CN113025318B - 一种以花椒为碳源的碳量子点及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以花椒为碳源的碳量子点及其制备方法与应用,所述碳量子点平均粒径为3~5 nm,表面含有羟基、胺基、酯类和烯类,最大激发波长与最大发射波长分别为450 nm和490 nm;具体制备过程为先将花椒粉碎后加入去离子水,搅拌分散后进行水热反应,反应产物自然冷却后进行离心分离,然后过滤;将滤液真空冷冻干燥后得到花椒为碳源碳量子点的粉末。本发明提供的碳量子点具有较强的荧光和良好的生物相容性,可以进入细胞内并且均匀分布在HeLa细胞中,具有一定的抗菌性能。

Description

一种以花椒为碳源的碳量子点及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光碳纳米材料技术领域,具体涉及一种以花椒为碳源的碳量子点及其制备方法与应用。
背景技术
碳量子点(Carbon Quantum Dots,CQDs)是一种零维的碳纳米材料,其粒径一般在3~10 nm。碳量子点具有优越的生物相容性,在生物体内毒性小,使其在生物成像、生物传感和生物体内的药物传递等方面具有广泛的应用价值。同时,有一些碳量子点还具有一项特殊的性能─抗菌性能,研究表明当碳量子点带有正电荷或者负电荷时,会产生活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),对细菌起到了抑制作用。通过水热法合成的具有疏水性的CQDs,在蓝色荧光的照射下,产生单线态氧,对蜡样芽胞杆菌和铜绿假单胞菌具有抗菌活性,并且可以显著的减少菌膜的形成,发挥抗生物淤积作用。
花椒是一种芳香型乔木和灌木,花椒的各个部分都有许多的药用价值,在中药中,花椒的果皮用于胃痛和消化不良,种子具有消炎和利尿作用,叶子被认为是辣的、刺激性的和发汗的,根部可以治疗腹泻、瘀伤、湿疹和蛇咬伤。花椒的主要的化学成分分为五类,分别是生物碱、挥发油、酰胺、木脂素、香豆素。花椒挥发油的功效多种多样,对许多细菌都有非常明显的抑制作用,比如,以金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌,和由于多种原因(霍乱弧菌)造成的肠内致病菌。同时,花椒挥发油对一些深部真菌具有非常明显的作用,如红色毛癣菌,花椒能够有效抑制和杀灭这些真菌。花椒挥发油还对皮肤癣菌有一定的抑制作用,但是其作用效果没有对深部真菌的作用效果大。花椒的挥发油具有抗菌性能和驱虫效果,是由于花椒中含有桉树脑(C10H18O)、萜品油烯(C10H16)和β-水芹烯(β-C10H16)等几种成分,这几种成分的协同作用,使得花椒拥有驱虫和抗菌的性能。
碳量子点具有优异的生物相容性和细胞毒性,基本不会对细胞产生影响,更主要的是碳量子点的表面易于修饰,可以作为运输药物的载体,这些特性使得碳量子点在许多领域都有广泛的应用。另外,碳量子点在许多已知种类的微生物灭活中显示出巨大潜力,其主要优点包括最小的侵入性,较少出现的副作用以及适用于快速重复的应用。例如,将包被的CQDs涂覆到ZnO纳米棒的表面上,以进行抗菌和生物成像应用。所得的纳米颗粒团聚物可以被金黄色葡萄球菌吸收。细胞显示出明亮的绿色荧光发射,并以浓度依赖的方式对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出抗菌活性。由于其有利的特性包括无毒性质,光稳定性,表面功能的多功能性(可实现所需的微生物粘附和相互作用)以及由大量廉价的前体生产而获得的其他优点,因此具有额外的优势广泛,低成本到超低成本的应用。因此,研究生物相容性碳纳米材料作为杀菌剂似乎是生物/环境领域的必然。
目前,在医院和其他医疗机构灭活病原微生物并防止感染的方法中,通常使用各种各样的消毒剂和防腐剂。但是,这些消毒剂中的大多数具有极强的刺激性和毒性,会导致健康并发症,例如接触性皮炎和粘膜刺激性,并且由于细菌的适应性和耐药性,其中一些消毒剂的有效性降低。因此,迫切且日益增长的需求是发现和开发具有优异性能和较低毒性的替代抗微生物策略和抗微生物剂,用于预防和治疗抗耐多药的感染。
发明内容
解决的技术问题:针对上述技术问题,本发明提供一种以花椒为碳源的碳量子点及其制备方法与应用,所述制备方法简单快速,具有优异性能和较低毒性,所制备碳量子点尺寸小,并且具有良好的水溶性、优越的荧光性能和良好的生物相容性等特点,可有效实现细胞荧光成像和抗菌功能。
技术方案:
一种以花椒为碳源的碳量子点,所述碳量子点平均粒径为3 ~ 5 nm,表面含有羟基、胺基、酯类和烯类,最大激发波长与最大发射波长分别为450 nm和490 nm。
上述以花椒为碳源的碳量子点的制备方法,包括以下步骤:
步骤一,将花椒粉碎后加入去离子水,搅拌分散;
步骤二,将搅拌分散后的溶液转移到反应釜中,水热反应10 ~ 12 h;
步骤三,将反应后的产物自然冷却后进行离心分离,然后过滤得到滤液;
步骤四,将滤液真空冷冻干燥后得到花椒为碳源碳量子点的粉末,记为ZB-CQDs。
进一步的,所述的制备方法,步骤一中花椒与水的比例为每1 g花椒用水50 ~ 100mL。
进一步的,所述的制备方法,步骤一中花椒粉碎后加入到水中时在10 ~ 25 ℃温度、转速为400 ~ 600 r/min条件下搅拌10 ~ 45 min。
进一步的,所述的制备方法,步骤二中水热反应的温度为150 ~ 250 ℃。
进一步的,所述的制备方法,步骤三中反应后的产物自然冷却至10 ~ 25 ℃。
进一步的,所述的制备方法,步骤三中离心分离转速为10000 ~ 12000 r/min,离心时间10 ~ 15 min。
进一步的,所述的制备方法,步骤三中过滤采用孔径为0.2 ~ 0.22 μm的滤膜进行。
进一步的,所述的制备方法,步骤四中真空冷冻干燥的温度为-60 ~ -50 ℃,真空度为9 ~ 10 Pa,时间为10 ~ 22 h。
一种以上所述的以花椒为碳源的碳量子点在抗菌和细胞荧光成像方面的应用。
有益效果:
(1)本发明使用花椒为碳源,不需要加入任何的表面钝化剂,一步就能制备花椒为碳源的高荧光碳量子点,简化了实验过程,提高了制备过程的效率。
(2)本发明所制备碳量子点尺寸小,并且具有良好的水溶性、优越的荧光性能和良好的生物相容性等特点,给未来的碳量子点在生物和农业等领域的应用奠定了重要的理论基础。
(3)本发明所制备的碳量子点通过使用金黄色葡萄球菌的对照试验,证明了ZB-CQDs的浓度越大,抗菌作用越明显,菌落数越少。证明了以花椒制备出来的碳量子点具抗菌性能,并且可以进入细胞内且均匀分布在细胞中,具有极好的荧光性能和生物相容性,为以中药为碳源制备碳量子点并拓展量子点生物应用提供了一个良好的开端,可用于生物成像领域和生物抗菌领域。
附图说明
图1是实施例1的花椒为碳源的碳量子点的透射电镜图;
图2是实施例1的花椒为碳源的碳量子点的粒径分布图;
图3是实施例1的花椒为碳源的碳量子点FTIR光谱图;
图4是实施例1的花椒为碳源的碳量子点的激发和发射的谱图;
图5是实施例1的花椒为碳源的碳量子点不同激发波长下的荧光光谱图;
图6是实施例1的花椒为碳源的碳量子点的紫外可见光谱图;
图7是实施例1制备的以花椒为碳源的碳量子点溶液在紫外灯激发下状态图;
图8是实施例1制备的以花椒为碳源的碳量子点的Zeta电位图;
图9是实施例4制备的以花椒为碳源的碳量子点的抗菌实验图;
图10是实施例4制备的以花椒为碳源的碳量子点的抗菌柱状图;
图11是实施例4中所述花椒为碳源的碳量子点的细胞荧光成像图,a为405 nm光照射下的HeLa细胞,b为488 nm光照射下的HeLa细胞,c为重叠下的HeLa细胞。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
本实施例提供一种以花椒为碳源的碳量子点合成方法,包括以下步骤:
步骤一,称取1 g花椒,用研钵研磨成粉末,然后置于100 mL干净烧杯中,加入50mL去离子水,在20 ℃的条件下以600 r/min搅拌10 min使其完全分散;
步骤二,将溶液转移到容量为100 mL的聚四氟乙烯反应釜中,放置于200 ℃烘箱中,反应12 h;
步骤三,反应后的产物自然冷却至25 ℃后,置于离心机中以12000 r/min的转速离心10 min,然后用滤膜孔径为0.22 μm的微孔滤头进行过滤得到澄清的碳量子点溶液;
步骤四,将得到澄清的碳量子点溶液进行真空冷冻干燥,其中温度为-50 ℃,时间为18 h,真空度为10 Pa,最终得到花椒为碳源的荧光碳量子点粉末。
本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点的透射电子显微镜图参见图1,图中显示出本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点分散性良好、均一,没有团聚,形状似球形,制备的以花椒为碳源的碳量子点的平均粒径为3 ~ 5 nm。
本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点的粒径分布图参见图2,图中显示出粒径分布为164 ~ 220 nm,平均粒径为186.7 nm,表明制备出的ZB-CQDs的水合粒径较大,即碳量子点的分散性较好,需要通过透射电子显微镜才能测得纳米粒子实际的尺寸。
本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点的FTIR图参见图3,图中显示出制备出的碳量子点含有羟基、胺基、酯类和烯类。
本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点的激发和发射的谱图参见图4,图中显示出本实施例中制备的以花椒为碳源的碳量子点的最大激发与发射波长为450 nm和490nm。
本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点在不同激发波长(370 nm、390 nm、410nm、430 nm、450 nm、470 nm、490 nm、510 nm、530 nm及550 nm)下的发射光谱图参见图5,图中显示出本实施例中制备的以花椒为碳源的碳量子点不具有波长依赖性。
本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点的紫外可见光谱图参见图6,图中显示出本实施例中制备的以花椒为碳源的碳量子点在280 nm处有较强的吸收峰,花椒结构上含有C=C基团。
本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点溶液在紫外灯激发下状态图参见图7,图7显示花椒碳量子点溶液在365 nm的紫外灯激发下可以看到明醒目的蓝色荧光。
本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点抗菌实验图参见图9,图9显示通过使用金黄色葡萄球菌的对照试验,证明了ZB-CQDs的浓度越大,抗菌作用越明显,菌落数越少。以此可以表明,以花椒制备出来的碳量子点具有一定的抗菌性能。
本实施例制备的以花椒为碳源的碳量子点细胞荧光成像图参见图11,图11显示通过HeLa细胞的荧光成像分析,进一步证明了ZB-CQDs具有激发波长依赖性和优越的生物相容性。
实施例2
一种以花椒为碳源的碳量子点合成方法,包括以下步骤:
步骤一. 称取1 g花椒,用研钵研磨成粉末,然后置于100 mL干净烧杯中,加入80mL去离子水,在10 ℃的条件下以500 r/min搅拌30 min使其完全分散;
步骤二. 将溶液转移到容量为100 mL的聚四氟乙烯反应釜中,放置于150 ℃烘箱中,反应12 h;
步骤三. 反应后的产物自然冷却至10 ℃后,置于离心机中以11000 r/min的转速离心15 min,然后用滤膜孔径为0.2 μm的微孔滤头进行过滤得到澄清的碳量子点溶液;
步骤四. 将得到澄清的碳量子点溶液进行真空冷冻干燥,其中温度为-60 ℃,时间为10 h,真空度为9 Pa,最终得到花椒为碳源的荧光碳量子点粉末。
对所制得的以花椒为碳源的荧光碳量子点粉末进行成分及特性检测,结果如下:本实施例制得的以花椒为碳源的碳量子点分散性良好、均一,没有团聚;制得的花椒为碳源的碳量子点平均粒径为3 ~ 5 nm;制得的花椒为碳源的碳量子点在280 nm处有较强的吸收峰,在365 nm的紫外灯激发下可以看到明亮的蓝色荧光。
实施例3
一种以花椒为碳源的碳量子点合成方法,包括以下步骤:
步骤一. 称取1 g花椒,用研钵研磨成粉末,然后置于100 mL干净烧杯中,加入100mL去离子水,在25 ℃的条件下以400 r/min搅拌45 min使其完全分散;
步骤二. 将溶液转移到容量为100 mL的聚四氟乙烯反应釜中,放置于250 ℃烘箱中,反应10 h;
步骤三. 反应后的产物自然冷却至20 ℃后,置于离心机中以10000 r/min的转速离心15 min,然后用滤膜孔径为0.22 μm的微孔滤头进行过滤得到澄清的碳量子点溶液;
步骤四. 将得到澄清的碳量子点溶液进行真空冷冻干燥,其中温度为-54 ℃,时间为22 h,真空度为9.6 Pa,最终得到花椒为碳源的荧光碳量子点粉末。
对所制得的花椒为碳源的荧光碳量子点粉末ZB-CQDs进行成分及特性检测得,结果如下:本实施例制得的以花椒为碳源的碳量子点分散性良好,均一,没有团聚;制得的花椒为碳源的碳量子点平均粒径为3 ~ 5 nm;制得的花椒为碳源的碳量子点在280 nm处有较强的吸收峰,在365 nm的紫外灯激发下可以看到明亮的蓝色荧光。
下面对实施例1 ~ 3制得的碳量子点分别进行荧光强度检测、表面电位分析及表面官能团分析。
(一)对实施例1 ~ 3制得的碳量子点,用荧光分光光度计进行荧光强度检测,结果如下:
组别 实施例1 实施例2 实施例3
荧光强度(a.u.) 450 470 500
其中实施例3制备的碳量子点荧光强度最高。
(二)对实施例1 ~ 3制得的碳量子点,用Zeta电位仪进行表面电位分析,结果如下。
组别 实施例1 实施例2 实施例3
Zeta电位(mV) -6.36 -6.2 -6.52
说明本发明所述以花椒为碳源的碳量子点水溶液的分散系很稳定,其中实施例3的效果最好。实施例1制备的以花椒为碳源的碳量子点的Zeta电位图参见图8,图8表明花椒为碳源的碳量子点电位是-6.36 mV,水溶液的分散系很稳定。
(三)对实施例1 ~ 3制得的碳量子点,用红外光谱仪进行表面官能团分析。实施例1制备的以花椒为碳源的碳量子点的红外图参见图3,最终发现,在3440 cm-1处出现的宽峰归因于O-H的伸缩振动,2930 cm-1处出现的峰归因于N-H的伸缩振动,1695 cm-1处出现C=O伸缩振动峰,1625 cm-1处出现C=C伸缩振动峰,说明花椒碳量子点表面有羟基、胺基、酯类和烯类。
实施例4
将实施例1所制备的花椒为碳源碳量子点制成培养基(浓度为0.5 mg/mL),取生长情况良好的HeLa细胞在37 ℃下、5 vt.%CO2的保温箱中与10 vt.%胎牛血清,1 vt.%青霉素和链霉素混合溶液DMEM(高葡萄糖)一起在培养瓶中培育。随后使用1 mL的胰蛋白酶使贴壁的细胞悬浮,将HeLa细胞接种到35mmPetri培养皿中,在培养皿中加入新鲜培养基(0.5mg/mL的花椒碳点)。在保温箱中培养0.5 h后去除游离的花椒碳点,用PBS缓冲液洗涤HeLa细胞。最后,使用多聚甲醛对细胞固定8 min,随后使细胞在激光扫描共聚焦显微镜上成像,细胞荧光成像图参见图11。
为了验证用花椒制备出的碳量子点是否同花椒一样具有抗菌性能,设计了一组实验,将金色葡萄球菌平均的装入四个培养皿中,第一个为对照组,从第二个到第四个,碳量子点的浓度逐渐增加,两天后,数出每个培养皿剩余的菌落数, 其结果如图9所示。为更加直观的表现出ZB-CQDs的抗菌性能,根据图9,做出ZB-CQDs抗菌的柱状图,为图10。由此可见,浓度越高菌落数越少。这主要是由于用花椒制备出的碳量子点还保留有花椒的部分结构和官能团,这些结构和 官能团里面有些官能团具有一定的抗菌效果,因此具有抗菌性能。
实施例1制备的以花椒为碳源的碳量子在激发波长为405 nm处细胞呈现出绿色荧光;在激发波长为488 nm处细胞呈现出蓝色荧光。这说明花椒碳量子点可以进入细胞内,能够发现ZB-CQDs均匀分布在HeLa细胞中并且具有极好的荧光性能和生物相容性,因此可用于生物成像领域。
综上所述,本发明提供一种以花椒为碳源的碳量子点及其制备方法与应用,所述制备方法简单快速,具有优异性能和较低毒性,所制备碳量子点尺寸小,并且具有良好的水溶性、优越的荧光性能和良好的生物相容性等特点,可有效进行细胞荧光成像和抗菌实验。所制得的碳量子点可以进入细胞内发出荧光并且均匀分布在HeLa细胞中,可用于生物成像领域;通过抗菌实验验证了用花椒制备出的碳量子点还保留有花椒的部分结构和官能团,这些结构和官能团里面有些官能团具有一定的抗菌效果,因此具有抗菌性能;本发明所制备的碳量子点尺寸小,并且具有良好的水溶性、没有细胞毒性以及优越的生物相容性等特点,给未来的碳量子点在生物和农业等领域的应用奠定了重要的理论基础。

Claims (6)

1.以花椒为碳源的碳量子点在制备抗菌剂中的应用,所述以花椒为碳源的碳量子点的制备方法包括以下步骤:
步骤一,将花椒粉碎后加入去离子水,花椒与水的比例为每1 g花椒用水50 ~ 100 mL,搅拌分散;
步骤二,将搅拌分散后的溶液转移到反应釜中,在150 ~ 250 ℃水热反应10 ~ 12 h;
步骤三,将反应后的产物自然冷却后进行离心分离,然后过滤得到滤液;
步骤四,将滤液真空冷冻干燥后得到花椒为碳源碳量子点的粉末。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤一中花椒粉碎后加入到水中时在10 ~25 ℃温度、转速为400 ~ 600 r/min条件下搅拌10 ~ 45 min。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤三中反应后的产物自然冷却至10 ~25 ℃。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤三中离心分离转速为10000 ~ 12000r/min,离心时间10 ~ 15 min。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤三中过滤采用孔径为0.2 ~ 0.22 μm的滤膜进行。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤四中真空冷冻干燥的温度为-60 ~ -50 ℃,真空度为9 ~ 10 Pa,时间为10 ~ 22 h。
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