CN113354836A - 一种硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的制备方法及在慢性伤口特别是糖尿病足伤口中的应用。本发明敷料制备方法简单易行,所制备的水凝胶具有较好的吸水率和溶胀率,该水凝胶具有pH和温度双重敏感性,有利于水凝胶中的活性物质硫酸化甘露葡萄糖醛酸在伤口处的释放。一种硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶敷料不仅具有隔绝创面、透气性好、吸湿性好等特性,还具有吸收炎症因子、促进成纤维细胞迁移,最终促进慢性伤口愈合的作用。本发明特别适用于临床广泛存在的慢性难愈合伤口,特别是糖尿病溃疡的治疗与护理。
Description
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域,具体涉及一种硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的制备及应用。
背景技术
由于创面环境、人体体质和创面类型的不同,人体创面的愈合是一个极其复杂的过程。与急性伤口相比,慢性伤口往往是由内源性机制引起的,这些内源性机制与易患疾病相关,最终会破坏真皮和表皮组织的完整性。其中一些慢性伤口,如糖尿病足溃疡,作为糖尿病的并发症,主要由血管病变、神经病变和感染引起。2型糖尿病的高糖环境会改变某些细胞因子和生长因子的水平,这些因子对伤口愈合至关重要。与此同时,2型糖尿病患者的免疫系统也会受到损害。创面处炎症期过长,创面感染不能有效控制,导致创面长期不能愈合或根本不愈合,形成糖尿病足。糖尿病伤口愈合迟缓是临床上常见的难题。在治疗糖尿病难愈性皮肤伤口中,除了进行全身治疗如控制血糖、抗感染、加强营养等措施外,积极的伤口护理促使其愈合在治疗中占有重要的地位。在我国,由于糖尿病足长期难以愈合而导致截肢的比例为21.8%,这一比例在国外甚至更高。因此,寻找一种适合糖尿病足的敷料,促进其慢性伤口的愈合,尤为重要。
在过去的几十年里,海洋多糖得到了广泛的关注。由于海洋生物的丰富,与植物相比,从海洋生物中提取多糖的成本最低。生物技术的进步也提高了产量。此外,海洋多糖还具有非细胞毒性、生物降解性和生物相容性等特性,因此,海洋多糖在生物医用材料上具备了广泛的潜力。我们前期研究发现,硫酸化的甘露糖醛酸可通过保护血管内皮细胞改善糖尿病引起的心脏、肾脏以及足部损伤,对糖尿病血管并发症具有显著疗效。那么,将其制备成敷料,直接针对病人的伤口,可能为糖尿病足敷料的优良选择。
水凝胶是三维的、交联的网络,可以吸收和保留大量的水而不溶解。其具有良好的生物相容性,在组织工程、制药和生物医学工程等领域有着广泛的应用。鉴于硫酸化的甘露糖醛酸在注射给药时能够有效地抑制糖尿病足溃疡和坏疽,将其做成水凝胶用于慢性伤口修复特别是糖尿病足伤口用生物敷料将具有很好的潜力。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供一种用于慢性伤口(特别是糖尿病足伤口)修复的硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:一种硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的制备及应用,所述水凝胶由终质量浓度0.1%-5%硫酸化甘露葡萄糖醛酸和终质量浓度8-12%PVA通过梯度降温和升温的方法交联而成,所述应用是指水凝胶敷料在慢性创伤修复特别是糖尿病足伤口中的应用。
其中,所述的多糖来源于海洋褐藻海带、鼠尾藻、墨角藻等褐藻等褐藻一种或两种以上,其硫酸基含量为5-18%,优选8-12%;甘露糖含量为2-10%,优选5-8%;葡萄糖醛酸含量为8-15%,优选10-12%;岩藻糖含量为8-15%,优选10-12%;分子量范围为3-350kD,优选30-100KDa。
其中,所述的硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶按照以下方法制备:
(1)称取一定量的硫酸化甘露葡萄糖醛酸,溶于纯水中,搅拌均匀制成8-12%的溶液,优选10-11%;
(2)称取一定量聚乙烯醇(PVA)1799型(上海麦克林生化科技有限公司)(醇解度98~99%),溶于纯水中,搅拌均匀制成8-12%的溶液,优选10-11%;在100mL 10%PVA溶液中滴加(1)所配置的硫酸化甘露葡萄糖醛酸溶液,使其终浓度为0.1%-5%,优选2%,搅拌均匀后,放入梯度降温盒(Thermo)中置于-80℃冰箱,控制反应时间8-12h;反应结束后,将梯度降温盒置于室温,控制反应时间8-12h;以此为一个循环,重复2-5次,得到水凝胶样品。
其中,所述的梯度降温盒组(市购于赛默飞世尔科技公司)成为:聚碳酸脂(PC)盒体,高密度聚乙烯(HDPE)盖,高密度聚乙烯(HDPE)管槽,泡沫衬垫。可实现每分钟1℃降温,用之前在盒夹层内注入100%浓度的异丙醇,使其占据夹层体积不低于80%。
其中,所述的创伤修复应用是指在慢性伤口特别是糖尿病足伤口中的应用。
本发明发现所述水凝胶敷料是由硫酸化甘露葡萄糖醛酸和PVA通过梯度降温和升温的方法交联而成。所述水凝胶敷料具有慢性伤口修复特别是糖尿病足伤口修复的活性。所述的应用是指硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶在慢性伤口(特别是糖尿病足伤口)修复)的临床治疗。
本发明提供了一种硫酸化甘露葡萄糖醛酸PVA水凝胶的制备方法,并且将它用于慢性伤口修复特别是糖尿病足伤口修复敷料。该水凝胶采用物理交联(可逆水凝胶)的方法制备,不需要化学交联剂,避免了一些交联剂的毒性问题,同时采用梯度降温和升温处理,减少了物理交联水凝胶机械阻力低、难以控制孔径的问题。所制备的水凝胶具有较大的比表面积和孔隙结构,可以促进成纤维细胞的增殖、迁移,对炎症因子有很好的吸附作用,促进皮肤伤口的愈合。本发明提供的硫酸化甘露葡萄糖醛酸PVA水凝胶安全无毒,无免疫原性,生物相容性好,可以很好的治疗例如糖尿病等引起的难愈合创面,在糖尿病溃疡性伤口等的治疗中有巨大的应用前景。
同时,本发明所获得的硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶敷料易于制备,生物活性高、安全无毒。该敷料有效隔绝创面的同时,又有优良的透气性。此生物活性敷料在具有常规伤口敷料的作用的同时,能够有效吸附炎症因子,避免其在伤口微环境聚集形成慢性炎症,同时可以促进生长因子表达及成纤维细胞迁移等全方位促进慢性伤口愈合。本发明特别适用于临床广泛存在的慢性难愈合伤口,特别是糖尿病溃疡的治疗与护理。
附图说明
图1硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶扫描电镜谱图。
图2硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶物理性质。
图3硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶溶血率。
图4硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶细胞迁移实验结果。
图5硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶细胞存活率实验结果。
图6硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶对炎症因子的吸附实验及碱性生长因子释放实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1,不同浓度硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的制备。
(1)称取10g硫酸化甘露葡萄糖醛酸,溶于纯水中,搅拌均匀制成10%水溶液;
(2)称取一定量聚乙烯醇(PVA)1799型(醇解度98~99%),95℃油浴溶于纯水中,搅拌均匀制成10%水溶液;在100mL 10%PVA溶液中滴加(1)所配置的硫酸化甘露葡萄糖醛酸溶液搅拌均匀后,放入梯度降温盒中置于-80℃冰箱,控制反应时间8-12h;反应结束后,将梯度降温盒置于室温,控制反应时间8-12h;以此为一个循环,重复2-5次。
记硫酸化甘露葡萄糖醛酸终浓度为0.1%、0.5%、2%、5%样品分别为FU1、FU2、FU3、FU4。
实施例2,硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的结构表征
利用分光光度计法对实施例1中原料硫酸化甘露葡萄糖醛酸中岩藻糖、硫酸基含量进行表征。该硫酸化甘露葡萄糖醛酸中岩藻糖含量28.86%、硫酸基含量27.06%,分子量8.7×104。利用扫描电镜对实施例1中水凝胶FU2微观形貌进行表征,扫描电镜照片见图1。
所得水凝胶为三维网状结构,通过扫描电镜可知,其微观结构含有大量孔隙,有利于其吸收伤口渗液及气体通过。
实施例3,硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的物理性能。
本试验通过测试硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的保水性、溶胀性、以及其在液体介质中糖醛酸的释放,评估其理化性能。
测试样品:实施例1中不同糖醛酸终浓度水凝胶样品FU1-FU4
试验方法:
保水性:取一定质量FU1-FU4水凝胶,37℃恒温箱内静置,每隔一段时间记录其质量,每组7个平行。
溶胀性:取一定质量干燥后FU1-FU4水凝胶,加入足量水置于37℃恒温箱中,充分溶胀后记录其质量,计算溶胀率,每组7个平行。
硫酸化甘露葡萄糖醛酸的释放:取一定质量FU1-FU4水凝胶按相关标准浸泡到一定生理盐水中,每隔一段时间测定浸出液中硫酸化甘露葡萄糖醛酸的浓度;通过与理论最高浓度的比值换算为硫酸化甘露葡萄糖醛酸的释放百分比;
结果:
不同水凝胶FU1-F4的物理化学性能见图2.
含有不同浓度硫酸化甘露葡萄糖醛酸的水凝胶材料都具有良好的含水量、保水性及溶胀性;其中,由于硫酸化甘露葡萄糖醛酸本身的吸水性,随着其含量的升高,水凝胶材料的含水率及溶胀率稍有提高。
关于水凝胶中硫酸化甘露葡萄糖醛酸的释放,随着原料含量升高,浸出液中糖醛酸含量增大,但FU3浸出液中糖浓度较理论浓度的比例最高,利用率最高。
实施例4,硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的溶血性实验
本试验通过将硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶加入红细胞悬液,来检验其溶血性。
测试样品:实施例1中的不同硫酸化甘露葡萄糖醛酸浓度水凝胶样品FU1-FU4,阳性对照品(去离子水),阴性对照(生理盐水),
试验方法:取新鲜鼠血配置2%红细胞悬液,分别取2.5ml2%红细胞悬液于10ml离心管中,阳性对照加入2.5ml去离子水,阴性对照加入2.5ml生理盐水;实验组加入水凝胶材料后加入生理盐水至体积与对照组相同。37摄氏度恒温箱中静置1h,离心,取上清。紫外分光光度计540nm下测定吸光度,溶血率计算公式:
溶血率(%)=[(ODh-ODn)/(ODp=ODn)]×100%
其中,ODh为实验组上清液吸光度,ODp为阳性对照上清液吸光度,ODn为阴性对照上清液吸光度。
结果:水凝胶FU1-FU4溶血率极低,符合国家标准。不同水凝胶溶血率见图3。
实施例5,硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的细胞增殖、迁移实验
本试验通过硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的细胞实验,细胞学上检验其相关性能。
测试样品:实施例1中的不同硫酸化甘露葡萄糖醛酸浓度水凝胶样品FU1-FU4;
试验方法:
取正常生长的L929鼠成纤维细胞消化后铺于96孔板中,每孔5×103个,37℃培养24h;对照组采用完全培养基培养,实验组使用浸泡过水凝胶FU1-FU4的完全培养基;培养24h后进行MTT实验,酶标仪490nm检测吸光度;
细胞划痕实验:将正常生长的L929鼠成纤维细胞铺于24孔板中,待细胞长满培养面后,使用200ml枪头制造划痕,洗去划下的细胞后,对照组使用无血清培养基培养面,实验组使用浸泡过水凝胶材料的无血清培养基培养,6h、12h和24h观察划痕处细胞迁移情况。
结果:
相比于对照组,FU1-FU4处理过的的细胞面划痕都有明显的细胞迁移,其中使用浸泡过FU3的培养基培养的效果最佳,见图4。
不同水凝胶处理后细胞存活率见图5;各组细胞存活率均≥90%,无细胞毒性,细胞相容性好;FU1与FU3组存活率甚至优于对照,说明硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶对于伤口出细胞的增殖可能有一定的促进作用。
实施例6,硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的对炎症因子的吸附作用及碱性生长因子释放实验
生成因子对于伤口愈合有重要作用,碱性生长因子(bFGF)可以促进纤维蛋白的迁移从而促进伤口愈合,本试验通过硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶对碱性生长因(bFGF)的释放作用,来说明其在促进伤口愈合方面的作用。
测试样品:实施例1中的水凝胶样品FU3,阳性对照品(藻酸盐水凝胶)
试验方法:将碱性生长因子(bFGF)分别与一定量的实验样品和阳性对照品(藻酸盐水凝胶)混合,将混合物放入孵育盒中室温孵育,孵育液为含有2%(v/v)胎牛血清的RPMI培养基(100mg/ml),孵育0,2,4,6,12,18,24小时后,将上清液用液氮速冻,放入-80℃冰箱保存,ELISA检测上清液中碱性生长因子(bFGF)的变化情况。
结果:上述碱性生长因子(bFGF)测定结果显示(图6),硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶样品和碱性生长因子(bFGF)混合后,0小时时上清液中没有检测到bFGF,随着时间的推移上清液中bFGF的含量逐渐增加,当孵育20小时后,上清液中bFGF的含量基本不变。阳性对照品和bFGF的混合物在孵育8小时后,上清液中bFGF的含量基本不变。本实验样品对bFGF有缓慢的释放作用,有利于成纤维蛋白的迁移,说明硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶可以促进慢性伤口愈合。
对生长因子的缓释实验是常用的评价样品对伤口愈合促进活性的测定实验,硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶可以缓慢释放生长因子,表明它可以促进慢性伤口愈合。
以上为对本发明实施例的描述,通过对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶,其特征在于,所述水凝胶由终质量浓度0.1%-5%硫酸化甘露葡萄糖醛酸和终质量浓度8-12%PVA交联而成。
2.根据权利要求1所述的硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶,其特征在于,所述的硫酸化甘露葡萄糖醛酸来源于海洋褐藻海带、鼠尾藻、墨角藻等褐藻一种或两种以上,其硫酸基含量为5-18%,优选8-12%;甘露糖含量为2-10%,优选5-8%;葡萄糖醛酸含量为8-15%,优选10-12%;岩藻糖含量为8-15%,优选10-12%;分子量范围为3-350kD,优选30-100KDa。
3.根据权利要求1所述的硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶,其特征在于,交联过程通过梯度降温和回温交替的方式完成。
4.一种权利要求1所述的硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的制备方法,其特征在于,所述的水凝胶按照以下方法制备:
(1)称取一定量的硫酸化甘露葡萄糖醛酸,溶于水中,搅拌均匀制成质量浓度为8-12%的溶液,优选浓度10-11%;
(2)称取一定量聚乙烯醇(PVA)(醇解度98~99%),溶于纯水中,搅拌均匀制成8-12%的溶液,优选10-11%;
在PVA溶液中滴加(1)所配置的硫酸化甘露葡萄糖醛酸溶液,使其终浓度为0.1%-5%,优选2-4%,搅拌均匀后,放入梯度降温盒(Thermo)中置于-80℃冰箱,控制反应时间8-12h;反应结束后,将梯度降温盒置于室温,控制反应时间8-12h;以此为一个循环,重复2-5次,得到水凝胶样品。
5.一种根据权利要求4所述硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶的方法,其特征在于,所述的梯度降温盒组成为:聚碳酸脂(PC)盒体,高密度聚乙烯(HDPE)盖,高密度聚乙烯(HDPE)管槽,泡沫衬垫;可实现每分钟1℃降温,用之前在盒夹层内注入异丙醇,使其占据夹层体积不低于80%。
6.一种根据权利要求1所述的硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶应用,其特征在于:硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶在慢性创伤修复的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述的慢性创伤是指糖尿病引起的糖尿病足或慢性难愈合溃疡,硫酸化甘露葡萄糖醛酸水凝胶具有隔绝创面、透气性好、吸湿性好等特性,还具有吸收炎症因子、促进成纤维细胞迁移,最终促进慢性伤口愈合的作用。
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王晶等: ""褐藻多糖硫酸酯的结构与生物活性研究"", 《海洋科学基刊》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115708834A (zh) * | 2022-11-25 | 2023-02-24 | 中国科学院海洋研究所 | 一种褐藻胶寡糖衍生物的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN113354836B (zh) | 2022-10-04 |
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