CN114469926B - 二氢槲皮素的新用途及二氢槲皮素水凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及二氢槲皮素的新用途及二氢槲皮素水凝胶的制备方法；新用途为：二氢槲皮素在制备调控皮肤菌群结构的药物和/或化妆品中的应用。制备方法为：(1)称量泊洛沙姆和壳聚糖置于烧杯中，加去离子水，磁力搅拌至充分溶解，置于4℃冰箱中充分溶胀，得到澄清粘稠的泊洛沙姆空白凝胶，置于冰箱静置备用，得到泊洛沙姆/壳聚糖水凝胶；(2)取二氢槲皮素和透明质酸，溶于醋酸溶液中，磁力搅拌至粉末完全溶解，取泊洛沙姆/壳聚糖水凝胶，加入到二氢槲皮素/透明质酸溶液中，搅拌至充分溶解，配置成含二氢槲皮素的水凝胶溶液，置于4℃冰箱中充分溶胀，得负载二氢槲皮素的水凝胶。新用途的发现为皮肤感染性疾病的治疗提供了新的方法和有利依据。

Description

二氢槲皮素的新用途及二氢槲皮素水凝胶的制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及二氢槲皮素的新用途及二氢槲皮素水凝胶的制备方法。

背景技术

二氢槲皮素是一种具有广泛的药理活性和药用价值的生物类黄酮，具有保护肝脏、保护肾脏、抗炎、镇痛、抑菌、抗糖尿病、保护心脑血管、改善微循环、抗肿瘤、治疗关节炎等功效。其在自然界中广泛分布，存在于多种植物中，其主要分在落叶松科落叶松、长白落叶松、西伯利亚落叶松、朝鲜落叶松、日本落叶松中，除了落叶松科之外，二氢槲皮素还分布在葡萄科、蔷薇科、菊科、桑科、杜鹃花科、百合科、胡桃科等50余科植物中，主要以苷元和糖苷的形式存在。欧盟和我国相继将二氢槲皮素批准为新食品原料，这为二氢槲皮素的发展提供了机遇。

水凝胶，一种以共价键或非共价键交联而形成的具有三维网络结构的高分子材料，其不仅具有较好的生物相容性和可生物降解功能，还可以诱导组织再生、促进细胞生长/增殖，并能够在伤口表面缓慢释放促进皮肤生长的活性成分，因而引起越来越多学者的重视。目前，负载二氢槲皮素的水凝胶未见报道。

发明内容

本发明将二氢槲皮素与水凝胶交联，获得负载二氢槲皮素的水凝胶；通过对二氢槲皮素水凝胶调控皮肤伤口菌群的研究，确定二氢槲皮素能够调控皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性和均匀度；因此，本发明的第一个目的在于：提供二氢槲皮素的新用途，具体为：二氢槲皮素在制备调控皮肤菌群结构的药物和/或化妆品中的应用。

作为本发明的优选，二氢槲皮素的新用途为：所述二氢槲皮素在制备调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性的药物和/或化妆品中的应用。

作为本发明的优选，二氢槲皮素的新用途为：所述二氢槲皮素在制备调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群均匀度的药物和/或化妆品中的应用。

作为本发明的优选，二氢槲皮素用于调控皮肤菌群结构时，二氢槲皮素是负载在水凝胶内，之后通过涂覆的方式涂在皮肤上。

另外，本发明对二氢槲皮素水凝胶通过诱导自噬途径促进创伤皮肤的修复进程进行研究，确定二氢槲皮素水凝胶是通过激活MAPK介导的自噬途径而促进创伤皮肤修复；因此，本发明的第二个目的在于：提供一种MAPK介导的自噬信号通路激活剂，该激活剂包括负载二氢槲皮素的水凝胶。

本发明通过二氢槲皮素水凝胶对创面组织中VEGF、HIF-a、Pan-Keratin及CD31的影响进行研究，确定二氢槲皮素可促进受伤组织中生长因子的表达而加速创面修复；因此，本发明的第三个目的在于：提供一种促进受伤组织中生长因子表达的药物，该药物包括负载二氢槲皮素的水凝胶。

本发明通过二氢槲皮素水凝胶对小鼠皮肤创面伤口愈合的影响进行研究，确定含有二氢槲皮素的水凝胶样品有利于创伤修复；另外，通过对小鼠皮肤伤口愈合的组织病理学分析，发现二氢槲皮素水凝胶处理后，皮肤创伤部位炎性细胞明显被抑制，成纤维细胞大量增殖，且可见少量血管和新生表皮形成；进一步证实，二氢槲皮素水凝胶处理可加速伤口创面表皮生成，在皮肤修复过程中表现出良好的促进作用；因此，本发明的第四个目的在于：提供一种促进皮肤伤口修复的方法，该方法为：在皮肤伤口处涂敷含有二氢槲皮素水凝胶的药物。

本发明第五个目的在于：提供一种负载二氢槲皮素的水凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)称量泊洛沙姆和壳聚糖置于在烧杯中，加去离子水，利用磁力搅拌器搅拌，充分溶解后，放置于4℃冰箱中充分溶胀，得到澄清粘稠的泊洛沙姆空白凝胶，置于冰箱静置备用，得到泊洛沙姆/壳聚糖水凝胶；

(2)取二氢槲皮素和透明质酸，溶于醋酸溶液中，磁力搅拌至粉末完全溶解，取步骤(1)的泊洛沙姆/壳聚糖水凝胶，加入到二氢槲皮素/透明质酸溶液中，搅拌至充分溶解，配置成含二氢槲皮素的水凝胶溶液，放置于4℃冰箱中充分溶胀，得到负载二氢槲皮素的水凝胶。

作为本发明的优选，所述泊洛沙姆的量为0.17-0.5g；所述壳聚糖的量为0.01-0.05g；所述二氢槲皮素与透明质酸的质量比为2:2-0.5；所述醋酸溶液的浓度为0.1-0.5％；二氢槲皮素水凝胶溶液中二氢槲皮素的含量为2-6mg/mL；所制备的负载二氢槲皮素的水凝胶孔隙之间相互连通，交联密度增加，孔径逐渐缩小，微腔壁同样出现多孔结构，总体呈现出三维网状结构；且具有温敏型，具体表现为在4℃时呈现溶液状态，在25-37℃的温度下呈现凝胶状。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明通过实验证实了二氢槲皮素能够调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性和均匀度，同时还能够促进有益菌的生长，该新用途的发现为皮肤感染性疾病的治疗提供了新的方法和有利依据。

(2)本发明提供了一种全新的MAPK介导的自噬信号通路激活剂，其为MAPK介导的自噬信号通路参与的疾病的治疗提供了新的方法。

(3)本发明通过实验发现二氢槲皮素水凝胶可促进受伤组织中生长因子的表达，这与“Evaluation of pro-apoptotic potential of taxifolin against liver cancer”公开的二氢槲皮素抑制生长因子的表达完全相反；充分证明负载二氢槲皮素的水凝胶对二氢槲皮素的功效有较大影响，在皮肤伤口处涂敷负载二氢槲皮素的水凝胶，可加速伤口创面表皮生成，促进受损皮肤修复。

(4)本发明提供的二氢槲皮素水凝胶的制备方法操作简便、生产成本低、收率高。

附图说明

图1为P407/HA/CS/TAX复合水凝胶SEM及形貌图；其中，A：P407/HA/CS水凝胶SEM图，放大倍数×200；B：P407/HA/CS水凝胶SEM图，放大倍数×2000；C：P407/HA/CS/TAX复合水凝胶SEM图，放大倍数×200；P407/HA/CS/TAX复合水凝胶SEM图，放大倍数×2000；E：4℃下P407/HA/CS/TAX复合水凝胶；F：37℃下P407/HA/CS/TAX复合水凝胶；

图2为P407/HA/CS/TAX复合水凝胶红外光谱图；

图3为P407/HA/CS/TAX复合水凝胶XRD谱图；

图4为P407/HA/CS/TAX复合水凝胶热重曲线；

图5为P407/HA/CS/TAX复合水凝胶体外缓释图；

图6为P407/HA/CS/TAX复合水凝胶的溶胀性图；

图7为P407/HA/CS/TAX复合水凝胶的抗氧化活性图；

图8为P407/HA/CS/TAX复合水凝胶的生物相容性图；

图9为水凝胶对小鼠皮肤创面愈合及愈合率的影响图，其中，A:皮肤创面愈合；B:愈合率；

图10为水凝胶对小鼠皮肤组织病理学变化的影响图；

图11为水凝胶对小鼠创面组织中VEGF和Pan-Keratin蛋白表达的影响图；

图12为水凝胶对小鼠创面组织中CD31和HIF-1α蛋白表达的影响图；

图13为水凝胶对小鼠创面组织中炎症因子的影响图；

图14为水凝胶对小鼠创面组织中NF-κB和IKK-α蛋白表达的影响图；

图15为二氢槲皮素水凝胶对小鼠创面组织中Erk、JNK和P38表达蛋白的影响图；

图16为二氢槲皮素水凝胶对小鼠创面组织中自噬相关蛋白表达蛋白的影响图；

图17为皮肤损伤小鼠创面不同指数稀释曲线；其中，A:chao1指数；B:Shannoncurves指数；C:Simpson指数；D:Pielou's evenness指数；

图18为二氢槲皮素水凝胶对小鼠创面菌群Alpha多样性的影响图；

图19为PCoA分析bray-curtis距离算法和weighted UniFrac距离算法图；其中，A:bray-curtis距离算法；B:weighted UniFrac距离算法；

图20为NMDS分析图；其中，A:bray-curtis距离算法；B:weighted UniFrac距离算法；

图21为层积聚类分析及组间差异分析图；其中，A:层积聚类分析；B:组间差异分析；

图22为二氢槲皮素对小鼠创面菌群组成Venn图分析图；

图23为二氢槲皮素水凝胶对小鼠创面菌群组成分析图；其中，A:群落热图分析(属水平)；B:群落条形图(门水平)；C:群落条形图(属水平)；

图24为二氢槲皮素水凝胶对皮肤损伤小鼠皮肤菌群物种差异和标志物的分析图；其中，A:进化分枝图；B:基于LDA的分布柱形图；C:PCA分析(门水平)；D:PCA分析(属水平)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1负载二氢槲皮素水凝胶的制备和表征

一、试验方法

1.1仪器与试剂

XRD-7000S/L型X射线衍射仪(日本岛津公司)、EMS-13磁力搅拌器(天津市欧诺仪器仪表有限公司)、真空冷冻干燥机(美国sigma公司)、Nexus 870型傅里叶变换红外光谱仪，(美国Nicolet公司)；Regulus 8230型超高分辨扫描电子显微镜(日本日立公司)、Q50热重分析仪(美国TA公司)。

壳聚糖(Sigma-Aldrich)，泊洛沙姆407(巴斯夫)，壳聚糖、透明质酸(HA)(源叶生物)，ABST、DPPH试剂等(北京中生瑞泰)。

1.2 P407/CS水凝胶的制备

称量泊洛沙姆P407(0.17g)和壳聚糖CS(0.01g)置于在烧杯中，加去离子水中溶解，利用磁力搅拌器搅拌4-6h，充分溶解后，放置于4℃冰箱中充分溶胀，得到澄清粘稠的泊洛沙姆空白凝胶，置于冰箱静置备用。

1.3负载二氢槲皮素(TAX)的P407/HA/CS温敏型水凝胶的制备

取二氢槲皮素(TAX)20mg和透明质酸(HA)10mg，溶于5ml 0.5％的醋酸溶液中，磁力搅拌至粉末完全溶解，取5ml的P407/CS水凝胶加入到二氢槲皮素/HA溶液中，搅拌至充分溶解，配置成二氢槲皮素含量为2mg/mL的水凝胶溶液，放置于4℃冰箱中充分溶胀，置于冰箱静置备用。

1.4复合水凝胶断面的扫描电镜测试

将制备好的样品冻干，样品的断面进行喷金处理后，在超高分辨扫描电子显微镜上观察水凝胶断面的微观结构。

1.5傅里叶红外变换光谱仪测试

将冻干后的测试样品与溴化钾以质量比约1∶100的比例在红外灯下混合研磨压片，使用傅里叶红外变换光谱仪测试，扫描范围为500～4000cm^-1。

1.6X射线衍射测试

将冻干后的测试样品制成30mm×30mm×3mm的薄片，干燥至质量恒定，采用X射线衍射仪测试不同样品的X射线衍射图谱，扫描角度为10°～80°，扫描速度为0.02(°)/s，扫描电压为40kV，扫描电流为40mA。

1.7热重测试

将冻干后的测试样品，采用热重分析仪在氮气氛围进行测试，测试温度范围为10～900℃，加热速度为10℃/min。

1.8体外缓释试验测试

称取一定量的P407/HA/CS温敏型水凝胶，浸没于10m L PBS溶液中，置于37℃培养箱中孵育，振荡速度为20r/min，一定时间后，在各个时间点(1h、2h、4h、6h....)用移液枪移取出溶液并补PBS溶液，共测定128h，待测液于4℃下保存，用高效液相色谱法检测二氢槲皮素的含量。

1.9溶胀性能测试

将测试样品烘干至质量恒定，使用分析天平称量记录样品质量m₀，之后置于室温的去离子水中，每隔一定时间更换一次水，在指定的时间点轻轻取出样品，用滤纸吸干水分，称量记录时间为t时的样品质量m_t，计算样品的溶胀度。

溶胀率％＝(mt-m₀)/m₀×100

二、试验结果

2结果与分析

2.1 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶的宏观和微观形貌

由附图1可知，P407/HA/CS/TAX水凝胶在4℃的条件下呈透明溶液状态，37℃孵育1min后，将装有水凝胶的试管倒置，溶液变为透明水凝胶结构，且倒置后不流动。通过扫描电子显微镜观察P407/HA/CS水凝胶和P407/HA/CS/TAX水凝胶微观形貌，从图中发现，P407/HA/CS水凝胶内部疏松多孔，呈现出不规则的微腔，而P407/HA/CS/TAX复合水凝胶孔隙之间相互连通，交联密度增加，导致了孔径逐渐缩小，微腔壁同样出现多孔结构，总体呈现出三维网状结构，这种多孔、网状结构更利于作为药物缓释载体及组织工程支架，同时这在创伤愈合过程中能够有效促进气体和组织液交换。

2.2 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶的红外光谱分析

附图2为壳聚糖、P407/HA/CS/TAX水凝胶、P407/HA/CS水凝胶等的的红外谱图。在二氢槲皮素的红外谱图中，在3471cm^-1处是醇、酚类物质O-H伸缩振动吸收峰，羟基可以形成分子间氢键，所以峰形较宽，在P407/HA/CS/TAX水凝胶的红外光谱中O-H被拉伸，在2908cm^-1处出现C-H伸缩振动吸收峰，且形成水凝胶后锋形变的尖锐，水凝胶的红外光谱中可以看到在1653cm^-1附近有C＝N亚胺的特征吸收峰，该吸收峰可以证明二氢槲皮素的羟基和壳聚糖的氨基发生反应，说明发生交联形成了水凝胶。总体来看，P407/HA/CS/TAX水凝胶、P407/HA/CS水凝胶的红外图谱区别不大，主要在高波数端有轻微区别，这可能是P407/HA/CS水凝胶与二氢槲皮素复合后高波数端的羟基叠加造成的，经过叠加后二氢槲皮素的吸收峰不明显，基本被P407/HA/CS的吸收峰所遮盖。

2.3 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶的X射线衍射仪分析

XRD图谱显示，二氢槲皮素在2θ为15°、20-27.5°、32.5°-37.5°处出现凸峰，15°为一个较大且尖锐的衍生峰，P407/HA/CS和泊洛沙姆P407在18°和23°均出现两个衍射峰，且两个衍生锋的强度相似，而在P407/HA/CS/TAX复合凝胶中在15°和23°同样出现相同的两个衍生锋，二氢槲皮素在20-27.5°、32.5°-37.5°的结晶区消失，可能是相容的共聚物体系，各组分间有较强的相互作用，衍射图谱则表现为某些聚合物组分特征衍射峰的消失，并使结晶发生变化。

2.4 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶热重测试分析

附图4为CS/P407/TAX复合水凝胶的热重曲线，由图可以看出，空白水凝胶再201℃是失重为10％，而载药水凝胶温度再260℃时失重为10％左右，载药后水凝胶的失重温度提高了60℃，这一阶段主要是水凝胶中的水分蒸发导致的失重；载药水凝胶在260℃～340℃时，CS/P407水凝胶迅速失重，这是由于水凝胶中一些低聚物和水凝胶链上较为稳定的基团的断裂分解所致，说明添加二氢槲皮素后有利于增加水凝胶的热稳定性。

2.5 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶体外缓释性能分析

由附图5中缓释的柱状图可见，在初始阶段，CS/P407/TAX复合水凝胶负载的二氢槲皮素释放速率较快，随着释放时间的延长，二氢槲皮素的释放速率逐渐减慢，在72h达到释放的最大值，72h后二氢槲皮素的释放变化不大，表明CS/P407/TAX复合水凝胶的药物释放达到平衡。在释放初期，由于二氢槲皮素在复合水凝胶表面和释放介质之间的浓度梯度较大，从而导致释放速度较快，随着时间的延长，复合水凝胶内部的二氢槲皮素不断向介质中扩散，水凝胶表面和释放介质中二氢槲皮素浓度梯度逐渐降低，使得药物释放速率减缓。在释放时间为128h，二氢槲皮素的释放量能够达到86.6％，说明CS/P40 7/TAX复合水凝胶具有较好的缓释作用。

2.6 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶溶胀性能分析

附图6中显示CS/P407水凝胶及CS/P407/TAX复合水凝胶在37℃下溶胀行为随时间的变化曲线。由图可以看出，随着时间的延长，CS/P407水凝胶及CS/P407/TAX复合水凝胶的溶胀率均出现先增加后趋于平稳的趋势，二者均在30min后达到最高值，CS/P407水凝胶及CS/P407/TAX复合水凝胶的溶胀率分别34％和31.3％，溶胀率随二氢槲皮素的添加而降低。可能是因为添加二氢槲皮素具有较多的酚羟基，添加后导致极性基团羟基增多，从而使分子间氢键等相互作用增强，水凝胶交联密度增高，进而导致溶胀率降低。

实施例2 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶的抗氧化和生物相容性分析

一、试验方法

1.1体外抗氧化活性测试

1.1.1 DPPH自由基清除试验

准确称取10.0mg DPPH，用无水乙醇溶解，随后定容至100mL容量瓶中，取P407/HA/CS空白水凝胶和P407/HA/CS/TAX水凝胶各100μL分别与3.9mL的DPPH溶液混匀，37℃下避光反应30min，以无水乙醇溶液为空白对照组，测得样品吸光度为A_i，以无水乙醇代替DPPH溶液和100μL样品溶液反应测得的吸光度值记为A₀，每个样品平行试验3次取平均值，在紫外波长为517nm处测定吸光度值。清除率计算公式如下：

1.1.2 ABTS自由基清除试验

将ABTS用无水乙醇溶解后和过硫酸钾等体积混合，在黑暗室温下放置12-16h，在734nm波长下，用无水乙醇稀释至吸光度0.70±0.05，作为ABTS自由基工作液，取P407/HA/CS水凝胶和P407/HA/CS/TAX水凝胶各100μL分别与3.9mL的ABTS溶液混匀，涡旋振荡混匀，室温下避光反应15min，以无水乙醇溶液为空白对照组，测得样品吸光度为A_i，以无水乙醇代替ABTS溶液和100μL样品溶液反应测得的吸光度值记为A₀，每个样品平行试验3次取平均值，在紫外波长为734nm处测定吸光度值。清除率计算公式如下：

1.1.3羟基自由基清除试验

取P407/HA/CS水凝胶和P407/HA/CS/TAX水凝胶各100μL，加入6mmol/L水杨酸-乙醇溶液，2mmol/L FeSO₄溶液和1mmol/L H₂O₂溶液，37℃水浴30min，以无水乙醇溶液为空白对照组，测得样品吸光度为A_i，以无水乙醇代替基液溶液和100μL样品溶液反应测得的吸光度值记为A₀，每个样品平行试验3次取平均值，在紫外波长为710nm处测定吸光度值，羟基自由基清除率计算公式如下：

1.2生物相容性测试

1.2.1溶血试验

取P407/HA/CS水凝胶和P407/HA/CS/TAX水凝胶各100μL放入试管，随后加入质量分数为0.9％氯化钠注射液，37℃避光孵育30min后加入稀释的葡萄糖-柠檬酸血液，稀释比例为血液:0.9％氯化钠注射液1:50，37℃孵育1h后离心取上清液，每个样品平行试验3次取平均值，在紫外波长为545nm处测定吸光度值，测得样品吸光度为A_i，以0.9％氯化钠注射液为阴性对照，测得的吸光度为A₀，以蒸馏水为阳性对照测得的吸光度为A_y，计算公式如下：

1.2.2细胞毒性试验

采用MTT测试复合水凝胶的细胞毒性。称取适量水凝胶冻干粉用培养基溶解后用微孔滤膜过滤，紫外照射后待用。将HaCaT细胞接种到培养皿中，加入含有10％FBS的DMEM/F12培养基，在37℃含有5％CO₂的恒温培养箱中进行培养。当培养至细胞密度超过80％时，消化并收集细胞。随后转移至96孔板培养，96孔板中加入适量的培养基和100μL的P407/HA/CS水凝胶和P407/HA/CS/TAX水凝胶，并设置阴性空白对照，待材料和细胞共同培养24h后，每孔加入10μL的MTT溶液并在37℃，5％CO₂的恒温培养箱中避光培养4h，用酶标仪在570nm处测定吸光度，计算公式如下：

细胞存活率％＝OD值(样品组)/OD值(对照组)×100

二、试验结果与分析

2.1 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶抗氧化活性分析

本发明显示，伤口敷料中含一定抗氧化成分可以减少过氧化作用，保护细胞免受损伤。由附图7(**p<0.01；)可知，P407/HA/CS水凝胶清除ABTS、DPPH和羟基自由基的能力分别为24.98％、14.43％、62.13％，添加二氢槲皮素后水凝胶清除ABTS、DPPH和羟基自由基的能力分别提升至92.09％、89.31％和89.03％，添加二氢槲皮素可以显著性提高水凝胶的抗氧化活性，表现出较好的羟基自由基清除能力，说明二氢槲皮素赋予水凝胶较强的抗氧化作用，为伤口修复做理论支持。

2.2 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶生物相容性分析

生物相容性包括血液相容性和组织相容性，伤口辅料应用于人体的前提是必须具有良好生物相容性和安全性。由附图8(A)可知，P407/HA/CS/TAX复合水凝胶以及P407/HA/CS水凝胶的溶血指数分别为4.46％和4.56％，均在5％以下，符合YY/T1651.1-2019规定的标准值，二氢槲皮素的添加可以降低水凝胶的溶血指数。本发明采用了MTT法来检查水凝胶的细胞毒性。由附图8(B)可以看出，P407/HA/CS/TAX复合水凝胶以及P407/HA/CS水凝胶的细胞毒性较小，添加二氢槲皮素在一定程度上可以提高细胞存活率逐渐增加，这可能和其疏松的双网络结构利于促进细胞的黏附及增殖有关。

实施例3 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶促进皮肤修复的研究

1.1材料与方法

1.1药品与试剂

二氢槲皮素样品(自制，纯度为92.5％)；壳聚糖(chitosan，CS，100kDa)购于山东青岛博智汇力有限公司，纯度≥95.0％；泊洛沙姆(Poloxamer 188)购于长春百金生物科技有限公司，纯度≥99.0％；透明质酸(Hyaluronic acid，HA)购于山东安华生物医药有限公司，纯度≥99.0％；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)购于上海酶联科技生物有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、苏木精-伊红(H&E)染液检测试剂盒、免疫荧光(DyLight 488-SABC和SABC-Cy3)染色试剂盒购于南京建成生物工程研究所；单克隆抗体VEGF、HIF-a及Pan-Keratin、CD31、Erk1/2、p-Erk1/2、MAPK(P38,p-P38)、LC3Ⅰ/Ⅱ、Atg5、Atg7、Beclin-1、P62、GAPDH、JNK、p-JNK、NF-κB(p65)、IKK kinaseα(IKKα)和β-acting均购自Abcam(Cambridge，英国)。

1.2实验动物

SPF级ICR雄性小鼠30只购自长春市亿斯实验动物有限公司(吉林省，18-22g)，合格证号：SCXK(吉)-2017-0064。

1.3仪器

电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号：LE204E/02)；恒温强磁力搅拌器(北京北信科仪分析仪器有限公司，型号：HG23-JJ88JB-2)；冷冻干燥机(德国Christ仪器公司，型号：ALPHA 1-2LD plus)；连续光谱扫描式酶标仪(美国Thermo Electron公司，型号MK3型)；紫外分光光度计(上海棱光技术有限公司756S)；扫描电镜(日本Hitachi公司S4800)；傅里叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司，型号：TENSOR 27)；同步热分析仪(德国Netzsch公司，型号：TG-DSC)；高速冷冻型微量离心机(北京大龙建设集团有限公司，型号：D3024R)；石蜡包埋机(湖北锦源医疗科技有限公司，型号:JYBMC)；石蜡切片机(德国Leica，型号：LeicaRM2235)，荧光成像显微镜(日本Olympus CX41)；凝胶成像分析系统、通用电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY-Clear ECL/JY600E)。

1.4实验方法

1.4.1供试药物的制备

见实施例1。

1.4.2皮肤创伤修复模型的制备及分组设计

所有小鼠适应性饲养一周，然后随机分为3组，每组10只：对照组(Control)，P407/HA/CS水凝胶组(Gel)，P407/HA/CS/TAX水凝胶组(TAXGel)。在实验手术当天，腹腔注射10％的水合氯醛(0.1mL/10g)麻醉小鼠，然后背部剃毛，用酒精对小鼠背部剃毛区域进行消毒后，用直径为1.2cm的管沾印泥在小鼠背部进行标记，然后根据圆形印记在其背部剪去一个直径为1.2cm的圆形全层皮肤伤口，造模完成。然后将空白水凝胶及载药水凝胶涂敷在皮肤伤口处，并每天固定时间段换药。每三天对皮肤伤口进行拍照，并测量伤口愈合面积。待伤口愈合后，将小鼠处死，并剪下愈合后的皮肤组织，一部分用4％甲醛固定，用于病理切片，另一部分用锡纸包裹，迅速放入液氮冷却后无菌-80℃保存，备用。

1.4.3创面愈合情况观察及分析

在造模后0、4、8、12、16天对皮肤创伤部位拍照，观察创面的修复情况，并用透明膜描记创面形状大小。

1.4.4皮肤组织炎症因子测定

将-80℃保存的皮肤组织取出，称取一定的组织用冰的生理盐水匀浆(1:9，m/v)，于3500r/min离心10min，收集上清液，置于4℃冷藏储存备用。按照ELLSA说明书测定TNF-α、IL-1β、IL-6在组织中的含量。

1.4.5组织病理学染色检查

(1)组织包埋与切片

取材和修剪组织：新鲜组织用4％的多聚甲醛固定24h以上，然后将组织从多聚甲醛固定液中取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修剪平整，并放入贴有对应标签的脱水盒内；

脱水处理：将装有组织的脱水盒放进脱水机内依次用酒精和二甲苯进行梯度脱水。用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇脱水处理1次，每次30min。然后使用无水乙醇与二甲苯混合液处理10min，再用二甲苯处理10min，备用；

包埋：在自动包埋机中进行包埋。加热温度和样品控制台温度控制在60±1℃，冷冻台控制在5±1℃；将组织移至加热台上，浸入石蜡中，然后移至样品控制台；在冷冻控制台中将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

切片：将修正后的蜡块放在切片机上进行切片，直至组织出现，切片厚度控制在4-6μm。水浴温度控制在48±2℃，将切片浮于表明展平，然后用载玻片轻轻捞起，并放置于60±2℃烘箱中烤片，直至烤干取出，备用。

(2)H&E染色

首先将切片依次置于二甲苯I、二甲苯II、无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中，各10min脱蜡处理，再浸入流动自来水中冲洗掉乙醇；然后用苏木精染液染色1min，用自来水冲洗；1％盐酸分化10s，目的是褪去胞浆之中的苏木精染料；然后使用1％氨水蓝化5sec，伊红染色2min；使用70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇进行梯度洗脱，每次2min，再用二甲苯I、二甲苯II各5min进行透化处理，最后用中性树胶封片。

(3)Masson染色

切片常规脱蜡处理如前所述，然后将切片置于丽春红酸性品红染液中2min，之后将其放入0.2％冰醋酸水溶液、5％磷铝酸水溶液、0.2％冰醋酸水溶液，各处理2min；甲基绿染色3min，然后用自来水冲洗；最后使用酒精溶液进行梯度脱水，然后二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察皮肤组织细胞脂肪变性、坏死、炎症细胞浸润等病理变化。

1.4.6免疫荧光染色分析

为了评估TAXGel对皮肤创伤的修复作用，对皮肤组织中生长因子的表达进行免疫荧光染色。组织切片如前所述用二甲苯溶液脱蜡并在乙醇中水合后，在柠檬酸盐缓冲溶液(0.01M，pH 6.0)中进行抗原修复20分钟，然后将组织与1％牛血清白蛋白(BSA)孵育1h，然后加入一抗VEGF(1:200)、HIF-a(1:400)、Pan-Keratin(1:400)和CD31(1:400)在4℃下孵育过夜，次日用PBS溶液洗涤三次、每次10min后加入二抗在37℃孵育30min，然后再次用SABC-CY3(1:100)标记。细胞核用4,6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，加入抗荧光猝灭剂封片后使用荧光显微镜观察表达情况，Image-Pro Plus 6.0软件分析免疫荧光强度。

1.4.7蛋白免疫印迹分析

使用RIPA裂解缓冲液(1:10，m/v)将收集的皮肤组织裂解成匀浆。使用BCA蛋白质检测试剂盒分析蛋白质浓度，并将其统一为5mg/mL。装载量为20μL，样品用12％SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离并转移到PVDF膜上。在用5％脱脂奶粉密封至少1.5h后，将膜在4℃下与一抗Erk1/2(1:1000)、p-Erk1/2(1:1000)、MAPK(P38,p-P38)(1:1000)、LC3Ⅰ/Ⅱ(1:1000)、Atg5(1:1000)、Atg7(1:1000)、Beclin-1(1:1000)、P62(1:1000)、JNK(1:600)、p-JNK(1:600)、NF-κB(p65)(1:400)、IKK kinaseα(IKKα)(1:400)一起孵育过夜。将膜在含有0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水(TBS)中洗涤3次，然后在室温下与HRP标记的二级抗体孵育1h。用ECL发光溶液检测蛋白质条带信号，并分析蛋白质的光密度。

1.5统计学分析

所有数据均表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)，并通过单向方差分析(ANOVA)进行分析。统计图由GraphPad Prism 6.0.4软件(GraphPad Software,Inc,San Diego,USA)表示，P<0.05或P<0.01定义为差异有统计学意义。

二、结果与分析

2.1水凝胶对小鼠皮肤创面伤口愈合的影响

通过对小鼠背部皮肤进行创伤造模，并每隔四天对创面进行拍照记录皮肤创面修复情况。结果发现，如图9所示，随着时间的推移，创伤小鼠整体上均呈现出愈合的趋势，但愈合速率和修复效果不同。与对照组相比，在造模后第5天各组愈合情况即显现出明显不同，Gel组小鼠创伤部结痂明显，伤口开始紧缩，而TAXGel组愈合速率最快，伤口创面缩小明显，改善效果最好。造模第9天，Gel组小鼠伤口创面缩小明显，但恢复效果与对照组相比并无显著差别，而TAXGel组小鼠伤口创面基本恢复。造模第13、16天，TAXGel组小鼠伤口创面已皮化，基本恢复，且恢复效果明显优于其他组。结果表明，含有二氢槲皮素的水凝胶样品有利于创伤修复。

2.2水凝胶对小鼠皮肤伤口愈合的组织病理学分析

为评价二氢槲皮素对创伤皮肤的修复作用，通过收集创面皮肤进行切片处理，并通过组织病理学研究皮肤伤口的愈合情况。附图10，H&E染色显示对照组和Gel组皮肤创伤处伴有明显地炎性细胞浸润，细胞排列不规则并有明显凋亡，且结构紊乱。然而，经TAXGel处理改善之后，皮肤创伤部位炎性细胞明显被抑制，与对照组相比，可见少量血管和新生表皮形成。此外，Masson染色观察到的结果与H&E染色基本一致。如附图10所示，对照组可见大量胶原纤维，明显的纤维粘连和大量炎症细胞。显然，与对照组相比，TAXGel治疗明显抑制了胶原纤维的产生，组织结构内有少量散在的增殖纤维，炎症细胞明显减少，成纤维细胞大量增殖。重要的是，经TAXGel改善之后新生组织皮肤更为致密，成纤维细胞排列更有序，创面愈合的更加完整。总之，这表明二氢槲皮素处理可加速伤口创面表皮生成，且在皮肤修复过程中表现出良好的促进作用。

2.3水凝胶对创面组织中VEGF、HIF-a、Pan-Keratin及CD31的影响

为进一步评估二氢槲皮素对皮肤创伤的改善作用，本发明利用免疫荧光染色测定了皮肤组织中VEGF、HIF-a、Pan-Keratin及CD31。对照组可观察到小鼠创伤部位皮肤中VEGF、HIF-a、Pan-Keratin及CD31荧光强度表达被抑制。然而，Gel组和TAXGel预处理可显著提高荧光表达，尤其是VEGF因子，且TAXGel荧光表达较为显著，表明二氢槲皮素可促进受伤组织中生长因子的表达而加速创面修复(附图11，**P<0.01,*P<0.05与Control相比；附图12，**P<0.01,*P<0.05与Control相比)。

2.4二氢槲皮素水凝胶通过降低创面伤口炎症因子水平促进皮肤修复

创面伤口往往与炎症损伤密切相关，且促炎细胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6在受伤组织中表达异常。为此，本发明通过Elisa试剂盒检查受伤皮肤中炎症因子水平。结果发现，对照组中TNF-α，IL-1β和IL-6水平显著升高，而Gel组中炎症因子虽然被抑制，但效果并不明显(附图13，**P<0.01,*P<0.05与Control相比)。与Gel组相比，负载二氢槲皮素的TAXGel组可显著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的过度表达。此外，为进一步验证二氢槲皮素在创面修复中的抗炎作用，本发明采用Western-blot方法检测皮肤组织中NF-κB和IKKα的蛋白表达水平。如附图14(**P<0.01,*P<0.05与Control相比)所示，与对照组和Gel组相比，TAXGel中NF-κB、IKKα的蛋白表达水平显著被抑制，而Gel组较对照组也对炎症因子具有一定的抑制活性，但效果并不显著。

2.5二氢槲皮素水凝胶通过诱导自噬途径促进创伤皮肤的修复进程

为进一步探索二氢槲皮素对皮肤创伤的修复作用，本发明进一步考察了自噬生化标志物和MAPK介导的自噬信号通路相关蛋白在创面伤口修复中的表达情况。附图15(**P<0.01,*P<0.05与Control相比)和附图16(**P<0.01,*P<0.05与Control相比)表明，创伤部位皮肤组织中LC3Ⅱ/Ⅰ比例、Atg5、Atg7蛋白水平显著被抑制，而与对照组和Gel组相比，TAXGel显著提高LC3Ⅱ/Ⅰ比例、Atg5、Atg7、Beclin-1蛋白的表达水平，而P62蛋白的过表达被显著逆转。此外，为进一步考察MAPK介导的自噬通路对创伤皮肤修复过程的作用，本发明通过Western-blot技术检测了Erk1/2、P38、JNK磷酸化水平(p-JNK、p-Erk1/2、p-P38)。结果发现，创伤部位组织Erk1/2、P38、JNK及其磷酸化水平显著被抑制，而TAXGel处理可显著提高这些蛋白的活化。这些证据表明二氢槲皮素水凝胶通过激活MAPK介导的自噬途径而促进创伤皮肤修复。

实施例4 P407/HA/CS/TAX复合水凝胶调控皮肤伤口菌群的研究

1材料与方法

1.1试剂

二氢槲皮素水凝胶，为实验室自制；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay试剂盒(美国Omega Bio-Tek公司)；DNA凝胶提取试剂盒购于美国Axygen公司；Pyrobest DNAPolymerase,TaKaRa,DR500A；1％琼脂糖凝胶由西班牙Biowest公司提供；FastPfu聚合酶由中国北京全式金生物技术有限公司提供。

1.2仪器

高速台式冷冻离心机(Eppendorf 5424R，德国Eppendorf公司)；荧光分光光度计(Quantifluor-ST fluorometer,Promega,E6090)，酶标仪(BioTek FLx800，美国Biotek公司)；超微量分光光度计(NanoDrop2000，美国Thermo FisherScientific公司)；PCR仪(ABI

9700，美国ABI公司)；MISEQ测序仪(Illumina Miseq，美国Illumina公司)。

1.3动物试验设计

见实施例3。

1.4小鼠伤口微生物DNA提取

试验结束后利用无菌棉签在小鼠伤口处擦拭2-3次，放入无菌EP管。采用DNeasyPowerWater试剂盒对棉签上的DNA进行抽提，并对抽提的DNA进行检测。采用荧光分光光度计在260nm和280nm波长处分别测定DNA的吸光值，检测DNA的浓度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。调整DNA溶液浓度，DNA工作液保存于4℃，储存液保存于-20℃。

1.5 16S rRNA基因扩增

利用16S rRNA特异性正向引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和反向引物806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对细菌16S rRNA基因的V3-V4区域进行PCR扩增。样品特异性7-b p条形码被纳入用于多重测序的引物中。反应体系为：5μl缓冲液(5×)、0.25μlFast pfu DNA聚合酶(5U/μl)、2μl(2.5mM)dNTPs、1μl(10uM)正向和反向引物、1μl DNA模板和14.75μl ddH2O。反应条件为：98℃预变性5min，(98℃变性30s、53℃退火30s和72℃延伸45秒)，共25个循环，在72℃下最终延伸5min。

1.6 Illumina Miseq测序

PCR扩增片段用Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads纯化，并使用Quant-iTPicoGreen dsDNA检测试剂盒定量。在单独的定量步骤之后，将扩增片段等量合并，并使用Illlumina MiSeq平台和MiSeq Reagent Kit v3进行双端2×250bp测序。

1.7测序数据及生物信息学分析

使用DADA2方法主要进行去引物，质量过滤，去噪，拼接和去嵌合体，以100％相似度聚类。使用DADA2质控后产生的每个去重的序列称为ASVs(amplicon sequencevariants)，或称为特征序列(对应于OTU代表序列)。采用Silva数据库对每条序列和16SrRNA数据库进行物种分类注释与比对，分析各16S rRNA基因序列的系统发育关系。

生物信息学序列数据分析主要使用QIIME2和R(v3.2.0)进行。使用QIIME2中的ASV表计算ASV级别的alpha多样性指数，如Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数、Faith's PD指数、Pielou's evenness指数和Good's coverage指数，比较样本间的丰富度和多样性。使用Jaccard metrics、Bray-Curtis metrics和UniFrac distance metric进行Beta多样性分析，研究样本间微生物群落的结构变化。并通过层级聚类分析、主坐标分析(PCoA)、非度量多维标度(NMDS)分析不同分组样本间群落组成的相似性或差异性。通过ASV/OTU Venn图、主成分分析(PCA)、群落Heatmap、LEfSe和随机森林分析检测组间差异丰富的分类群，并找到与丰度有显著性差异的类群。

1.8统计学分析

LEfSe分析采用线性判别分析(LDA＞3.6)来估算每个组分物种丰度对差异效果影响的大小。Student t检验(Student's t test)比较各组间差异性，P<0.01或P<0.05被认为具有统计学意义。

2结果与分析

2.1二氢槲皮素水凝胶对皮肤损伤小鼠皮肤菌群Alpha多样性的影响

2.1.1稀释曲线

以chao1指数、Shannon指数、Simpson指数和Pielou's evenness指数绘制稀释曲线结果发现，随着测深度的增加，ASV/OTU数逐渐增加，增加到一定程度后趋于平坦，说明小鼠样本的皮肤菌群物种多样性、均匀度、丰富度较好，同时也说明测序循环周期以及本试验样本测序数据量充足，能够覆盖绝大多数物种，见附图17。

2.2.2对小鼠皮肤菌群Alpha多样性的影响

使用QIIME2软件来表征小鼠皮肤菌群多样性，附图18(**P<0.01,*P<0.05)结果显示，与TAXGel组Control组和Gel组中的chao1指数没有显著性差异(P＝0.1)，TAXGel组中的chao1指数较Control组和Gel组高，说明给药组在一定程度上能够增加皮肤菌群的丰富度，在菌群多样性的结果中，Control组和Gel组中的Shannon指数、Simpson指数显著性低于TAXGel组，表明这两组中菌群多样性降低，TAXGel组中菌群的多样性显著性高于Control组和Gel组(P＜0.05)，说明二氢槲皮素能够提高皮肤损伤小鼠伤口的菌群多样性。Pielou'sevenness指数是在去除香浓指数的丰富度效应的基础上，来强调群落的均匀度。在本发明中发现TAXGel组的Pielou's evenness指数与Control组相比具有显著性差异，与Gel组相比具有极显著性差异，说明TAXGel组中菌群的均匀度较好。以上结果表明，二氢槲皮素能够提高小鼠皮肤菌群的丰富度、多样性和均匀度。

2.2二氢槲皮素水凝胶对皮肤损伤小鼠皮肤菌群Beta多样性的影响

2.2.1 PCoA分析

bray-curtis距离算法(附图19A)和weighted UniFrac距离算法(附图19B)能够对于环境梯度/实验处理引起的微生物群落差异，往往主要是微生物丰度的消长变化。采用bray-curtis距离算法和weighted UniFrac距离算法观察小鼠皮损菌群各组样本间群落组成的相似性或差异性。PCoA分析结果显示，bray-curtis距离算法中的PCo1和PCo2分别为57.1％和37.4％，weighted UniFrac距离算法中PCo1和PCo2分别为56％和23.9％，在bray-curtis距离算法中，Control组和Gel组沿第二主成分(PCo2)的正方向表现出明显的偏移，与TAXGel组之间存在明显距离，给药组逆转了皮肤损伤引起的正向变化。weightedUniFrac距离算法中Control组和Gel组沿第一主成分(PCo1)的正方向表现出明显的偏移。

2.2.2 NMDS分析

本发明通过bray-curtis距离算法(附图20A)和weighted UniFrac距离算法(附图20B)对皮肤菌群的NMDS进行分析，以阐明各组样本间群落组成的相似性或差异性，从附图20中可以看出，Control组和Gel组的分布区域具有交叉重合的部分，说明这两组的皮肤菌群系具有相似性，而TAXGel组的分布区域与这两组之间几乎没有重合，说明给药组与其他两组的菌群相识程度较小，且分布呈现明显差异，进一步证明二氢槲皮素能够改变小鼠皮肤表面细菌多样性。

2.2.3层积聚类及组间差异分析

附图21中左侧显示为样本的聚类情况，右侧为各样本属水平的丰度柱状图，层次聚类结果显示，三个组别中的优势菌群均为sphingomonas、bacteroides、escherichia-shigella，但是TAXGel组中三种属的菌占比较为均匀，而Control组和Gel组中sphingomonas属的菌群占比较高，说明经二氢槲皮素处理后，皮肤微生物组成发生明显变化。这一结果表明，二氢槲皮素可显著影响小鼠的皮肤菌群组成促进皮肤修复。

采用bray-curtis距离算法，对组间差异进行定量分析，结果显示，Control组和Gel组菌群的足见差异不明显，而TAXGel组与这两组相比，组间差异程显著性差异。

2.3二氢槲皮素水凝胶对皮肤损伤小鼠皮肤菌群组成的影响

2.3.1物种Venn图分析

Venn图可反映三个组别中所独有或共有的物种ASV/OTU数目，并且能直观的看出样本或分组之间微生物重叠情况，观察组别之间菌群的相似度。从附图22中可以看出，TAXGel组、Control组和Gel组中的ASV/OTU数目分别为2525、1776和1675个，三组中共有的ASV/OTU数目为538个，Control组和Gel组中的共有的ASV/OTU数目212个，Control组和TAXGel组中的共有的ASV/OTU数目203个，TAXGel组和Gel组中的共有的ASV/OTU数目234个，表明Control组和Gel组相识度较高，说明其菌群组成相识，而TAXGel组中ASV/OTU数目明显高于Control组和TAXGel组，说明经二氢槲皮素给药后能够提高菌群的多样性，这与Beta多样性和Alpha多样性的结果一致。

2.3.2群落柱形图及热图分析

本发明通过物种聚类绘制成热图，并通过颜色的不同反应物种的丰富度，结果显示，三个组别的物种丰富度优势菌群不同，在热图中显示，TAXGel组中的优势菌群为Aeromonas、Advenella、Pseudomonas、Erysipelatoclostridium、Proteus、Parabacteroides、Parasutterella、Enterococcus、Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Bacteroides、Blautia等11个属，而Control组和TAXGel组中的优势菌群较为相似，分别为Acinetobacter、Sphingomonas、Methylobacterium等3个属，说明这两组的菌群的多样性和丰富度降低较为明显，负载二氢槲皮素后，菌群的多样性明显增加，提示二氢槲皮素能够明显改善皮肤菌群结构。

本发明分别在门和属水平上并绘制了各组物种组成情况相对丰度的分布柱形图，在门水平上，三组中的优势菌群均为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)，但是这三种菌门在各组中的占比不同，在Control组中三个菌门的占比分别为69.36％、14.83％、13.12％，在Gel组中的占比分别为69.18％、16.67％、13.68％，而在TAXGel组中的占比分别为41.16％、30.92％、26.81％，表明这三个菌门在TAXGel组中的分布较为均匀。

在属水平上，Control组中的优势菌群的种类和占比分别是Sphingomonas27.1％、Bacteroides 10.97％、Blautia 8.31％、Escherichia-Shigella 5.93％、Halomonas 16.25％，Gel组中的优势菌群的种类和占比分别是Sphingomonas 56.62％、Bacteroides 12.91％、Blautia 9.14％、Escherichia-Shigella 6.66％，TAXGel组中的优势菌群的种类和占比分别是Sphingomonas 15.35％、Bacteroides 23.25％、Blautia18.4％、Escherichia-Shigella 14.43％、Parabacteroides 7.45％。结果表明二氢槲皮素可以有效地改善Sphingomonas属菌群的升高，逆转Bacteroides和Blautia属菌群的降低，见附图23。

2.4物种差异性分析

2.4.1 Lefse分析和PCA分析

本发明通过Lefse多级物种层级分析了三个组别中皮肤菌群的多样性，并绘制LDA的分类学分支图和柱形图。以分开具有明显差异的生物标记物和优势菌。从附图24中的结果可以看出，在属水平上，显示有显著差异的物种有10个(LDA的绝对值大于3.6，P＜0.05)，在Control组中显示有显著差异的属有2个，按LDA的分值排序为g_Halomonas(单胞菌属)和g_Pelagibacteriums(耐盐远洋杆菌属)，在Gel组中同样具有两个显示有显著差异的属，分别为g_Anaerolineae(氧菌属)、g_Lachnospiraceae(毛螺旋菌属)，而在TAXGel组中显示有显著差异的属有6个，明显高于Control组和Gel组，TAXGel组中的主要富集的优势菌属为g_Bacteroides(拟杆菌属)、g_Blautia(布劳特氏菌属)、g_Escherichia-shigella(志贺氏菌属)、g_Parabacteroides(副拟杆菌)、g_Lactobacillus(乳杆菌属)、g_enterococcus(球菌属)。这些结果表明，二氢槲皮素能够改善皮肤菌群，增加菌群多样性，同时还能够促进有益菌的生长。

在PCA主成分分析中，本发明通过对小鼠菌群在门水平和属水平进行小鼠皮损菌群各组样本间群落组成的相似性或差异性。PCA分析结果显示，在门水平中，PC1和PC2分别为99.4％和0.5％，在属水平中PC1和PC2分别为71.8％和21.9％，在门水平和属水平中，TAXGel组沿第一主成分(PC1)的正方向表现出明显的偏移，Control组和Gel组与TAXGel组之间存在明显距离，没有重复交叉。

Claims (3)

1.负载二氢槲皮素的水凝胶在制备调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性、均匀度的药物中的应用；其中，负载二氢槲皮素的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）称量泊洛沙姆和壳聚糖置于在烧杯中，加去离子水，利用磁力搅拌器搅拌，充分溶解后，放置于4 ℃冰箱中充分溶胀，得到澄清粘稠的泊洛沙姆空白凝胶，置于冰箱静置备用，得到泊洛沙姆/壳聚糖水凝胶；

（2）取二氢槲皮素和透明质酸，溶于醋酸溶液中，磁力搅拌至粉末完全溶解，取步骤（1）的泊洛沙姆/壳聚糖水凝胶，加入到二氢槲皮素/ 透明质酸溶液中，搅拌至充分溶解，配置成含二氢槲皮素的水凝胶溶液，放置于4 ℃冰箱中充分溶胀，得到负载二氢槲皮素的水凝胶。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述泊洛沙姆的量为0.17-0.5 g ；所述壳聚糖的量为 0.01-0.05 g；所述二氢槲皮素与透明质酸的质量比为2:2-0.5；所述醋酸溶液的浓度为0.1-0.5 %；二氢槲皮素水凝胶溶液中二氢槲皮素的含量为2-6mg /mL。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所制备的负载二氢槲皮素的水凝胶孔隙之间相互连通，交联密度增加，孔径逐渐缩小，微腔壁同样出现多孔结构，总体呈现出三维网状结构；且具有温敏型，具体表现为在4℃时呈现溶液状态，在25-37℃的温度下呈现凝胶状。

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