfntesis de gluc6sido de taxifolina parece estar en un valor
significativamente mas bajo que 30% y cercano a 15%.
EJEMPLO 3 : Activacion del glucosido de taxifolina por iicroflora de piel huiana
Se recogi6 por separado flora cutanea de 5 donantes. Los antebrazos y frente de cada donante fueron raspados con un hisopo de algod6n-lana saturado con una disoluci6n de NaCl (v = 5 ml, 8 g/l). Despues de cada raspado, el hisopo fue dividido en la disoluci6n de NaCl restante y exprimido para entregar el material muestreado. Despues de dos ciclos de raspado/exprimido sobre ambos antebrazos y tres sobre la frente, la preparaci6n problema obtenida se filtr6 (40 Im) para eliminar las escamas y finalmente se centrifug6 (4°C, 5000 g, 16 min). Los granulos microbianos fueron resuspendidos en una disoluci6n de NaCl (v = 1 ml, 8 g/l) y se caracterizaron por OD a 600 nm.
Las cinco muestras microbianas se mezclaron para formar la suspensi6n microbiana final usada para el ensayo. Se cultivaron celulas microbianas usando el medio de cultivo Hickey-Tresner (extracto de levadura a 1,0 g/L, extracto de carne a 1,0 g/L, peptona de casefna a 2,0 g/L, almid6n a 10,0 g/L, cloruro de cobalto hexahidrato a 20 mg/L; pH=6). El crecimiento microbiano se llev6 a cabo en matraces Erlenmeyer de 100 ml a 37°C bajo agitaci6n continua (100 rpm). El caldo de cultivo esteril (20 ml) fue inoculado con 0,1 mL de suspensi6n. El crecimiento microbiano fue controlado midiendo la OD a 600 nm.
Se obtuvo gluc6sido de taxifolina como se describe en el ejemplo 1 (preparaci6n altamente purificada correspondiente al cromatograma APLC presentado en la Figura 14). El gluc6sido de taxifolina se anadi6 o no en el dfa 0 (V = 0,5 ml de 0,20 Im de disoluci6n esterilizada). El control se hizo cultivando la suspensi6n microbiana final sin gluc6sido de taxifolina.
Despues de la centrifugaci6n de una alfcuota de medio de cultivo celular, el sobrenadante se diluy6 4 veces con una disoluci6n que contenfa metanol y agua en las proporciones de 40/60. las concentraciones de gluc6sido de taxifolina y taxifolina en los sobrenadantes se determinaron por HPLC (metodo 2).
La Figura 15 muestra el crecimiento bacteriano aparente durante una semana en el medio de cultivo de Hickey-Tresner. Del dfa 3 al dfa 7, la producci6n de biomasa aparente es mas alta en presencia de gluc6sido de taxifolina que en su ausencia. Esto se podrfa explicar por una concentraci6n mas alta de fuente de carbono y energfadebido a la liberaci6n de la glucosa del gluc6sido de taxifolina bajo la hidr6lisis bacteriana.
En la Figura 16, la hidr6lisis del gluc6sido de taxifolina no se puede detectar durante los primeros tres dfas. Despues de tres dfas de incubaci6n, probablemente cuando la fuente de carbono y energfa llega a ser limitante, la concentraci6n de gluc6sido de taxifolina disminuye de una manera significativa y el flavonoide aglicona, taxifolina, aparece concomitantemente. La tensi6n nutricional sufrida por la comunidad bacteriana que se origina de la flora cutanea humana podrfa estimular la liberaci6n del residuo glucosilo mediante la acci6n de las enzimas secretadas.
Este ejemplo demuestra que la flora cutanea humana reconoce y es capaz de hidrolizar el enlace glucosfdico flavonoide con un alto rendimiento, ofreciendo una nueva vfa para la entrega de ingredientes activos.
EJEMPLO 4 : Activacion del glucosido de taxifolina por una preparacion de a-glucosidasa
Se incub6 gluc6sido de taxifolina en presencia de una enzima a-glucosidasa en las siguientes condiciones:
-
Gluc6sido de taxifolina obtenido como se describe en el ejemplo 1 (preparaci6n altamente purificada correspondiente al cromatograma de HPLC presentado en la Figura 14): 0,25 ml;
-a-glucosidasa (de Saccharomyces cerevisiae; FLUKA 70797; lote 0641337/1; actividad: 5,8 U/mg): 50,1 mg en 5 ml de tamp6n fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,3; sin enzima en el medio de control;
-
Temperatura: 30°C;
-
Agitaci6n moderada.
Los medios de reacci6n se analizaron por HPLC (metodo 2) despues de una diluci6n a 2 veces de una alfcuota con metanol.
Despues de 18 horas de incubaci6n, la molecula de gluc6sido de taxifolina permaneci6 sin cambios en el medio que no contenfa la enzima a-glucosidasa, mientras que la molecula de gluc6sido de taxifolina fue convertida totalmente en taxifolina en presencia de la enzima a-glucosidasa.
Estos resultados muestran que una enzima aislada especffica para la hidr6lisis de enlaces a-glucosfdicos es capaz de hidrolizar la molecula de gluc6sido de taxifolina: esto indica que la molecula de gluc6sido de taxifolina contiene taxifolina y glucosa, estando la glucosa enlazada a un grupo hidroxilo de la taxifolina mediante un enlace aglucosfdico. Por esta raz6n, los nuevos derivados glucosfdicos sintetizados son derivados de O-a-D-gluc6sido reivindicados.
EJEMPLO 5 : Sintesis enziiatica de O-a-D-glicosidos de pirocatecol, acido protocatecuico y {ster etilico de acido protocatecuico.
Se prepararon medios de reacci6n como se describe en el Ejemplo 1, siendo la taxifolina reemplazada por pirocatecol (SIGMA, referencia C 9510), o por acido protocatecuico (ALDRICH, referencia D10,980-0) o por ester etflico de acido protocatecuico (ALDRICH, referencia E 2,485-9).
Despues de 21 horas de incubaci6n, se diluy6 una muestra de cada medio de reacci6n 5 veces con una disoluci6n que contenfa metanol y agua en las proporciones de 40/60 y despues se analiz6 por HPLC (metodo 1).
Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Aceptor de glucosilo
Tiempo de retenci6n, minutos m/z [M-H] Identificaci6n (peso molecular te6rico)
Pirocatecol (cromatograma a 276 nm en la Figura 17)
13,78 108,74 Pirocatecol (110)
16,80
271,01 Monogluc6sido de pirocatecol (272)
14,88
433,05 Digluc6sido de pirocatecol (434)
13,22
595,06 Trigluc6sido de pirocatecol (596)
11,87
919,35 Pentagluc6sido de pirocatecol (920)
Acido protocatecuico (cromatograma a 294 nm en la Figura 18)
11,26 152,88 Acido protocatecuico (154)
8,25
315,05 Monogluc6sido de acido protocatecuico (316)
7,89
477,00 Digluc6sido de acido protocatecuico (478)
7,15
801,26 Tetragluc6sido de acido protocatecuico (802)
Ester etflico del acido protocatecuico (cromatograma a 295 nm en la Figura 19)
28,28 180,96 Ester etflico del acido protocatecuico (182)
27,30
343,02 Monogluc6sido de ester etflico de acido protocatecuico (344)
24,99
505,05 Digluc6sido de ester etflico de acido protocatecuico (506)
20,54
829,30 Tetragluc6sido de ester etflico de acido protocatecuico (830)
Es posible por tanto, segun el metodo descrito, sintetizar los nuevos derivados glucosilados de pirocatecol, acido
10 protocatecuico y ester etflico de acido protocatecuico: los productos resultantes son una familia de sustancias que contienen al menos derivados monoglucosilados, diglucosilados, triglucosilados y tetraglucosilados.
EJEMPLO 6 : Sintesis enziiatica de O-a-D-glicosidos de acido cafeico, acido 3,4-dihidroxihidrocinaiico (acido hidrocafeico) y acido rosiarinico.
Se prepararon medios de reacci6n como se describe en ejemplo 1, siendo reemplazada la taxifolina por acido
15 cafeico (SIGMA, referencia C 0625), o por acido 3,4-dihidroxihidrocinamico (ALDRICH, referencia D10,980-0 o por acido rosmarfnico (FLUKA, referencia 44699; la concentraci6n de acido rosmarfnico en el medio de reacci6n fue 1 g/L).
Despues de 21 horas de incubaci6n, una muestra de cada medio de reacci6n se diluy6 5 veces con una disoluci6n que contenfa metanol y agua en las proporciones de 40/60 y despues se analiz6 por HPLC (metodo 1).
20 Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Acido cafeico (cromatograma a 322 nm en la Figura 20)
19,53 178,97 Acido cafeico (180)
15,46
341,09 Monogluc6sido de acido cafeico (342)
14,62
503,16 Digluc6sido de acido cafeico (504)
Acido 3,4dihidroxihidrocinamico (acido hidrocafeico) (cromatograma a 278 nm en la Figura 21)
18,72 343,02 Monogluc6sido de acido hidrocafeico (344)
17,93
505,05 Digluc6sido de acido hidrocafeico (506)
17,80
180,96 Acido hidrocafeico (182)
17,50
343,02 Monogluc6sido de acido hidrocafeico (344)
17,06
667,21 Trigluc6sido de acido hidrocafeico (668)
16,23
829,25 Tetragluc6sido de acido hidrocafeico (830)
16,01
505,05 Digluc6sido de acido hidrocafeico (506)
15,70
992,36 Pentagluc6sido de acido hidrocafeico (992)
14,70
667,21 Trigluc6sido de acido hidrocafeico (668)
13,92
829,39 Tetragluc6sido de acido hidrocafeico (830)
13,22
991,50 Pentagluc6sido de acido hidrocafeico (992)
21,61
1153,60 Hexagluc6sido de acido hidrocafeico (1154)
12,08, 11,21
# Grado de polimerizaci6n mayor que 6
Acido rosmarfnico (cromatograma a 295 nm en la Figura 22)
28,36 359,09 Acido rosmarfnico (360)
27,18
521,16 Monogluc6sido de acido rosmarfnico (522)
Es posible por tanto, segun el metodo descrito, sintetizar derivados glucosilados deacido cafeico, acido hidrocafeico y acido rosmarfnico: los productos resultantes son una familia de sustancias que contienen derivados al menos monoglicosilados, diglucosilados, triglucosilados y tetraglucosilados. En lo que se refiere al acido hidrocafeico,
5 aparece claramente que ambos grupos hidroxilo han sido sustituidos: de hecho, se pueden ver dos series de derivados, que contienen ambos, derivados al menos monoglucosilados (344), diglucosilados (506), triglucosilados (668), tetraglucosilados (830) y pentaglucosilados (992). Esto muestra que, en algunos casos que no pueden ser predichos por un experto, ambos grupos hidroxilados pueden aceptar un resto de glucosa.
EJEMPLO � : Sintesis enziiatica de O-a-D-glicosidos de acido 3,4-dihidroxiiand{lico, esculetina y esculina.
10 Se prepararon medios de reacci6n como se describe en el ejemplo 1, siendo reemplazada la taxifolina por acido 3,4dihidroximandelico (ALDRICH, referencia 151610), o por esculetina (ALDRICH, referencia 24,657-3) o esculina (SIGMA, referencia E 8250).
Despues de 21 horas de incubaci6n, una muestra de cada medio de reacci6n se diluy6 5 veces con una disoluci6n que contenfa metanol y agua en las proporciones de 40/60 y despues se analiz6 por HPLC (metodo 1).
15 Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Aceptor de glucosilo
Tiempo de retenci6n, minutos m/z [M-H] Identificaci6n (peso molecular te6rico)
Acido 3,4dihidroximandelico
14,68 136,82 Desconocido
(cromatograma a 322 nm en la Figura 23)
5,32 136/164 Desconocido
4,10
182,95 Acido 3,4-dihidroximandelico (184)
3,45
341,03 Desconocido
2,79
341,03 Desconocido
2,49
140,80 Desconocido
Esculetina (cromatograma a 346 nm en la Figura 24)
18,36 176,91 Esculetina (178)
15,65
339,03 Monogluc6sido de esculetina (340)
14,74
501,06 Digluc6sido de esculetina (502)
12,25
987,40 Pentagluc6sido de esculetina (988)
11,686
1149,55 Hexagluc6sido de esculetina (1150)
Esculina o 6-O--Dpiran6sido de esculetina (cromatograma a 343 nm en la Figura 25)
18,30 176,91 Esculetina (178)
13,69
338,99 Esculina o 6-O--D-piran6sido de esculetina
11,38
501,06 Monogluc6sido de esculina (502)
10,73
663,15 Digluc6sido de esculina (664)
9,38
1149,48 Tetragluc6sido de esculina (1150)
El acido 3,4-dihidroximandelico contiene una estructura de pirocatecol como la taxifolina, el pirocatecol, el acido protocatecuico, el acido cafeico: no obstante, no se ha sintetizado ningun derivado glucosilado del acido 3,4dihidroximandelico en las presentes condiciones.
5 De manera inesperada, la cadena principal de la 6,7-dihidroxicumarina es tambien un aceptor de gluc6sido que conduce a una serie de esculetinas glucosiladas. Se tiene que subrayar que el monogluc6sido de esculetina sintetizado tiene un tiempo de retenci6n de 15,65 minutos, mientras que la esculetina glucosilada natural (6-O--Dglucopiran6sido de esculina o esculetina) tiene un tiempo de retenci6n de 13,69 minutos: esto tiene que ser atribuido a que el enlace osfdico en el caso de la molecula natural es del tipo a mientras que el enlace osfdico en la esculina
10 es del tipo �.
De manera inesperada, la esculina es un aceptor de gluc6sido, probablemente por su resto de glucosa.
EJEMPLO � : Sintesis enziiatica de O-a-D-glicosidos de acido galico, galato de propilo y galato de epigalocatequina.
Se prepararon medios de reacci6n como se describe en el ejemplo 1, siendo reemplazada la taxifolina por acido
15 galico (FLUKA, referencia 48630), o por galato de propilo (SIGMA, referencia P3130) o por galato de epigalocatequina (SIGMA, referencia 44699) y siendo la concentraci6n de DMSO reducida a 15% v/v.
Despues de 6 horas de incubaci6n, una muestra de cada medio de reacci6n se diluy6 5 veces con una disoluci6n que contenfa metanol y agua en las proporciones de 40/60 y despues se analiz6 usando el equipo de HPLC descrito anteriormente con una combinaci6n de eluente A (agua desionizada que contiene acido acetico al 1% v/v) y eluente
20 B (metanol de grado HPLC que contiene acido acetico al 1% v/v) como se indica a continuaci6n.
Los resultados se presentan en la siguiente tabla: Condiciones del analisis:
Aceptor de glucosilo
Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Condiciones del an�lisis
Acido galico
7,92 Acido galico 10,40 O-a-D-gluc6sido de acido galico G6
5,95 Acido galico
6,75 O-a-D-gluc6sido de acido galico G1
Galato de propilo
27,22 Galato de propilo 25,35 O-a-D-gluc6sido de galato de propilo G1
Galato de epigalocatequina
17,03 Galato de epigalocatequina 18,30 y 17,60 O-a-D-gluc6sido de galato de epigalocatequina y di-Oa-D-gluc6sido de galato de epigalocatequina G1
G1: caudal 1 ml/min; de 0 a 10 min: B aumenta linealmente de 10 a 20%; de 10 a 25 min: B aumenta linealmente de 20 a 50%; de 25 a 30 min: B es estable a 50%; de 30 a 35 min: B disminuye linealmente de 50 a 10%.
5 G6: caudal 1 ml/min; de 0 a 20 min: B aumenta linealmente de 2,5 a 25%; de 20 a 25 min: B es estable a 25%; de 25 a 28 min: B disminuye linealmente de 25 a 2,5%.
Es posible por tanto, segun el metodo descrito, sintetizar los nuevos derivados glucosilados de acido galico, galato de propilo y galato de epigalocatequina: los productos resultantes son una familia de sustancias que contienen al menos un derivado monoglucosilado.
10 EJEMPLO � : Sintesis enziiatica de O-a-D-glicosidos de {ster fenetilico de acido cafeico, acido clorog{nico y 3,4-dihidroxibenzofenona.
Se prepararon medios de reacci6n como se describe en el ejemplo 1, siendo reemplazada la taxifolina por ester fenetflico de acido cafeico (SIGMA, referencia C8221), o por acido clorogenico (SIGMA, referencia C3878) o por 3,4dihidroxibenzofenona (ALDRICH, referencia 579815) y las concentraciones de DMSO fueron 15% y 25% v/v.
15 Despues de 6 horas de incubaci6n, una muestra de cada medio de reacci6n se diluy6 5 veces con una disoluci6n que contenfa metanol y agua en las proporciones de 40/60 y despues se analiz6 usando el equipo de HPLC descrito anteriormente con una combinaci6n de eluente A (agua desionizada que contiene acido acetico al 1% v/v) y eluente B (metanol de grado HPLC que contiene acido acetico al 1% v/v) como se indica a continuaci6n.
Los resultados se presentan en la siguiente tabla:
Aceptor de glucosilo (DMSO 15 � 25%)
Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Condiciones del an�lisis
Ester fenetflico del acido cafeico
20,15 Ester fenetflico del acido cafeico 17,42 y 16,88: productos mayoritarios 18,42, 15,65, 14,22 y 13,77 O-a-gluc6sidos de ester fenetflico del acido cafeico G2
Acido clorogenico
15,53 Acido clorogenico 11,00 y 10,67 Mono-O-a-gluc6sido de acido clorogenico y di-O-agluc6sido de acido clorogenico G1
3,4-Dihidroxibenzofenona
32,35 3,4-Dihidroxibenzofenona 27,98 y 27,68 O-a-gluc6sido de 3,4-Dihidroxibenzofenona y di-Oa-gluc6sido de 3,4-Dihidroxibenzofenona G1
Condiciones del analisis:
G1: vease el ejemplo 8
G2: caudal 1 ml/min; de 0 a 20 min: B aumenta linealmente de 40 a 80%; de 20 a 22 min: B es estable a 80%; de 22 a 27 min: B disminuye linealmente de 80 a 40%.
Es posible por tanto, segun el metodo descrito, sintetizar los nuevos derivados glucosilados de ester fenetflico de 5 acido cafeico, acido clorogenico y 3,4-dihidroxibenzofenona: los productos resultantes son una familia de sustancias que contienen al menos un derivado monoglucosilado.
EJEMPLO 1� : Sintesis enziiatica de O-a-D-glicosidos de catequina, eriodictiol, fisetina, oleuropeina y acido nordihidroguaiar{tico.
Se prepararon medios de reacci6n como se describe en el ejemplo 1, siendo reemplazada la taxifolina por catequina
10 (FLUKA, referencia 22110), o por eriodictiol (EXTRASYNTHESE, referencia 0056) o por fisetina (SIGMA, referencia F4043), o por oleuropefna (EXTRASYNTHESE, referencia 0204) o por acido nordihidroguaiaretico (EXTRASYNTHESE, referencia 6135) y las concentraciones de DMSO fueron 15% y 25% v/v.
Despues de 6 horas de incubaci6n, una muestra de cada medio de reacci6n se diluy6 5 veces con una disoluci6n que contenfa metanol y agua en las proporciones de 40/60 y despues se analiz6 usando el equipo de HPLC descrito
15 anteriormente con una combinaci6n de eluente A (agua desionizada que contiene acido acetico al 1% v/v) y eluente B (metanol de grado HPLC que contiene acido acetico al 1% v/v) como se indica a continuaci6n.
Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Aceptor de glucosilo (DMSO 15 � 25%)
Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Condiciones del an�lisis
Catequina
14,07 12,60 O-a-gluc6sido de catequina G1
Eriodictiol
30,10 Eriodictiol 27,18 y 26,90 O-a-gluc6sido de eriodictiol y di-O-a-gluc6sido de eriodictiol G1
Fisetina
29,37 Fisetina 26,05 O-a-gluc6sido de fisetina G1
Oleuropefna
28,28 Oleuropefna 26,45 y 24,68 O-a-gluc6sido de oleuropefna y di-O-agluc6sido de oleuropefna G1
Acido nordihidroguaiaretico
18,53 Acido nordihidroguaiaretico 16,97 y 16,40: productos mayoritarios 15,53 O-a-gluc6sidos de acido nordihidroguaiaretico G2
Condiciones del analisis:
20 G1: vease el ejemplo 8 G2: vease el ejemplo 9 Es posible por tanto, segun el metodo descrito, sintetizar los nuevos derivados glucosilados de catequina, eriodictiol,
fistina, oleuropefna y acido nordihidroguaiaretico: los productos resultantes son una familia de sustancias que contienen al menos un derivado monoglucosilado.
25 EJEMPLO 11 : Sintesis enziiatica de O-a-D-glicosidos de catequina, acido 3,4-dihidroxibenzoico, acido galico, acido rosiarinico, acido cafeico y acido clorog{nico en iedios estrictaiente acuosos.
Se prepararon medios de reacci6n como se describe en el ejemplo 1, siendo reemplazada la taxifolina por catequina (FLUKA, referencia 22110), a una concentraci6n de 7,5 g/L, o por acido 3,4-dihidroxibenzoico (ALDRICH, referencia D10,980-0) a una concentraci6n de 9,0 g/L, o por acido galico (FLUKA, referencia 48630) a una concentraci6n de
5 9,0 g/L, o por acido rosmarfnico (FLUKA, referencia 44699) a una concentraci6n de 7,5 g/L, o por acido cafeico (SIGMA, referencia C0625) a una concentraci6n de 9,0 g/L, o por acido clorogenico (SIGMA, referencia C3878) a una concentraci6n de 7,5 g/L. El DMSO fue omitido, mientras que la concentraci6n de tamp6n acetato de sodio fue aumentado hasta 100 mM y la actividad enzimatica fue reducida a 1,0 U/ml.
Despues de 6 horas de incubaci6n, una muestra de cada medio de reacci6n se diluy6 5 veces con una disoluci6n
10 que contenfa metanol y agua en las proporciones de 40/60 y despues se analiz6 usando el equipo de HPLC descrito anteriormente con una combinaci6n de eluente A (agua desionizada que contiene acido acetico al 1% v/v) y eluente B (metanol de grado HPLC que contiene acido acetico al 1% v/v) como se indica a continuaci6n.
Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Aceptor de glucosilo
Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Condiciones del an�lisis
Catequina
13,57 Catequina 12,57 O-a-gluc6sido de catequina G1
Acido galico
5,95 Acido galico 6,75 O-a-gluc6sido de acido galico G1
Acido cafeico
18,62 Acido cafeico 14,27 O-a-gluc6sido de acido cafeico G1
Acido 3,4dihidroxibenzoico
10,58 Acido 3,4-dihidroxibenzoico 6,83 O-a-gluc6sido de acido 3,4dihidroxibenzoico G1
Acido rosmarfnico
27,65 Acido rosmarfnico 26,42, 25,15 y 24,33: O-a-gluc6sidos de acido rosmarfnico G1
Acido clorogenico
15,63 Acido clorogenico 10,95 O-a-gluc6sidos de acido clorogenico G1
15 Condiciones del analisis:
G1: vease el ejemplo 8
Es posible por tanto, segun el metodo descrito, sintetizar los nuevos derivados glucosilados de catequina, acido galico, acido cafeico, acido 3,4-dihidroxibenzoico, acido rosmarfnico y acido clorogenico en ausencia de disolvente organico: los productos resultantes son una familia de sustancias que contienen al menos un derivado
20 monoglucosilado.
EJEMPLO 12 : Intento para la sintesis enziiatica de O-a-D-glicosidos de acido elagico, alizarina, epinefrina, rutina y baicaleina.
Se prepararon medios de reacci6n como se describe en el ejemplo 1, siendo reemplazada la taxifolina por acido elagico (FLUKA, referencia 45140), o por rutina (SIGMA, referencia R5143), o por alizarina (EXTRASYNTHESE,
25 referencia 0411), o por epinefrina (SIGMA, referencia E4250), o por baicalefna (FLUKA, referencia 11712). La concentraci6n de DMSO fue 25% v/v.
Despues de 6 horas y 21 horas de incubaci6n, una muestra de cada medio de reacci6n se diluy6 5 veces con una disoluci6n que contenfa metanol y agua en las proporciones de 40/60 y despues se analiz6 usando el equipo de HPLC descrito anteriormente con una combinaci6n de eluente A (agua desionizada que contiene acidoacetico al 1% v/v) y eluente B (metanol de grado HPLC que contiene acido acetico al 1% v/v) como se indica a continuaci6n.
Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Aceptor de glucosilo
Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Tiempo de retenci6n, min Identificaci6n Condiciones del an�lisis
Acido elagico
27,42 Acido elagico Ningun otro pico y por tanto ningun O-a-gluc6sido de acido elagico G1
Rutina
26,33 Rutina Ningun otro pico y por tanto ningun O-a-gluc6sido de acido elagico G1
Alizarina
19,17 Alizarina Ningun otro pico y por tanto ningun O-a-gluc6sido de acido elagico G2
Epinefrina
5,96 Epinefrina Ningun otro pico y por tanto ningun O-a-gluc6sido de acido elagico G6
Baicalefna
11,60 Baicalefna Ningun otro pico y por tanto ningun O-a-gluc6sido de acido elagico G4
Condiciones del analisis:
G1: vease el ejemplo 8
G2: vease el ejemplo 9
10 G6: vease el ejemplo 8
G4: caudal 1 ml/min; de 0 a 10 min: B aumenta linealmente de 40 a 80%; de 10 a 15 min: b es estable a 80%; de 15 a 20 min: B disminuye linealmente de 80 las sustancias ensayadas contienen una estructura de pirocatecol, los sustituyentes del anillo no permiten su reconocimiento por la enzima. En el caso de la rutina, la parte sacarida del 3O-rutin6sido de quercetina parece ser muy importante para el reconocimiento de la enzima, dado que la quercetina
15 esta glucosilada en la posici6n 3' y/o 4' (BERTRAND et al.) mientras que la rutina no lo esta.

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para producir un O-a-gluc6sido fen6lico, que comprende incubar sacarosa y una glucansacarasa de Leuconostoc species con un compuesto fen6lico que tiene la siguiente f6rmula:
    en la que R2 es H o OH; y R1 se selecciona del grupo que consiste en
    -
    10 en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH;
    -
    en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR, y R8 es H o OH, a condici6n de que al 15 menos uno entre R7 y R8 representa OH; --(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2; --(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal, ramificado o cfclico; --(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2; 20 - -H; -
    -
    en donde R es H o un grupo hidrocarbonado C1-C10 lineal, ramificado o cfclico, aromatico o no, saturado o insaturado, opcionalmente interrumpido por al menos un heteroatomo, en donde dicho grupo hidrocarbonado 5 comprende un alquilo, un alquenilo o un alquinilo, que puede estar sustituido por uno o varios sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en: un arilo (C5-C9), un heterociclo (C4-C9), un alcoxi (C1-C3), un acilo (C2-C3), un alcohol (C1-C3), un grupo carboxflico (-COOH), un ester (C2-C3), una amina (C1-C3), un grupo amino (-NH2), una amida (-CONH2), una imina (C1-C3), un nitrilo, un hidroxilo (-OH), un grupo aldehfdo (-CHO), un hal6geno, un halogenoalquilo (C1-C3), un tiol (-SH), un tioalquilo (C1-C3), una sulfona (C1-C3), un sulf6xido (C1-C3), y una
    10 combinaci6n de los mismos.
  2. 2. Metodo segun la reivindicaci6n 1, en donde R1 del compuesto fen6lico es
    en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH.
    15 3. Metodo segun la reivindicaci6n 1, en donde R1 del compuesto fen6lico es
    en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR, y R8 es H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R7 y R8 representa OH.
  3. 4. Metodo segun la reivindicaci6n 1, en donde R1 del compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en
    20 a) -(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2; b) -(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6lineal, ramificado
    o cfclico; c) -(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2; d) H;
    25 e)
    f)
  4. 5. Metodo segun la reivindicaci6n 1, en donde el compuesto fen6lico se selecciona del grupo que consiste en la
    5 taxifolina, el eriodictiol, la dihidrorobinetina, la fustina, la catequina, la epicatequina, el galato de catequina, el galato de epicatequina, la galocatequina, la epigalocatequina, el galato de galocatequina, el galato de epigalocatequina, el acido homoprotocatecuico, el acido dihidrocafeico, el ester etflico del acido protocatecuico, el galato de propilo, el acido galico, la hamamelitanina (2',5-di-O-galoil-hamamelosa), el acido protocatecuico, el acido cafeico, el acido rosmarfnico, la esculetina, la 4-metilesculetina, la nordalbergina (6,7-dihidroxifenilcumarina), el acido clorogenico, el
    10 ester fenetflico del acido cafeico, el acido chic6rico (acido dicafeoiltartarico), el equinac6sido (2-(3,4-dihidroxifenil)etil) O-6-desoxi-alfa-L-manopiranosil-(1-3)-O-(beta-D-glucopiranosil-(1-6))-, 4-(3-(3,4-dihidroxifenil)-2-propenoato, beta-D-glucopiran6sido), el verbasc6sido, la maclurina, el 3,4-dihidroxibenzaldehfdo, la 3,4-dihidroxibenzofenona, la butefna (2',3,4,4'-tetrahidroxichalcona), la 3,4-dihidroxiacetofenona, la marefna (2',3,3',4,4'-pentahidroxi-4'glucosilchalcona), la eriodictiolchalcona (2',4',6',3,4-pentahidroxichalcona), el pirocatecol, el acido
    15 nordihidroguaiaretico, la oleuropefna.
  5. 6.
    Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la glucansacarasa es de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F.
  6. 7.
    Un O-a-gluc6sido fen6lico que tiene la siguiente f6rmula:
    20 en la que
    A y B, identicos o diferentes, son H o un residuo -a-glucosilo, a condici6n de que al menos uno de A y B es un residuo -a-glucosilo; R2 es H o OH; y, R1 se selecciona del grupo que consiste en
    25 -
    en donde R3 y R4, independientemente, son H o OH, a condici6n de que al menos uno entre R3 y R4 representa OH; y,
    -
    en donde R7 se selecciona del grupo que consiste en H, -OH o -OCOR, y R8 es H o OH, a condici6n de que,
    cuando R2 es H, R7 y R8 no son ambos OH, y al menos uno entre R7 y R8 es OH;
    --
    (CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2;
    --
    (CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal, ramificado o 10 cfclico;
    --
    (CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2;
    -H; -
    15 -
    en donde R es H o un grupo hidrocarbonado C1-C10 lineal, ramificado o cfclico, aromatico o no, saturado o insaturado, opcionalmente interrumpido por al menos un heteroatomo, en donde dicho grupo hidrocarbonado comprende un alquilo, un alquenilo o un alquinilo, que puede estar sustituido por uno o varios sustituyentes 20 seleccionados del grupo que consiste en: un arilo (C5-C9), un heterociclo (C4-C9), un alcoxi (C1-C3), un acilo (C2-C3), un alcohol (C1-C3), un grupo carboxflico (-COOH), un ester (C2-C3), una amina (C1-C3), un grupo amino (-NH2), una
    amida (-CONH2), una imina (C1-C3), un nitrilo, un hidroxilo (-OH), un grupo aldehfdo (-CHO), un hal6geno, un halogenoalquilo (C1-C3), un tiol (-SH), un tioalquilo (C1-C3), una sulfona (C1-C3), un sulf6xido (C1-C3), y una combinaci6n de los mismos.
  7. 8.
    O-a-gluc6sido fen6lico segun la reivindicaci6n 7, en el que R1 es
  8. 9.
    O-a-gluc6sido fen6lico segun la reivindicaci6n 7, en el que R1 es
  9. 10.
    O-a-gluc6sido fen6lico segun la reivindicaci6n 7, en el que R1 se selecciona del grupo que consiste en a) -(CH2)n-COOR o -(CH2)n-CONHR, siendo n un numero entero de 0 a 2; b) -(CR12=CH)-COOR o -(CR12=CH)-CONHR, siendo R12 H o un alquilo o alquenilo C1-C6 lineal o cfclico; c) -(CH2)n-COR o -(CH=CH)n-COR, siendo n un numero entero de 0 a 2.
  10. 11.
    O-a-gluc6sido fen6lico segun la reivindicaci6n 7, en el que R1 se selecciona del grupo que consiste en
  11. 12.
    O-a-gluc6sido fen6lico segun la reivindicaci6n 7, en donde el O-a-gluc6sido fen6lico se selecciona del grupo que
    15 consiste en O-a-gluc6sido de taxifolina, el O-a-gluc6sido de eriodictiol, el O-a-gluc6sido de dihidrorobinetina, el O-agluc6sido de fustina, el O-a-gluc6sido de galato de catequina, O-a-gluc6sido de galato de epicatequina, el O-agluc6sido de galocatequina, el O-a-gluc6sido de epigalocatequina, el O-a-gluc6sido de galato de galocatequina y el O-a-gluc6sido de galato de epigalocatequina, el O-a-gluc6sido de acido homoprotocatecuico, el O-a-gluc6sido de acido dihidrocafeico, el O-a-gluc6sido del ester etflico del acido protocatecuico, el O-a-gluc6sido de galato de propilo,
    20 el O-a-gluc6sido de acido galico, el O-a-gluc6sido de hamamelitanina, el O-a-gluc6sido de acido protocatecuico, el O-a-gluc6sido de acido cafeico, el O-a-gluc6sido de acido rosmarfnico, el O-a-gluc6sido de esculetina, el O-agluc6sido de 4-metilesculetina, el O-a-gluc6sido de nordalbergina (6,7-dihidroxifenilcumarina), el O-a-gluc6sido de acido clorogenico, el O-a-gluc6sido del ester fenetflico del acido cafeico, el O-a-gluc6sido de acido chic6rico (acido dicafeoiltartarico), el O-a-gluc6sido de equinac6sido (2-(3,4-dihidroxifenil)etil O-6-desoxi-alfa-L-manopiranosil-(1-3)
    25 O-(beta-D-glucopiranosil-(1-6))-, el O-a-gluc6sido de 4-(3-(3,4-dihidroxifenil)-2-propenoato), el O-a-gluc6sido de beta-D-glucopiran6sido, el O-a-gluc6sido de verbasc6sido, el O-a-gluc6sido de maclurina, el O-a-gluc6sido de 3,4dihidroxibenzaldehfdo, el O-a-gluc6sido de 3,4-dihidroxibenzofenona, el O-a-gluc6sido de butefna (2',3,4,4'tetrahidroxichalcona), el O-a-gluc6sido de 3,4-dihidroxiacetofenona, el O-a-gluc6sido de marefna (2',3,3',4,4'pentahidroxi-4'-glucosilchalcona), el O-a-gluc6sido de eriodictiolchalcona (2',4',6',3,4-pentahidroxichalcona), el O-agluc6sido de pirocatecol, el O-a-gluc6sido de acido nordihidroguaiaretico, el O-a-gluc6sido de 3-hidroxidaidzefna, el O-a-gluc6sido de oleuropefna y el O-a-gluc6sido de maritimefna (3',4',6,7-tetrahidroxi-6-O-glucosilaurona).
  12. 13. O-a-gluc6sido fen6lico segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en donde dicho residuo de O-a5 glucosilo es un mon6mero de glucosa.
  13. 14.
    O-a-gluc6sido fen6lico segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-13, que tiene una solubilidad 20 veces mas alta que la correspondiente aglicona en las mismas condiciones fisiol6gicas.
  14. 15.
    O-a-gluc6sido fen6lico segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-14, en donde dicho O-a-gluc6sido fen6lico puede ser escindido por una enzima para liberar la correspondiente aglicona.
    10 16. O-a-gluc6sido fen6lico segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-15 como medicamento.
  15. 17.
    Una composici6n farmaceutica o cosmetica que comprende un O-a-gluc6sido fen6lico segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-15.
  16. 18.
    Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende ademas usar el O-a-gluc6sido fen6lico para preparar una composici6n farmaceutica o cosmetica.
    15 19. Uso de un O-a-gluc6sido fen6lico segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-15 para preparar una composici6n farmaceutica o cosmetica para ser administrada por vfa t6pica, oral, rectal, nasal o vaginal, en donde enzimas emitidas por microorganismos asociados a la piel, boca, tracto intestinal, sistema respiratorio superior o tracto genital femenino liberan la correspondiente aglicona.
  17. 20. Uso de un O-a-gluc6sido fen6lico segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-15 para preparar una
    20 composici6n farmaceutica o cosmetica para tratar o prevenir un cancer, una enfermedad cardiovascular, una nfecci6n bacteriana, un eritema inducido por UVB, una alergia, un trastorno inflamatorio o inmune.
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