CN109999028B - 四氮唑或其衍生物修饰的抗菌金纳米颗粒、其制备方法及应用 - Google Patents

四氮唑或其衍生物修饰的抗菌金纳米颗粒、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种四氮唑或其衍生物修饰的抗菌金纳米颗粒，及其制备方法和应用。本发明将没有抗菌活性的取代四氮唑部分，没有抗菌活性的未取代的金纳米颗粒相连，并首次应用于抗菌领域，所得的取代四氮唑修饰的金纳米颗粒取得了出乎意料的抗菌效果。本发明合成的金纳米颗粒对革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抗菌效果，抗菌谱宽，并且可以对抗临床分离的多药耐药菌。与现有技术相比，本发明采用金纳米颗粒与巯基四氮唑化合物相连，合成方法为水相一步合成，合成中所使用原材料绿色环保。

Description

四氮唑或其衍生物修饰的抗菌金纳米颗粒、其制备方法及 应用
技术领域
本发明属于领域，具体涉及一种四氮唑或其衍生物修饰的抗菌金纳米颗粒，及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌药物的广泛使用和不合理滥用已经使细菌耐药问题成为我国乃至全世界广泛存在的问题，为人民健康和社会经济带来巨大损失，是临床上最困难和最迫切需要解决的问题之一。面临对人类健康造成危害日益严重的细菌耐药性，除了倡导和推广合理应用抗菌药物以外，加快研发有效并且安全的抗菌药物至关重要。抗菌药物的发展目前主要基于两方面，一是天然抗菌成分的发现，另一为人工合成抗菌药物。前者需要大量分离纯化分析工作，步骤繁多复杂，难以广泛推广。后者目前主要集中在对现有药物进行结构改造，容易使新药在短期内产生耐药性。纳米材料可以为抗菌药物的研发提供了优异的平台，主要基于以下几个特点：纳米颗粒与生物大分子尺寸相当，可以有效地携带药物进入细菌，并与相关靶标产生相互作用；纳米颗粒具有较高的比表面积，可以通过多价效应，显著提高所负载药物的有效浓度；纳米颗粒表面性质活泼，可以进行多种功能性分子的修饰，改善药物的物理性质并实现药物的靶向性治疗。其中，金纳米颗粒具有较高的生物安全性和独特的理化性质，是抗菌研究领域的理想材料。
万古霉素修饰到具有刚性结构的金纳米颗粒上，可以抑制三种不同基因型的耐万古霉素的肠球菌，药效可以提高60倍以上。金纳米颗粒不仅增强了万古霉素的药效，还扩展了它的抗菌谱，可以抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌的生长。金纳米颗粒对β-内酰胺类抗菌药物氯头孢菌素也有增强抗菌的效果，将氯头孢菌素连接到金纳米颗粒表面后，金颗粒表面高浓度的氯头孢菌素可以抑制细菌细胞壁中的肽聚糖成分，并且金纳米颗粒可以在细菌的细胞壁上产生“孔洞”，造成核酸蛋白等物质泄露而导致菌体死亡。此外，用抗癌类药物5-氟尿嘧啶稳定金纳米颗粒，结果显示合成的金纳米颗粒对一系列细菌真菌都表现出了比5-氟尿嘧啶更高的抗菌活性。
金纳米颗粒除了通过连接现有抗菌药物增加其药效外，还可以通过被一些特殊分子修饰对抗多药耐药菌。例如，巯基嘧啶是细菌tRNA胞嘧啶的类似物，当被修饰在金纳米颗粒表面后，可以发挥强大的抗革兰氏阴性菌的活性，且和商业抗菌药物相比，不容易诱导细菌产生耐药性。延缓细菌产生耐药性的发现也被报道，当金纳米颗粒被疏水阳离子单分子层修饰后，不仅可以对抗多药耐药菌，在用低浓度诱导细菌20代以后仍没有发现耐药性的产生。
除此之外，金纳米材料自身的光热性质也是开发新型抗菌剂的一个途径。例如，金纳米颗粒的形状可以有效的吸收近红外光并将其转化为热能，提高周围环境的温度来杀死细菌。将可以粘附细菌的抗体修饰在金纳米颗粒表面，当金纳米颗粒与细菌粘附在一起的时候进行NIR照射，便可通过光热疗法杀死细菌。
但是，以上诸多研究在临床应用上主要存在以下几点问题：1、配体为商业抗菌药物，与细菌产生耐药性的药物具有相同的化学结构，即便投入临床使用也会很快产生耐药性；2、配体需要复杂的合成过程，不具备推广性，并且筛选率低；3、抗菌谱较窄，仅对单一革兰氏阳性菌或者革兰氏阴性菌具有抑制作用，缺少广谱性；4、很多开发的抗菌剂需要借助红外等外界力量，临床应用会给患者造成不便。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种四氮唑或其衍生物修饰的抗菌金纳米颗粒，以及其制备方法及应用。
在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“吐温80”是指：聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。
术语“NPN”N-苯基-1-萘胺，N-Phenyl-1-naphthylamine。
术语“PTT”是指：5-疏基-1-苯基-四氮唑。
术语“HPTT”是指：1-(4-羟基苯基)-5-巯基-四氮唑。
术语“MMT”是指：5-巯基-1-甲基四氮唑。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种四氮唑或其衍生物修饰的抗菌金纳米颗粒，所述抗菌金纳米颗粒包括：
四氮唑或其衍生物；和
金纳米颗粒；
优选地，所述四氮唑衍生物为巯基修饰的四氮唑；
更优选地，所述巯基修饰的四氮唑选自以下一种或多种：5-疏基-1-苯基-四氮唑，1-(4-羟基苯基)-5-巯基-四氮唑，5-巯基-1-甲基四氮唑。
根据本发明第一方面的抗菌金纳米颗粒，其中，所述抗菌金纳米颗粒的平均粒径为1～50nm，优选为1～20nm，更优选为1～10nm。本发明的第二方面提供了第一方面所述的抗菌金纳米颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将氯金酸水溶液与四氮唑或其衍生物溶液混合，冰水稀释，向溶液中加入吐温80，冰浴搅拌；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入硼氢化钠冰水溶液并搅拌；
(3)透析袋透析步骤(2)所得溶液得到所述抗菌金纳米颗粒。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述氯金酸水溶液的浓度为0.1～10mmol/L，优选为0.1～5mmol/L，最优选为1mmol/L；所述四氮唑或其衍生物溶液浓度为0.1～10mmol/L，优选为0.1～5mmol/L，最优选为1mmol/L；所述吐温80与所述四氮唑或其衍生物的摩尔比为1:1～1:100，优选为1:50～1:100，最优选为1:61。优选地，所述步骤(2)中，所述硼氢化钠与氯金酸的摩尔比为1:1～1:10，优选为1:1～1:5，最优选为1:3。
更优选地，所述步骤(2)中，所述搅拌过程为先快速搅拌再慢速搅拌，所述快速搅拌时间为5～30分钟，优选为10～20分钟，最优选为15分钟；所述慢速搅拌时间为0.1～5小时，优选为0.5～2小时，最优选为1小时。
再优选地，所述步骤(3)中，所述透析截止值为10～20kDa MW，优选为10～15kDaMW，最优选为14kDa MW；所述透析时间为10～60小时，优选为30～60小时，最优选为48小时。进一步优选地，所述方法进一步包括以下步骤：
(4)将所制得的抗菌金纳米颗粒储存在1～10℃，优选为1～5℃，最优选为4℃。
本发明的第三方面提供了第一方面所述抗菌金纳米颗粒或根据第二方面所述方法制备的抗菌金纳米颗粒在制备抗菌药物或抗菌产品中的应用，优选地，抗菌药物或抗菌产品针对选自以下一种或多种细菌：革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和多药耐药菌。
优选地，所述革兰氏阴性菌选自以下一种或多种：大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯氏菌、猪霍乱沙门氏杆菌；所述革兰氏阳性菌选自以下一种或多种：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；所述多药耐药菌选自以下一种或多种：多药耐药的大肠杆菌、多药耐药的铜绿假单胞菌、多药耐药的金黄色葡萄球菌。
本发明着眼于克服原有抗菌材料复杂多步的合成路径，聚焦于拓展抗菌谱和提高抗菌活性，并研究独特的抗菌机制，为临床上快速高效广泛地开发新型抗菌药物提供基础、理论以及可行性。本发明利用金纳米颗粒活化具有潜在抗菌作用的四氮唑小分子，利用其多价效应开发可对抗多药耐药菌的新型纳米制剂。四氮唑小分子可通过抑制金属β-内酰胺酶以及细菌的氨基酰-tRNA合成酶的作用来增强抗菌作用，但是作为药物增效基团合成过程复杂且分子不易进入细菌。本发明选取具有不同结构的四氮唑小分子，通过硼氢化钠还原的方法将其修饰于无毒的金纳米颗粒上，形成具有广谱抗菌活性的纳米药物。该方法为水相一步反应，绿色环保简单，避免了复杂的有机合成；所选分子是药物前体而不是现成药物，降低了合成难度和成本，拓宽了药物筛选的范围；所用药物载体金为生物惰性，属于生物相容性材料，从源头降低了其生物毒性；最为关键的是，该抗菌体系的母核与传统抗菌药物不同，从根本上减小了临床应用中耐药的产生。这在科学研究和实际药物开发中都有开拓性的意义。
本发明首次将取代四氮唑修饰的金纳米颗粒应用于抗菌剂的制备，合成方法简单环保，制备出的金纳米颗粒尺寸均一稳定。抗菌活性测试显示，本发明中的金纳米颗粒对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抗菌作用，并且对临床上分离出来的多药耐药菌也具有较强抗菌作用，和现有报道相比，本发明所采用合成方法更加简便，颗粒的抗菌谱也更广。
我们选取了5-疏基-1-苯基-四氮唑(PTT)，1-(4-羟基苯基)-5-巯基-四氮唑(HPTT)，5-巯基-1-甲基四氮唑(MMT)三种常见巯基修饰的四氮唑小分子，前期抗菌测试显示三种小分子均无抗菌作用。我们利用金纳米颗粒的高比表面积，可以浓缩药物分子的作用，容易形成局部高浓度，以及易于进入细胞膜结构等特点来活化潜药四氮唑分子。巯基分子与金纳米颗粒连接可以起到很好的稳定金纳米颗粒的作用。通过硼氢化钠还原氯金酸的方法将巯基氮杂环分子修饰到金纳米颗粒上来筛选抗菌药。该方法避免了使用复杂的合成步骤，并且所选用的分子是药物前体而不是现成的抗菌药物，从而降低了合成新药的难度和成本，拓展了药物筛选的范围。抗菌活性研究显示这些四氮唑修饰的金纳米颗粒对实验室标准菌株和临床分离出的多药耐药的细菌均有很好的抗菌活性。三种金纳米颗粒对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及多药耐药菌均有抗菌活性。其中Au_MMT对革兰氏阴性菌抗菌效果较好，最小抑菌浓度(MIC)值普遍在8μg/mL以下，对于多药耐药绿脓杆菌(MDR P.a)效果稍差，MIC值为16μg/mL。Au_MMT可以抑制革兰氏阳性细菌的生长，但是效果比革兰氏阴性菌稍差，MIC值普遍在16μg/mL以上。Au_PTT和Au_HPTT对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有很好的抑制作用，MIC值均在4以下，且对于部分耐药菌，比如耐药的大肠杆菌和绿脓杆菌反而抗菌效果更好。
对抗菌机理进行初步研究我们发现金纳米颗粒可以破坏细菌细胞膜。NPN是一种疏水性的荧光探针，在水溶液中荧光较弱，当与细胞膜内的疏水物质结合后，荧光强度会大大增强。当细菌的细胞膜Au NPs破坏后，细胞膜内的疏水物质暴露出来，可以有效的结合NPN，使NPN发出较强的荧光。因而NPN可以有效的反应出细菌细胞外膜的通透性，以此来测定Au NPs是否会破坏细菌细胞膜。Au NPs处理后的细菌经过NPN染色后的荧光强度增强，说明纳米颗粒对细菌的细胞外膜会产生破坏。进一步，通过TEM表征，我们发现经过金纳米颗粒处理的大肠杆菌可以见到很明显的坏死特征。对照组中大肠杆菌细胞壁和细胞膜非常完整，核酸在菌体内均匀分布。接触三种金纳米颗粒后，细菌内部形成空泡，内容物和细胞膜分离。在金黄色葡萄菌的电镜切片中也能明显看到菌体的破坏，Au_MMT大部分聚集在菌体外部，Au_PTT和Au_HPTT两种纳米颗粒可以进入到菌体内部，所以Au_PTT和Au_HPTT显示出了对革兰氏阳性菌更强的抗菌活性。
细菌在吸附于固体表面后，数量增加到一定程度后，会分泌出一些多聚糖和蛋白质，与菌体自身包裹在水合基质内，形成一层黏滑的生物膜。这种生物膜群体可以让非固定的、或者浮游细菌迅速增殖和扩散。生物膜在固体物质如医疗器械表面极易形成，生物膜的形成增加了抗生素进入细菌的难度，增加了细菌感染的治疗难度。抗生素可以有效的对抗从生物膜上释放出的细菌，却不能破坏生物膜。生物膜对抗生素的耐药机制主要包括以下几点：1、阻止抗生素深度进入生物膜，阻碍抗生素扩散。2、生物膜内的细菌受到营养限制，处于生长迟缓期和饥饿状态，这种状态对许多杀菌剂都不敏感。3、生长在表面的细菌可以自发保护自身所形成的生物膜。所以检测金纳米颗粒是否可以抑制生物膜的形成对其日后应用研究具有非常重要的意义。本发明中三种金纳米颗粒对于绿脓杆菌形成生物膜的抑制作用，结果如图6所示，金纳米颗粒可以显著抑制细菌生物膜的形成，三种纳米颗粒的抑制作用相当，抑制率高于50％。
本发明可以为新型抗菌材料的设计提供思路，发明的金纳米抗菌材料制备过程简单，采用的方法和试剂绿色环保，抗菌谱广，对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均有强大的抗菌作用，不仅可以抑制实验室菌株，还可以抑制临床分离的多药耐药菌，最小抑菌浓度(MIC)均低于32μg/mL，对于大部分菌株MIC为4或2μg/mL，对于临床分离的多药耐药菌甚至抗菌效果更好。此外，该金纳米颗粒还可以有效抑制细菌生物膜的形成，未来有助于在体内减少细菌耐药性的形成，也有可能进一步固定在医用材料上用于抗菌医疗器械的开发。同时，本发明考察了金纳米颗粒对细菌细胞膜的影响，为进一步探讨金纳米颗粒的抗菌机制奠定了基础。
本发明设计了三种具有强效抗菌作用的金纳米颗粒，克服了原有抗菌材料复杂多步的合成路径，同时有效地拓展了抗菌谱和提高抗菌活性，这些金纳米颗粒和现有抗菌药物具有不同的结构，在抗菌机理上可能具有自己独特的抗菌机制。从科研及技术路线上来看，本发明为临床上开发新型抗菌药物提供了一种新的基础理论以及技术可行性。从临床来看，若是本发明可以应用于临床患者并实现产品化和产业化，由于该抗菌体系的母核与传统抗菌药物不同，从根本上减小了临床应用中耐药的产生。因此，本发明在科学研究和实际药物开发中都有开拓性的意义。
本发明的四氮唑或其衍生物修饰的抗菌金纳米颗粒可以具有但不限于以下有益效果：
1、本发明将没有抗菌活性的取代四氮唑部分，没有抗菌活性的未取代的金纳米颗粒通过S-Au键相连，并首次应用于抗菌领域，所得的取代四氮唑修饰的金纳米颗粒取得了出乎意料的抗菌效果。本发明合成的金纳米颗粒对革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抗菌效果，抗菌谱宽，并且可以对抗临床分离的多药耐药菌。
2、与现有技术相比，本发明采用金纳米颗粒与巯基四氮唑化合物相连，合成方法为水相一步合成，合成中所使用原材料绿色环保。本发明所述的取代四氮唑修饰的金纳米颗粒，制备方法简单，纳米颗粒粒径分布小，颗粒在水中分散性好，能在4℃或-20℃保存至少一年，冻干颗粒仍可溶于水。
3、在正常剂量下，本发明所述的金纳米颗粒具有广谱抗菌效果，并且可以抑制细菌生物膜的形成，是一种新型高效的抗菌剂。本发明中的金纳米颗粒可以破坏细菌的细胞结构，同时还可以抑制细菌的生物膜的形成，有利于对抗多药耐药菌。本发明中的金纳米颗粒在动物体内具有一定抗菌作用，具有被开发成商用抗菌药物的潜力。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明所述的巯基四氮唑的结构，其中编号1、2、3分别为MMT，PTT和HPTT的分子式。图2示出了本发明所述的四氮唑修饰的金纳米颗粒的透射电镜图片及粒径分布图片。
图3示出了本发明金纳米颗粒影响细菌通透性的图片。
图4示出了本发明金纳米颗粒对细菌微观结构影响的图片。
图5示出了本发明金纳米颗粒对细菌生物膜的抑制作用。
图6示出了本发明金纳米颗粒的细胞毒性结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
氯金酸，硼氢化钠购自国药集团化学试剂有限公司；巯基四氮唑，吐温80购自Sigma公司，，胰化蛋白胨，酵母提取物购自北京拜尔迪生物技术有限公司，NaCl，NaOH，乙醇，PBS缓冲液购自北京北化精细化学品有限公司，NPN购自梯希爱(上海)化成工烽发展有限公司，戊二醛固定液，甲醛购自陇西化工股份有限公司，结晶紫购自北京化学试剂公司，庆大霉素，多黏菌素，购自上海麦克林生化科技有限公司；
透析袋购自北京蓝弋化工产品有限责任公司、铜网购自北京中镜科仪技术有限公司、96-孔酶标板购自美国Corning公司，CCK-8试剂盒购自碧云天生物科技有限公司；
菌种：大肠杆菌(Escherichia coli,ATCC11775,革兰氏阴性菌)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa,ATCC27853,革兰氏阴性菌)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae,ATCC 13883,革兰氏阴性菌)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,ATCC 6538P,革兰氏阳性菌)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,ATCC 12228,革兰氏阳性菌)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，ATCC 6633，革兰氏阳性菌)均购买于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心；猪霍乱沙门氏杆菌(Salmonella choleraesuis,ATCC 14028,革兰氏阴性菌)购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心；多药耐药的大肠杆菌(MDR E.coli，革兰氏阴性菌)(VITEK全自动细菌分离仪分离鉴定细菌，临床分离号903657)、多药耐药的铜绿假单胞菌(MDR P.aeruginosa，革兰氏阴性菌)(VITEK全自动细菌分离仪分离鉴定细菌，临床分离号903624)、多药耐药的金黄色葡萄球菌(MR S.aureus，革兰氏阳性菌)(VITEK全自动细菌分离仪分离鉴定细菌，临床分离号395631)由天坛医院提供。
仪器：
透射电镜，购自美国FEI公司、型号Tecnai G2020S-TWIN；
恒温培养箱，购自北京中兴伟业仪器公司、型号GH-36；
酶标仪，购自美国Tecan Infinite公司、型号Tecan Infinite M200；
实施例1：取代四氮唑修饰的金纳米颗粒Au_DAPT的制备
A反应混合液的制备：
向50mL圆底烧瓶中加入100μL的1mmol/mL的氯金酸水溶液,和100μL的1mmol/mL巯基四氮唑(PTT，HPTT，MMT)水溶液，用冰水将溶液稀释到15mL，再加入8mg吐温80，冰浴下搅拌10分钟。
B金纳米颗粒的还原及纯化：
按氯金酸与硼氢化钠的摩尔比为1：3，向反应混合液中加入硼氢化钠冰水溶液，快速搅拌15分钟，再慢速搅拌1h，使配体稳定。用截留分子量为14000MW的透析袋透析48h，每4h换一次水，除去未反应的原料及杂质。所得到的金纳米颗粒溶液为酒红色，可在4℃冰箱稳定保存至少一年。
实施例2：金纳米颗粒电镜样品制备与观察
用镊子夹取一片铜网保持水平，用移液枪吸取10μL金纳米颗粒溶液垂直滴到铜网表面，保持2分钟，之后用滤纸从铜网边缘吸干溶液，放置于干燥器中过夜，用透射电镜观察。结果如图2所示。MMT修饰的金纳米颗粒粒径最大，为5.49±0.7nm；其次为Au_PTT金纳米颗粒，粒径为2.63±0.62nm；粒径最小的为Au_HPTT金纳米颗粒，粒径仅为1.78±0.28nm。金纳米颗粒的尺寸与表面修饰的分子密切相关，1号分子甲基基团呈线性结构，其稳定金纳米颗粒的作用不如2号和3号分子中的苯基大，所以生成的纳米颗粒尺寸较大，而2号和3号分子中苯基分子基团较大，可以较好的稳定金纳米颗粒，所以形成的颗粒粒径较小。
试验例1：金纳米颗粒抗菌活性测试结果
采用微量稀释法或者孔板稀释法测定最小抑菌浓度。首先将96孔板进行分组，每组最后一孔为最高浓度药物组，体积为200μL，浓度为128μg/mL。其余各孔均加入100μL LB-培养基，随后进行倍比稀释，即从最高浓度组中取出100μL加入到前一组，混合均匀，使药物浓度达到64μg/mL，再对下一组进行相同操作，直到倒数第二组，混匀后，取出100μL弃去。保持第一组药物浓度为0μg/mL，为阴性对照组。将培养至对数期的细菌进行稀释，调节菌浓度到1×104CFU/mL，每孔加入10μL上述菌液，将孔板置于37℃的恒温培养箱中培养24h。观察每个孔的浑浊度，溶液透明、不浑浊的孔所对应的纳米颗粒的浓度为最小抑菌浓度。
LB-培养基配制方法：取1g胰化蛋白胨，0.5g酵母提取物，1g NaCl，100mL水搅拌至溶解，用NaOH调节pH值为7.0，经过121℃，0.1MPa高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温即可使用。
抗菌结果如表1所示。三种金纳米颗粒对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及多药耐药菌均有抗菌活性。其中Au_MMT对革兰氏阴性菌抗菌效果较好，最小抑菌浓度(MIC)值普遍在8μg/mL以下，对于多药耐药绿脓杆菌(MDR P.a)效果稍差，MIC值为16μg/mL。Au_MMT可以抑制革兰氏阳性细菌的生长，但是效果比革兰氏阴性菌稍差，MIC值普遍在16μg/mL以上。Au_PTT和Au_HPTT对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有很好的抑制作用，MIC值均在4以下，且对于部分耐药菌，比如耐药的大肠杆菌和绿脓杆菌反而抗菌效果更好。
表1金纳米颗粒抗菌活性测试结果
Figure BDA0001539137630000101
试验例2：金纳米颗粒对细菌通透性的影响
首先，将大肠杆菌培养用玻璃试管在37℃200rpm摇床中培养到中-对数期，将细菌放入1.5mL EP管中8000rpm/3min离心收集细菌，并用PBS缓冲液清洗一次。然后，将细菌稀释到106CFU/mL，并向其中加入10μg/mL Au_MMT，Au_PTT，Au_HPTT金纳米颗粒，不加纳米颗粒的细菌为对照组。将纳米颗粒与细菌细胞在37℃下孵育4h，用PBS缓冲液清洗掉未进入细菌的纳米颗粒。之后，用10μM的NPN(N-苯基-1-萘胺，N-Phenyl-1-naphthylamine)染料染色30分钟。然后8000rpm/3min离心收集细菌，用PBS缓冲液洗两次，除去没有进入细胞的NPN，再将细胞稀释至1mL。最后，将样品转入96-孔酶标板黑板中，用酶标仪测样品荧光值，激发波长为350nm、发射波长为420nm。结果如图3所示。NPN是一种疏水性的荧光探针，在水溶液中荧光较弱，当与细胞膜内的疏水物质结合后，荧光强度会大大增强。当细菌的细胞膜AuNPs破坏后，细胞膜内的疏水物质暴露出来，可以有效的结合NPN，使NPN发出较强的荧光。因而NPN可以有效的反应出细菌细胞外膜的通透性，以此来测定Au NPs是否会破坏细菌细胞膜。Au NPs处理后的细菌经过NPN染色后的荧光强度如图3所示，经纳米颗粒处理后的菌液比对照组菌液的荧光要强，说明纳米颗粒对细菌的细胞外膜会产生破坏。
试验例3：金纳米颗粒对细菌显微结构的影响
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养到中-对数期，8000rpm/5min离心收集细胞。细菌细胞用PBS缓冲溶液重悬，取500μL含有细菌的PBS溶液加入1mL离心管中，向其中加入AuNPs，使金纳米颗粒的最终浓度为30μg/mL。金铂纳米颗粒与细菌在37℃摇床中孵育4h。不加纳米颗粒的细菌溶液为空白对照组。8000rpm 5min离心收集细菌，向每个样品中轻轻加入500μL 2.5％的戊二醛固定液，注意不要打散细菌，固定过夜。标本的脱水，包埋和染色由中日友好医院完成。结果如图4所示。通过TEM表征，我们发现在低放大倍数下，经过金纳米颗粒处理的大肠杆菌可以见到很明显的坏死特征。如图4所示，对照组中大肠杆菌细胞壁和细胞膜非常完整，核酸在菌体内均匀分布。接触三种金纳米颗粒后，细菌内部形成空泡，内容物和细胞膜分离。在金黄色葡萄菌的电镜切片中也能明显看到菌体的破坏，Au_MMT大部分聚集在菌体外部，Au_PTT和Au_HPTT两种纳米颗粒可以进入到菌体内部，所以Au_PTT和Au_HPTT显示出了对革兰氏阳性菌更强的抗菌活性。
试验例4：金纳米颗粒对细菌生物膜的影响
将铜绿假单胞杆菌培养到对数期，将菌液浓度稀释到1×107CFU/mL，向96孔板中每孔加入200μL的菌液，培养一天。之后向菌液中分别加入50μg/mL Au_MMT，Au_PTT，Au_HPTT纳米颗粒，使纳米颗粒的终浓度为，不加纳米颗粒的孔作为对照组。孔板置于恒温培养箱内37℃培养4天。后去除浮游细菌，用PBS洗5-6次至浮游细菌完全洗净。加入37％的甲醛，室温下固定5min，除去甲醛，用PBS洗一次。加入0.3％的结晶紫溶液染色30min，洗去多余的结晶紫，吸干孔板中的水份。加入250μL 95％的乙醇，对吸收的结晶紫脱色30min。吸出125μL的溶液于干净的96孔板中，用酶标仪测定溶液在590nm处的吸光值。结果如图5所示。细菌在吸附于固体表面后，数量增加到一定程度后，会分泌出一些多聚糖和蛋白质，与菌体自身包裹在水合基质内，形成一层黏滑的生物膜。这种生物膜群体可以让非固定的、或者浮游细菌迅速增殖和扩散。生物膜在固体物质如医疗器械表面极易形成，生物膜的形成增加了抗生素进入细菌的难度，增加了细菌感染的治疗难度。抗生素可以有效的对抗从生物膜上释放出的细菌，却不能破坏生物膜。生物膜对抗生素的耐药机制主要包括以下几点：1、阻止抗生素深度进入生物膜，阻碍抗生素扩散。2、生物膜内的细菌受到营养限制，处于生长迟缓期和饥饿状态，这种状态对许多杀菌剂都不敏感。3、生长在表面的细菌可以自发保护自身所形成的生物膜。所以检测金纳米颗粒是否可以抑制生物膜的形成对其日后应用研究具有非常重要的意义。本发明中三种金纳米颗粒对于绿脓杆菌形成生物膜的抑制作用，结果如图5所示，金纳米颗粒可以显著抑制细菌生物膜的形成，三种纳米颗粒的抑制作用相当，抑制率高于50％。
试验例5：金纳米颗粒细胞毒性实验
利用CCK-8试剂盒测试金纳米颗粒的细胞毒性：在96孔板中接种1×104个HUVEC细胞(人脐带血管内皮细胞)/孔，每孔加入培养基的体积为100μL，在含有5％的CO2，温度为37℃的温箱中孵育过夜使细胞贴壁完全。弃去培养基，加入100μL含有不同浓度金纳米颗粒的培养基，同时设置对照孔(100μL培养基)，在5％CO2，37℃条件下孵育24小时，弃去各孔液体，每孔加入100μL CCK溶液(用培养基将CCK-8试剂盒中液体稀释10倍)，5％CO2和37℃条件下培养4小时后，用酶标仪以600nm处吸光值作为参比，读取450nm处吸光值，并据此计算各孔中细胞的相对活力，所用公式为：
Figure BDA0001539137630000121
其中，OD450’为每孔修正后吸光值，avg(OD450’)为对照孔修正后吸光值的平均值。
细胞毒性结果见图6。三种金纳米颗粒在20μg/mL时几乎不显示细胞毒性，此浓度高于作用于细菌的MIC值，随着金纳米颗粒浓度的升高，Au_HPTT显示出比另外两种纳米颗粒较大的细胞毒性，提示金纳米颗粒在抗菌浓度范围是对细胞毒性较小的。
试验例6：金纳米颗粒治疗细菌感染动物模型效果
感染动物模型采用对多黏菌素敏感的多药耐药肺炎克雷伯菌(MDRKP)在小鼠体内构建，使用ICR小鼠，体重18-22g，每组10只，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。经过文献调研和致死实验，我们采用为每只小鼠腹腔注射0.5mL 1.6×107CFU/mLMDRKP的方法构建小鼠感染模型，在此接种浓度下，生理盐水对照组全部死亡，而多黏菌素阳性对照组全部成活。因为在体外抗菌实验和细胞毒性中Au_PTT显示了较强的抗菌活性和相对较低的细胞毒性，所以主要使用该种金纳米颗粒进行动物抗感染实验活性评价。确定细菌接种浓度后，抗菌实验分为86组，生理盐水组，注射庆大霉素组，注射多黏菌素组，以及3个不同浓度Au_PTT实验组，在细菌接种后15分钟分别给予各组小鼠尾静脉注射200μL生理盐水，庆大霉素3mg/kg，多黏菌素2.5mg/kg，Au_PTT 100μg/kg、50μg/kg、25μg/kg，观察并记录小鼠48小时内存活情况。
结果如表2所示。注射生理盐水小鼠由于细菌感染后没有抗生素的治疗，全部死亡。注射庆大霉素的小鼠，由于细菌是庆大霉素耐药的，因此小鼠治疗效果也非常不理想，只有2只存活。注射多粘菌素组小鼠，由于细菌是多粘菌素敏感的，有很好的治疗效果，小鼠全部存活。注射100μg/kg的Au_PTT可使小鼠全部存活，如果减低剂量则治疗效果下降，可见该金纳米颗粒的治疗效果具有剂量依赖性。
表2小鼠在感染耐药肺炎克雷伯菌后的存活率
Figure BDA0001539137630000131
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (21)

1.一种四氮唑衍生物修饰的抗菌金纳米颗粒在制备抗菌药物或抗菌产品中的应用，其特征在于，所述抗菌金纳米颗粒包括：
四氮唑衍生物；和
金纳米颗粒；其中，
所述四氮唑衍生物为巯基修饰的四氮唑；并且，所述巯基修饰的四氮唑选自以下一种或多种：5-疏基-1-苯基-四氮唑，1-(4-羟基苯基)-5-巯基-四氮唑，5-巯基-1-甲基四氮唑；并且，
所述抗菌药物或抗菌产品针对选自以下一种或多种细菌：革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和多药耐药菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌金纳米颗粒的平均粒径为1～50nm。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌金纳米颗粒的平均粒径为1～20nm。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗菌金纳米颗粒的平均粒径为1～10nm。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗菌金纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
(1)将氯金酸水溶液与四氮唑衍生物溶液混合，冰水稀释，向溶液中加入吐温80，冰浴搅拌；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入硼氢化钠冰水溶液并搅拌；
(3)透析袋透析步骤(2)所得溶液得到所述抗菌金纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，
所述氯金酸水溶液的浓度为0.1～10mmol/L；
所述四氮唑衍生物溶液浓度为0.1～10mmol/L；和/或
所述吐温80与所述四氮唑衍生物的摩尔比为1:1～1:100。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，
所述氯金酸水溶液的浓度为0.1～5mmol/L；
所述四氮唑衍生物溶液浓度为0.1～5mmol/L；和/或
所述吐温80与所述四氮唑衍生物的摩尔比为1:50～1:100。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，
所述氯金酸水溶液的浓度为1mmol/L；
所述四氮唑衍生物溶液浓度为1mmol/L；和/或
所述吐温80与所述四氮唑衍生物的摩尔比为1:61。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，所述硼氢化钠与氯金酸的摩尔比为1:1～1:10。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，所述硼氢化钠与氯金酸的摩尔比为1:1～1:5。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，所述硼氢化钠与氯金酸的摩尔比为1:3。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，所述搅拌过程为先快速搅拌再慢速搅拌；
所述快速搅拌时间为5～30分钟；和/或
所述慢速搅拌时间为0.1～5小时。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，
所述快速搅拌时间为10～20分钟；和/或
所述慢速搅拌时间为0.5～2小时。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，
所述快速搅拌时间为15分钟；和/或
所述慢速搅拌时间为1小时。
15.根据权利要求5至14中任一项所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，
所述透析截止值为10～20kDa MW；和/或
所述透析时间为10～60小时。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，
所述透析截止值为10～15kDa MW；和/或
所述透析时间为30～60小时。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，
所述透析截止值为14kDa MW；和/或
所述透析时间为48小时。
18.根据权利要求5至17中任一项所述的应用，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
(4)将所制得的抗菌金纳米颗粒储存在1～10℃。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
(4)将所制得的抗菌金纳米颗粒储存在1～5℃。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
(4)将所制得的抗菌金纳米颗粒储存在4℃。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌选自以下一种或多种：大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、肺炎克雷伯氏菌、猪霍乱沙门氏杆菌；所述革兰氏阳性菌选自以下一种或多种：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；所述多药耐药菌选自以下一种或多种：多药耐药的大肠杆菌、多药耐药的铜绿假单胞菌、多药耐药的金黄色葡萄球菌。
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