CN114940488B - 岩藻多糖碳量子点、制备方法及其在根管消毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种碳量子点,采用岩藻多糖为原料制备而来。该碳量子点呈类球形,除含有羟基,羧基外,表面还具有岩藻多糖特有的硫酸根。本发明提供一种碳量子点的制备方法,采用水热法制备。本发明提供一种碳量子点在根管消毒中的应用。
Description
技术领域
本公开属于口腔疾病治疗技术领域,具体涉及一种岩藻多糖碳量子点、制备方法及其在根管消毒中的应用。
背景技术
牙髓根尖周病是口腔常见的疾病。根管治疗术是牙髓根尖周病主要的治疗方法,但由于根管系统复杂性、口腔微生物复杂性及技术敏感性等原因,仍存在4-15%的失败率。经过多次根管治疗后,根管内感染仍持续存在,根尖周病变迁延不愈成为难治性根尖周炎(refractory apical periodontitis,RAP),引起牙槽脓肿、牙根吸收、牙槽骨破坏,甚至是失牙。
大量研究证实,微生物因素是引起难治性根尖周炎的主要致病因素,持续性感染的根管内存在大量致病微生物,其中粪肠球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)是持续性根管内感染的主要致病菌,检出率达24-77%。E.faecalis具有较强的耐受力及抵抗性;能够进入到牙本质小管、副根管、根尖分歧等复杂的根管系统中,形成生物膜,具有更强的存活力和致病性,同时增强了自身的耐药性。因此,彻底清除复杂根管系统内的致病微生物是治疗难治性根尖周炎的基础。
目前非手术的先为根管治疗仍是治疗难治性根尖周炎的主要治疗方法,根管预备是其中重要一环。由于机械清理难以清除牙本质小管、副根管、根尖分歧、根管曲折等复杂的根管系统中的细菌,必须借助根管消毒药物的化学作用辅助清除。根管消毒药物包括根管冲洗液和根管内封药。根管冲洗液是在机械预备时冲洗根管辅助去除感染,主要包括次氯酸钠(NaClO)、氯己定(CHX)、乙二胺四乙酸(EDTA)。其中NaClO、CHX抗菌能力强,但其具有刺激的气味和较差的生物相容性。17%EDTA仅能够去除玷污层,无明显杀菌作用,须与NaClO合用,但其难进入细小管隙深处。根管封药主要包括酚醛类、抗生素及氢氧化钙糊剂等。酚醛类制剂具有潜在的毒性和抗癌性,目前广泛应用的氢氧化钙糊剂无法渗入牙本质小管等狭小管隙深处。这些都限制了目前的根管消毒药物在临床上的应用。
目前临床上缺乏一种安全高效且能够有效清除复杂根管系统内生物膜的根管消毒药物。近年来有研究者进行纳米粒子作为根管消毒药物可能性研究,应用前景广泛。因此,寻找一种既能够渗透进牙本质小管等细窄管隙,高效破坏细菌生物膜并杀灭细菌,又具有良好的生物相容性的纳米材料是非常有意义的。
发明内容
岩藻多糖(Fucoidan,FD)是一类从海洋褐藻中提取的硫酸多糖。已有研究证实FD具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、免疫调节、促进创口愈合、具有良好生物安全性等多种生物学功能。在抗菌领域的研究中,FD仅在较高浓度时对多种条件致病菌(大肠杆菌、霍乱弧菌)和口腔相关致病菌(变形链球菌、白色念珠菌等)产生抑制作用。本发明以FD为原料制备岩藻多糖碳量子点(FDCDs),在根管消毒中具有较好的应用前景,FD合成FDCDs及其应用示意图见图1。
本发明一方面提供一种碳量子点,采用FD为原料制备而来。该碳量子点呈类球形,除含有羟基(-OH),羧基(-COOH)外,表面还具有FD特有的硫酸根(SO4 2-)。
本发明一方面提供一种碳量子点的制备方法,采用水热法制备,其步骤为:
步骤1:岩藻多糖在双蒸水中溶解;
步骤2:高温高压反应釜中反应;
步骤3:将所得溶液冷却至室温后,离心,过滤;
步骤4:真空干燥得固体粉末,得FDCDs。
进一步的,具体步骤为:
步骤1:将0.8g FD溶于40mL双蒸水中,用磁力搅拌器搅拌至完全溶解;
步骤2:将混合均匀的样品溶液转移至50mL的内衬聚四氟乙烯的高温高压反应釜中,200℃反应12h;
步骤3:将所得溶液冷却至室温后,以10000rpm/min的转速离心10min,并通过0.22μm滤膜过滤,得到碳量子点水溶液;
步骤4:将过滤后的液体真空干燥得固体粉末,获得FDCDs。
本发明一方面提供一种碳量子点消毒中的应用。进一步的,所述消毒主要指的是对微生物的杀灭,进一步的,所述消毒是对根管中常见致病微生物的杀灭,进一部分,所述的微生物可以为细菌(需氧菌、兼性厌氧菌、厌氧菌等)、真菌、病毒等。
本发明一方面提供一种碳量子点在抗生物膜中的应用。
本发明一方面提供一种碳量子点在根管消毒中的应用。
与现有技术相比,本公开的有益效果是:
1.FD具有一定的抗菌效果,且与SO4 2-的存在及含量有关。本发明采用FD作为原料合成的FDCDs保留了SO4 2-,可发挥抗菌作用。
2.与FD相比,FDCDs抗菌/生物膜的活性明显增强,是由于FDCDs的尺寸明显缩小,可以通过生物膜孔径,破坏生物膜,并且更容易粘附在细菌表面,进入细菌细胞膜,诱导产生ROS,破坏细胞内容物及胞膜通透性,增强抗菌作用。
3.目前常用的根管冲洗剂包括NaClO、CHX、EDTA等,其中NaClO凭借高效杀菌/生物膜、溶解有机质,成为临床最常用的冲洗液,但其具有明显毒性,且易导致患者黏膜化学性灼伤,需要在橡皮障下使用;CHX对细菌、真菌均有较强的抑制作用,但组织溶解能力和渗透性差,通常需要与其他制剂联合使用;17%EDTA/NaClO是目前主要的根管冲洗方法,其能够去除玷污层,开放牙本质小管,杀灭牙本质小管内微生物,但其可以使牙本质脱矿,使牙本质硬度下降。FDCDs与NaClO相比,具有相似的杀菌效果,具有较好的生物相容性,对口腔黏膜无烧灼腐蚀,对牙本质结构的无破坏;
4.FDCDs为水溶性,以液体的形式应用,便于根管封药;
5.FDCDs粒径极小(<10nm),能够进入直径为1-2.5μm的牙本质小管深处,杀灭其中的细菌;
6.FDCDs细胞相容性好,即使超出根尖孔不会对根尖区产生明显的毒副作用。
附图说明
图1为FD合成FDCDs及其应用示意图;
图2为FDCDs粒径图;
图3为FDCDs荧光性能图;
图4为FDCDs表面电荷图;
图5为FDCDs傅里叶红外光谱图;
图6为FDCDs X射线光电子能谱图;
图7为FDCDs抗粪肠球菌浮游菌作用图;(A)为光照和非光照条件下,FD、不同浓度的FDCDs处理后E.faecalis在BHI固体培养基中菌落照片。(B)为FD、不同浓度的FDCDs处理对E.faecalis的(ns表示无显著差异,***p<0.001)。
图8为FDCDs抗菌机制;(A)为PBS、FD、FDCDs处理后E.faecalis形态的TEM图像。(B)为细胞外ROS形成。(C)E.faecalis内ROS形成。
图9为FDCDs抗生物膜作用的激光共聚焦图;(A)BHI、(B)1%NaClO、(C)3.0mg/mLFDCDs处理12h后,E.faecalis生物膜的CLSM荧光图。(D)E.faecalis生物膜的平均厚度(ns表示无统计学差异,*p<0.05,**p<0.01)。
图10为FDCDs清除根管内粪肠球菌扫描电镜图,(A)为根管壁和(B)为牙本质小管残余E.faecalis。
图11为FDCDs细胞相容性图;MC3T3-E1细胞与不同浓度FDCDs、1%NaClO共培养不同时间后的活力(ns表示无显著性差异,*p<0.05,***p<0.001)。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1 FDCDs的水热法制备
步骤1:将0.8g FD溶于40mL双蒸水中,用磁力搅拌器搅拌30min直至完全溶解;
步骤2,将混合均匀的样品溶液转移至50mL的聚四氟乙烯内衬中,并放入高温高压反应釜中,200℃反应12h;
步骤3,将所得溶液冷却至室温后,以10000rpm/min的转速离心10min,并通过0.22μm滤膜过滤,得到纯净的碳量子点水溶液;
步骤4,将过滤后的液体真空干燥得固体粉末,获得FDCDs。
实施例2 FDCDs的理化表征
1)透射电镜:
FDCDs直径<10nm。如图2,FDCDs是一类分散均匀的类球状颗粒,具有良好的分散性,粒径进行统计分析见平均粒径大小约为7.15nm。
2)荧光光谱:
FDCDs具有固有的荧光特性。如图3,FDCDs在环境中呈浅棕色,而在波长为365nm紫外光照射下呈现明显的蓝绿色荧光,同时荧光光谱显示FDCDs的最大激发波长为362nm,最大发射波长为453nm。
3)Zeta电位检测:
FDCDs表面含SO4 2-,因此带有负电荷。纳米粒度电位仪检测见FDCDs的表面电荷为-15.80±0.22mV,略低于FD。
4)傅里叶红外光谱扫描:
FDCDs具有FD的特征性基团SO4 2-。图4中FT-IR示FDCDs的光谱中,3185cm-1处的峰值与O-H的伸缩振动有关,2979和2810cm-1处的峰属于C-H键,而在1675cm-1处的峰值与COO-有关,这些均是碳点的基本结构。在1057和832cm-1处的谱带则属于C=S和S=O以及C-O-S弯曲振动。这些特征峰也同时存在于FD的红外光谱中。
5)X射线衍射能谱
FDCDs含有S元素且是以SO4 2-的形式存在。如图5所示,FDCDs主要由C、O、N组成,其含量分别为62.31%、32.34%、2.19%。同时测定了S的含量为3.15%,进一步检测S2p能谱,在168.92eV和170.14eV处有两个峰,均属于SO4 2-,进一步证实FDCDs的成功合成并保留了FD的特征性基团。
实施例3 FDCDs抑制E.faecalis浮游菌
在持续性感染的根管内,兼性厌氧的E.faecalis占据首位,主要以生物膜的形式存在,并能侵入牙本质小管等复杂根管系统中,使其难以清除。
将实施例1的FDCDs溶解在无菌的PBS(pH=7.4)溶液中,制得不同浓度FDCDs(1、2、3、4mg/mL)溶液,与浓度为1×107CFU/mL的E.faecalis细菌悬液共培养,脑心浸液培养基(Brian Heart Infusion,BHI)和前驱体FD为对照组。
为了观察光动力是否能够催化FDCDs的抗菌效果,提高临床杀菌效率,遂将上述样品均分为光照组(日光灯照射)和非光照组(避光处理),置于37℃恒温培养箱中培养12h。
在孵育期结束时,采用CFU计数法即用PBS对各组混合液体进行十倍梯度稀释,吸取20μL终溶液涂布在无菌的BHI固体培养基上,于37℃,5%CO2培养箱中培养过夜。实验重复3次,估算参与细菌数量,并计算抑菌率(Inhibitionrate,简称IR)如图6示。
抗菌实验结果如图7示,低浓度(1、2mg/mL)FDCDs的抑菌活性与阴性对照组无统计学差异,对E.faecalis无抑制作用,较高浓度(3、4mg/mL)FDCDs抗E.faecalis作用显著提高,抑制率均大于85%。证实FDCDs无光动力抗菌活性,但与前驱型FD相比,FDCDs具有更强的抗菌性能,且抑菌效果具有浓度依赖性,初步证实其可应用于根管中杀灭E.faecalis。
实施例4 FDCDs抗E.faecali机制
首先,将BHI、FD和FDCDs(3mg/mL)与细菌悬液共培养12h,5000rpm/min离心5min后的细菌沉淀,用2.5%(v/v)戊二醛固定。利用透射电镜检测FDCDs对E.faecalis形态的影响,如图8A所示,空白组和FD组的细菌呈典型的球形,细胞壁完整,而3mg/mL FDCDs处理后的E.faecalis表面变得粗糙,通透性明显增强。
此外,采用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)荧光猝灭检测FDCDs能够产生ROS。选择单独的DPBF溶液和不含DPBF的FDCDs乙醇溶液作为对照组,排除DPBF变性及FDCDs自身荧光的影响。将实施例1中的FDCDs粉末分散于无水乙醇中,并将DPBF溶液加入其中,等量分成两份。一份完全避光,另一份用可见(3.2mW/cm2)照射,用紫外-可见分光光度计每5min测定410nm处的吸收峰,测30min。结果如图8B所示,在可见光下,DPBF与FDCDs混合后,410nm的吸光度显著降低。相反,混合溶液在黑暗条件下30min内保持不变。表明FDCDs在可见光下催化FDCDs产生ROS。
同时采用2,7-二氯二氢荧光素二醋酸染料(DCFH-DA)试剂盒验证FDCDs是否能够诱导细菌细胞内ROS。分别将500μL PBS、FD和FDCDs(3mg/mL)与500μL细菌悬液共培养12h,将各组悬浮液充分混合,平均分成两份,一部分经离心获得的细菌沉淀于按照说明书配制的DCFH-DA溶液混合。在激发波长为488nm,发射波长为525nm的条件下,测荧光强度。用另一部分采用CFU计数检测细菌数量,进而估算每个细菌中的荧光强度。如图8C示,BHI和FD处理后细菌内的荧光强度可以忽略不计,而FDCDs接触后的细菌内的荧光强度明显增加,且随FDCDs浓度的增加而增加。表明FDCDs能够进入细菌内产生ROS。
实施例4实验证实FDCDs在可见光下产生ROS,并且能够进入细菌内,诱导产生ROS,破坏细菌细胞壁、增加细菌通透性来杀灭细菌。
实施例5 FDCDs抗E.faecalis生物膜效果
难治性根尖周炎中的细菌进入到复杂的根管系统中,以生物膜的形式存在,所以进一步验证其抗生物膜特性。
将直径为14mm的无菌细胞爬片放入24孔板中,每孔中加入1mL OD600为0.05的E.faecalis悬液,在37℃,5%CO2培养箱静置培养48h,形成E.faecalis生物膜。加入PBS(阴性对照)、3mg/mL FDCDs(实验组)、1%次氯酸钠(NaClO,阳性对照)共培养12h后,用无菌PBS(pH=7.4)洗去残留的药物,并用细菌活/死染色试剂盒进行避光染色15min,采用倒置荧光激光共聚焦显微镜观察生物膜情况。
图9图像显示FDCDs对E.faecalis生物膜的作用效果。空白组E.faecalis生物膜致密且均匀,而3mg/mL FDCDs处理后生物膜完整性被破坏,厚度下降,生物膜内的细菌被杀灭,效果与临床使用的NaClO相当。生物膜厚度测量结果验证上述结果。
实施例6 FDCDs对根管中E.faecalis清除效果
FDCDs能够凭借极小的粒径进入到根管系统中,发挥良好的抗浮游菌的生物膜的作用。选用离体牙为研究对象,建立体外根管感染E.faecalis模型。
1)离体牙收集与制备
收集因正畸拔除的牙体完整、无隐裂、无龋坏或充填物且根尖孔发育完全的上颌双根前磨牙。开髓后去除牙髓组织,使用15#K锉简单疏通后,EDTA+ProTaper根备至F3,过程中用3%(v/v)NaClO和生理盐水交替冲洗并超声荡洗5min,最后用树脂封闭根尖孔。将处理后的离体牙用3%(v/v)NaClO溶液中浸泡过夜后进行高温高压灭菌(121℃,20min)。
2)制备E.faecalis感染根管模型
在无菌离体牙根管中接种E.faecalis菌液,在37℃的CO2培养箱中培养21d,每2d更换一次培养基,过程中确保无杂菌。
3)观察FDCDs对根管中E.faecalis清除效果
将成功建模的样本随机分为3组,每组3颗牙,根管中加入200μL 3mg/mLFDCDs(实验组)、BHI(阴性对照组)、和1%NaClO(阳性对照组)共培养。最后通过SEM观察根管内和牙本质小管内残存的细菌,评估清除细菌的效率。
图10所示,空白对照组的根管壁及牙本质小管中残留较多E.faecalis,FDCDs显著清除根管壁和牙本质小管中的E.faecalis,与1%NaClO的效果相当。NaClO的化学腐蚀作用,使得牙本质结构变得粗糙,FDCDs的牙本质结构无明显变化。
FDCDs既能够高效地清除根管系统中的E.faecalis,且对牙本质结构没有副作用。
实施例7 FDCDs的细胞相容性
目前不乏根管消毒药物的新材料研究,但保证高效抗菌的同时,普遍具有一定的细胞毒性。实施例1的FDCDs具有良好的生物相容性是十分重要的。
采用CCK-8法对FDCDs的细胞毒性进行评价。将小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)用含10%胎牛血清的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2恒温培养箱中复苏、传代、培养,当细胞培养皿中细胞密度超过80%时,将其按照5×103个/孔的密度接种至96孔板中,孵育24h后,加入不同浓度的FDCDs DMEM溶液(1、2、3、4mg/mL),等量的DMEM和1%NaClO,进行共培养,在孵育12、24和36h时,按说明加入CCK-8液避光孵育后,使用酶标仪测450nm处的吸光度,并评估细胞存活率,公式如下:
从图11中可以看出共培养12h时,随着FDCDs浓度的增加,细胞活力下降,但仍保持较高的存活率(>50%)。当共培养24、36h时,3mg/mL浓度下细胞存活率仍超过80%。当FDCDs浓度达到4mg/mL时,细胞活力显著下降(<50%),但其细胞活力仍较NaClO高。表明≤3mg/mL的FDCDs具有良好的细胞相容性。证实FDCDs能够安全的清除E.faecalis,具备成为根管消毒药物的潜力。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已,并不用于限制本公开,对于本领域的技术人员来说,本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种碳量子点在抗生物膜中的应用,其特征是:所述碳量子点的制备方法包括以下步骤:
步骤1:岩藻多糖双蒸水中溶解;
步骤2:高温高压反应釜中反应;
步骤3:将所得溶液冷却至室温后,离心,过滤;
步骤4:真空干燥得固体粉末,得岩藻多糖碳量子点。
2.一种碳量子点在制备根管消毒药物中的应用,其特征是:所述碳量子点的制备方法包括以下步骤:
步骤1:岩藻多糖双蒸水中溶解;
步骤2:高温高压反应釜中反应;
步骤3:将所得溶液冷却至室温后,离心,过滤;
步骤4:真空干燥得固体粉末,得岩藻多糖碳量子点。
3.如权利要求1或2所述的应用,其特征是:所述制备方法,具体步骤为:
步骤1:将0.8 g 岩藻多糖溶于40mL双蒸水中,用磁力搅拌器搅拌至完全溶解;
步骤2:将混合均匀的样品溶液转移至50 mL的内衬聚四氟乙烯的高温高压反应釜中,200℃反应12 h;
步骤3:将所得溶液冷却至室温后,以10000 rpm/min的转速离心10 min,并通过0.22 μm滤膜过滤,得到碳量子点水溶液;
步骤4:将过滤后的液体真空干燥得固体粉末,获得岩藻多糖碳量子点。
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