CN114940764B - 一种水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种水凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114940764B CN114940764B CN202210535691.XA CN202210535691A CN114940764B CN 114940764 B CN114940764 B CN 114940764B CN 202210535691 A CN202210535691 A CN 202210535691A CN 114940764 B CN114940764 B CN 114940764B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hydrogel
- hyaluronic acid
- chitosan
- solution
- exosome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
- C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
- C08J3/075—Macromolecular gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/716—Glucans
- A61K31/722—Chitin, chitosan
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
- C08J3/246—Intercrosslinking of at least two polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
- C08J2305/02—Dextran; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2405/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2401/00 or C08J2403/00
- C08J2405/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及一种水凝胶及其制备方法和应用,涉及医用生物材料技术领域。该水凝胶包括以下原料:磺化壳聚糖、氨基化透明质酸、交联剂和外泌体。该水凝胶采用磺化壳聚糖这种经特定改性手段获得的具有生物活性的天然高分子材料作为原料,使其与人脐带间质干细胞外泌体共同促进巨噬细胞表型极化和增强血管化,实现协同作用,避免了水凝胶材料仅作为药物载体,不发挥生物学功能的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域,特别是涉及一种水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
外泌体是细胞通过出芽方式分泌的囊性小泡,包含多种活性成分,应用于创面损伤治疗时能够促进创面部位巨噬细胞由促炎性表型(M1)转化为抗炎性表型(M2),同时还能够加速创面部位的血管化过程。影响创面愈合过程的两个主要问题就是损伤部位的过度炎症反应和血管化不足,因此,干细胞外泌体治疗能够极大地加快创面愈合过程。外泌体治疗面临的一大困境是直接注射后,容易被创面部位的酶清除,导致半衰期短,难以维持长效活性,因此需要大剂量多次给药,极大地增加了治疗成本。
水凝胶可以将外泌体留存在水性凝胶网络中,避免外泌体直接与组织周围环境接触,通过水凝胶构建的免疫隔离屏障,能够极大地实现外泌体在体内的长期有效释放。现有技术中常用的提高外泌体治疗效果的方式有两种,一种是利用水凝胶材料实现长期缓释,增加外泌体的作用时间,例如将人胎盘间充质干细胞外泌体负载于壳聚糖水凝胶中,可以实现外泌体在体内持续释放72小时;另一种是利用外源性刺激或理化改性手段,增加外泌体中特定活性因子的含量。
然而,第一种方式中单一用水凝胶作为载体,实现外泌体缓释的方式,水凝胶仅作为药物载体,没有发挥其他功效,对外泌体本身的生物学功能并不能起到改善作用;第二种方式需要对细胞或获得的外泌体进行额外改造,增加了获取外泌体的难度和制备成本。
发明内容
针对上述技术问题,本发明提供一种水凝胶,该水凝胶采用磺化壳聚糖这种经特定改性手段获得的具有生物活性的天然高分子材料作为原料,使其与人脐带间质干细胞外泌体共同促进巨噬细胞表型极化和增强血管化,实现协同作用,避免了水凝胶材料仅作为药物载体,不发挥生物学功能的缺陷。
本发明提供了一种水凝胶,该水凝胶包括以下原料:磺化壳聚糖、氨基化透明质酸、交联剂和外泌体。
本发明人在研究过程中发现,水凝胶虽然能够促进外泌体的留存,避免外泌体直接使用时过快清除,但现有技术中的水凝胶仅是药物载体,并不能对外泌体的功能起到协同促进作用,无法增强干细胞外泌体的功能活性,因此效果欠佳,而造成上述缺点的原因是因为没有将外泌体与一些具有生物活性的天然高分子材料建立联系,发掘功能间的共通点。因此,本发明人采用上述原料制备水凝胶,常规水凝胶制备的时候会采用壳聚糖作为原料之一,壳聚糖本身是一种生物相容性良好的天然生物材料,但自身结构较为简单,无法实现更好的生物学功能,而磺化壳聚糖是一种类肝素材料,具有众多生物活性位点,可以维持细胞因子的活性,且具有募集血管生长因子和调节验证反应的作用,将磺化壳聚糖和外泌体联用,与单独使用磺化壳聚糖或外泌体相比,两者联用时能显著增强人脐静脉内皮细胞的成血管作用,同时能明显诱导M1型巨噬细胞向M2型转化,从而使本发明的水凝胶的各成分协同增效,极大提高外泌体的治疗效果。
在其中一个实施例中,所述磺化壳聚糖的质量分数为1%-3%,所述外泌体的工作浓度为80-120μg/mL。
在其中一个实施例中,所述氨基化透明质酸的质量分数为1%-2%,所述交联剂的质量分数为3%-7%。
采用上述浓度的氨基化透明质酸和交联剂,能够使制备得到的水凝胶具有更适宜的机械强度。
在其中一个实施例中,所述外泌体为人脐带间质干细胞外泌体。
在其中一个实施例中,所述交联剂包括以下原料中的至少1种:醛基化葡聚糖、醛基化海藻酸钠或醛基化透明质酸。
在其中一个实施例中,所述磺化壳聚糖的制备方法包括以下步骤:将壳聚糖、甲酰胺和甲酸混合,得到壳聚糖溶液;将氯磺酸和N,N-二甲基甲酰胺混合,得到DMF·SO3;将DMF·SO3加入所述壳聚糖溶液,搅拌,加入乙醇,过滤,取沉淀物,洗涤乙醇,溶解于水,调节pH值,透析,冷冻干燥,得到磺化壳聚糖;
所述氨基化透明质酸的制备方法包括以下步骤:将透明质酸、己二酸二酰肼和水混合,得到第一溶液,将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和DMSO混合,调节pH值,得到第二溶液,将所述第一溶液和所述第二溶液混合,搅拌,加入氯化钠至饱和,加入乙醇,抽滤,取沉淀物溶解于水,透析,冻干,得到氨基化透明质酸;
所述交联剂的制备方法包括以下步骤:将葡聚糖溶于水,加热,搅拌,得到葡聚糖溶液;将高碘酸钠加入所述葡聚糖溶液,搅拌,加入乙二醇,搅拌,透析,冷冻干燥,得到交联剂。
本发明还提供了所述水凝胶的制备方法,包括以下步骤:将磺化壳聚糖、氨基化透明质酸、外泌体混合,然后加入交联剂。
本发明还提供了一种药物,包括所述水凝胶。
本发明还提供了所述水凝胶的应用,该应用包括:药物制备。
在其中一个实施例中,所述药物包括皮肤修复药物或软组织填充修复药物。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的一种水凝胶及其制备方法和应用,该水凝胶采用磺化壳聚糖这种经特定改性手段获得的具有生物活性的天然高分子材料作为原料,使其与人脐带间质干细胞外泌体共同促进巨噬细胞表型极化和增强血管化,实现协同作用,避免了水凝胶材料仅作为药物载体,不发挥生物学功能的缺陷。
附图说明
图1为实施例2中人脐静脉内皮细胞的成血管结果示意图;
图2为实施例2中人脐静脉内皮细胞的成血管结果统计图;
图3为实施例2中M1型巨噬细胞向M2极化的免疫荧光染色结果图;
图4为实施例2中各大鼠创面的愈合情况比较图;
图5为实施例2中对图4第0天各大鼠的创面形状做绘图处理后的示意图;
图6为实施例2中各大鼠的伤口面积随时间的变化曲线图;
图7为实施例2中第3天时血管的免疫荧光染色结果图;
图8为实施例2中第3天时创面处血管数量的定量统计结果图;
图9为实施例2中第7天时血管的免疫荧光染色结果图;
图10为实施例2中第7天时创面处血管数量的定量统计结果图;
图11为实施例2中第3天时各大鼠的VEGF的免疫组化染色结果图;
图12为实施例2中第3天时各大鼠的VEGF表达量的定量统计结果图;
图13为实施例2中第7天时各大鼠的VEGF的免疫组化染色结果图;
图14为实施例2中第7天时各大鼠的VEGF表达量的定量统计结果图;
图15为实施例2中第7天时各大鼠的M1型巨噬细胞的免疫荧光染色结果图;
图16为实施例2中第7天时各大鼠的M2型巨噬细胞的免疫荧光染色结果图;
其中,1为实施例2中大鼠全层皮肤损伤模型治疗实验的对照组,2为大鼠全层皮肤损伤模型治疗实验的实验组1,3为大鼠全层皮肤损伤模型治疗实验的实验组2,4为大鼠全层皮肤损伤模型治疗实验的实验组3,5为大鼠全层皮肤损伤模型治疗实验的实验组4,6为大鼠全层皮肤损伤模型治疗实验的实验组5。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
定义:
磺化壳聚糖:指一种肝素类似物,具有与肝素/硫酸乙酰肝素十分相似的分子结构,其分子中所具有的磺酸基团及其结构能够同肝素中的磺化结构一样实现对蛋白质结合活性的调控,从而具备类似肝素的生物功能,包括抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗菌、调节细胞分化等。
来源:
外泌体(人脐带间充质干细胞外泌体,购自广州达博生物制品有限公司)、基质胶(康宁公司)。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明,均为市售来源;试验方法如无特殊说明,均为本领域的常规试验方法。
实施例1
一种水凝胶。
该水凝胶的制备方法如下所示。
一、磺化壳聚糖(SCS)的制备。
1、将150mL甲酰胺与6mL甲酸混合,置于250mL圆底烧瓶中,搅拌均匀,随后将1.0g壳聚糖溶解于甲酰胺/甲酸混合液中;
2、将1mL氯磺酸滴加至5mL冷N,N-二甲基甲酰胺中,持续搅拌15min至恢复室温,得到磺化试剂DMF·SO3;
3、将5mL DMF·SO3滴加至壳聚糖溶液中,除去氧气,氮气保护室温搅拌反应3小时;
4、反应液用过量乙醇沉淀,过滤,乙醇洗涤后重溶于去离子水,用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7~8,溶液用截留分子量为8000Da的纤维素透析袋在去离子水中透析3天,冷冻干燥得到磺化壳聚糖。
二、氨基化透明质酸(AHA)的制备。
1、将1.0g透明质酸溶于200mL去离子水中,加入13g己二酸二酰肼,得到第一溶液;
2、将1.56g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1.54g 1-羟基苯并三唑溶于20mL DMSO/H2O体积比为1:1的混合液中,调节pH至4.75,室温下搅拌反应24小时,得到第二溶液;
3、将第一溶液和第二溶液混合,搅拌,加入氯化钠至饱和,随后用乙醇沉淀,产物抽滤,沉淀重新溶解与去离子水中,透析后冻干。
三、醛基化葡聚糖(ODex)的制备。
1、将1g葡聚糖溶于50mL去离子水中,水浴加热至60℃并辅助磁力搅拌至完全溶解;
2、避光称取1.0g高碘酸钠,加入葡聚糖溶液中,避光,室温下搅拌3.5小时,随后加入0.6mL乙二醇溶液继续搅拌1小时以终止反应;
3、反应液用截留分子量为3500Da的纤维素透析袋在去离子水中透析,产物冷冻干燥。
四、水凝胶的制备。
1、将上述步骤制备得到的氨基化透明质酸溶解成质量分数为2.5%的溶液,将上述步骤制备得到的醛基化葡聚糖溶解成质量分数为10%的溶液,直接将质量分数为2.5%的氨基化透明质酸溶液、质量分数为10%的醛基化葡聚糖溶液以体积比为1:1的比例混合,得到第一水凝胶(醛基化葡聚糖+氨基化透明质酸)。
2、将上述步骤制备得到的氨基化透明质酸溶解成质量分数为2.5%的溶液,将上述步骤制备得到的醛基化葡聚糖溶解成质量分数为10%的溶液,将磺化壳聚糖溶解于质量分数为2.5%的氨基化透明质酸溶液中,使得磺化壳聚糖的质量分数为4%,随后将质量分数为10%的醛基化葡聚糖溶液,与磺化壳聚糖、氨基化透明质酸形成的混合溶液,以体积比1:1进行混合,得到第二水凝胶(醛基化葡聚糖+磺化壳聚糖+氨基化透明质酸)。
3、将上述步骤制备得到的氨基化透明质酸溶解成质量分数为2.5%的溶液,将上述步骤制备得到的醛基化葡聚糖溶解成质量分数为10%的溶液,将浓度为8.4mg/mL的外泌体悬液加入质量分数为2.5%的氨基化透明质酸溶液,然后将质量分数为10%的醛基化葡聚糖溶液,与氨基化透明质酸、外泌体形成的混合溶液,以体积比1:1进行混合,使外泌体的工作浓度为100ug/mL(即每毫升水凝胶中加入12μL外泌体悬液),得到第三水凝胶(醛基化葡聚糖+外泌体+氨基化透明质酸)。
4、将上述步骤制备得到的氨基化透明质酸溶解成质量分数为2.5%的溶液,将上述步骤制备得到的醛基化葡聚糖溶解成质量分数为10%的溶液,将磺化壳聚糖溶解于质量分数为2.5%的氨基化透明质酸溶液中,使得磺化壳聚糖的质量分数为4%,随后加入浓度为8.4mg/mL的外泌体悬液,最后将质量分数为10%的醛基化葡聚糖溶液,与磺化壳聚糖、氨基化透明质酸、外泌体形成的混合溶液,以体积比1:1进行混合,使外泌体的工作浓度为100ug/mL(即每毫升水凝胶中加入12μL外泌体悬液),得到第四水凝胶(醛基化葡聚糖+磺化壳聚糖+外泌体+氨基化透明质酸)。
实施例2
性能验证实验。
1、对人脐静脉内皮细胞体外成血管的影响。
将基质胶与基础培养基以重量份比1:1的比例,混合,加入24孔板,置于37℃半小时,每孔接种10万人脐静脉内皮细胞,作为对照组。
将基质胶与基础培养基以重量份比1:1的比例,混合,加入24孔板,置于37℃半小时,加入实施例1制备得到的磺化壳聚糖,使磺化壳聚糖的质量浓度为0.5mg/mL,每孔接种10万人脐静脉内皮细胞,作为磺化壳聚糖组。
将基质胶与基础培养基以重量份比1:1的比例,混合,稀释,加入24孔板,置于37℃半小时,加入外泌体,使外泌体的质量浓度为100μg/mL,每孔接种10万人脐静脉内皮细胞,作为外泌体组。
将基质胶与基础培养基以重量份比1:1的比例,混合,加入24孔板,置于37℃半小时,加入外泌体和实施例1制备得到的磺化壳聚糖,使磺化壳聚糖的质量浓度为0.5mg/mL,外泌体的质量浓度为100μg/mL,每孔接种10万人脐静脉内皮细胞,作为外泌体/磺化壳聚糖组。
将上述对照组、磺化壳聚糖组、外泌体组、外泌体/磺化壳聚糖组,培养5小时,拍照,观察人脐静脉内皮细胞的成血管情况,如图1所示,对于连接点,使用ImageJ软件进行统计,结果如图2所示。
2、对M1型巨噬细胞向M2极化的影响。
将RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)以每孔50万接种至放有细胞爬片的6孔板中,然后加入含有100ng/mL的脂多糖和20ng/mL的IFN-γ诱导培养基,诱导培养48h,随后在孔内分别加入0.25mL第二、三、四水凝胶和2.5mL完全培养基;不含水凝胶,仅有2.5mL完全培养基的孔作为对照组。培养3天后对CD206进行免疫荧光染色,CD206为M2巨噬细胞的特异性标志物。
结果如图3所示。
3、大鼠全层皮肤损伤模型治疗实验。
选取6组大鼠,分别在其身上割去大小相等的全层皮肤,一组大鼠的创面不涂抹任何药物,作为对照组;一组大鼠的创面滴加了200μL实施例1制备得到的第一水凝胶,使水凝胶完全覆盖创面,在室温下静止10min待其完全成胶,作为实验组1;一组大鼠的创面滴加了200μL实施例1制备得到的第二水凝胶,使水凝胶完全覆盖创面,在室温下静止10min待其完全成胶,作为实验组2;一组大鼠的创面滴加了200μL实施例1制备得到的第三水凝胶,使水凝胶完全覆盖创面,在室温下静止10min待其完全成胶,作为实验组3;一组大鼠的创面滴加了200μL实施例1制备得到的第四水凝胶,使水凝胶完全覆盖创面,在室温下静止10min待其完全成胶,作为实验组4;一组大鼠的创面贴上市面上购买的常规水胶体辅料HydrocolloidDressing,作为实验组5。
在实验开始的第0天、第3天、第7天、第10天、第14天,对创面拍照,观察创面愈合情况,如图4所示;图5为对图4第0天各大鼠的创面形状做绘图处理后的示意图;对各大鼠各时间点的伤口面积做统计后,利用ImageJ软件统,绘制得到各大鼠的伤口面积随时间的变化曲线,如图6所示。
4、对大鼠创面组织血管化情况的检测。
将上述大鼠全层皮肤损伤模型治疗实验中第3天、第7天各大鼠的创面组织,经石蜡包埋,切片,对CD31和α-SMA进行免疫荧光染色,操作过程按免疫荧光染色的标准化流程进行,得到第3天时血管的免疫荧光染色结果图如图7所示,第7天时血管的免疫荧光染色结果图如图9所示;再采用imageJ软件统计,得到第3天时创面处血管数量的定量统计结果如图8所示,第7天时创面处血管数量的定量统计结果如图10所示。
5、对大鼠创面组织血管内皮生长因子(VEGF)、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的检测。
对上述大鼠全层皮肤损伤模型治疗实验中第3天、第7天各大鼠的创面组织,分别进行免疫组化染色,并且对各组大鼠的创面组织进行免疫荧光染色,操作过程按免疫组化染色、免疫荧光染色的标准化流程进行,得到第3天时各大鼠的VEGF的免疫组化染色结果如图11所示,第3天时各大鼠的VEGF表达量的定量统计结果如图12所示;第7天时各大鼠的VEGF的免疫组化染色结果如图13所示,第7天时各大鼠的VEGF表达量的定量统计结果如图14所示;第7天时各大鼠的M1型巨噬细胞的免疫荧光染色结果如图15所示,第7天时各大鼠的M2型巨噬细胞的免疫荧光染色结果如图16所示,其中F4/80是巨噬细胞的特异性标志物,iNOS是M1型巨噬细胞的特异性标志物,CD206是M2型巨噬细胞的特异性标志物。
结果分析:根据上述图1-16的检测结果可看出,第四水凝胶利用磺化壳聚糖作为外泌体释放载体的同时,对外泌体的生物学功能起到了联合促进的作用,对比与单独的磺化壳聚糖和人脐带间充质干细胞外泌体,对人脐静脉内皮细胞的体外成血管和促进M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞的作用更明显。大鼠全层皮肤损伤模型治疗结果显示,联合使用外泌体的磺化壳聚糖水凝胶对创面的愈合速率更快,血管化作用更明显,同时对巨噬细胞表型的影响更显著。因此,第四水凝胶利用水凝胶本身具备的特殊的理化性质构建了免疫屏障,避免外泌体直接注射产生的体内清除速度快的问题,显著降低外泌体的给药量,极大地降低了治疗成本;同时,第四水凝胶利用磺化壳聚糖与外泌体发挥协同作用,共同促进血管化和巨噬细胞表型极化作用,增强人脐带间充质干细胞外泌体的治疗效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种水凝胶,其特征在于,该水凝胶包括以下原料:磺化壳聚糖、氨基化透明质酸、交联剂和外泌体;
所述磺化壳聚糖的质量分数为1%-3%,所述外泌体的工作浓度为80-120μg/mL;
所述氨基化透明质酸的质量分数为1%-2%,所述交联剂的质量分数为3%-7%;
所述外泌体为人脐带间质干细胞外泌体;
所述交联剂包括以下原料中的至少1种:醛基化葡聚糖、醛基化海藻酸钠或醛基化透明质酸。
2.根据权利要求1所述的水凝胶,其特征在于,所述磺化壳聚糖的制备方法包括以下步骤:将壳聚糖、甲酰胺和甲酸混合,得到壳聚糖溶液;将氯磺酸和N,N-二甲基甲酰胺混合,得到DMF·SO3;将DMF·SO3加入所述壳聚糖溶液,搅拌,加入乙醇,过滤,取沉淀物,乙醇洗涤,溶解于水,调节pH值,透析,冷冻干燥,得到磺化壳聚糖;
所述氨基化透明质酸的制备方法包括以下步骤:将透明质酸、己二酸二酰肼和水混合,得到第一溶液,将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和DMSO混合,调节pH值,得到第二溶液,将所述第一溶液和所述第二溶液混合,搅拌,加入氯化钠至饱和,加入乙醇,抽滤,取沉淀物溶解于水,透析,冻干,得到氨基化透明质酸。
3.权利要求1-2中任一项所述水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:将磺化壳聚糖、氨基化透明质酸、外泌体混合,然后加入交联剂。
4.一种药物,其特征在于,包括权利要求1-2中任一项所述的水凝胶。
5.权利要求1-2中任一项所述的水凝胶的应用,该应用包括:药物制备。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述药物包括皮肤修复药物或软组织填充修复药物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210535691.XA CN114940764B (zh) | 2022-05-17 | 2022-05-17 | 一种水凝胶及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210535691.XA CN114940764B (zh) | 2022-05-17 | 2022-05-17 | 一种水凝胶及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114940764A CN114940764A (zh) | 2022-08-26 |
CN114940764B true CN114940764B (zh) | 2023-03-24 |
Family
ID=82907371
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210535691.XA Active CN114940764B (zh) | 2022-05-17 | 2022-05-17 | 一种水凝胶及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114940764B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115429931B (zh) * | 2022-10-24 | 2023-08-15 | 山东爱基康健康科技有限公司 | 一种包含外泌体的壳聚糖水凝胶敷料及其制备方法 |
CN115581810B (zh) * | 2022-10-26 | 2023-12-22 | 济宁医学院附属医院 | 一种富含外泌体的水凝胶及其制备方法和应用 |
CN115721774A (zh) * | 2022-10-31 | 2023-03-03 | 博品(上海)生物医药科技有限公司 | 一种基于干细胞提取物的凝胶及其制备方法与应用 |
CN115737887A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-03-07 | 河北大学 | 一种皮肤创面敷料及其制备方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108014376A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-05-11 | 华南理工大学 | 一种甜菜碱修饰壳聚糖的多糖水凝胶及其制备方法 |
CN109912850B (zh) * | 2019-03-11 | 2021-03-02 | 同济大学 | 包载外泌体的自愈合水凝胶及其制备方法和应用 |
CN112206356A (zh) * | 2019-07-11 | 2021-01-12 | 温宁 | 一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法 |
CN111154149A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-05-15 | 广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心) | 一种水凝胶及其制备方法与敷料 |
CN111110914B (zh) * | 2020-01-08 | 2021-09-28 | 广州贝奥吉因生物科技股份有限公司 | 一种促进骨再生的可注射水凝胶及其制备方法 |
CN112210091B (zh) * | 2020-10-29 | 2021-08-10 | 吉林大学 | 一种多功能天然多糖修复粘合水凝胶、制备方法及其在制备治疗皮肤损伤药物方面的应用 |
-
2022
- 2022-05-17 CN CN202210535691.XA patent/CN114940764B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114940764A (zh) | 2022-08-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN114940764B (zh) | 一种水凝胶及其制备方法和应用 | |
ES2790300T3 (es) | Métodos y medios para ingeniería de tejidos blandos | |
KR100314488B1 (ko) | 다당류겔조성물 | |
Yu et al. | Design of a novel wound dressing consisting of alginate hydrogel and simvastatin-incorporated mesoporous hydroxyapatite microspheres for cutaneous wound healing | |
CN107224617B (zh) | 一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶及其制备方法 | |
Gao et al. | In situ activated mesenchymal stem cells (MSCs) by bioactive hydrogels for myocardial infarction treatment | |
EP2979710A1 (en) | Cell tissue gel containing collagen and hyaluronan | |
CN113577366B (zh) | 促进糖尿病难愈性伤口快速愈合的干膜敷料及其制备方法 | |
US20170252372A1 (en) | Viral inactivated biological mixture | |
Doǧan et al. | Controlled release of EGF and bFGF from dextran hydrogels in vitro and in vivo | |
CN109069875A (zh) | 产生免疫耐受反应的组合物和方法 | |
CN108113977B (zh) | 一种红细胞膜包封的明胶载盐酸小檗碱纳米粒的制备方法及其应用 | |
Jiang et al. | Brain microenvironment responsive and pro‐angiogenic extracellular vesicle‐hydrogel for promoting neurobehavioral recovery in type 2 diabetic mice after stroke | |
Zhuang et al. | A poly (γ‐glutamic acid)‐based hydrogel loaded with superoxide dismutase for wound healing | |
CN110917391A (zh) | 一种多肽修饰海藻酸钠/pva水凝胶敷料及其制备方法 | |
CN113876693A (zh) | 一种促创面愈合的鹿茸多肽单体凝胶制剂及其制备方法 | |
CN114058663A (zh) | 一种多功能牡蛎活性多肽及其制备方法和应用 | |
CN113181217A (zh) | 一种细胞支架、其搭载胰岛细胞复合物、制备方法、应用 | |
CN109503863B (zh) | 一种可注射水凝胶及其制备方法和应用 | |
CN113081951B (zh) | 一种用于慢性伤口愈合的水凝胶及制备方法 | |
CN114984295A (zh) | 多孔纳米医用敷料及其制备方法 | |
CN116535682A (zh) | 水凝胶生物材料及其制备方法和应用 | |
CN106474157B (zh) | 一种肝干细胞注射液及其制备方法 | |
Denkbas et al. | EGF loaded chitosan sponges as wound dressing material | |
US20220378976A1 (en) | Means for use in preparation of hydrogel based on hydroxyphenyl derivative of hyaluronan, method of hydrogel preparation and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |