CN114569558B - 辣木秸秆介导合成生物碲纳米颗粒及其抗菌抗病毒应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种辣木秸秆介导合成生物碲纳米颗粒，由包含如下步骤的方法制备：取辣木秸秆与水制得到固液混合物；过滤收集滤液；将滤液与亚碲酸钾混合搅拌反应；离心取沉淀；洗涤后重悬于去离子水中即得。本发明还提供了所述的生物碲纳米材料的抗菌抗病毒应用。本发明填补了现有技术中用辣木合成具有抗菌抗病毒功能的生物碲纳米颗粒的技术空白，并且生产成本低、合成工艺简单、安全高效、产品稳定性高、生物功能丰富、应用范围较广、抗菌效果显著、抗病毒效果好、绿色环保。本发明具有广阔的市场前景。

Description

辣木秸秆介导合成生物碲纳米颗粒及其抗菌抗病毒应用

【技术领域】

本发明涉及生物纳米材料技术领域，更具体地涉及一种辣木秸秆介导合成生物碲纳米颗粒及其抗菌抗病毒应用。

【背景技术】

病原菌是一类可以引起人类等宿主治病的细菌，在一定条件下，能直接或间接地引起疾病，严重影响人类健康。脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯菌是临床上常见的病原菌，感染人体后会引起不同程度的呼吸道感染性疾病，如常见的细菌性肺炎、支气管炎、脑膜炎、败血症等等。呼吸道感染是其常见的疾病，在临床上，由于病原体不能及时明确，导致其死亡率居高不下，更重要的是，由于抗生素地频繁使用，许多呼吸道感染病原体在不同程度上都对抗生素产生耐药性，单一地使用某种抗生素无法治疗病原菌的感染，可能需要多种抗生素配合使用。肠道病原菌也是一类临床上常见病原菌，包括：痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌和沙门氏菌等肠道病原菌，感染人体后会引起腹泻、肠炎、急性发热、腹部疼痛等疾病，严重的甚至可以引起死亡。一方面，由于抗生素的滥用，许多患者在临床用药时出现多重耐药的现象，为患者的治疗带来巨大困难。另外，目前对于常见的病原菌的消杀还是以化学试剂为主，基于生物材料，效果很好的消杀产品投入使用的并不多。

病毒是一类非细胞型微生物，可以通过经呼吸道、消化道、皮肤接触等途径传播，感染人体后会引起发热、头痛、全身不适等中毒症状及局部症状。

抗菌纳米材料的兴起，使之可能成为抗生素的代替品，碲是自然界中的稀散金属之一，Te(Ⅳ)在一定条件下可被还原为Te(0)，进而形成TeNPs，合成方法也各不相同，通过化学法合成的碲粉具有一定的抗菌效果，但对病毒的无灭活效果。纳米材料也可由生物合成，例如：植物、细菌、真菌等，与之相比，通过植物提取物合成的生物碲纳米可能具有更好的生物医药功能，因为植物体内有多种活性物质。辣木是一种原产于印度的药用植物，具有多种活性物质，如：黄酮类、多酚类、苯丙素类、萜类、甾体类、生物碱类和异硫氰酸酯类等物质，具有多种特殊的生物学功能，在抗菌、抗氧化、抗癌、、降血糖、降尿酸、调血脂等方面表现出良好的应用价值。目前，尽管有一些植物被用于合成生物碲纳米颗粒(Bio-TeNPs)，然而，用辣木合成生物碲纳米颗粒的研究还没有报道。

在此次研究中，利用辣木秸秆提取物合成了生物碲纳米颗粒，通过可见光谱、扫描电镜、透射电镜、元素Mapping、红外光谱等方法对生物碲纳米颗粒进行了表征分析，合成的生物碲纳米颗粒具有辣木秸秆的抗病毒、抗菌活性与碲纳米颗粒的抗菌活性，使之生物功效大大增强，并通过抑菌圈实验、TCID₅₀法对其抗菌和抗病毒活性进行了评价。

【发明内容】

本发明的目的是解决现有技术中辣木合成具有抗菌抗病毒功能的生物碲纳米颗粒尚存在技术空白的缺陷，提供一种生产成本低、合成工艺简单、抗菌效果显著、抗病毒效果好、实用性强、生物功能丰富、绿色环保的辣木秸秆介导合成生物碲纳米颗粒。

为实现上述技术目的，本发明提供了辣木秸秆介导合成生物碲纳米颗粒，其特征在于是由包含如下步骤的方法制备：

①取辣木秸秆与水按照1g：10mL的比例混合，240℃搅拌5～10min，得到固液混合物；

②将步骤①获得的固液混合物用8层纱布过滤，对粗提液进行抽滤，收集滤液；

③将步骤②获得的滤液与亚碲酸钾按照50mL：0.1～0.3g的比例混合，25～50℃下搅拌反应1～4h；

④反应结束后，将样品在12000rpm条件下，室温离心5min，取沉淀；

⑤将步骤④得到的沉淀用去离子水洗涤，最终重悬于去离子水中，获得所述生物碲纳米颗粒。

优选地，所述生物碲纳米颗粒制备方法的步骤②中，还需对滤液置于2～6℃，保存16～48h。

优选地，所述生物碲纳米颗粒是由包含如下步骤的方法制备：

①取辣木秸秆与水按照1g：10mL的比例混合，240℃搅拌5min，得到固液混合物；

②将步骤①获得的固液混合物用8层纱布过滤，对粗提液进行2次抽滤，收集滤液，对滤液置于4℃保存24h；

③将步骤②获得的滤液与亚碲酸钾按照50mL：0.1g的比例混合，28℃下搅拌反应4h；

④反应结束后，将样品在12000rpm条件下，室温离心5min，取沉淀；

⑤将步骤④得到的沉淀用去离子水洗涤，最终重悬于去离子水中，获得所述生物碲纳米颗粒。

本发明还提供了所述的生物碲纳米颗粒的抗菌抗病毒应用。

优选地，所述菌为脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌中的一种或几种；所述病毒为SARS-CoV-2病毒。

本发明的有益效果是：生产原料来源低廉，获取方式简单，主要由辣木秸秆组成，为农作物副产品，植物提取物的获取方式安全高效，由水浸提有效成分，时间较短，反应条件温和，保存方式简单，稳定性较高，合成过程简单，生物功能丰富，应用范围较广，抑菌活性较高，抗病毒效果好。

【附图说明】

图1A为生物碲纳米颗粒实物图；

图1B为生物碲纳米颗粒光谱扫描图；

图2为生物碲纳米颗粒透射电镜、元素Mapping检测；

图3A为生物碲纳米颗粒X射线光电子Te(0)元素谱图；

图3B为生物碲纳米颗粒傅立叶红外光谱图；

图4A为生物碲纳米颗粒抑制呼吸道病原菌效果图；

图4B为生物碲纳米颗粒抑制肠道病原菌效果图；

图5为生物碲纳米颗粒的抗病毒检测；

图6为生物碲纳米颗粒抗菌应用实例。

【具体实施方式】

为了更好地理解本发明，下面结合附图，详细描述实施例。应理解，本实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的范围。

除特别说明外，本实施例所采用的技术手段为本领域的常规技术手段。

实施例1生物碲纳米颗粒的合成

(1)取100g辣木秸秆(茎秆、叶)与1000mL水混合，使用2100W电磁炉在240℃条件下，搅拌加热10min；

(2)固液混合物使用8层纱布过滤，粗提液使用水循环式真空泵进行2次抽滤，最终收集600mL滤液，并将滤液分装在250mL锥形瓶中(100mL/瓶)，置于6℃，保存16h；

(3)在100mL的玻璃烧杯中，取上述置于6℃，保存16h的辣木秸秆提取物50mL与0.2g亚碲酸钾混合，在水浴加热50℃的条件下搅拌反应4h；

(4)反应结束后，将样品分装于2mL离心管中，在12000rpm条件下，室温离心5min，弃上清，取沉淀；

(5)将沉淀用2mL去离子水洗涤，重复洗涤2～3次，最终重悬于10mL去离子水，获得所述生物碲纳米颗粒。

实施例2生物碲纳米颗粒的合成

(1)取100g辣木秸秆(茎秆、叶)与1000mL水混合，使用2100W电磁炉在240℃条件下，搅拌加热5min；

(2)固液混合物使用8层纱布过滤，粗提液使用水循环式真空泵进行2次抽滤，最终收集600mL滤液，并将滤液分装在250mL锥形瓶中(100mL/瓶)，置于2℃，保存48h；

(3)在50mL的玻璃烧杯中，取上述置于2℃，保存48h的辣木秸秆提取物50mL与0.3g亚碲酸钾混合，在水浴加热25℃的条件下搅拌反应1h；

(4)反应结束后，将样品分装于2mL离心管中，在12000rpm条件下，室温离心5min，弃上清，取沉淀；

(5)将沉淀用2mL去离子水洗涤，重复洗涤2～3次，最终重悬于10mL去离子水，获得所述生物碲纳米颗粒。

实施例3生物碲纳米颗粒的合成

(1)取100g辣木秸秆(茎秆、叶)与1000mL水混合，使用2100W电磁炉在240℃条件下，搅拌加热5min；

(2)固液混合物使用8层纱布过滤，粗提液使用水循环式真空泵进行2次抽滤，最终收集600mL滤液，并将滤液分装在250mL锥形瓶中(100mL/瓶)，置于4℃，保存24h；

(3)在50mL的玻璃烧杯中，取上述置于4℃，保存24h的辣木秸秆提取物50mL与0.1g亚碲酸钾混合，在水浴加热28℃的条件下搅拌反应4h；

(4)反应结束后，将样品分装于2mL离心管中，在12000rpm条件下，室温离心5min，弃上清，取沉淀；

(5)将沉淀用2mL去离子水洗涤，重复洗涤2～3次，最终重悬于10mL去离子水，获得所述生物碲纳米颗粒，保存于4℃；

(6)取步骤(5)中4℃过夜的生物碲纳米颗粒(Biological TelluriumNanoparticles，Bio-TeNPs)1mL，在80℃的条件下，干燥48h，按照所得固体重量与所取溶液体积，确定生物碲纳米颗粒的浓度；

(7)取步骤(5)中4℃过夜的生物碲纳米颗粒重悬液200μL，使用酶标仪在200～800nm范围内进行光谱扫描。

结果说明：

如图1A、1B所示，辣木秸秆提取物与亚碲酸钾反应过程中，不断有生物碲纳米颗粒的合成，在反应过程中不断地发生颜色变化，生成黑色的目标产物，通过200～800nm的可见光光谱扫描，发现其在300～400nm处有最大吸收峰，结果表明在反应体系中生物碲纳米颗粒的生成。

实施例4生物碲纳米颗粒的表征分析

(1)使用实施例3中提取的生物碲纳米颗粒，并使用去离子水洗涤2～3次，最后将收集的沉淀，重悬在2mL ddH₂O中；

(2)收集目标样品，放置-80℃超低温冰箱1～2h，使用真空冷冻干燥机在-34℃，真空度为20Pa的条件下，连续冻干24h后收集；

(3)表征检测：使用粉末状的样品，进行红外光谱扫描、扫描电镜和X射线光电子能谱扫描，使用实施例1中步骤5的液体样品进行透射电镜和元素Mapping分析。

结果说明：

如图2、图3A、3B所示，通过透射电镜观察不同视野中的生物碲纳米颗粒，确定其形状为圆形、大小约为20nm；通过元素Mapping分析生物碲纳米颗粒，确定了其表面均匀分布碲、碳、氧、氮、磷和硫元素，确定其表面均匀分布着碲元素和多种有机物；通过X射线衍射技术分析生物碲纳米元素价态，确定其在583.2和572.8处有最高峰，标志着碲元素的价态为0；通过红外光谱扫描分析生物碲纳米颗粒，发现其在3385.78(羟基)、1649.01(烯基)、1488.20(碳酸根离子)、1440.89(甲基)、1361.61(羟基，苯酚/叔醇)、1272.26(羟基，一级醇/二级醇)、1198.56(叔胺)、1075.17(伯胺)、625.03(硫化物，C-S)cm^-1处有伸缩振动，表明其表面均匀分布的有机物包含一些蛋白质、脂质、无机盐等物质。综合可得，生物碲纳米颗粒的形状为不规则圆形，大小在20nm左右，碲元素的价态为0价，在其表面均匀分布着碲元素和蛋白质、脂质等有机物以及无机盐离子。

实施例5不同浓度生物碲纳米颗粒的抗菌检测

本实施例所用的生物碲纳米颗粒是由实施例3合成。

(1)分别取100μL的呼吸道病原菌：脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis CMCC29021)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae ATCC 49619)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae E442)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae ATCC700603)和肠道病原菌：痢疾志贺氏菌(Shigella dysentery CMCC 51252)大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)、霍乱弧菌(Vibrio cholera CICC 23794)、沙门氏菌(Salmonella Typhimunum ATCC14028)接种到MHA培养基(Mueller Hinton Agar)(配方：牛肉粉：6.0g/L，可溶性淀粉：1.5g/L，酸水解酪蛋白：17.5g/L，琼脂：17.0g/L)中，25℃过夜培养；

(2)使用质量百分比为0.85％的生理盐水清洗、重悬、收集MHA培养皿中的细菌，并使用比浊仪将其浊度调整为0.5M；

(3)分别取上述浊度为0.5M的的菌悬液50μL，包括：痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌和肺炎克雷伯菌，涂于MHA培养基上，分别取上述浊度为0.5M的的菌悬液50μL，包括：脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、无乳链球菌，涂于含5％纤维羊血的MHA培养基上；

(4)在每个培养皿中央放置一个灭菌的内环直径为6mm(外环直径为8mm)的牛津杯；

(5)取100μL 7mg/mL的Chem-Te(0)(aladdin，CAS：13494-80-9)(化学零价碲)用于实验对照组，100μL 7mg/mL、0.7mg/mL、0.07mg/mL的生物碲纳米颗粒加入到灭菌牛津杯中；

(6)在25℃的条件下，培养15h；

(7)记录培养皿中抑菌圈的直径。

结果说明：

如图4A、4B所示，使用琼脂糖凝扩散法测定生物碲纳米颗粒的抗菌效果，根据抑菌圈大小判定其抑菌效价，结果显示浓度为7mg/mL、0.7mg/mL、0.07mg/mL的生物碲纳米颗粒可以很好地抑制0.5个麦氏单位的脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌的生长，根据其在15个小时内抑菌圈直径大小，评价其抗菌能力，而且0.07mg/mL的生物碲纳米颗粒比7mg/mL的碲粉效果还强。具体抑菌圈大小见表1，生物碲纳米颗粒在高浓度(7mg/mL)和低浓度(0.07mg/mL)条件下均能很好地抑制脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌的生长。

表1不同浓度生物碲纳米颗粒的抗菌效果

备注：ND表示无抗菌效果。

实施例6生物碲纳米颗粒的抗病毒检测

本实施例所用的生物碲纳米颗粒是由实施例3合成。

(1)将VERO-E6细胞铺96孔细胞培养板，培养24小时至细胞长满单层培养板；

(2)取实施例1步骤5中的生物碲纳米颗粒900μL加入100μLSARS-CoV-2病毒，充分吹打混匀后于37℃条件下作用1小时。同时设立对照组，阳性对照组为含2％(胎牛血清)FBS的(Dulbecco's Modified Eagle Medium)DMEM培养液的细胞维持液(900μL)与100μL的SARS-CoV-2病毒液，在同样条件于37℃作用1小时。阴性对照为细胞对照，仅加入细胞维持液；

(3)作用1h后取出病毒和生物碲纳米颗粒混合物，采用TCID₅₀法对病毒进行滴定，将每个病毒和生物碲纳米混合物进行10倍梯度稀释(即每次取100μL混合物加入到900μL细胞维持液中进行10倍梯度稀释，即稀释倍数为10^-1～10^-6)。

(4)吸去96孔板中的培养基，每孔加入各稀释梯度的将上述样本与病毒混合物100μL加入到96孔板的相应孔中，每个梯度做4个复孔，每个样本重复3次，做好标记，置于含有5％ CO₂的37℃培养箱中培养1小时，1小时后吸去每个生物碲纳米的10^-1倍(最高稀释倍数)的培养液，用Hank’s液(Balanced Salt Solution，BSS)清洗2遍重新加入新鲜细胞维持液100μL，(其它各梯度不弃培养基)，直接在37℃含5％CO₂条件下培养3天；

(5)3天后，在显微镜下观察每个样本在每个梯度下的细胞病变效应(CPE)，采用Reed-Muench法计算病毒残余滴度；

(6)根据阳性对照病毒滴度及每个样本残余病毒滴度，换算每个样本抗新型冠状病毒的滴度。

结果说明：

如图5所示，通过Reed-Muench法计算病毒残余滴度，数据显示7mg/mL生物碲纳米颗粒、辣木上清、7mg/mL辣木沉淀、7mg/mL碲粉、阴性对照对病毒滴度的对数值(Lg TCID50)分别为4.83Lg TCID50/mL、4.81Lg TCID50/mL、5.43Lg TCID50/mL、6.37Lg TCID50/mL、6.89Lg TCID50/mL，表明生物碲纳米颗粒对新型冠状病毒SARS-CoV-2具有很好的抑制效果。

实施例7生物碲纳米颗粒抗菌应用实例

本实施例所用的生物碲纳米颗粒是由实施例3合成。

(1)取约2*10⁸cfu/mL的大肠杆菌CMCC 25922，30μL菌悬液涂布在2cm*2cm的载玻片上；

(2)约15分钟，菌液在载玻片上干燥后，加不同浓度的生物碲纳米颗粒(7、0.7mg/mL)100μL覆盖菌液涂布的区域，同时以100μL的生理盐水的涂布作为对照；

(3)材料处理10分钟后，用无菌棉签将2cm*2cm区域内的微生物收集起来，然后将棉签头浸泡在1mL的0.85％的生理盐水中；

(4)然后取50μL上述处理后的生理盐水的原液和梯度稀释液(10^-1、10^-2、10^-3)涂布MHA平板，计算菌落的数量。

结果说明：

如图6所示，通过稀释涂布平板法进行菌落计数，数据显示经过7mg/mL生物碲纳米颗粒、0.7mg/mL生物碲纳米颗粒和生理盐水(对照组)处理后的大肠杆菌存活率分别为0％，2.66％和100％，结果表明生物碲纳米颗粒可以在一定时间内，将接触过载玻片的大肠杆菌后灭活，最大灭活率可达到100％。

Claims (2)

1.辣木秸秆介导合成生物碲纳米颗粒，其特征在于是由包含如下步骤的方法制备：

①取辣木秸秆与水按照1g：10mL的比例混合，240℃搅拌5min，得到固液混合物；

②将步骤①获得的固液混合物用8层纱布过滤，对粗提液进行2次抽滤，收集滤液，对滤液置于4℃保存24h；

③将步骤②获得的滤液按照50mL：0.1g与亚碲酸钾混合，28℃下搅拌反应4h；

④反应结束后，将样品在12000rpm条件下，室温离心5min，取沉淀；

⑤将步骤④得到的沉淀用去离子水洗涤，最终重悬于去离子水中，获得所述生物碲纳米颗粒。

2.如权利要求1所述的生物碲纳米颗粒在制备抗菌抗病毒药物中的应用，所述菌为脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌中的一种或几种；所述病毒为SARS-CoV-2病毒。

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