CN113520997B - 负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医用材料技术领域，涉及一种负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液及其制备方法和应用，制备步骤包括：在纳米介孔碳上载入银、在纳米介孔碳上载入那他霉素和制备滴眼液；以纳米介孔碳为载体、负载那他霉素及银，其中的纳米介孔碳具有高载药量、大的比表面积的特征，能达到缓释那他霉素的目的，并能提高那他霉素的溶解性及生物利用度，从而减少真菌性角膜炎患者的用药频次、提高患者依从性、改善治疗效果；纳米介孔碳还能把炎症因子吸附到内部碳结构中，有效减轻炎症反应；银单质具有强烈的杀伤真菌作用，将其载入纳米介孔碳中，可延长银单质的抗真菌时间，同时减少那他霉素的药物用量，减轻不良反应；制作工艺简单，成本不高，易于保存。

Description

负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液及其制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及医用材料技术领域，涉及一种负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液及其制备方法和应用，以纳米介孔碳为载体、负载那他霉素及银，能提高那他霉素的溶解性及生物利用度，同时减少那他霉素的药物用量，减轻不良反应。

技术背景：

真菌性角膜炎是一种致病真菌相关的感染性眼病，镰刀菌及曲霉菌是我国真菌性角膜炎的主要致病菌，可造成严重的视力损害。我国作为以工农业为主要产业的发展中国家，近年来真菌性角膜炎发病率明显上升，居我国感染性角膜炎的首位。该病患者多为一线工作的青壮年劳动力，致盲率高，社会危害大。

真菌性角膜炎临床治疗较为棘手。目前临床上采用的抗真菌滴眼液存在水溶性差、眼表停留时间短、刺激性强、毒性大等问题，治疗手段匮乏导致真菌性角膜炎的致盲率居高不下，因此寻找真菌性角膜炎治疗药物新剂型至关重要。

介孔材料是近20年来材料科学领域研究的热点，它的孔径一般为2～50nm，其独特的结构特性，使其在催化、吸附、分离、储能等领域受到广泛的关注。介孔炭微球是一种具有高比表面积、较大的孔容、均一可调的孔径、规整的孔道结构、良好的热稳定性、化学稳定性的纳米材料，因此在选择性催化、吸附分离、吸收、电池电极以及能量转换等方面都具有广阔的应用前景，引起了科学工作者的广泛关注。但是，目前还未有关于纳米介孔碳材料在眼用药物中应用的报道。

发明内容：

本发明针对现有临床用药的不足，提供一种以纳米介孔碳为载体、负载那他霉素及银的滴眼液。

为了实现上述目的，本发明提供一种负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，具体步骤如下

S1、在纳米介孔碳上载入银：将纳米介孔碳分散于双蒸水中，加入摩尔浓度为0.1mol/L的硝酸银水溶液，避光搅拌4-6小时，双蒸水清洗后抽滤，然后紫外线光照4-6小时，将银离子还原为银单质，得到负载银的纳米介孔碳固体；

S2、在纳米介孔碳上载入那他霉素：将负载银的纳米介孔碳固体分散于体积浓度为30％的乙酸水溶液中，加入那他霉素，避光搅拌24-36小时，水洗后烘干，得到负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体；

S3、制备滴眼液：将负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体分散于生理盐水中，制备成负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液。

进一步的，负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的质量体积浓度为0.05-0.1mg/mL。

进一步的，在纳米介孔碳上载入银时，纳米介孔碳与硝酸银水溶液的质量体积比为1mg:0.1-0.2mL。

进一步的，在纳米介孔碳上载入那他霉素时，负载银的纳米介孔碳固体与那他霉素的质量比为1:2。

进一步的，所述纳米介孔碳的制备方法为：

(1)将海藻酸钠溶解于双蒸水中，室温搅拌4小时，配置成质量体积浓度为5-10mg/mL的海藻酸钠溶液，将其滴入到500mL浓度为0.1mol/L的氯化钙溶液中，室温搅拌8小时，经过滤后得到海藻酸钙凝胶；

(2)先将海藻酸钙凝胶置于冷冻干燥机内48小时，然后将其放入管式炉中，在氮气氛围下加热至950℃，保温1小时，使样品碳化；

(3)将碳化后的样品浸泡于摩尔浓度为1mol/L的盐酸水溶液中，在室温下，浸泡过夜，然后用双蒸水和乙醇抽滤清洗，置于鼓风干燥机中6小时，得到纳米介孔碳固体。

进一步的，所述步骤(2)中冷冻干燥机的环境温度为-60℃；管式炉的升温速率为5℃/min。

进一步的，所述步骤(3)中鼓风干燥机的温度为60℃。

本发明还提供一种利用负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法得到的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液。

本发明还提供一种负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的在治疗角膜炎中的应用，所述角膜炎为真菌性角膜炎。

本发明与现有技术相比，有益效果为：

1)本发明的滴眼液以纳米介孔碳为载体、负载那他霉素及银，其中的纳米介孔碳具有高载药量、大的比表面积的特征，能达到缓释那他霉素的目的，并能提高那他霉素的溶解性及生物利用度，从而减少真菌性角膜炎患者的用药频次、提高患者依从性、改善治疗效果；纳米介孔碳还能把炎症因子吸附到内部碳结构中，有效减轻炎症反应；

2)银单质具有强烈的杀伤真菌作用，将其载入纳米介孔碳中，可延长银单质的抗真菌时间，同时减少那他霉素的药物用量，减轻不良反应；

3)本发明滴眼液的成分生物相容性好；制作工艺相对简单，成本不高，易于保存。

附图说明：

图1为本发明涉及的纳米介孔碳及负载那他霉素的纳米介孔碳的物理表征图，其中A为纳米介孔碳的扫描电镜图；B为那他霉素、纳米介孔碳及负载那他霉素的纳米介孔碳的红外光谱图。

图2为本发明涉及的实施例3负载那他霉素的纳米介孔碳的释药能力及影响因素分析实验结果图，其中A为负载那他霉素的纳米介孔碳随时间变化的药物释放率；B为不同条件对负载那他霉素的纳米介孔碳释药率的影响。

图3为本发明涉及的实施例4纳米介孔碳的抗炎功能实验结果图。

图4为本发明涉及的实施例5纳米介孔碳的细胞毒性实验结果图。

图5为本发明涉及的实施例6负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的抗菌实验结果图，其中A和B分别为负载那他霉素的纳米介孔碳、负载那他霉素及银的纳米介孔碳对真菌生长的影响；C和D分别为负载那他霉素的纳米介孔碳、负载那他霉素及银的纳米介孔碳对真菌生物膜的影响。

图6为本发明涉及的实施例7负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液在小鼠真菌性角膜炎的应用结果图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

本实施例涉及负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，具体步骤如下：

1)将5g海藻酸钠溶解于500mL双蒸水中，室温搅拌4小时，配置成质量体积浓度为10mg/mL的海藻酸钠溶液，将其滴入到500mL浓度为0.1mol/L的氯化钙溶液中，室温搅拌8小时，经纱布过滤后得到海藻酸钙凝胶；

2)将海藻酸钙凝胶置于冷冻干燥机(-60℃)48小时，之后将其放入管式炉，在氮气氛围下加热至950℃(升温速率为5℃/min)，保温1小时；

3)将碳化后的样品置于摩尔浓度为1mol/L的盐酸溶液中，室温浸泡过夜，然后双蒸水和乙醇抽滤清洗，置于鼓风干燥机(60℃)6小时后得到纳米介孔碳固体；

4)将40mg纳米介孔碳分散于双蒸水中，加入4mL摩尔浓度为0.1mol/L硝酸银水溶液，避光搅拌4小时，双蒸水清洗后抽滤，紫外线光照4小时，将银离子还原为银单质，得到负载银的纳米介孔碳固体；

5)将20mg负载银的纳米介孔碳固体分散于20mL体积浓度为30％的乙酸水溶液中，加入40mg那他霉素，避光搅拌24小时，水洗后烘箱烘干，得到负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体；

6)将负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体分散于生理盐水中，制备成质量体积浓度为0.1mg/mL的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液。

本实施例的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的浓度在0.1mg/mL时的透光率好，不影响视物，故滴眼液的优选浓度为0.1mg/mL。

本实施例对上述步骤得到的纳米介孔碳、负载那他霉素的纳米介孔碳进行物理表征：

(1)用扫描电子显微镜(SEM)观察纳米介孔碳的形态及结构，结果如图1A所示。

(2)通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)对那他霉素、纳米介孔碳和负载那他霉素的纳米介孔碳进行物理表征，结果如图1B所示，证实药物成功载于纳米介孔碳。

(3)对样品进行比表面积、孔体积分析，结果如表1所示。

表1纳米介孔碳和负载那他霉素的纳米介孔碳的比表面积及孔体积分析

结果显示，纳米介孔碳材料吸附那他霉素后，比表面积减少，孔体积减小，证明那他霉素成功载于多孔碳材料上。

本实施例涉及的负载那他霉素的纳米介孔碳的制备方法采用负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体的制备方法，但不包括负载银的步骤。

实施例2：

本实施例涉及负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，具体步骤如下：

1)将2.5g海藻酸钠溶解于500mL双蒸水中，室温搅拌4小时，配置成密度为5mg/mL的海藻酸钠溶液，将其滴入到500mL摩尔浓度为0.1mol/L的氯化钙水溶液中，室温搅拌8小时，经纱布过滤后得到海藻酸钙凝胶；

2)将海藻酸钙凝胶置于冷冻干燥机(-60℃)48小时，之后将其放入管式炉，在氮气氛围下加热至950℃(升温速率为5℃/min)，保温1小时；

3)将碳化后的样品置于1mol/L盐酸水溶液中，室温浸泡过夜，双蒸水和乙醇抽滤清洗，置于鼓风干燥机(60℃)6小时后得到纳米介孔碳固体；

4)将40mg纳米介孔碳分散于双蒸水中，加入7mL摩尔浓度为0.1mol/L硝酸银水溶液，避光搅拌6小时，双蒸水清洗后抽滤，紫外线光照6小时，将银离子还原为银单质，得到负载银的纳米介孔碳固体；

5)将30mg负载银的纳米介孔碳固体分散于30mL体积浓度为30％的乙酸水溶液中，加入60mg那他霉素，避光搅拌36小时，水洗后烘箱烘干，得到负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体；

6)将负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体分散于生理盐水中，制备成0.1mg/mL的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液。

实施例3：

本实施例涉及负载那他霉素的纳米介孔碳的释药能力及影响因素分析实验，具体为：

(1)体外药物释放实验

称取2mg的载那他霉素的纳米介孔碳，加入3mL PBS溶液，装入透析袋中，两端夹紧，放入装有50mL PBS溶液的烧杯中，温度为37℃，转速为100r/min，每隔2小时取出2mL的透析液，并立即补充等量PBS溶液，在304nm处测定透析液的吸光度，根据回归方程计算其浓度，并计算药物的累积释药率：累积释药率＝释放出的药物量/投药量×100％。结果如图2A所示。

从图2A可以看出，那他霉素的释放呈现缓释，10小时释放率约56％，12小时释放率约61％，18小时释放率约67％，18小时后，药物停止释放。

(2)负载那他霉素的纳米介孔碳的释药能力影响因素分析实验

1)角膜上皮细胞碎片对负载那他霉素的纳米介孔碳的释药能力的影响

称取2mg的载那他霉素的纳米介孔碳，与角膜上皮细胞碎片共孵育，37℃孵育24小时，将其放入透析袋中，两端夹紧，放入装有50mL PBS溶液的烧杯中，温度为37℃，转速为100r/min，分析释药率，具体步骤同上。结果如图2B所示。

结果显示，角膜上皮细胞碎片与负载那他霉素的纳米介孔碳共同孵育后，可促进那他霉素释放，10小时释放率约68％，12小时释放率约72％，12小时后药物停止释放。

2)温度对负载那他霉素的纳米介孔碳的释药能力的影响

称取2mg的载那他霉素的纳米介孔碳，加入3mL PBS溶液，装入透析袋中，两端夹紧，放入装有50mL PBS溶液的烧杯中，加热至90℃，持续5min后，温度维持在42℃，转速为100r/min，分析释药率，具体步骤同上。结果如图2B所示。

结果显示，加热可促进负载那他霉素的纳米介孔碳释放那他霉素，8小时释放率约75％，10小时释放率约80％，10小时后药物停止释放。

3)真菌孢子孵育影响负载那他霉素的纳米介孔碳的释药能力

称取2mg的载那他霉素的纳米介孔碳，与烟曲霉菌孢子共孵育，37℃孵育24小时，将其放入透析袋中，两端夹紧，放入装有50mL PBS溶液的烧杯中，温度为37℃，转速为100r/min，分析释药率，具体步骤同上。结果如图2B所示。

结果显示，烟曲霉菌孢子与负载那他霉素的纳米介孔碳共同孵育后，可促进那他霉素释放，10小时释放率约73％，12小时释放率约76％，12小时后药物停止释放。

本实施例涉及的负载那他霉素的纳米介孔碳的制备方法采用负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体的制备方法，但不包括负载银的步骤。

实施例4：

本实施例涉及纳米介孔碳的抗炎功能实验，具体为：

培养角膜上皮细胞，分为空白组、对照组和实验组，空白组对角膜上细胞进行正常培养；对照组用灭活烟曲霉菌菌丝刺激角膜上皮细胞18小时；实验组分别给予浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL纳米介孔碳混悬水溶液处理，并用灭活烟曲霉菌菌丝刺激角膜上皮细胞18小时。收集各组的角膜上皮细胞培养液的上清液，检测上清液中白细胞介素6及白细胞介素8的蛋白水平，结果如图3所示。

结果显示，与对照组相比，浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的纳米介孔碳能分别减少24％、63％、93％的白细胞介素6；浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的纳米介孔碳能分别减少13％、78％、94％的白细胞介素8。说明，真菌菌丝感染角膜上皮细胞18小时，纳米介孔碳处理可显著下调真菌诱导细胞产生的炎症因子水平。

实施例5：

本实施例涉及纳米介孔碳的细胞毒性检测实验。

在96孔板中接种永生化人角膜上皮细胞悬液，向培养液中加入纳米介孔碳，使终浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL，刺激完毕后将细胞培养板离心，吸除上清，加入150微升用PBS稀释了10倍的试剂盒提供的LDH释放试剂，在细胞培养箱中孵育1小时。随后将细胞培养板用多孔板离心，分别取各孔的上清液120微升，加入到新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定，结果如图4所示。

结果显示，浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL的纳米介孔碳均不影响角膜上皮细胞存活率，对细胞无毒性。

实施例6：

本实施例涉及实施例1制备的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的抗菌实验，具体为:

(1)真菌生长分析

将一定量的烟曲霉菌孢子及培养基加入96孔板中，分别加入不同浓度的负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼液，以及负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液，置于37℃温箱，培养48小时，酶标仪测量吸光度，结果如图5A和5B所示。

结果显示，负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼液能降低真菌吸光度值，有效减少真菌的生长，而同时负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液能够进一步抑制真菌生长。与空白对照组相比，浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼液分别降低37％，48％，69％的真菌生长水平；浓度为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液分别抑制75％、80％、85％的菌丝数量。

(2)生物膜形成能力检测

烟曲霉菌孢子与药物混合的96孔板置于恒温箱37℃，分别加入不同浓度的负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼液，以及负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液，孵育48小时至生物膜形成。PBS漂洗3次，空气干燥后，经体积浓度为99％的甲醇水溶液固定20分钟；然后用100μL质量浓度为0.1％的结晶紫水溶液染色15分钟；用PBS洗去未结合的染料；干燥后，室温下每孔加入100μL体积浓度为95％的乙醇水溶液静置30分钟，充分释放与生物膜结合的染料，用酶标仪测量吸光度。

结果显示，与空白对照组相比，0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼液可分别减少23％，47％，61％的真菌生物膜的形成；0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL同时负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液可分别减少62％，85％，85％的真菌生物膜的形成。因此，负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼液能有效抑制真菌生物膜的形成，而同时负载那他霉素及银的纳米介孔碳能够进一步降低真菌生物膜的生成能力。

本实施例涉及的负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼液的制备方法采用实施例1负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，但不包括负载银的步骤。

实施例7：

本实施例涉及负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液在小鼠真菌性角膜炎的应用实验，具体为：

取8周龄C57BL/6健康雌鼠，建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型，后随机分为四组：第一组为感染对照组，第二组为负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼液组，第三组为负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液组，第四组为那他霉素滴眼液组，均以右眼为实验眼。模型建立成功后，第一组对小鼠不采取任何措施，第二组至第四组分别用负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼液(浓度为0.1mg/mL)、负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液(浓度为0.1mg/mL)和那他霉素滴眼液(浓度为50ug/mL)点眼，每天点眼2次，每次3微升。根据O’Day标准行角膜溃疡评分标准，感染3天后，于裂隙灯下观察并记录小鼠角膜溃疡的评分情况，结果如图6所示。

结果表明，负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼组和负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼组的角膜溃疡及临床评分均低于感染对照组及那他霉素滴眼液组。与负载那他霉素的纳米介孔碳滴眼组相比，负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼能进一步减轻角膜的炎性损伤，降低临床评分。

实施例8：

本实施例涉及负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液在治疗人真菌性角膜炎的应用，具体为：

采集2019年4月至2021年4月于我院接受治疗的真菌角膜炎患者51例，其中男性28例，女性23例，年龄为23～61岁，平均(37.14±5.12)岁。

所有患者均接受负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液点眼治疗，每天2次，需连续治疗3周。

按照相关标准对患者治疗后临床效果进行评价，治愈：经过治疗后，患者分泌物消失，角膜浸润及水肿情况消退，结膜充血情况消失，真菌培养呈现为阴性，角膜溃疡愈合，经过共聚焦显微镜检查后未见菌丝；显效：经过治疗后，患者相关检测结果为阴性，各项指标得到改善，仅存在结膜充血或角膜斑翳情况；有效：经过治疗后，患者相关检查结果呈现阴性，各项指标中仅有1～2项得到改善。无效：治疗前后各项指标均无变化，或者存在加重情况。治疗总有效率＝(治愈+显效+有效)/总例数×100％。按照相关标准对患者各项症状进行评价，每一项症状评分最高5分，评分越高则代表该症状程度越严重。

经过统计后，见表2，51例患者接受治疗后，46例患者治疗效果，其中治愈38例，显效6例，有效2例，无效5例，治疗有效率为90.2％(46/51)。

表2负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液在治疗人真菌性角膜炎的应用效果

Claims (8)

1.一种负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

S1、在纳米介孔碳上载入银：将纳米介孔碳分散于双蒸水中，加入摩尔浓度为0.1mol/L的硝酸银水溶液，避光搅拌4-6小时，双蒸水清洗后抽滤，然后紫外线光照4-6小时，将银离子还原为银单质，得到负载银的纳米介孔碳固体；

所述纳米介孔碳的制备方法为：

(1)将海藻酸钠溶解于双蒸水中，室温搅拌4小时，配置成质量体积浓度为5-10mg/mL的海藻酸钠溶液，将其滴入到500mL浓度为0.1mol/L的氯化钙溶液中，室温搅拌8小时，经过滤后得到海藻酸钙凝胶；

(2)先将海藻酸钙凝胶置于冷冻干燥机内48小时，然后将其放入管式炉中，在氮气氛围下加热至950℃，保温1小时，使样品碳化；

(3)将碳化后的样品浸泡于摩尔浓度为1mol/L的盐酸水溶液中，在室温下，浸泡过夜，然后用双蒸水和乙醇抽滤清洗，置于鼓风干燥机中6小时，得到纳米介孔碳固体；

S2、在纳米介孔碳上载入那他霉素：将负载银的纳米介孔碳固体分散于体积浓度为30％的乙酸水溶液中，加入那他霉素，避光搅拌24-36小时，水洗后烘干，得到负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体；

S3、制备滴眼液：将负载那他霉素及银的纳米介孔碳固体分散于生理盐水中，制备成负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液。

2.根据权利要求1所述的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，其特征在于，负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的质量体积浓度为0.05-0.1mg/mL。

3.根据权利要求1所述的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，其特征在于，在纳米介孔碳上载入银时，纳米介孔碳与硝酸银水溶液的质量体积比为1mg:0.1-0.2mL。

4.根据权利要求1所述的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，其特征在于，在纳米介孔碳上载入那他霉素时，负载银的纳米介孔碳固体与那他霉素的质量比为1:2。

5.根据权利要求1所述的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中冷冻干燥机的环境温度为-60℃；管式炉的升温速率为5℃/min。

6.根据权利要求1所述的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中鼓风干燥机的温度为60℃。

7.根据权利要求1所述的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液的制备方法得到的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液。

8.根据权利要求7所述的负载那他霉素及银的纳米介孔碳滴眼液在制备治疗角膜炎药物中的应用，其特征在于，所述角膜炎为真菌性角膜炎。

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