CN111450311A - 一种增强皮肤屏障功能的离子提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强皮肤屏障功能的离子提取物及其制备方法与应用，属于生物医用材料领域。该离子提取物由生物活性玻璃、浸提介质和添加物组成；其中，所述生物活性玻璃与浸提介质的质量体积浓度为0.01~200 mg/mL，所述添加物与浸提介质的体积比是3~10%。制备该离子提取物包括如下步骤：（1）在无菌条件下，用浸提介质浸没生物活性玻璃，得到混合物；（2）将所述混合物置于无菌条件下振荡孵育；（3）将步骤（2）所得孵育产物离心、过滤除去粉体，随后加入添加物，涡旋振荡混匀后得到离子提取物。本发明的离子提取物制备方法便捷，具有良好的生物相容性，能够增强皮肤的屏障功能，促进创面再上皮化过程。

Description

一种增强皮肤屏障功能的离子提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种增强皮肤屏障功能的离子提取物及其制备方法与应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，是人体的最重要的屏障，一方面为人体抵御物理因素如光、热、化学物质以及细菌病毒微生物等带来的伤害，另一方面防止机体内水分及营养物质的损失。皮肤主要由表皮、真皮及皮下组织构成，其中表皮位于最外层，主要承担皮肤的屏障功能。表皮中90%以上的细胞是角质形成细胞，角质形成细胞经过不断分化使表皮形成复层上皮，从上到下为基底层、棘细胞层、颗粒层、透明层和角质层。
由于覆盖于体表，皮肤经常受到损伤。正常情况下人体可以快速启动创伤愈合机制使得皮肤的结构和功能能够及时地恢复，但是许多因素如伤口感染、局部缺血、糖尿病等会影响皮肤恢复的进程，使创面迁延不愈，形成难愈创面。一般情况下，难愈创面处角质形成细胞的增殖、迁移、分化等生理行为会发生异常，造成创面再上皮化进程缓慢，屏障功能无法重塑，需要外界条件介入，促进皮肤结构和功能的恢复。
生物活性玻璃是一种无机非金属生物活性材料，广泛应用于骨、牙齿等硬组织修复。近年来有文献报道生物活性玻璃对于软组织如皮肤的修复也有促进作用，其释放的离子会激活多条信号通路，调控细胞行为，促进皮肤创面的修复。某些情况下，直接使用生物活性玻璃粉体可能会出现粉体在皮肤创面处分布不均匀，出现局部堆积，离子释放后造成局部较强的碱性化学环境，产生细胞毒性，造成患者不适。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种增强皮肤屏障功能的离子提取物及其制备方法与应用，本发明的离子提取物具有良好得生物相容性，能够降低细胞通透性，增强屏障功能，促进难愈创面再上皮化。
为达到上述目的，本发明的通过下述技术方案之一实现。
一种增强皮肤屏障功能的离子提取物，由生物活性玻璃、浸提介质和添加物组成；其中，所述生物活性玻璃与浸提介质的质量体积浓度为0.01~200 mg/mL，所述添加物与浸提介质的体积比是3~10%。
作为本发明优选的方案，所述生物活性玻璃是以SiO2-CaO-P2O5三元系统为主的生物活性玻璃粉体，其中SiO2摩尔百分比是40~80%，CaO的摩尔百分比为10~40%，P2O5的摩尔百分比为1~20%。
作为本发明优选的方案，所述生物活性玻璃为58S生物活性玻璃。
作为本发明优选的方案，所述浸提介质为DMEM培养基、无血清的角质形成细胞专用培养基、磷酸盐缓冲溶液、生理盐水、无菌去离子水中的一种。
作为本发明优选的方案，所述添加物为表皮生长因子、转化因子α、胰岛素、氢化可的松、L-谷氨酰胺、肾上腺素、转铁蛋白、牛脑垂体提取物、青霉素-链霉素、庆大霉素、透明质酸钠中的一种或多种。
以上任一项所述的一种增强皮肤屏障功能的离子提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）在无菌条件下，用浸提介质浸没生物活性玻璃，得到混合物；
（2）将所述混合物置于无菌条件下振荡孵育；
（3）将步骤（2）所得孵育产物离心、过滤除去粉体，随后加入添加物，涡旋振荡混匀后得到离子提取物。
作为本发明优选的方案，步骤（1）所述生物活性玻璃用100~500目筛网进行过筛处理。
作为本发明优选的方案，步骤（2）所述振荡孵育是在恒温摇床中，其中温度设置为20~37℃，振荡速度设置为50~150rpm。
作为本发明优选的方案，步骤（2）所述振荡孵育的时间为12~72h。
以上任一项所述的一种增强皮肤屏障功能的离子提取物应用于制备皮肤护理或皮肤创面修复产品。
本发明的离子提取物可以通过涂敷、喷洒等手段在创面治疗中应用，也可作为基础溶剂添加其他成分进行功能化应用，对于治疗难愈创面以及皮肤屏障功能障碍相关疾病有着良好的应用前景。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明的增强皮肤屏障功能的离子提取物具有良好的生物相容性，调控细胞通透性，增强皮肤屏障功能。
（2）本发明的增强皮肤屏障功能的离子提取物可以加速创面再上皮化过程，缩短创面愈合时间。
（3）本发明的增强皮肤屏障功能的离子提取物制备工艺简单，适合工业生产。
附图说明
图1为本发明的实施例1制得的离子提取物对角质形成细胞的细胞单层屏障功能的影响结果图。
图2为本发明的实施例1制得的离子提取物对角质形成细胞的细胞单层细胞通透性的影响结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1
一种增强皮肤屏障功能的离子提取物，其制备方法如下：
（1）生物活性玻璃粉体的制备：量取534.17 mL去离子水倒入烧杯，放入30℃恒温水浴锅中，将13.03 mL浓度为12 mol/L的盐酸溶液滴加至去离子水中，使用数显恒温搅拌器搅拌5 min，使其混合均匀。用蠕动泵以15 mL/min的速度加入660.6 mL的正硅酸乙酯，在添加过程中使用数显恒温搅拌器持续搅拌，待正硅酸乙酯添加完毕后，再持续搅拌30 min使其充分溶解。用蠕动泵以5 mL/min的速度加入65.4 mL的磷酸三乙酯，在添加过程中使用数显恒温搅拌器持续搅拌，待磷酸三乙酯添加完毕后，再继续搅拌1 h使其充分水解。称取421.095 g四水硝酸钙加入到上述溶液中，添加过程中使用数显恒温搅拌器持续搅拌，待四水硝酸钙添加完毕后，再继续搅拌3~4 h直至溶液澄清，随后停止搅拌。用保鲜膜密封烧杯口，置于室温下陈化3天，之后分别在60℃和120℃的烘箱中，各干燥3天，使其水分完全挥发。然后置于650°C的马弗炉中热处理3 h，即得到生物活性玻璃。
（2）将得到的生物活性玻璃球磨，用400目筛网过筛，随后进行高温高压灭菌，干燥后得到无菌的生物活性玻璃粉体。
（3）取1g无菌生物活性玻璃粉体，均匀地铺在直径10cm的无菌培养皿中，随后加入5mL的皮肤细胞基础培养基（ATCC），浸没生物活性玻璃粉体，生物活性玻璃与浸提介质的质量体积浓度为200 mg/mL。
（4）将培养皿用封口胶密封置于恒温摇床中，设置摇床温度为37℃，摇床震荡速度为80rpm，孵育24小时。
（5）将步骤（4）的混合物吸出离心过滤除去粉体得到混合溶液。向混合溶液中加入体积比为3%的添加物，添加物由转化因子α、L-谷氨酰胺、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、肾上腺素、牛脑垂体提出物、青霉素-链霉素溶液组成。经过涡旋混匀，然后得到离子提取物。
实施例2
一种增强皮肤屏障功能的离子提取物，其制备方法如下：
（1）生物活性玻璃粉体的制备：量取267.085mL去离子水倒入烧杯，放入30℃恒温水浴锅中，将6.515mL浓度为12 mol/L的盐酸溶液滴加至去离子水中，使用数显恒温搅拌器搅拌5 min，使其混合均匀。用蠕动泵以15 mL/min的速度加入330.3mL的正硅酸乙酯，在添加过程中使用数显恒温搅拌器持续搅拌，待正硅酸乙酯添加完毕后，再持续搅拌30 min使其充分溶解。用蠕动泵以5 mL/min的速度加入32.7 mL的磷酸三乙酯，在添加过程中使用数显恒温搅拌器持续搅拌，待磷酸三乙酯添加完毕后，再继续搅拌1 h使其充分水解。称取210.548g四水硝酸钙加入到上述溶液中，添加过程中使用数显恒温搅拌器持续搅拌，待四水硝酸钙添加完毕后，再继续搅拌3~4 h直至溶液澄清，随后停止搅拌。用保鲜膜密封烧杯口，置于室温下陈化3天，之后分别在60℃和120℃的烘箱中，各干燥3天，使其水分完全挥发。然后置于650°C的马弗炉中热处理3 h，即得到生物活性玻璃。
（2）将得到的生物活性玻璃球磨，用400目筛网过筛，随后进行高温高压灭菌，干燥后得到无菌的生物活性玻璃粉体。
（3）取0.5 g无菌生物活性玻璃粉体，均匀地铺在直径10cm的无菌培养皿中，随后加入5mL的皮肤细胞基础培养基（ATCC），浸没生物活性玻璃粉体，生物活性玻璃与浸提介质的质量体积浓度为100 mg/mL。
（4）将培养皿用封口胶密封置于恒温摇床中，设置摇床温度为37℃，摇床震荡速度为80rpm，孵育24小时。
（5）将步骤（4）的混合物吸出离心过滤除去粉体得到混合溶液，向混合溶液中加入体积比为3%的添加物，添加物由转化因子α、L-谷氨酰胺、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、肾上腺素、牛脑垂体提出物、青霉素-链霉素溶液组成。经过涡旋混匀，然后得到离子提取物。
实施例3
一种增强皮肤屏障功能的离子提取物，其制备方法如下：
（1）生物活性玻璃粉体的制备：量取53.417 mL去离子水倒入烧杯，放入30℃恒温水浴锅中，将1.303 mL浓度为12 mol/L的盐酸溶液滴加至去离子水中，使用数显恒温搅拌器搅拌5 min，使其混合均匀。用蠕动泵以15 mL/min的速度加入66.06 mL的正硅酸乙酯，在添加过程中使用数显恒温搅拌器持续搅拌，待正硅酸乙酯添加完毕后，再持续搅拌30 min使其充分溶解。用蠕动泵以5 mL/min的速度加入6.54 mL的磷酸三乙酯，在添加过程中使用数显恒温搅拌器持续搅拌，待磷酸三乙酯添加完毕后，再继续搅拌1 h使其充分水解。称取42.1095 g四水硝酸钙加入到上述溶液中，添加过程中使用数显恒温搅拌器持续搅拌，待四水硝酸钙添加完毕后，再继续搅拌3-4 h直至溶液澄清，随后停止搅拌。用保鲜膜密封烧杯口，置于室温下陈化3天，之后分别在60℃和120℃的烘箱中，各干燥3天，使其水分完全挥发。然后置于650°C的马弗炉中热处理3 h，即得到生物活性玻璃。
（2）将得到的生物活性玻璃球磨，用400目筛网过筛，随后进行高温高压灭菌，干燥后得到无菌的生物活性玻璃粉体。
（3）取0.05mg无菌生物活性玻璃粉体，均匀地铺在直径10cm的无菌培养皿中，随后加入5mL的皮肤细胞基础培养基（ATCC），浸没生物活性玻璃粉体，生物活性玻璃与浸提介质的质量体积浓度为0.01 mg/mL。
（4）将培养皿用封口胶密封置于恒温摇床中，设置摇床温度为37℃，摇床震荡速度为80rpm，孵育24小时。
（5）将步骤（4）的混合物吸出离心过滤除去粉体得到混合溶液，向混合溶液中加入体积比为3%的添加物，添加物由转化因子α、L-谷氨酰胺、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、肾上腺素、牛脑垂体提出物、青霉素-链霉素溶液组成。
经过涡旋混匀，然后得到离子提取物。
跨上皮细胞电阻（Transepithelial/transendothelial ElectricalResistance, TEER）检测法是一种常用的体外实验用来评估皮肤屏障功能的办法，TEER值越大说明屏障功能越强。将人源角质形成细胞以8×104个/孔的密度接种于24孔transwell培养板中的上层小室中（transwell 微孔滤膜孔径为0.4 μm，内径为6.5 mm，膜的有效面积为0.33 cm2），放入37℃，浓度为5%放入CO2培养箱中培养24小时。预先将实施例中制备的离子提取物用皮肤细胞基础培养基稀释20倍，得到实验组培养基备用。24小时后，取出transwell培养板，将培养基吸出，更换为实验组培养基或皮肤细胞基础培养基继续培养，设定培养开始后1天、3天、7天作为TEER的检测时间点。取未接种细胞的transwell小室加入皮肤基础培养基一并放入培养箱中培养，用作测量时的空白对照。用Millicell-ERS电阻仪对细胞单层的电阻进行测量，单层角质形成细胞的净电阻值TEER计算如下：
TEER(Ω•cm2)=（Ωn-Ω0）×S ，其中Ωn表示每个transwell小室实际电阻值， Ω0表示未接种细胞的transwell小室的电阻值，S表示transwell小室微孔膜的面积。
实施例1制备中的离子提取物跨上皮细胞电阻检测如图1所示，经过离子提取物处理之后，角质形成细胞细胞单层的TEER值显著升高，在处理第7天时TEER值达到1541±50.94Ω•cm2，而对照组仅为15.18±0.8305Ω•cm2，说明离子提取物可以增强角质形成细胞单层的屏障功能。用实施例2以及实施例3制备的离子提取物处理角质形成细胞单层，第7天时TEER值分别达到1070±14.12Ω•cm2，74.60±6.550Ω•cm2，同样能提高角质形成细胞细胞单层的TEER值，对角质形成细胞单层的屏障功能也具有一定的增强作用。
异硫氰酸荧光素一葡聚糖（FITC-dextran）是用FITC标记的葡聚糖，易溶于水溶液或盐溶液中，被广泛应用于细胞通透性的研究。将人源角质形成细胞以8×104个/孔的密度接种于24孔transwell培养板中的上层小室中（transwell 微孔滤膜孔径为0.4μm，内径为6.5mm，膜的有效面积为0.33cm2），放入37℃，浓度为5%的CO2培养箱中培养24小时。预先将实施例中制备的离子提取物用皮肤细胞基础培养基稀释20倍，得到实验组培养基备用。24小时后，取出培养系统，将培养基吸出，分别更换为实验组培养基或皮肤细胞基础培养基继续培养，设定培养开始后24小时、48小时、72小时是作为检测时间点。每个时间点到达后，小心吸出培养基，加入DPBS润洗2次后，在transwell上层小室中加入200μl 含1mg/ml 4kDaFITC-dextran的DPBS，下室中加入700μl DPBS。之后用铝箔纸将transwell培养板包好，置于37℃培养箱中避光孵育两小时。孵育结束后，将上层小室小心夹出，取下层下室中的100μl于黑色遮光96孔板中，利用多功能酶标仪检测液体的荧光发射强度（激发波长为490nm，测定波长为520nm）。各实验组荧光值与对照组荧光值的比值即为4kDa FITC-dextran的相对通透性。
实施例1中的离子提取物异硫氰酸荧光素—葡聚糖细胞通透性检测实验结果如图2所示，用离子提取物处理后，角质形成细胞的细胞通透性显著降低，72h后实验组荧光值与对照组荧光值的比值为0.06590±0.002233，说明离子提取物可以降低角质形成细胞的细胞通透性，控制细胞间物质的进出。实施例2以及实施例3制备的离子提取物同样能够降低角质形成细胞的细胞通透性，72h后实验组荧光值与对照组荧光值的比值分别为0.07333±0.005774，0.6900±0.03464, 也能一定程度控制细胞间物质的进出。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种增强皮肤屏障功能的离子提取物，其特征在于，由生物活性玻璃、浸提介质和添加物组成；其中，所述生物活性玻璃与浸提介质的质量体积浓度为0.01~200 mg/mL，所述添加物与浸提介质的体积比是3~10%。
2.根据权利要求1所述的一种增强皮肤屏障功能的离子提取物，其特征在于，所述生物活性玻璃是以SiO2-CaO-P2O5三元系统为主的生物活性玻璃粉体，其中SiO2摩尔百分比是40~80%，CaO的摩尔百分比为10~40%，P2O5的摩尔百分比为1~20%。
3.根据权利要求2所述的一种增强皮肤屏障功能的离子提取物，其特征在于，所述生物活性玻璃为58S生物活性玻璃。
4.根据权利要求1所述的一种增强皮肤屏障功能的离子提取物，其特征在于，所述浸提介质为DMEM培养基、无血清的角质形成细胞专用培养基、磷酸盐缓冲溶液、生理盐水、无菌去离子水中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种增强皮肤屏障功能的离子提取物，其特征在于，所述添加物为表皮生长因子、转化因子α、胰岛素、氢化可的松、L-谷氨酰胺、肾上腺素、转铁蛋白、牛脑垂体提取物、青霉素-链霉素、庆大霉素、透明质酸钠中的一种或多种。
6.制备权利要求1-5任一项所述的一种增强皮肤屏障功能的离子提取物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在无菌条件下，用浸提介质浸没生物活性玻璃，得到混合物；
（2）将所述混合物置于无菌条件下振荡孵育；
（3）将步骤（2）所得孵育产物离心、过滤除去粉体，随后加入添加物，涡旋振荡混匀后得到离子提取物。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述生物活性玻璃用100~500目筛网进行过筛处理。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述振荡孵育是在恒温摇床中，其中温度设置为20~37℃，振荡速度设置为50~150rpm。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述振荡孵育的时间为12~72h。
10.权利要求1-5任一项所述的一种增强皮肤屏障功能的离子提取物应用于制备皮肤护理或皮肤创面修复产品。
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CN113768799A (zh) * 2021-10-19 2021-12-10 四川涑爽医疗用品有限公司 一种多离子混合液及其制备方法与应用、含有该多离子混合液的口腔护理产品

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