CN110404106A - 一种用于创伤修复的多糖敷料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于创伤修复，特别是慢性创伤修复的生物活性多糖敷料及其制备方法和应用。本发明敷料制备方法简单易行，所制得的生物敷料伤口黏附良好，安全无毒，应用方便。具有生物活性的褐藻多糖硫酸酯水凝胶敷料在隔绝创面，透气性好的同时又有止血，保湿，促进慢性伤口愈合的作用。本发明特别适用于临床广泛存在的慢性难愈合伤口，特别是糖尿病溃疡的治疗与护理。

Description

一种用于创伤修复的多糖敷料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种用于创伤修复(特别是慢性创伤修复)的多糖敷料及其制备方法和应用。
背景技术
随着人类生活水平的提高、饮食结构改变和体力劳动减少，糖尿病(diabetesmellitus,DM)的发病率呈持续上升趋势，已成为目前世界发病率和病死率最高的3种疾病之一，其中在中国、印支次大陆及非洲等发展中国家患者增加尤为明显。据调查，我国45岁以上的人群中约有10％患有DM；目前全世界DM患者已达到2.4亿人，预计2025年突破三亿，发病也日趋低龄化，严重影响人类的生命及健康水平。糖尿病并发难愈性皮肤伤口(如糖尿病足溃疡、褥疮)是糖尿病的常见合并症，糖尿病患者下肢坏疽之前足部皮肤常出现难愈性溃疡，这种溃疡是浅表的、疼痛性的，往往久治不愈，是糖尿病患者致残的重要原因。研究表明，胰再生源蛋白REG3A/RegIIIγ能够通过诱导角质形成细胞的增殖来促进皮肤伤口愈合，但是在糖尿病皮肤伤口中，高血糖抑制REG3A/RegIIIγ的表达，使其不能控制TLR3基因诱导的炎症反应，从而使糖尿病伤口持续产生过度的炎症因子，导致伤口不能愈合。糖尿病伤口愈合迟缓是临床上常见的难题。在治疗糖尿病难愈性皮肤伤口中，除了进行全身治疗如控制血糖、抗感染、加强营养等措施外，积极的伤口护理促使其愈合在治疗中占有重要的地位。目前，国内临床上多用中药化学膏剂、抗生素等治疗创面，但是存在换药次数多、伤口愈合慢、易产生抗药性等缺点。
1962年伦敦大学的Winter博士提出“湿润愈合”理论，以“湿润愈合”为基础的各种高科技医用敷料广泛应用于烧伤、慢性难愈型伤口等各种伤口护理。近些年来海洋生物来源的生物活性物质(多糖类)越来越多应用于生物医用材料领域。壳聚糖和褐藻胶医用敷料在治疗皮肤伤口愈合中的应用越来越广泛，褐藻胶医用敷料含有钙和钠离子，止血性好，能作自体清创，能吸收大量渗液，本身完整性强，不易残留。壳聚糖医用敷料具有止血、抑菌和促进伤口愈合的作用。临床试验表明褐藻胶和壳聚糖医用敷料针对烧伤等皮肤伤口创伤有很好的疗效。但是对于糖尿病慢性伤口愈合其实不单是湿润愈合，还要针对糖尿病慢性伤口发病机制，提供更有针对性的治疗措施。
褐藻多糖硫酸酯(FPS)是一种主要由岩藻糖组成的硫酸化多糖，课题组已建立高纯度褐藻多糖硫酸酯的制备技术，发现口服或注射FPS对糖尿病足具有显著治疗作用，可以显著改善糖尿病小鼠血糖浓度，减轻跛行状态，抑制小鼠足的溃疡和坏疽，改善下肢血流，促进骨骼肌血管新生，降低内皮细胞炎症，是很有潜力的治疗糖尿病足的药物。鉴于褐藻多糖硫酸酯在口服或注射给药能够有效地抑制糖尿病足溃疡和坏疽，将FPS做成糖尿病慢性伤口用生物敷料将具有很好的潜力。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于创伤修复(特别是慢性创伤修复)的多糖敷料及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于创伤修复的多糖敷料及其制备方法和应用，所述多糖敷料是褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶，所述多糖敷料具有创伤修复活性，所述多糖敷料的应用是指多糖敷料在创伤修复(特别是慢性创伤修复)中的应用。
其中，
所述的褐藻多糖硫酸酯来源于下述中的一种或多种，海洋褐藻海带、鼠尾藻、墨角藻等中的一种或多种褐藻的褐藻多糖硫酸酯，或者是来源于海参、海胆等中的一种或多种海洋棘皮动物中的褐藻多糖硫酸酯，褐藻多糖硫酸酯的组分为硫酸基含量为15-35％，岩藻糖含量为15-35％，分子量范围为5-350kD。
其中，所述的多糖敷料按照以下方法制备：
(1)称取褐藻多糖硫酸酯溶于甲酰胺中，搅拌均匀制成质量浓度1-4％褐藻多糖硫酸酯溶液，优选2％；
(2)在该多糖溶液中滴加含有质量浓度0.5-2％N-溴代丁二酰亚胺(NBS)的甲基丙稀酸酐，优选1％；控制甲基丙稀酸酐浓度为0.5Mol/L-1.5Mol/L，优选1Mol/L；反应温度为40-80℃，优选50℃，反应时间2-8h，反应6h；
(3)反应完毕后，用95％乙醇进行沉淀，使最终乙醇质量浓度为60-80％进行沉淀，优选72％，将沉淀干燥后溶于水，用3600-12000Da的透析袋透析，自来水24-48h，蒸馏水透析24-48h，于透析袋内得到透析液。
(4)将(3)中的透析液减压浓缩至浓缩前体积的1/10-1/15，将浓缩液冻干，制得甲基丙烯酰化的褐藻多糖硫酸酯；
(5)将甲基丙烯酰化的褐藻多糖硫酸酯加入到光引发剂溶液中，使终浓度为3-8％，优选5％；
(6)吸取步骤(5)所配置的溶液1-5μL滴到双疏(疏水疏油)玻璃板上，优选1μL，将玻璃板放到可见光(T5-8W-220-240V/50-60Hz)下照射10-30分钟，优选20分钟，反应结束后用水冲洗，收集溶液，透析是用3600-12000Daa的透析袋透析，自来水24-48h，蒸馏水24-48h。
(7)将(6)中的透析液减压浓缩至初始体积的1/10-1/15，将浓缩液冻干，制得褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶，即为多糖敷料。
其中，所述的光引发剂由以下试剂组成：含有0.3％-0.5％伊红的乙烯吡咯烷酮和5-8M三乙醇胺水溶液。
优选为含有0.3％伊红的乙烯吡咯烷酮和5M三乙醇胺水溶液。
其中，所述的双疏(疏水疏油)玻璃板由以下步骤制备：
(1)将载玻片待双疏处理的一侧表面用石蜡均匀熏黑；
(2)将熏黑的载玻片放入干燥器中，同时放入四乙氧基硅烷和氨水各2-4mL，室温放置24h-36h；
(3)将(2)中载玻片取出在马弗炉中500-600℃烧制2h-4h；
(4)将载玻片从马弗炉中取出后室温放凉，放入干燥器中，同时放入全氟十二烷基三氯硅烷1-2mL，室温放置72-84h。
其中，所述的创伤修复应用是指多糖敷料在创伤修复中(特别是慢性创伤修复)的应用。
本发明发现所述多糖敷料是由褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸酐交联得到的水凝胶。所述多糖敷料具有创伤修复(特别是慢性创伤修复)的活性。所述的创伤修复应用是指多糖敷料在创伤修复(特别是慢性创伤修复)的的临床治疗，所述慢性创伤包括烧伤创伤，糖尿病引起的病足或慢性难愈合溃疡。
本发明提供了一种褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶的制备方法，并且将它用于创伤修复特别是慢性伤口修复敷料，具有较大的比表面积和孔隙结构，可以提供天然仿生的类细胞外基质，可以促进成纤维细胞的增殖、迁移，对炎症因子有很好的吸附作用，促进皮肤伤口的愈合。本发明提供的多糖敷料安全无毒，无免疫原性，生物相容性好，可以很好的治疗例如糖尿病等引起的难愈合创面，在糖尿病溃疡性伤口等的治疗中有巨大的应用前景。
同时，本发明敷料制备方法简单易行，所制得的生物敷料伤口黏附良好，安全无毒，应用方便。具有生物活性的褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶敷料在隔绝创面，透气性好的同时又有止血、保湿、吸附炎症因子，促进慢性伤口愈合的作用。此生物活性敷料在具有常规伤口敷料的作用的同时，能够有效吸附促炎因子，避免其在伤口微环境聚集形成慢性炎症，同时可以促进生长因子表达，成纤维细胞迁移全方位促进伤口愈合。本发明特别适用于临床广泛存在的慢性难愈合伤口，特别是糖尿病溃疡的治疗与护理。
附图说明
图1褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸酯衍生物的IR谱图。
图2褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸酯衍生物的1H NMR谱图。
图3褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶扫描电镜谱图。
图4褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶对炎症因子的吸附结果。
图5褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶对碱性生长因子的释放结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1，褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸酯衍生物的制备(FMA1)
称取2g的褐藻多糖硫酸酯，溶于100mL甲酰胺中，搅拌均匀制成2％褐藻多糖硫酸酯溶液。在该多糖溶液中滴加含有0.12g N-溴代丁二酰亚胺(NBS)的甲基丙稀酸酐12mL，50℃反应6h。反应完毕后，用最终浓度为72％的乙醇进行沉淀，将沉淀干燥后溶于水透析。24h后，将透析袋(透析是用3600Da的透析袋透析，自来水24h，蒸馏水24h)内溶液减压浓缩，减压浓缩至浓缩前体积的1/10，将浓缩液冻干，制得甲基丙烯酰化的褐藻多糖硫酸酯，记为FMA1。
实施例2，褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸酯衍生物的制备(FMA2)
称取2g的褐藻多糖硫酸酯，溶于200mL甲酰胺中，搅拌均匀制成1％褐藻多糖硫酸酯溶液。在该多糖溶液中滴加含有0.15g N-溴代丁二酰亚胺(NBS)的甲基丙稀酸酐15mL，80℃反应2h。反应完毕后，用最终浓度为75％的乙醇进行沉淀，将沉淀干燥后溶于水透析。24h后，将透析袋(透析是用3600Da的透析袋透析，自来水24h，蒸馏水24h)内溶液减压浓缩，将浓缩液冻干，制得甲基丙烯酰化的褐藻多糖硫酸酯，记为FMA2。
实施例3，褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸酯衍生物的制备(FMA3)
称取2g的褐藻多糖硫酸酯，溶于50mL甲酰胺中，搅拌均匀制成4％褐藻多糖硫酸酯溶液。在该多糖溶液中滴加含有0.10g N-溴代丁二酰亚胺(NBS)的甲基丙稀酸酐10mL，40℃反应8h。反应完毕后，用最终浓度为80％的乙醇进行沉淀，将沉淀干燥后溶于水透析。24h后，将透析(透析是用3600Da的透析袋透析，自来水24h，蒸馏水24h)袋内溶液减压浓缩，将浓缩液冻干，制得甲基丙烯酰化的褐藻多糖硫酸酯，记为FMA3。
实施例4，褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸酯衍生物的化学组成和结构表征
分别利用分光光度计法、离子色谱法和高效液相色谱法测定实施例1制备的褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸衍生物中岩藻糖、硫酸基含量和分子量，利用红外光谱和核磁共振波谱对褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸衍生物的结构进行表征。褐藻多糖硫酸酯和褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸衍生物的化学组成分析见表1，IR谱图和1H-NMR谱图见图1和图2。和褐藻多糖硫酸酯原料相比，褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸衍生物中岩藻糖含量基本没有变化，硫酸基稍有降低，分子量稍有增加。由IR谱图可见褐藻多糖硫酸酯在衍生化反应后多糖的骨架结构没变，FMA1谱图中新出现的1725.27cm-1、1523.82处的吸收峰是甲基丙烯酸的羰基和碳碳双键的振动吸收峰，表明衍生化反应是成功的。1H-NMR谱图中也可以看到甲基丙烯酸中氢原子的特征吸收峰。根据1H-NMR谱图我们可以计算出甲基丙烯酸酯取代度为6.8％。
表1褐藻多糖硫酸酯及其衍生物的化学成分分析(％)
实施例5，褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸酯水凝胶的制备
将实施例1制备的甲基丙烯酰化的褐藻多糖硫酸酯1g加入到20mL光引发剂溶液中，光引发剂为含有0.3％伊红的乙烯吡咯烷酮和5M三乙醇胺水溶液。吸取所配置的溶液1μL滴到双疏(疏水疏油)玻璃板上，将玻璃板放到可见光(T5-8W-220-240V/50-60Hz)下照射20分钟。反应结束后用水冲洗，收集溶液，透析，去除小分子杂质。将透析液减压浓缩，冻干，制得褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶JFMA。双疏(疏水疏油)玻璃板由以下步骤制备：(1)将载玻片用石蜡均匀熏黑。(2)将熏黑的载玻片放入干燥器中，同时放入四乙氧基硅烷和饱和氨水各2mL，室温放置24h。(3)将(2)中载玻片取出在马弗炉中600烧制2h。4)将载玻片从马弗炉中取出后室温放凉，放入干燥器中，同时放入全氟十二烷基三氯硅烷，室温放置72h。
实验例6，褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶对炎症因子的吸附作用
本试验通过褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶对炎症因子的吸附作用，来说明其在促进慢性伤口愈合方面的作用。
测试样品：实施例5中的样品(JFMA)，阳性对照品(藻酸盐水凝胶，AL)
试验方法：将炎症因子MCP-1和IL-8分别与实验样品JFMA和阳性对照品(藻酸盐水凝胶)在室温共孵育，孵育液为含有2％(v/v)胎牛血清的RPMI培养基(100mg/ml)，孵育0,2,4,6,12,18，24小时后,将上清液用液氮速冻，放入-80℃冰箱保存，ELISA检测上清液中样品吸附前后炎症因子的变化情况。
结果：上述炎症因子吸附测定结果显示(图4)，JFMA样品与炎症因子共孵育后，随着时间的推移对炎症因子的吸附率增加，当孵育超过12小时后，对炎症因子的吸附量维持不变，可能是达到了饱和吸附。本实验样品对炎症因子的吸附作用远远高于阳性对照样品，说明褐藻多糖硫酸酯水凝胶对炎症因子有很好的吸附作用。
实施例7，褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶对碱性生长因子(bFGF)的释放作用生成因子对于伤口愈合有重要作用，碱性生长因子(bFGF)可以促进纤维蛋白的迁移从而促进伤口愈合，本试验通过褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶对碱性生长因子(bFGF)的释放作用，来说明其在促进伤口愈合方面的作用，所以褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶在创伤修复的治剂中有明显的作用。
测试样品：实施例5中的样品(JFMA)，阳性对照品(藻酸盐水凝胶，AL)
试验方法：将碱性生长因子(bFGF)分别与一定量的实验样品JFMA和阳性对照品(藻酸盐水凝胶)混合，将混合物放入孵育盒中室温孵育，孵育液为含有2％(v/v)胎牛血清的RPMI培养基(100mg/ml)，孵育0,2,4,6,12,18，24小时后,将上清液用液氮速冻，放入-80℃冰箱保存，ELISA检测上清液中碱性生长因子(bFGF)的变化情况。
结果：上述碱性生长因子(bFGF)测定结果显示(图5)，JFMA样品和碱性生长因子(bFGF)混合后，0小时时上清液中没有检测到bFGF，随着时间的推移上清液中bFGF的含量逐渐增加，当孵育18小时后，上清液中bFGF的含量基本不变。阳性对照品和bFGF的混合物在孵育4小时后，上清液中bFGF的含量基本不变。本实验样品对bFGF有缓慢的释放作用，有利于成纤维蛋白的迁移，说明褐藻多糖硫酸酯水凝胶可以促进慢性伤口愈合。
对炎症因子的吸附和对生长因子的缓释实验是常用的评价样品对伤口愈合促进活性的测定实验，褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶对炎症因子有显著的吸附作用，同时可以缓慢释放生长因子，表明它可以促进慢性伤口愈合。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种用于创伤修复的多糖敷料，其特征在于，所述多糖敷料由褐藻多糖硫酸酯与甲基丙烯酸酐交联制备得到的多糖敷料。
2.根据权利要求1所述用于创伤修复的多糖敷料，其特征在于，所述的褐藻多糖硫酸酯来源于下述中的一种或多种，海洋褐藻海带、鼠尾藻、墨角藻等中的一种或多种褐藻的褐藻多糖硫酸酯，或者是来源于海参、海胆等中的一种或多种海洋棘皮动物中的褐藻多糖硫酸酯，褐藻多糖硫酸酯的组分为硫酸基含量为15-35％，岩藻糖含量为15-35％，分子量范围为5-350kD。
3.一种权利要求1或2所述用于创伤修复的多糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的多糖敷料按照以下方法制备：
(1)称取褐藻多糖硫酸酯溶于甲酰胺中，搅拌均匀制成质量浓度1-4％褐藻多糖硫酸酯溶液，优选2％；
(2)在该多糖溶液中滴加含有质量浓度0.5-2％N-溴代丁二酰亚胺(NBS)的甲基丙稀酸酐，优选1％；控制甲基丙稀酸酐浓度为0.5Mol/L-1.5Mol/L，优选1Mol/L；反应温度为40-80℃，优选50℃，反应时间2-8h，反应6h；
(3)反应完毕后，用95％乙醇进行沉淀，使最终乙醇质量浓度为60-80％进行沉淀，优选72％，将沉淀干燥后溶于水，用3600-12000Da的透析袋透析，自来水透析24-48h，蒸馏水透析24-48h，于透析袋内得到透析液；
(4)将(3)中的透析液减压浓缩至浓缩前体积的1/10-1/15，将浓缩液冻干，制得甲基丙烯酰化的褐藻多糖硫酸酯；
(5)将甲基丙烯酰化的褐藻多糖硫酸酯加入到光引发剂溶液中，使终浓度为3-8％，优选5％；
(6)吸取步骤(5)所配置的溶液1-5μL滴到双疏(疏水疏油)玻璃板上，优选1μL，将玻璃板放到可见光(T5-8W-220-240V/50-60Hz)下照射10-30分钟，优选20分钟，反应结束后用水冲洗，收集溶液，透析是用3600-12000Daa的透析袋透析，自来水24-48h，蒸馏水24-48h；
(7)将(6)中的透析液减压浓缩至初始体积的1/10-1/15，将浓缩液冻干，制得褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶，即为多糖敷料。
4.根据权利要求3所述用于创伤修复的多糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的光引发剂由以下试剂组成：含有0.3％-0.5％伊红的乙烯吡咯烷酮和5-8M三乙醇胺水溶液。
5.根据权利要求3所述用于创伤修复的多糖敷料的制备方法，其特征在于：所述的双疏(疏水疏油)玻璃板由以下步骤制备：
(1)将载玻片待双疏处理的一侧表面用石蜡均匀熏黑；
(2)将熏黑的载玻片放入干燥器中，同时放入四乙氧基硅烷和饱和氨水各2-4mL，室温放置24h-36h；
(3)将(2)中载玻片取出在马弗炉中500-600℃烧制2h-4h；
(4)将载玻片从马弗炉中取出后室温放凉，放入干燥器中，同时放入全氟十二烷基三氯硅烷1-2mL，室温放置72-84h。
6.一种权利要求1所述用于创伤修复的多糖敷料的应用，其特征在于：所述的褐藻多糖硫酸酯甲基丙烯酸水凝胶在创伤修复的外用治剂中的应用，尤其是慢性创伤修复的外用治剂中应用。
7.根据权利要求6所述用于创伤修复的多糖敷料的应用，其特征在于：所述的慢性创伤是指糖尿病慢性伤口愈合。
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